HercepTest for Automated Link Platforms

Transkript

1 HercepTest for Automated Link Platforms Kód SK vydání ( ) P04456CZ_01_SK / str. 1/40

2 Obsah Strana Použití...3 Souhrn a vysvětlení - prs...4 Princip metody - prs...4 Dodané materiály - prs...5 HercepTest Control Slides...5 Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky - prs...6 Bezpečnostní opatření - prs...7 Skladování - prs...7 Příprava vzorku - prs...8 Příprava činidla - prs...8 Postup barvení - prs...9 Kontrola kvality - prs...10 Interpretace zabarvení - prs...12 Všeobecná omezení - prs...14 Omezení specifická pro tento výrobek - prs...15 Charakteristiky účinnosti - prs...15 Řešení problémů - prs...18 Souhrn a vysvětlení - žaludek...20 Princip metody - žaludek...20 Dodané materiály - žaludek...21 HercepTest Control Slides...21 Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky - žaludek...22 Bezpečnostní opatření - žaludek...23 Skladování - žaludek...24 Příprava vzorku - žaludek...24 Příprava činidla - žaludek...24 Postup barvení - žaludek...25 Kontrola kvality - žaludek...26 Interpretace zabarvení - žaludek...28 Všeobecná omezení - žaludek...31 Omezení specifická pro tento výrobek - žaludek...31 Charakteristiky účinnosti - žaludek...32 Řešení problémů - žaludek...36 Reference...38 Vysvětlivky k symbolům...40 ( ) P04456CZ_01_SK / str. 2/40

3 Použití K diagnostice in vitro. HercepTest je semikvantitativní imunocytochemický test ke stanovení hyperexprese proteinu HER2 v tkáních karcinomu prsu zpracovaných běžným způsobem pro histologické vyšetření a tkáních rakoviny pacientů s adenokarcinomem žaludku, včetně gastroezofageálního spojení, fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. HercepTest je určen jako pomůcka v hodnocení pacientů, u kterých byla zvažována léčba prostředkem Herceptin (trastuzumab), (viz příbalový leták k výrobku Herceptin ). POZNÁMKA, pouze pro rakovinu prsu: Všichni pacienti účastnící se klinických zkoušek s přípravkem Herceptin byli vybráni pomocí zkušební imunocytochemické klinické studie (CTA). Žádný pacient účastnící se těchto studií nebyl vybrán pomocí testu HercepTest. Test HercepTest byl porovnán se studií CTA na nezávislé skupině vzorků a byl shledán jako vhodný k dosažení přijatelných souhlasných výsledků. Současný vztah testu HercepTest ke klinickému výsledku Herceptin nebyl zjišťován. POZNÁMKA, pouze pro rakovinu žaludku: Všichni pacienti ve studii BO18255 (ToGA) fáze III, sponzorované společností Hoffmann-La Roche, byli vybráni na základě použití Dako HercepTest (IHC) a Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). Studie prokázala klinické využití obou testů při hodnocení stavu HER2 u pacientů s inoperabilním, lokálně pokročilým, rekurentním a/nebo metastazujícím adenokarcinomem žaludku nebo gastroezofageální junkce. Pro tuto soupravu, kód SK001, byly hodnoty činidla nastaveny specielně pro použití s Dako Automated Link platforms. Adenokarcinom žaludku, včetně gastroezofageálního spojení, je v tomto dokumentu uváděn také jako rakovina žaludku. HercepTest a Herceptin jsou ochranné známky společnosti Genentech, Inc., držitelem licence je společnost Dako Denmark A/S a F. Hoffmann-La Roche Ltd. Aplikace pro rakovinu prsu, viz strany 4-19 Aplikace pro rakovinu žaludku, viz strany Důležitá informace: Povšimněte si rozdílů u tkáně rakoviny prsu a tkáně rakoviny žaludku, zejména v části Interpretace zabarvení. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 3/40

4 Rakovina prsu Souhrn a vysvětlení - prs Pozadí Lidský gen HER2 (rovněž nazýván jako ERBB2 nebo NEU) kóduje protein často označovaný jako protein HER2 nebo p185 HER2. Protein HER2 je membránový tyrozinkinázový receptor s homologií s receptorem epidermálního růstového faktoru (EGFR nebo HER1) (1-8). Protein HER2 je normální komponenta, exprimována mnoha typy epiteliálních buněk (8). U části pacientů s rakovinou prsu je protein HER2 hyperexprimován jako součást procesu maligní transformace a progrese tumoru (9). Hyperexprese proteinu HER2 na povrchu buněk rakoviny prsu znamená, že se může jednat o cíl terapie protilátkou. Herceptin (trastuzumab) je lidská monoklonální protilátka (10), která se vysokou afinitou váže na protein HER2 a prokázalo se, že inhibuje proliferaci lidských rakovinných buněk hyperexprimujících protein HER2 in vitro a in vivo (11-13). Charakteristiky HercepTest byl vyvinut s cílem vytvořit alternativu ke zkušební výzkumné metodě CTA používané v klinických studiích s přípravkem Herceptin. Účinnost testu HercepTest pro determinaci hyperexprese proteinu HER2 byla vyhodnocena nezávislou studií srovnávající výsledky testu HercepTest a studie CTA na 548 vzorcích rakoviny prsu, z nichž ani jeden nepocházel od pacientů zařazených do klinických studií s přípravkem Herceptin. Výsledky vykazují 79 % shodu mezi výsledky těchto dvou zkoušek na těchto tkáňových vzorcích. Shoda údajů rovněž naznačuje, že hodnota 3+ výsledků testu HercepTest odpovídala s vysokou pravděpodobností pozitivním hodnotám ve studii CTA, což by vyhovovalo zadávacím kritériim zkoušky (2+ nebo 3+). Výskyt hodnoty 2+ v testu HercepTest nekoreluje také s výsledky studie CTA. Asi 42 % (53/126) výsledků 2+ testu HercepTest bylo negativních za použití CTA (0 1+), což nedovoluje zařazení do klinických zkoušek s Herceptinem. HercepTest se interpretuje pro hyperexpresi proteinu HER2 jako negativní (intenzita zabarvení 0 a 1+ ), slabě pozitivní (intenzita zabarvení 2+ ) a silně pozitivní (intenzita zabarvení 3+). HercepTest není vhodný k poskytování informací o prognóze pacientovi a lékaři a nebyl pro tento účel ověřen. Princip metody - prs HercepTest obsahuje činidla potřebná pro úplnou imunocytochemickou metodu barvení ve dvou krocích pro vzorky zpracované běžným způsobem, zalité v parafínu. Po inkubaci primární králičí protilátkou proti lidskému proteinu HER2 využívá tato souprava předem připravené vizualizační reagens Visualization Reagent založené na dextranové technologii. Toto reagens obsahuje molekuly sekundárního kozího anti-králičího imunoglobulinu i molekuly křenové peroxidázy navázané na společný hlavní řetězec dextranového polymeru, a tak eliminuje nutnost sekvenční aplikace vazby protilátky a konjugátu peroxidázy. Křížová reakce vizualizačního reagens s lidskými imunoglobuliny a s fetálním telecím sérem byla odstraněna absorpcí v pevné fázi. Enzymatická přeměna následně přidaného chromogenu vede k vytvoření viditelného reakčního produktu v místě antigenu. Vzorek pak lze obarvit kontrastním barvivem a zakrýt krycím sklíčkem. Výsledky se pak interpretují pomocí světelného mikroskopu. Podložní skla s kontrolními vzorky obsahují k vyhodnocení barvících cyklů tři linie lidských buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu s hodnotami intenzity zabarvení 0, 1+ a 3+. Intenzita zabarvení těchto linií buněk koreluje s počtem receptorů na jednu buňku. HercepTest for Automated Link Platforms, kód SK001 je určen pro automatické barvení se systémem Automated Link Platforms. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 4/40

5 Rakovina prsu Dodané materiály - prs Kód SK001 Materiály v níže uvedeném seznamu postačí na 50 testů (50 podložních skel inkubovaných primární protilátkou na protein HER2 a 50 podložních skel inkubovaných odpovídající reagencií pro negativní kontrolu). Počet testů vychází z použití 200 µl na jeden tkáňový řez (22 mm x 22 mm) pro každé činidlo, s výjimkou vyhledávacího roztoku epitopu. Kit obsahuje dostatek materiálů na maximálně 10 samostatných cyklů barvení. Množství Popis 1 x 22 ml HercepTest Peroxidase-Blocking Reagent 3 % peroxid vodíku s obsahem 15 mol/l azidu sodného (NaN 3). 1 x 12 ml HercepTest Rabbit Anti-Human HER2 Protein Afinitně izolovaná protilátka k okamžitému použití. Dodává se v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mol/l NaN 3, ph 7,2, který obsahuje stabilizující protein Imunogen: Syntetický C-koncový fragment (intracytoplazmatická část) proteinu HER2 navázaný na KLH (keyhole limpet hemocyanin). Specificita: protein HER2. Purifikační metoda: Protilátka je afinitně izolovaná pomocí imobilizovaného peptidu proteinu HER2. 1 x 22 ml HercepTest Visualization Reagent Dextranový polymer konjugovaný s křenovou peroxidázou a afinitně izolovanými kozími anti-králičími imunoglobuliny. Dodává se v Tris-HCl pufru, který obsahuje stabilizující protein a antimikrobiální činidlo. 1 x 10 ml HercepTest Negative Control Reagent Imunoglobulinová frakce normálního králičího séra při odpovídající koncentraci proteinu jako primární protilátka k proteinu HER2. Dodává se v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mol/l NaN 3, ph 7,2, který obsahuje stabilizující protein 2 x 22 ml HercepTest DAB Substrate Buffer Substrátový pufrový roztok, ph 7,5, který obsahuje < 0,1 % peroxidu vodíku, stabilizátory, posilovače a antimikrobiální činidlo. 1 x 1 ml HercepTest DAB Chromogen 5 % 3,3'-diaminobenzidin v tetrahydrochloridovém chromogenovém roztoku. 3 x 500 ml HercepTest Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x) 0,1 mol/l citrátový pufr s detergentem 2 x 5 podložní skla HercepTest Control Slides Každé podložní sklo obsahuje tři linie buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu představující různé úrovně exprese proteinu HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) a SK-BR-3 (3+). Podložní skla s kontrolními vzorky byla tepelně opracována, aby se zlepšila přilnavost vzorků ke sklům. Každé další tepelné zpracování podložních skel s kontrolními vzorky za účelem zlepšení přilnavosti řezů ke sklům může ohrozit výsledky barvení. 10 x lahví Láhev plnitelná činidly uživatele, obsah 12 ml Každá láhev pojme 12 ml činidla. Láhve se používají pro smíchávání a přidávání roztoku substrát-chromogenu (viz část Příprava činidla). Dodáváno jednotlivě baleno. POZNÁMKA: Všechny reagenty jsou speciálně připraveny pro použití s tímto testem. Aby test odpovídal uvedené specifikaci, nelze používat žádné substituty. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 5/40

6 Rakovina prsu Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky - prs Dako Wash Buffer, kód S3006 Kontrastní barvivo: Hematoxylin, například Hematoxylin for Automated Link Platforms (kód SK308) Krycí sklíčka Destilovaná nebo deionizovaná voda Sušička, schopná udržovat teplotu nejvýše 60 C Etanol, bezvodý a 95 % Světelný mikroskop (zvětšení objektivu 4 40x) Montážní médium, například Dako Faramount (kód S3025) nebo Dako Glycergel (kód C0563) Pozitivní a negativní tkáně k použití pro kontrolu průběhu (viz část Kontrola kvality) Podložní skla SuperFrost Plus, potažená poly-l-lysinem nebo Dako Silanized Slides (kód S3003) Xylen, toluen nebo substituty xylenu SK001 je určen k použití se systémem Dako Automated Link platforms. Další informace naleznete v uživatelské příručce k systému Dako Automated Link platforms. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 6/40

7 Rakovina prsu Bezpečnostní opatření - prs 1. K diagnostice in vitro. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN 3), který je v čisté formě vysoce toxický. Přestože se koncentrace azidu sodného ve výrobku neklasifikuje jako nebezpečná, může reagovat s olovem a mědí v odpadním potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy těchto kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množství vody, aby nedocházelo k usazování azidů v potrubí (21). 4. HercepTest činidlo blokující peroxidázu obsahuje 3 % peroxid vodíku. Bezpečnostní list pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. 5. HercepTest králičí anti-lidský protein HER2, HercepTest vizualizační činidlo a HercepTest činidlo pro negativní kontrolu obsahují materiál živočišného původu. 6. Jako u každého výrobku biologického původu je nutno dodržovat řádná bezpečnostní opatření. 7. S biologickými vzorky před a po fixaci a se všemi ostatními materiály, které s nimi přijdou do styku, je nutno manipulovat jako s potenciálně infekčním materiálem a je nutno je likvidovat s souladu s bezpečnostními opatřeními (22). Nikdy nenabírejte reagencie do pipety ústy a zamezte kontaktu reagencií a vzorků s kůží a sliznicemi. Jestliže se reagencie dostanou do kontaktu s citlivými oblastmi, omyjte je dostatečným množstvím vody. 8. Minimalizujte mikrobiální kontaminaci činidel, jinak by mohlo dojít k zvýšení nespecifického zabarvení. 9. Nedodržení inkubační doby, teploty nebo metody může vést k chybným výsledkům. Nadměrné sušení po dobu delší než jedna hodina při teplotě 60 C m ůže způsobit výrazné snížení nebo ztrátu specifické, s HER2 související, imunoreaktivity (17). 10 Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může způsobit ztrátu zabarvení antigenu. 11. Všechny reagenty jsou speciálně připraveny pro použití s tímto testem. Aby test odpovídal uvedené specifikaci, nelze používat žádné substituty. 12. HercepTest Visualization Reagent a HercepTest chromogen DAB mohou být v případě vystavení působení intenzivního světla negativně ovlivněny. Neskladujte složky systému ani neprovádějte barvení při silném světle, například při přímém slunečním světle. 13. Používejte odpovídající osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. 14. Nespotřebované roztoky je nutno likvidovat v souladu s místními a celostátními předpisy Bezpečnostní list pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. Použití jiných než doporučených objemů činidel může mít za následek ztrátu viditelnosti imunologické reakce HER2. Tkáňové řezy větší než 22 mm x 22 mm potřebují aplikovat 2 3x 200 µl činidla na 2 3 automatické aplikační oblasti. 17. HercepTest chromogen DAB obsahuje 1 5 % 3,3 -diaminobenzidin tetrahydrochloridu (bifenyl- 3,3,4,4 - tetrayltetraammonium tetrachlorid) a je označen: Nebezpečí H350 Může vyvolat rakovinu. H341 Podezření na genetické poškození. P201 Před použitím si obstarejte speciální instrukce. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. P308 + P313 PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. P405 Skladujte uzamčené. P501 Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. 18. Rezidua parafínu mohou vést k falešně negativním výsledkům. Základní pravidlo osoby mladší 18 let nesmí s tímto produktem pracovat. Uživatelé musí být řádně proškoleni co se týče správného pracovního postupu, nebezpečných vlastností produktu a nutných bezpečnostních opatření (podle Směrnice EU 94/33/EC). Další informace naleznete v Bezpečnostním listu o materiálech (SDS). USA: 3,3 -diaminobenzidin (DAB) může být zdraví škodlivý při vdechování, styku s kůží a při požití. Materiál dráždí oči a pokožku. Pokud dojde ke kontaktu s pokožkou, opláchněte postižené místo vodou a mýdlem. POZNÁMKA: Ačkoliv diaminobenzidin je strukturou příbuzný benzidinu, nebylo hlášeno, že diaminobenzidin má rakovinotvorné vlastnosti. Při likvidaci postupujte v souladu s místními a celostátními předpisy. Skladování - prs Pokud se nepoužívá na automatizovaných přístrojích Automated Link Platforms výrobce Dako, uchovávejte při 2 8 C. Výrobky HercepTest Peroxidase-Blocking Rea gent, HercepTest Visualization Reagent, HercepTest DAB Substrate Buffer a HercepTest DAB Chromogen uchovávejte v temnu při 2 8 C. Nepoužívejte soupravu po datu exspirace vytištěném na obalu. Pokud se reagencie skladují za jiných podmínek, než jaké jsou uvedeny v příbalovém letáku, musí uživatel provést jejich kontrolu (14a, 14b). Pamatujte, že podložní skla s kontrolními vzorky musí být rovněž skladována při 2 8 C. Neexistují žádné známky toho, že by tyto produkty byly nestabilní. Proto je nutno provádět pozitivní a negativní kontroly současně s pacientovými vzorky. Pokud zpozorujete neočekávané zabarvení, které nelze vysvětlit změnami laboratorních postupů a máte podezření, že se jedná o problém s látkou HercepTest, obraťte se na technickou podporu společnosti Dako. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 7/40

8 Rakovina prsu Příprava vzorku - prs Se vzorky pro biopsii je nutno nakládat tak, aby byla zachována tkáň pro imunocytochemické barvení. U všech vzorků by se měly používat standardní způsoby zpracování tkáně (15). Řezy zalité v parafínu Tkáně uchovávané v neutrálním pufrovaném formalínu nebo v Bouinově fixativu jsou vhodné pro zpracování a zalití v parafínu běžným způsobem.. Například vzorky z biopsie by měly být nařezány na části s tloušťkou 3 nebo 4 mm a na dobu hodin fixovány neutrálním pufrovaným formalínem. Tkáně se potom dehydrují v řadě alkoholů a xylenu a potom jsou napuštěny rozpuštěným parafínem a skladovány při teplotě ne více než 60 C. Řádně fixované a zalité tkáně exprimující protein HER2 vydrží před řezáním a montáží na podložní sklo neurčitou dobu, pokud se skladují na chladném místě (15 25 C) (15,16). Clinical Laboratory Improvemen t Amendments of 1988 (Zákon o zdokonalení klinických laboratoří z roku 1998) od profesionálních uživatelů ve Spojených státech vyžaduje v článku 42 CFR (b): Laboratoř musí uchovávat barvená podložní skla nejméně deset let od data testu a bločky vzorků nejméně dva roky od data testu (16). Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce 4 5 µm, namontovat na podložní skla a usušit na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin (nebo až do jejich uschnutí) nebo při 37 C p řes noc nebo při 60 C po dobu hodiny. UPOZORNĚNÍ: Nadměrné zahřívání po dobu delší než jedna hodina při teplotě 60 C m ůže způsobit výrazné snížení nebo ztrátu specifické, s HER2 související, imunoreaktivity (17). V zájmu zachování antigennosti se musí řezy tkání namontované na podložních sklech (SuperFrost Plus, Poly- L-lysine nebo silanizovaná skla) barvit do 4 6 týdnů od řezání, pokud se skladují při pokojové teplotě (20 25 C) (18). Podložní skla požadovaná pro vyhodnocení HER2 a ověření přítomnosti nádoru se musí připravovat současně. Doporučuje se vytvořit minimálně 5 podložních skel, 1 sklo pro přítomnost tumoru, 2 skla pro vyhodnocení proteinu HER2 (jedno sklo pro inkubaci s králičím anti-lidským proteinem HER2 a jedno sklo pro činidlo pro negativní kontrolu) a 2 záložní skla. Použití testu HercepTest u odvápněných tkání dosud nebylo ověřeno a nedoporučuje se. Další podrobné informace o přípravě vzorků naleznete v dokumentu společnosti Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods" (19) a v odkazech 15 a 16. Zpracování tkání před barvením Pro optimální účinnost zkoušky musí být použita metoda vyhledávání specifického epitopu v 0,01 mol/l citrátovém pufru. Vyhledávací roztok epitopu je dodáván v soupravě HercepTest. Tato metoda zahrnuje zahřívání řezů tkání namontovaných na podložních sklech, které se ponořují do 0,01 mol/l citrátového pufru (20) v kalibrované vodní lázni nebo na Dako PT Link (Kód PT101 a PT200) při požadované teplotě (95 99 C). Laboratoře, umístěné ve vyšších nadmořských výškách, musí stanovit optimální metodu udržování potřebné teploty. Byly testovány další metody vyhledávání epitopu, ale nepřinesly reprodukovatelné výsledky. Odchylky od opsaného postupu mohou vést k nesprávným výsledkům. Příprava činidla - prs Je vhodné připravit před barvením následující reagencie: Vyhledávací roztok epitopu Rozřeďte před započetím plánovaného barvícího postupu dostatečné množství roztoku, lahvička 7 (roztok k vyhledávání cíle x 10) v poměru 1:10 pomocí destilované nebo deionizované vody. Nespotřebovaný roztok lze používat při pokojové teplotě po dobu jednoho týdne nebo skladovat při 2 8 C po dobu jednoho m ěsíce. Rozředěný roztok zlikvidujte, pokud je zakalený. Další informace naleznete v uživatelské příručce k příslušné Dako Automated Link platform(s). Promývací pufr Rozřeďte dostatečné množství Dako Wash Buffer (kód S3006) 1:10 pomocí destilované nebo deionizované vody. Nespotřebovaný pufrový roztok lze používat při pokojové teplotě po dobu jednoho týdne nebo skladovat při 2 8 C po dobu jednoho m ěsíce. Pufr zlikvidovat, pokud je zakalený. Další informace naleznete v uživatelské příručce k příslušné Dako Automated Link platform(s). Roztok substrát-chromogen (DAB) Připravte roztok substrát-chromogenu v uživatelských lahvích přidáním 25 µl DAB chromogenu na 1 ml DAB substrátového pufru a promíchejte. Hotový substrát-chromogenový roztok (DAB) je stabilní po dobu přibližně 5 dnů, je-li skladován při 2 8 C. Roztok je t řeba před použitím řádně promíchat. Případná přítomnost sraženiny v roztoku neovlivní kvalitu barvení. Uživatelská láhev obsahující roztok substrát-chromogenu se před použitím musí nadefinovat v přístroji Dako Automated Link platform. Další informace naleznete v uživatelské příručce k příslušné Dako Automated Link platform(s). POZNÁMKA: Barva DAB Chromogenu se může lišit od čiré až po světle hnědě levandulovou. To však funkci tohoto produktu neovlivní. Řeďte prosím v souladu s postupem uvedeným v příbalovém letáku. Přidání příliš velkého množství DAB chromogenu do DAB pufrového substrátu způsobí poškození pozitivního signálu. Kontrastní barvivo Zabarvený výsledný produkt barvicí reakce DAB není rozpustný v alkoholu ani ve vodě. V případě potřeby kontrastního barviva můžete použít Automated Link Platforms Hematoxylin (kód SK308). Potřebné kroky a inkubační doby jsou předem naprogramovány v softwaru systému Dako Link. Příprava činidla není zapotřebí. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 8/40

9 Rakovina prsu Montovací médium Doporučuje se bezvodé, permanentní montážní médium. Vodní montáž je však také přípustná. Pro vodní montáž se doporučují montážní média, jako například Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-touse (kód S3025) nebo Dako Glycergel Mounting Medium (kód C0563). Glycergel před použitím zkapalněte zahříváním na přibližně 40 (±5) C. Postup barvení - prs Poznámky k postupu Uživatel by si měl tyto pokyny pozorně přečíst a před použitím se seznámit se všemi součástmi a nástroji (viz kapitola Bezpečnostní opatření). Nenechejte řezy tkání při procesu barvení nikdy vyschnout. Suché řezy tkání mohou vykazovat zvýšení nespecifického zabarvení. Všechny potřebné kroky a inkubační doby k odstranění parafínu, vyhledání epitopu a barvení jsou předem naprogramovány softwarem systému Dako Link. Podrobné pokyny k programování a vkládání podložních skel a plnění činidel naleznete v uživatelské příručce k systému Dako Automated Link platform(s). Je-li postup barvení přerušen, podložní skla je třeba ponechat v pufrové lázni po inkubaci primární protilátky po dobu až jedné hodiny při pokojové teplotě (20 25 C), aby nebyla ovlivn ěna účinnost barvení. Odstranění parafínu a rehydratace Před barvením musí být podložní skla s tkáněmi zbavena parafínu, aby se odstranilo médium, ve kterém je tkáň zalita, a aby mohla být rehydratována. Zajistěte úplné odstranění parafínu. Přítomnost zbytků zalévacího média způsobí zvýšené nespecifické zabarvení. Tento krok by měl být prováděn při pokojové teplotě (20 25 C). 1. Vložte podložní skla do xylenové lázně a inkubujte 5 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 2. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do bezvodého etanolu na 3 (±1) minuty. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 3. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do 95 % etanolu na 3 (±1) minuty. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 4. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do destilované nebo deionizované vody na minimálně 30 sekund. Začněte postup barvení, jak je popsáno v části Protokol barvení, Vyhledávání epitopu. Roztoky xylenu a alkoholu je nutno vyměnit po 40 podložních sklech. Místo toluenu nebo xylenu lze použít substituty, například Histoclear. POZNÁMKA: Činidla a návody dodané v této soupravě byly navrženy pro optimální účinnost. Další ředění reagencií nebo změna inkubačních teplot může vést k nesprávným nebo nesouhlasným výsledkům. Rozdíly v zpracování tkání a v technických postupech v laboratoři uživatele mohou znehodnotit výsledky studie pro použití vybraných pacientů pro terapii s přípravkem Herceptin. Protokol barvení Všechny potřebné kroky a inkubační doby a barvení jsou předem naprogramovány softwarem systému the Dako Automated Link platforms. Po odstranění parafínu, po rehydrataci a vyhledávání epitopu pracuje přístroj s podložními skly způsobem uvedeným níže. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 9/40

10 Rakovina prsu Krok 1: Vyhledávání epitopu Naplnit nádrž modulu Dako PT Link nebo barvící nádobu, např. nádobu Coplin, roztokem Epitope Target Retrieval Solution (viz příprava reagentu). Nádrž Dako PT Link (Kód PT101 a PT200): Zahřejte naředěný roztok Epitope Target Retrieval Solution v nádrži Dako PT Link na 85 C. Roztok pro vyhledáván í epitopu se po zahřátí zakalí.umístěte řezy vyvážené na pokojovou teplotu, po odstranění parafínu do stojanů na sklíčka barvícího automatu a ponořte sklíčka do předem zahřátého roztoku Epitope Target Retrieval Solution. Nechejte Dako PT Link zahřát na 97 C a inkubujte po dobu for 40 ( ±1) minut při 97 C. Nechejte řezy v nádrži Dako PT Link ochladit na teplotu 85 C. Vyjm ěte nádoby PT Link se řezy z přístroje Dako PT Link. Ponechte nádoby s odkrytým víkem na stole dalších 10 minut chladit. Opláchněte řezy promývacím pufrem. Další informace naleznete v Uživatelské příručce k barvicímu systému Dako PT Link. Nádoby Coplin: Vložte barvicí nádoby obsahující roztok Epitope Retrieval Solution do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a roztok vyhledávání epitopu na C. Roztok pro vyhledávání epitopu se po zahřátí zakalí. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a aby nedocházelo k odpařování. Ponořte řezy vyvážené při pokojové teplotě do předehřátého roztoku Epitope Retrieval Solution v nádobách na barvení. Přiveďte teplotu vodní lázně a roztoku Epitope Target Retrieval Solution zpět na C. Inkubujte 40 (±1) minut při C. Vyjm ěte celou nádobu se sklíčky z vodní lázně. Nechte podložní skla zchladnout v roztoku na vyhledávání epitopu po dobu 20 (±1) minut při pokojové teplotě. Slijte roztok na vyhledávání epitopu a opláchněte řezy v promývacím pufru. Pro docílení optimální účinnosti máčejte řezy v promývacím pufru po dobu 5 20 minut po vyhledávání epitopu a před barvením. POZNÁMKA: Roztok vyhledávání epitopu je určen pouze pro jednu aplikaci. Nepoužívejte opakovaně. Krok 2: Postup barvení Po vyhledání epitopu se podložní skla vyjmou z ponořovacích nádob a umístí se do stojanů na sklíčka Dako Automated Link platforms. Přístroj provede barvící proces přidáním příslušného činidla, sledováním inkubační doby a oplachováním podložních skel mezi jednotlivými přidávanými činidly. Inkubační doby pro činidlo jsou předem naprogramovány v softwaru Dako Link. Step 3: Kontrastní barvivo Podložní skla lze obarvit kontrastním barvivem Hematoxylin (kód SK308) pro Automated Link Platforms. V softwaru Dako jsou k dispozici 2 barvící protokoly. Jeden zahrnuje kontrastní barvení hematoxylinem, druhý nikoliv. Inkubační doba pro hematoxylin je předem naprogramována v protokolu, který zahrnuje kontrastní barvení. Další informace o programovacích protokolech naleznete v uživatelské příručce k systému Dako Automated Link platform(s). Krok 4: Montování Doporučuje se bezvodé, permanentní montážní médium. Vodní montáž je však také přípustná. Vzorky mohou být namontovány a zakryty montážním médiem na bázi vody, například Dako Faramount (kód S3025) nebo Dako Glycergel (kód C0563). POZNÁMKA: Podložní skla lze číst, kdykoli je to vhodné. Pokud jsou však podložní skla po dobu více než jednoho týdne zakryta vodným montážním médiem a vystavena intenzivnímu světlu, může dojít k určitému vyblednutí. Z důvodu minimalizace vyblednutí skladujte podložní skla ve tmě a při pokojové teplotě (20 25 C). Kontrola kvality - prs Odchylky od doporučených postupů fixace tkání, zpracování a zalévání v laboratoři uživatele mohou způsobit výraznou variabilitu výsledků, která si kromě používání podložních skel s kontrolními vzorky dodaných společností Dako navíc vyžádá pravidelné provádění vlastních kontrol. Profesionální uživatelé ve Spojených státech se musí seznámit se směrnicí pro kontrolu kvality College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, viz také CLSI (dříve NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23) a dalšími informacemi uvedenými v referenci 24. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 10/40

11 Rakovina prsu Tabulka 1: Účel každodenní kontroly kvality. Tkáň: Fixována a zpracována jako vzorek pacienta Pozitivní kontrola: Tkáň nebo buňky obsahující antigen, který je třeba detekovat (může se nacházet ve tkáni pacienta). Ideální kontrola je jednou týdně pozitivní barvení tkáně nejcitlivější na degradaci protilátky nebo antigenu. Negativní kontrola: Tkáně nebo buňky, které by měly být negativní (mohou se nacházet ve tkáni pacienta nebo tkáni pro pozitivní kontrolu). Tkáň pacienta Podložní skla s kontrolním vzorkem dodávaná společností Dako. Specifická protilátka a detekční systém Řídí všechny kroky analýzy. Ověřuje reagens a postupy použité pro barvení proteinu HER2. Detekce neplánované křížové reaktivity protilátky s buňkami nebo buněčnými složkami. Detekce specifického zabarvení. Pouze postup kontrolního barvení Nespecifická protilátka* nebo pufr a stejný detekční systém, jako byl použit pro specifickou protilátku Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. * Sérum ze stejných druhů jako specifická protilátka, není však zaměřeno proti stejnému cílovému antigenu. K detekci nespecifické vazby protilátky, např. vazby Fc části protilátky ke tkáni. Podložní sklo s kontrolními vzorky (dodávané) Každé dodané podložní sklo s kontrolními vzorky obsahuje tři slisované linie lidských buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu s hodnotami intenzity zabarvení 0, 1+ a 3+. V každém barvícím cyklu by se mělo barvit jedno podložní sklo. Hodnocení linií buněk na podložních sklech s kontrolními vzorky dodanými společností Dako rozhoduje o platnosti cyklu barvení. Tkáň pro pozitivní kontrolu Kontrolní vzorky by měly být čerstvé fixované vzorky z pitvy/biopsie/operace zpracované a zalité co nejdříve stejným způsobem jako vzorek (vzorky) pacienta. Pozitivní kontroly tkáně jsou známkou správně připravených tkání a použití správných metod barvení. Pro každou sadu testovacích podmínek by měla být v každém cyklu barvení použita jedna tkáň pro pozitivní kontrolu. U tkání použitých pro pozitivní kontroly tkáně by se mělo projevit slabé pozitivní zabarvení, aby mohly tkáně detekovat mírné změny v citlivosti primární protilátky. Podložní skla s kontrolními vzorky dodané s touto soupravou nebo různě zpracované vzorky ze vzorku (vzorků) pacienta ověřují pouze činnost reagencie, ale neověřují přípravu tkáně. Pro tkáň použitou pro pozitivní kontrolu použijte dříve zjištěný protein HER2, 2+ hyperexprimující invazivní (infiltrující) lidskou tkáň karcinomu prsu. POZNÁMKA: Známé tkáně pro pozitivní kontrolu by měly být používány pouze ke sledování správné funkce zpracovaných tkání a testovacích reagencií, NIKOLIV jako pomůcka k formulaci specifické diagnózy vzorků pacienta. Pokud se při pozitivních kontrolách tkáně neprojeví příslušné pozitivní zabarvení, je nutno považovat výsledky pacientových vzorků za neplatné. Tkáň pro negativní kontrolu Při každém barvícím cyklu používejte fixovanou tkáň pro negativní kontrolu (o níž víme, že je protein HER2 negativní) zpracovanou a zalitou identickým způsobem jako vzorek (vzorky) pacienta, aby byla ověřena specificita primární protilátky a aby se projevilo specifické zabarvení pozadí. Tračník, játra nebo štítná žláza jsou vyhovující jako tkáně pro negativní kontrolu. Rozmanitost různých typů buněk, které se nacházejí ve většině řezů tkání, nabízí vnitřní oblasti pro negativní kontrolu (to by měl ověřit uživatel). Normální prsní kanálky mohou sloužit jako vnitřní negativní kontroly. Pokud se objeví specifické zabarvení tkáně pro negativní kontrolu nebo ve vnitřní oblasti tkáně pro negativní kontrolu, je nutné výsledky pacientských vzorků považovat za neplatné a test se musí opakovat. Další informace o programování kontrolních podložních skel naleznete v uživatelské příručce k systému Dako Automated Link platform(s). Nespecifické činidlo pro negativní kontrolu Použijte dodané reagens pro negativní kontrolu místo primární protilátky s řezem každého vzorku pacienta a vyhodnoťte tak nespecifické zabarvení a umožněte lepší interpretaci specifického zabarvení v oblasti antigenu. Inkubační doba reagencie pro negativní kontrolu by měla odpovídat inkubační době primární protilátky. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 11/40

12 Rakovina prsu Ověření testu Před prvním použitím barvicího systému v diagnostické metodě by měl uživatel ověřit funkci testu tak, že jej vyzkouší u několika v laboratoři dostupných tkáních se známou IHC charakteristikou, které představují známé pozitivní a negativní tkáně. Seznamte se s postupy pro kontrolu kvality popsané v této části příbalového letáku a s požadavky pro kontrolu kvality programu CAP Certification Program for Immunohistochemistry nebo CLSI (dříve NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23). Tyto postupy pro kontrolu kvality musí být provedeny vždy, když se změní šarže protilátky nebo když se změní parametry testu. Pro ověření testu jsou vhodné karcinomy prsu se známými intenzitami zabarvení od 0-3+ proteinu HER2 a negativní tkáně, např. tračník, játra nebo štítná žláza. Interpretace zabarvení - prs Pro stanovení hyperexprese proteinu HER2 by měla být vyhodnocována intenzita a vzor pouze membránového zabarvení pomocí škály uvedené v tabulce 2. Vyhodnocení podložních skel by měl provádět patolog pomocí světelného mikroskopu. Pro vyhodnocení imunocytochemického barvení a jeho ohodnocení je vhodné zvětšení objektivu 10x. Použití zvětšení objektivu 20 40x je vhodné pro potvrzení skóre. Cytoplazmatické zabarvení by se mělo považovat za nespecifické zabarvení a nemělo by být zahrnováno do hodnocení intenzity membránového zabarvení (8). Další informace o pomůckách při diferenciaci zabarvení 0, 1+, 2+ a 3+ a reprezentativní obrázky intenzity zabarvení naleznete v HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Příručka k interpretaci zabarvení při testu HercepTest rakovina prsu) společnosti Dako. Hodnoceny by měly být pouze vzorky pacientů s karcinomem prsu. V případě výskytu karcinomu in situ a invazivního karcinomu ve stejném vzorku se hodnotí pouze invazivní komponenta. Tabulka 2: Kritéria intenzity barvení buněčné membrány. Barvící vzor Nebylo pozorováno žádné zbarvení nebo bylo pozorováno membránové zbarvení v méně než 10 % nádorových buněk Nejasné / sotva znatelné membránové zbarvení bylo zjištěno ve více než 10 % nádorových buněk. Buňky byly zabarveny pouze na části své membrány Slabé až střední úplné membránové zabarvení bylo pozorováno ve více než 10 % nádorových buněk Silné úplné membránové zabarvení bylo pozorováno ve více než 10 % nádorových buněk Skóre (Hlášení ošetřujícímu lékaři) Hodnocení hyperexprese proteinu HER2 (Hlášení ošetřujícímu lékaři) 0 negativní 1+ negativní 2+ Slabě pozitivní 3+ Silně pozitivní HercepTest se interpretuje pro hyperexpresi proteinu HER2 jako negativní (intenzita zabarvení 0 a 1+), slabě pozitivní (intenzita zabarvení 2+) a silně pozitivní (intenzita zabarvení 3+). HercepTest není vhodný k poskytování informací o prognóze pacientovi a lékaři a nebyl pro tento účel ověřen. Aby barvící cyklus byl platný a aby bylo možno uskutečnit semikvantitativní zkoušku intenzity zabarvení vzorku tkáně, je třeba podložní skla pro každý barvící cyklus testovat v pořadí uvedeném v tabulce 3. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 12/40

13 Rakovina prsu Tabulka 3: Pořadí hodnocení podložních skel. Pořadí čtení skel 1. Podložní sklo s kontrolními vzorky obsahující tři buněčné linie Zdůvodnění Přítomnost hnědého zabarvení membrány buněk 3+ (proužkování) SK-BR-3 kontrolní buněčné linie 3+, částečné hnědé proužky 1+ MDA- 175 kontrolní buněčné linie a žádné zabarvení 0 MDA-231 kontrolní buněčné linie označuje, že je zkouška platná. V malém až středním počtu buněk slabě pozitivní 1+ MDA-175 kontrolní buněčné linii je přítomno tečkované a nesouvislé membránové zabarvení. V této buněčné linii lze pozorovat také bodové imunologické zabarvené v cytoplazmě Golgiho oblasti. 2. Podložní sklo s tkání pro pozitivní kontrolu 3. Podložní sklo s tkání pro negativní kontrolu 4. Podložní sklo s tkání pacienta zabarvené pomocí činidla pro negativní kontrolu. 5. Podložní sklo s tkání pacienta zabarvené pomocí primární protilátky. Přítomnost hnědého zabarvení v MDA-231 kontrolní buněčné linii 0 (negativní na barvení proteinem HER2) označuje, že během zkoušky zde bylo nespecifické zabarvení. Výsledky zkoušky mohou být v důsledku přílišného zabarvení neplatné. Mělo by se objevit hnědé membránové zabarvení. Zabarvení cytoplazmy a negativních tkání by nemělo být silnější než 1+. NEPŘÍTOMNOST specifického zabarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost křížové reaktivity sady s buňkami / částmi buněk. Pokud se projeví specifické membránové zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Nepřítomnost specifického membránového zbarvení potvrzuje specifické značení cílového antigenu primární protilátkou. Jiné než žlutohnědé nebo hnědé zabarvení vyskytující se v cytoplazmě vzorků zpracovaných činidlem pro negativní kontrolu, například v pojivové tkáni, leukocytech, erytrocytech nebo v nekrotické tkání by se mělo považovat za nespecifické zabarvení pozadí a mělo by být hlášeno v kapitole komentáře v datovém listu. Když je ve vzorku zjištěna hyperexprese proteinu HER2, projeví se to jako hnědé proužky nacházející se na buněčné membráně nádorových buněk zpracovaných primární protilátkou. 1. Podložní sklo s kontrolními vzorky (dodávané): Nejprve je nutné zkontrolovat podložní sklo s kontrolními vzorky zabarvené pomocí HercepTest a ověřit tak správnost funkce všech reagencií. Přítomnost hnědého produktu reakce (3,3 -diaminobenzidin, DAB) na membráně buňky indikuje pozitivní reaktivitu. Přítomnost hnědého zabarvení membrány buněk po celém obvodu (proužkování) v SK-BR-3 kontrolní buněčné linii 3+, částečné hnědé proužky v MDA-175 kontrolní buněčné linii 1+ a žádné zabarvení v MDA kontrolní buněčné linii označuje, že je zkouška platná. Jestliže jakákoli kontrolní buněčná linie neodpovídá těmto kritériím, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. 2. Tkáň pro pozitivní kontrolu: Jako další je třeba zkontrolovat podložní sklo se vzorky pro pozitivní kontrolu. Toto podložní sklo ověřuje, zda fixační metoda a vyhledávání epitopu jsou účinné. K interpretaci výsledků použijte intaktní buňky, protože nekrotické a degenerované buňky se často zabarvují nespecificky (25). Zabarvení by mělo být pozorováno v nádorových buňkách jako hnědé zabarvení membrány buněk. Hnědé zabarvení cytoplazmy a negativních tkání na vzorku by nemělo být silnější než skóre intenzity zabarvení Tkáň pro negativní kontrolu: Tkáň pro negativní kontrolu je nutno otestovat po tkáni pro pozitivní kontrolu, abychom ověřili specificitu značení cílového antigenu primární protilátkou. Nepřítomnost specifického zabarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost křížové reaktivity sady s buňkami / částmi buněk. Pokud se projeví specifické zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Negativní podíly tkání pro pozitivní kontrolu mohou být také použity jako tkáň pro negativní kontrolu, ale toto musí být uživatelem ověřeno. Je třeba mít na zřeteli, že slabou reakci (intenzita zabarvení 0 1+) lze pozorovat u většiny normálních epiteliálních tkání. Vhodné tkáně pro negativní kontrolu zahrnují: tračník, játra a štítnou žlázu. Pokud se vyskytne nespecifické zabarvení, bude difúzní. Sporadické zabarvení pojivové tkáně lze také pozorovat v řezech z tkání příliš fixovaných formalínem Tkáň pacienta: Vzorky pacienta zabarvené během testu HercepTest zkontrolujte jako poslední. Intenzitu pozitivního zabarvení je nutno posuzovat v kontextu jakéhokoli nespecifického zabarvení pozadí reagencií pro negativní kontrolu. Jako u každého imunocytochemického testu, negativní výsledek znamená, že antigen nebyl detekován, nikoli, že antigen není v testovaných buňkách / tkáni přítomen. Další informace o imunoreaktivitě testu HercepTest naleznete v kapitolách Souhrn a vysvětlení, Omezení a Charakteristiky účinnosti. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 13/40

14 Rakovina prsu Další doporučení k interpretaci výsledků barvení během testu HercepTest Většina metastatických karcinomů prsu testovaných na hyperexpresi proteinu HER2 dávala skóre 0 nebo 3+. Zatímco většina těchto případů je zcela jasná, malé procento vzorků s intenzitou 1+ a 2+ se může zdát těžko interpretovatelné. K interpretaci zabarvení pro HercepTest ve vaší laboratoří použijte následující pokyny. 1. K ověření účinnosti zkoušky je třeba vyhodnotit kontrolní buněčné linie. 2. Vyhodnoťte podložní skla pro pozitivní a negativní kontrolu. 3. Pro první vyhodnocení se doporučuje barvení vzorků tkání hematoxylinem a eozinem (H&E). (Nádor nemusí být zjevný, díváte-li se na vzorek barvený testem HercepTest. K ověření přítomnosti nádoru je od patologa vyžadováno podložní sklo barvené pomocí H&E). Test HercepTest je třeba provést na párovém řezu (sériový řez) ze stejného parafínového bloku vzorku. 4. Nejdříve vyhodnoťte řezy barvené na hyperexpresi proteinu HER2 s nejmenším zvětšením. Většina pozitivních případů bude zřetelná již při malém zvětšení.. 5. Ke stanovení procenta pozitivních nádorových buněk je třeba použít dobře uchovávané a barvené oblasti vzorku. 6. Obecně by skóre případů mělo být zjevné při malém zvětšení.. Rozhodujete-li při malém zvětšení případy mezi hodnotami 1+/2+, obvykle je třeba zvolit hodnotu K ověření membránového zabarvení použijte zvětšení objektivu 20 40x. 8. Jestliže většina nádorových buněk vykazuje úplné membránové zabarvení, je skóre barvení 2+ nebo 3+. K potvrzení skóre použijte zvětšení objektivu 20 40x. 9. Je-li většina případů 3+, je nejméně 80 % nádorových buněk zabarveno a membránové zabarvení je silné. 10. Je-li vzorek blízko mezní hodnotě 10 % pozitivních nádorových buněk, doporučuje se ke stanovení procentuální hodnoty zabarvených buněk počítat minimálně 100 nádorových buněk. 11. Je-li úplné membránové zabarvení slabé až střední intenzity ve více než 10 % nádorových buněk, skóre vzorku je 2+. To je obvykle průvodním jevem u neúplného membránového zabarvení většiny zbývajících nádorových buněk. 12. Jestliže méně než 10 % nádorových buněk vykazuje úplné obvodové membránové zabarvení, ačkoliv ostatní nádorové buňky mohou mít neúplné membránové zabarvení, skóre je Skóre 0 je definováno, jestliže méně než 10 % nádorových buněk má úplné nebo neúplné obvodové zabarvení membrány. Všeobecná omezení - prs 1. Imunocytochemie je diagnostický proces obsahující více kroků, který vyžaduje specializované vyškolení ve výběru vhodných reagencií, výběru tkání, fixaci a zpracování; přípravě imunocytochemického podložního skla a interpretaci výsledku zabarvení. 2. Zbarvení tkáně závisí na manipulaci s tkání a na jejím zpracováním před barvením. Nesprávná fixace, zmražení, rozmražení, umývání, sušení, zahřívání, řezání neb kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může vést ke vzniku artefaktů, zachycení protilátky nebo falešně negativním výsledkům. V důsledku kolísavosti fixačních a zalévacích metod nebo v důsledku vnitřních nepravidelností tkáně se mohou vyskytnout nekonzistentní výsledky. 3. Přílišné nebo neúplné kontrastní zabarvení může ohrozit správnou interpretaci výsledků. 4. Klinická interpretace jakéhokoli pozitivního zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být vyhodnocena v kontextu klinického projevu, morfologie a jiných histopatologických kritérií. Klinická interpretace jakéhokoli zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být doplněna morfologickými studiemi a řádnými kontrolami a také dalšími diagnostickými testy. Za interpretaci barveného preparátu zodpovídá kvalifikovaný patolog, který zná použité protilátky, reagencie a použité metody. Barvení se musí provádět v certifikované, licencované laboratoři s příslušným oprávněním a pod dohledem patologa zodpovědného za hodnocení barvených podložních skel a zaručení adekvátnosti pozitivních a negativních kontrol. 5. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy B, které obsahují povrchový antigen (HBsAg) hepatitidy B, mohou s křenovou peroxidázou vykazovat nespecifické zabarvení (26). 6. Reagencie mohou vykazovat neočekávané reakce v dříve netestovaných typech tkání. Možnost neočekávaných reakcí ve skupinách testovaných tkání nelze zcela vyloučit v důsledku biologické variability exprese antigenu v novotvarech nebo jiných patologických tkáních (27). Se zdokumentovanými neočekávanými reakcemi se obraťte na technickou podporu společnosti Dako. 7. Falešně pozitivní výsledky se mohou vyskytovat v důsledku neimunologické vazby proteinů nebo produktů reakce se substrátem. Mohou být také způsobeny aktivitou pseudoperoxidázy (erytrocyty) a endogenní aktivitou peroxidázy (cytochrom C) (27). 8. Postup barvení se provádí při předem naprogramované teplotě v rozmezí (20 25 C). ( ) P04456CZ_01_SK / str. 14/40

15 Rakovina prsu Omezení specifická pro tento výrobek - prs Charakteristiky účinnosti - prs 1. Antigen přítomný v MDA-175 kontrolní buněčné linii1+ může být po určité době degradován. Posuzujte výsledky podložních skel s kontrolními vzorky ve spojení s datem exspirace podložních kontrolních skel. Negativní zabarvení buněk MDA-175 může znamenat pouze degradaci podložních skel s kontrolními vzorky. Podložní skla s kontrolními vzorky musí být skladována při 2 8 C. 2. Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny degradací antigenu v tkáních, ke které může po určité době docházet. Vzorky by měly být barveny do 4 6 týdnů od montáže tkání na podložní skla, pokud jsou skladovány při pokojové teplotě (20 25 C) (28). 3. Nenahrazujte reagencie soupravy reagenciemi z jiných čísel šarží nebo ze souprav od jiných výrobců. 4. Z hodnocení cytoplazmatického zabarvení by se mohly získat falešně negativní výsledky. Při interpretaci výsledků posuzujte pouze intenzitu membránového zabarvení. 5. Barvení linií kontrolních buněk by mělo být použito pouze pro ověření postupu barvení a nemělo by se používat pro hodnocení reakce barvení v tkáňových řezech. 6. Silné fokální zabarvení (3+), tj. občas lze pozorovat aktivní body To může být výsledek nerovnoměrné fixace nebo zpracování tkáně. Doporučuje se imunologické barvení druhého tkáňového bloku ze stejného vzorku. 7. Použití testu HercepTest na vzorcích fixovaných jinými fixačními prostředky než neutrálním pufrovaným formalínem nebo Bouinovým fixativem dosud nebylo ověřeno. 8. Normální epitel v prsní tkáni by se měl barvit mezi 0 a 1+. Je-li pozorováno barvení normálního epitelu výše než 1+, test je třeba opakovat. Připomínáme, že normální epitely tonzily a jícnu se mohou zabarvit až do intenzity 2+. Pozadí Klinické studie (CTA) použité k vyhledání vhodných pacientů pro klinické studie s přípravkem Herceptin sloužily hodnotícím účelům a již nejsou k dispozici. Test HercepTest byl vyvinut za účelem porovnání se studií CTA. Bezpečnost účinnosti Herceptin byla hodnocena v náhodně uskutečněné klinické studii a v rozsáhlé, veřejné studii (Viz příbalový leták k výrobku Herceptin ). Všichni pacienti vybraní do klinických studií s přípravkem Herceptin vykázali během imunocytochemického testování provedeného pomocí CTA v centrální laboratoři hyperexpresi proteinu HER2. Pacienti byli shledáni vhodnými pro léčbu Herceptinem, jestliže jejich nádor vykazoval úroveň hyperexprese proteinu HER2 2+ nebo 3+ (hodnoceno škálou 0-3+, přičemž 3+ představuje nejvyšší úroveň). Podskupina analýz výsledku z těchto studií dává předpoklad, že pacienti, jejichž tkáně jsou silně pozitivní (3+) na hyperexpresi proteinu HER2 mohou mít z léčby přípravkem Herceptin větší přínosy, než pacienti, jejichž tkáně jsou slabě pozitivní (2+). Stupeň hyperexprese proteinu HER2 je potencionálně důležitým prediktorem účinnosti léčby přípravkem Herceptin. Protože žádný z pacientů účastnící se studie s přípravkem Herceptin nebyl vybrán pomocí HercepTest, korelace mezi stupněm pozitivity a pravděpodobností přínosu léčby přípravkem Herceptin není známa. Srovnávací studie K specifikaci testu HercepTest byly provedeny dvě studie. 1) Srovnání s klinickou výzkumnou studií (CTA). 2) Kontrola přesnosti srovnáním s pěti dalšími studiemi. Srovnání s klinickou výzkumnou studií (CTA) K identifikaci vhodných pacientů pro léčbu přípravkem Herceptin byl porovnán HercepTest se studií CTA, bylo použito 274 na protein HER2 pozitivních (2+ nebo 3+) a stejný počet na protein HER2 negativních vzorků rakovinných tkání prsu Tabulka 4 ukazuje výsledky v diagramu 2 x 2, přičemž hodnoty 0 a 1+ byly považovány za negativní a 2+ a 3+ byly pozitivní. Tabulka 4: Shoda 2 x 2 testu HercepTest a klinické výzkumné studie (CTA) (počet vzorků). Klinická výzkumná studie pozitivní negativní Celkem HercepTest pozitivní negativní Celkem Shoda: 79 % (76 82 %) 95 % interval spolehlivosti. Celková binární shoda testu HercepTest se studií CTA byla 79 % (431/548), s 95 % dvoustranným intervalem spolehlivosti %. Dvacet jedna procent (21 %) výsledků bylo u těchto dvou metod nesouhlasných. Výsledky testu HercepTest se hodnotí škálou 0-3+ a interpretují se jako negativní na hyperexpresi proteinu HER2 (intenzita zabarvení 0 a 1+), slabě pozitivní (intenzita zabarvení 2+) a silně pozitivní (intenzita zabarvení 3+). ( ) P04456CZ_01_SK / str. 15/40

16 Rakovina prsu Tabulka 5: Shoda 3 x 3 testu HercepTest a klinické výzkumné studie (CTA). Klinická výzkumná studie Celkem HercepTest Celkem Shodný projev 3 x 3 znamená, že hodnota 3+ u testu HercepTest s vysokou pravděpodobností odpovídá pozitivnímu výsledku ve studii CTA, což odpovídá kriteriím zadání pro zkoušku s Herceptinem (2+ nebo 3+). Výskyt hodnoty 2+ v testu HercepTest nekoreluje také s výsledky studie CTA. Asi 42 % (53/126) výsledků 2+ testu HercepTest bylo negativních za použití CTA (0 1+), což nedovoluje zařazení do klinických zkoušek s Herceptinem. Věrohodnost HercepTest byl rovněž testován na 2 mikroskopických sklech obsahujících tkáňové řezy zalité v parafínu ze 168 nádorů prsu. Nádory byly již specifikovány pomocí pěti různých metod ke stanovení amplifikace genu HER2 a hyperexprese proteinu HER2, včetně testu Southern blot v laboratoři uživatele, fluorescence in situ hybridizace (FISH) pro amplifikaci DNA, analýz RNA pomocí Northern blot, testu Western blot a imunocytochemie (ICC) na zmražených tkáních (28). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. Tabulka 6: Porovnání testu HercepTest a sloučených výsledků (OE) z testů genové amplifikace a hyperexprese proteinu HER2. Klasifikace referenčních OE + - Celkem HercepTest Shoda v pozitivitě 43/69 = 62 % Shoda v negativitě: 99/99 = 100 % Celkem Výsledky vykazují 85 % (142/168) úroveň shody (95 % interval spolehlivosti %) mezi pozitivitou (2+ a 3+) a negativitou (0 a 1+) intenzity barvení pomocí testu HercepTest. Žádný ze vzorků negativních v 5 různých metodách nebyl pozitivní v testu HercepTest, přičemž sloučené výsledky těchto 5 různých metod vykázaly vyšší počet pozitivních případů. Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost intra-run Reprodukovatelnost intra-run byla testována v jedné laboratoři s 5 vzorky různých hodnot ICC intenzity zabarvení. Každý vzorek byl spouštěn trojmo v randomizované a zaslepené úpravě. Protokol je určen pro automatické barvení. Všechny vzorky vykázaly 100 % opakovatelné výsledky. Reprodukovatelnost inter-run (mezi cykly) Reprodukovatelnost inter-run testovali ve třech laboratořích po dobu 4 dnů s 5 randomizovanými a zaslepenými vzorky různých hodnot intenzity barvení ICC pomocí automatizované metodologie. Vynikající reprodukovatelnost byla zjištěna, co se týče pozitivních versus negativních výsledků (0 a 1+ versus 2+ ad 3+) s výjimkou dvou vzorků v jedné laboratoři, které se pohybovaly mezi 1+ a % reprodukovatelnost byla u vzorků 2+ a 3+. Mezilaboratorní reprodukovatelnost Reprodukovatelnost mezi laboratořemi byla testována ve třech geograficky oddělených laboratořích s 40 stejnými randomizovanými a zaslepenými vzorky různých hodnot ICC zabarvení. Čerstvé řezy byly odeslány do jednotlivých testovacích laboratoří za účelem automatického barvení a vyhodnocení patologem. Procentuální shoda se mezi laboratořemi pohybovala od 83 % do 90 % u dichotomického určení pozitivní/negativní, kde 0 byla negativní a 2+ a 3+ byly pozitivní na hyperexpresi proteinu HER2. V porovnání s výsledky dosaženými v referenční laboratoři prostřednictvím studie CTA, bylo 12,5 % (15/120) porovnávaných výsledků odlišných u určení negativní (0 nebo 1+) a pozitivní (2+ nebo 3+). Dále bylo 10 % (12/120) odlišných případů mezi hodnotami 2+ a 3+. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 16/40

17 Rakovina prsu Imunoreaktivita Tabulka 7 shrnuje imunoreaktivitu testu HercepTest s doporučeným panelem normálních tkání. Všechny tkáně byly fixovány formalínem, zality v parafínu a barveny protilátkou HercepTest podle pokynů uvedených v příbalovém letáku. Tabulka 7. Shrnutí reaktivity HercepTest u normálních tkání. Typ tkáně (počet testovaných) Tkáň nadledvinek (3) Kostní dřeň (3) Mozek/Cerebellum (3) Mozek/Cerebrum (3) Prsní tkáň (3) Děložní čípek (3) Tlusté střevo (3) Jícen (3) Srdce (3) Ledviny (3) Játra (3) Plíce (3) Buňky mezotelu (3) Vaječníky (3) Pankreas (3) Příštítná tělíska (3) Periferní nerv (3) Hypofýza (3) Prostata (3) Slinná žláza (3) Kosterní sval (3) Kůže (3) Tenké střevo (3) Slezina (3) Žaludek (3) Varle (3) Brzlík (3) Štítná žláza (3) Tonzila (3) Děloha (3) Zabarvení pozitivního prvku tkáně a vzor zabarvení Prsní žláza (2 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk) Epiteliální buňky (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk, membrána a cytoplazma, granulární) Epiteliální buňky folikulu (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk, membrána a cytoplazma) Skvamózní epitel (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk. 2 ze 3 tkání, intenzita barvení 2+, % buněk, membrána a cytoplazma) Endometriální tkáň (2 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, % buněk, cytoplazma, granulární) Zaznamenané zabarvení ve všech tkáních bylo membránové, pokud není uvedeno jinak. Všechny tři vzorky z každého typu tkáně měly stejnou intenzitu zabarvení, pokud není uvedeno jinak. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 17/40

18 Rakovina prsu Řešení problémů - prs Informace o dalších řešeních naleznete v již zmiňované příručce (19) společnosti Dako v části Řešení problémů nebo se obraťte na technickou podporu společnosti Dako a nahlaste neobvyklé zabarvení. Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 1. Nedochází k 1a. Chyba programování. 1a. Zkontrolujte protokol podložního barvení Činidla nejsou použita skla a ověřte, zda byt zvolen podložních skel. ve správném pořadí. správný program. 1b. Azid sodný v promývacím 1b. Používejte pouze Dako Wash 2. Podložní skla jsou slabě zabarvena. roztoku. 1c. Nadměrné zahřívání namontovaných tkáňových řezů před deparafinací a tepelně indukovaném vyhledávání antigenu může vést ke ztrátě viditelné HER2 imunoreaktivity. 2a. Nepřiměřené vyhledávání epitopu. 2b. Nepřiměřené inkubační doby činidel. 2c. Byl použit nevhodný způsob fixace. 2d. Nadměrné zahřívání namontovaných tkáňových řezů před deparafinací a tepelně indukovaným vyhledávání antigenu může způsobit výrazné snížení viditelné HER2 imunoreaktivity. Buffer, kód S c. Nechejte tkáňové řezy uschnout na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin nebo až do jejich uschnutí. Alternativně je možné je sušit přes noc při 37 C nebo při 60 C po dobu maximálně jedné hodiny. Sušení tkáňových řezů při zvýšené teplotě se smí provádět pouze v kalibrované troubě s rovnoměrným rozložením tepla (17). 2a. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda bylo použito správné vyhledávání epitopu. 2b. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda byly doby inkubace činidel správné. 2c. Zkontrolujte, zda není tkáň pacienta příliš fixována a zda je použit schválený fixační prostředek. 2d. Nechejte tkáňové řezy uschnout na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin nebo až do jejich uschnutí. Alternativně je možné je sušit přes noc při 37 C nebo při 60 C po dobu maximálně jedné hodiny. Sušení tkáňových řezů při zvýšené teplotě se smí provádět pouze v kalibrované troubě s rovnoměrným rozložením tepla (17) 3. Přílišné zabarvení pozadí podložních skel. 4. Tkáň se odděluje od podložních skel. 2e. Bylo aplikováno nedostatečné množství činidla. 2e. Zkontrolujte velikost tkáňového řezu (22 mm x 22 mm) a množství aplikovaného činidla. 3a. Parafín není zcela odstraněn. 3a. Používejte čerstvé čisticí roztoky. 3b. K montáži řezů na podložní skla byly použity škrobové přísady. 3c. Podložní skla nejsou důkla ně opláchnutá. 3d. Při barvení došlo k vysušení řezů. 3e. Byl použit nevhodný způsob fixace. 3f. Nespecifická vazba činidel k káni. 4a. Použití nesprávných podložních skel. 3b. Pro lepení řezů na podložní skla nepoužívejte žádné přísady. Mnohé přísady jsou imunoreaktivní. 3c. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda byla podložní skla řádně opláchnuta. 3d. Zkontrolujte, že se na skla nanáší odpovídající objem činidla. 3e. Zkontrolujte, zda bylo použito doporučené fixativum. Jiná fixativa mohou zapříčinit přílišné zabarvení pozadí. 3f. Zkontrolujte, zda je vzorek dobře fixován nebo zda se u něj nevyskytuje nekróza. 4a. Používejte silanizovaná podložní skla, například Dako Silanized Slides, (kód S3003), SuperFrost Plus nebo poly-l-lysinem potažená podložní skla. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 18/40

19 Rakovina prsu Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 5. Příliš silné specifické 5a. Byl použit nevhodný způsob 5a. Dohlédněte, aby byly použity pouze zabarvení. fixace. schválené způsoby fixace. 5b. Inkubační doby činidel jsou 5b. Zkontrolujte protokol podložního příliš dlouhé. skla a ověřte, zda byly doby inkubace činidel správné. 5c. Byl použit nevhodný pufrový 5c. Používejte pouze Dako Wash roztok. Buffer, kód S Slabé zabarvení podložního skla s kontrolní linií buněk Roztok pro vyhledávání epitopu se po zahřátí zakalí. 8. Roztok pro vyhledávání epitopu je po uchovávání kalný (před zahřáním). 6a. Následoval esprávný protokol vyhledávání epitopu. 6b. Neproběhla reakce s roztokem subs rát-chromogenu (DAB). 6c. Degradace podložního skla s kontrolním vzorkem. 6a. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda bylo použito správné vyhledávání epitopu. 6b. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda byl správně připraven chromogen. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda byly doby inkubace chromogenu správné. 6c. Zkontrolujte datum expirace soupravy a podmínky pro skladování soupravy vytištěné na obalu. 7. Po zahřátí se roztok zakalí. 7. To je normální a nemá to žádný vliv na kvalitu zabarvení. 8. Roztok byl uchováván nesprávně nebo vypršelo datum jeho použitelnosti. 8. Zkontrolujte datum exspirace soupravy a podmínky pro uchovávání soupravy vytištěné na obalu. Roztok pro vyhledávání epitopu zlikvidujte. POZNÁMKA: Pokud nelze za příčinu problému považovat žádnou z uvedených příčin nebo pokud se nepodaří problém doporučeným postupem vyřešit, obraťte se s žádostí o pomoc na technickou podporu společnosti Dako. Další informace o technikách barvení a přípravě vzorků naleznete v již zmiňované příručce společnosti Dako (19) (k dispozici ve společnosti Dako) Atlas of Immunohistology (29) a Immunoperoxidase Techniques. Practical Approach to Tumor Diagnosis (Praktický přístup k diagnóze nádorů) (30). ( ) P04456CZ_01_SK / str. 19/40

20 Rakovina žaludku Souhrn a vysvětlení - žaludek Pozadí Lidský gen HER2 (rovněž nazýván jako ERBB2 nebo NEU) kóduje protein často označovaný jako protein HER2 nebo p185 HER2. Protein HER2 je membránový tyrozinkinázový receptor s homologií s receptorem epidermálního růstového faktoru (EGFR nebo HER1) (1-8). Protein HER2 je normální komponenta, exprimována mnoha typy epiteliálních buněk (8). Nadměrná exprese proteinu HER2 a amplifikace genu HER2 v rakovině žaludku byla prokázána v řadě studií (31). Pozitivitu HER2 je možné prokázat buď metzodou IHC nebo FISH u 20 % pacientů (31). Předklinické studie in vitro a in vivo prokázaly, že trastuzumab (Herceptin ) je účinný u různých typů rakoviny žaludku, a proto jejich výsledky vedly k zahájení několika klinických studií (31-35). Ve studii BO18255, ToGA, fáze III, byli HER2-pozitivní pacienti s inoperabilním, lokálně pokročilým, rekurentním a/nebo metastazujícím adenokarcinomem žaludku nebo gastroezofageální junkce randomizováni do skupin léčených 5-FU nebo kapecitabinem a cisplatinou, buď v monoterapii, nebo v kombinaci s trastuzumabem. Statisticky významný přínos vyjádřený celkovou dobou přežití (overall survival, OS) byl prokázán u pacientů léčených kombinovanou léčbou trastuzumabem a chemoterapií (36, 37). Herceptin (trastuzumab) je lidská monoklonální protilátka (10), která se vysokou afinitou váže na protein HER2 a prokázalo se, že inhibuje proliferaci lidských rakovinných buněk nadměrně exprimujících protein HER2 in vitro a in vivo (32-35). Charakteristiky Kvůli zařazení do studie ToGA byl stav HER2 ověřen u 3803 pacientů. V této studii byla hodnocena overexprese proteinu HER2 pomocí IHC (HercepTest, Dako) a amplifikace genu HER2 metodou FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako). Platných výsledků testu bylo dosaženo u 3665 vzorků testovaných buď pomocí IHC, nebo metodou FISH a u 3280 vzorků testovaných oběma metodami. Výsledky studie ToGA ukázaly, že 22,1 % pacientů s pokročilým karcinomem žaludku bylo podle stanovení metodou IHC nebo FISH HER2-pozitivních, a to podle definice kritérií výběru ToGA HER2 (37). Více informací ohledně použití výrobku HercepTest při hodnocení pacientů, u kterých je zvažována léčba trastuzumabem, naleznete v příbalové informaci pro Herceptin. Princip metody - žaludek HercepTest obsahuje činidla potřebná pro úplnou imunocytochemickou metodu barvení ve dvou krocích pro vzorky zpracované běžným způsobem, zalité v parafínu. Po inkubaci primární králičí protilátkou proti lidskému proteinu HER2 využívá tato souprava předem připravené vizualizační reagens Visualization Reagent založené na dextranové technologii. Toto reagens obsahuje molekuly sekundárního kozího anti-králičího imunoglobulinu i molekuly křenové peroxidázy navázané na společný hlavní řetězec dextranového polymeru, a tak eliminuje nutnost sekvenční aplikace vazby protilátky a konjugátu peroxidázy. Křížová reakce vizualizačního reagens s lidskými imunoglobuliny a s fetálním telecím sérem byla odstraněna absorpcí v pevné fázi. Enzymatická přeměna následně přidaného chromogenu vede k vytvoření viditelného reakčního produktu v místě antigenu. Vzorek pak lze obarvit kontrastním barvivem a zakrýt krycím sklíčkem. Výsledky se pak interpretují pomocí světelného mikroskopu. Podložní skla s kontrolními vzorky obsahují k vyhodnocení barvících cyklů tři linie lidských buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu s hodnotami intenzity zabarvení 0, 1+ a 3+. Intenzita zabarvení těchto linií buněk koreluje s počtem receptorů na jednu buňku. HercepTest for Automated Link Platforms, kód SK001 je určen pro automatické barvení se systémem Automated Link Platforms. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 20/40

21 Rakovina žaludku Dodané materiály - žaludek Kód SK001 Materiály v níže uvedeném seznamu postačí na 50 testů (50 podložních skel inkubovaných primární protilátkou na protein HER2 a 50 podložních skel inkubovaných odpovídající reagencií pro negativní kontrolu). Počet testů vychází z použití 200 µl na jeden tkáňový řez (22 mm x 22 mm) pro každé činidlo, s výjimkou vyhledávacího roztoku epitopu. Kit obsahuje dostatek materiálů na maximálně 10 samostatných cyklů barvení. Množství Popis 1 x 22 ml HercepTest Peroxidase-Blocking Reagent 3 % peroxid vodíku s obsahem 15 mmol/l azidu sodného (NaN 3). 1 x 12 ml HercepTest Rabbit Anti-Human HER2 Protein Afinitně izolovaná protilátka k okamžitému použití. Dodává se v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mol/l NaN 3, ph 7,2, který obsahuje stabilizující protein Imunogen: Syntetický C-koncový fragment (intracytoplazmatická část) proteinu HER2 navázaný na KLH (keyhole limpet hemocyanin). Specificita: protein HER2. Purifikační metoda: Protilátka je afinitně izolovaná pomocí imobilizovaného peptidu proteinu HER2. 1 x 22 ml HercepTest Visualization Reagent Dextranový polymer konjugovaný s křenovou peroxidázou a afinitně izolovanými kozími anti-králičími imunoglobuliny. Dodává se v Tris-HCl pufru, který obsahuje stabilizující protein a antimikrobiální činidlo. 1 x 10 ml HercepTest Negative Control Reagent Imunoglobulinová frakce normálního králičího séra při odpovídající koncentraci proteinu jako primární protilátka k proteinu HER2. Dodává se v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mol/l NaN 3, ph 7,2, který obsahuje stabilizující protein 2 x 22 ml HercepTest DAB Substrate Buffer Substrátový pufrový roztok, ph 7,5, který obsahuje < 0,1 % peroxidu vodíku, stabilizátory, posilovače a antimikrobiální prostředek. 1 x 1 ml HercepTest DAB Chromogen 5 % 3,3'-diaminobenzidin v tetrahydrochloridovém chromogenovém roztoku. 3 x 500 ml HercepTest Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x) 0,1 mol/l citrátový pufr s detergentem. 2 x 5 podložní skla HercepTest Control Slides Každé podložní sklo obsahuje tři linie buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu představující různé úrovně exprese proteinu HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) a SK-BR-3 (3+). Podložní skla s kontrolními vzorky byla tepelně opracována, aby se zlepšila přilnavost vzorků ke sklům. Každé další tepelné zpracování podložních skel s kontrolními vzorky za účelem zlepšení přilnavosti řezů ke sklům může ohrozit výsledky barvení. 10 x lahví Láhev plnitelná činidly uživatele, obsah 12 ml Každá láhev pojme 12 ml činidla. Láhve se používají pro smíchávání a přidávání roztoku substrát-chromogenu (viz část Příprava činidla). Dodáváno jednotlivě baleno. POZNÁMKA: Všechny reagenty jsou speciálně připraveny pro použití s tímto testem. Aby test odpovídal uvedené specifikaci, nelze používat žádné substituty. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 21/40

22 Rakovina žaludku Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky - žaludek Promývací pufr, Dako, kód S3006 Kontrastní barvivo: Hematoxylin, například Hematoxylin for Automated Link Platforms (kód SK308) Krycí sklíčka Destilovaná nebo deionizovaná voda Sušička, schopná udržovat teplotu nejvýše 60 C Etanol, bezvodý a 95 % Světelný mikroskop (zvětšení objektivu 4 40x) Montážní médium, například Dako Faramount (kód S3025) nebo Dako Glycergel (kód C0563) Pozitivní a negativní tkáně k použití pro kontrolu průběhu (viz část Kontrola kvality) Podložní skla SuperFrost Plus, potažená poly-l-lysinem nebo Dako Silanized Slides (kód S3003) Xylen, toluen nebo substituty xylenu SK001 je určen k použití se systémem Dako Automated Link platforms. Další informace naleznete v uživatelské příručce k systému Dako Automated Link platforms. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 22/40

23 Rakovina žaludku Bezpečnostní opatření - žaludek 1. K použití v diagnostice in vitro. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN 3), který je v čisté formě vysoce toxický. Přestože se koncentrace azidu sodného ve výrobku neklasifikuje jako nebezpečná, mohou usazeniny NaN 3 reagovat s olovem a mědí v odpadním potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy těchto kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množství vody, aby nedocházelo k usazování azidů v potrubí (21). 4. HercepTest činidlo blokující peroxidázu obsahuje 3 % peroxid vodíku. Bezpečnostní list pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. 5. HercepTest králičí anti-lidský protein HER2, HercepTest vizualizační činidlo a HercepTest činidlo pro negativní kontrolu obsahují materiál živočišného původu. 6. Jako u každého výrobku biologického původu je nutno dodržovat řádná bezpečnostní opatření. 7. S biologickými vzorky před a po fixaci a se všemi ostatními materiály, které s nimi přijdou do styku, je nutno manipulovat jako s potenciálně infekčním materiálem a je nutno je likvidovat s souladu s bezpečnostními opatřeními (22). Nikdy nenabírejte reagencie do pipety ústy a zamezte kontaktu reagencií a vzorků s kůží a sliznicemi. Jestliže se reagencie dostanou do kontaktu s citlivými oblastmi, omyjte je dostatečným množstvím vody. 8. Minimalizujte mikrobiální kontaminaci činidel, jinak by mohlo dojít k zvýšení nespecifického zabarvení. 9. Nedodržení inkubační doby, teploty nebo metody může vést k chybným výsledkům. Nadměrné sušení po dobu delší než jedna hodina při teplotě 60 C m ůže způsobit výrazné snížení nebo ztrátu specifické, s HER2 související, imunoreaktivity (17). 10. Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může způsobit ztrátu zabarvení antigenu. 11. Všechny reagenty jsou speciálně připraveny pro použití s tímto testem. Aby test odpovídal uvedené specifikaci, nelze používat žádné substituty. 12. HercepTest Visualization Reagent a HercepTest chromogen DAB mohou být v případě vystavení působení intenzivního světla negativně ovlivněny. Neskladujte složky systému ani neprovádějte barvení při silném světle, například při přímém slunečním světle. 13. Za účelem přesné interpretace výsledků s HercepTest na obarvených vzorcích adenokarcinomu žaludku, včetně gastroezofageálního spojení z biopsie, se doporučuje použít shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk. Shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk sestává z 5 propojených nádorových buněk obarvených na HER Vzhledem k heterogenní povaze vzorků rakoviny žaludku z biopsie, je pro docílení věrohodného výsledku potřeba provést HER2 IHC testování na vzorcích biopsie z více (7 8) oblastí nádoru. 15. Doporučuje se testovat více než jeden tkáňový blok z resekce rakoviny žaludku, pokud vzorek vykazuje vysokou heterogenitu (40). 16. Používejte odpovídající osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. 17. Nespotřebované roztoky je nutno likvidovat v souladu s místními a celostátními předpisy. 18. Bezpečnostní list pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. 19. Použití jiných než doporučených objemů činidel může mít za následek ztrátu viditelnosti imunologické reakce HER2. Tkáňové řezy větší než 22 mm x 22 mm potřebují aplikovat 2 3x 200 µl činidla na 2 3 automatické aplikační oblasti. 20. HercepTest chromogen DAB obsahuje 1 5 % 3,3 -diaminobenzidin tetrahydrochloridu (bifenyl-3,3,4,4 - tetrayltetraammonium tetrachlorid) a je označen: Nebezpečí H350 Může vyvolat rakovinu. H341 Podezření na genetické poškození. P201 Před použitím si obstarejte speciální instrukce. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. P308 + P313 PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. P405 Skladujte uzamčené. P501 Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. 21. Rezidua parafínu mohou vést k falešně negativním výsledkům. Práce s tímto výrobkem není obecně povolena osobám mladším 18 let. Uživatelé musí být řádně proškoleni co se týče správného pracovního postupu, nebezpečných vlastností produktu a nutných bezpečnostních opatření (podle Směrnice EU 94/33/EC). Další informace najdete v příslušném Bezpečnostním listu (SDS). USA: 3,3 -diaminobenzidin (DAB) může být zdraví škodlivý při vdechování, styku s kůží a při požití. Materiál poškozuje oči a pokožku. Pokud dojde ke kontaktu s pokožkou, opláchněte postižené místo vodou a mýdlem. POZNÁMKA: Ačkoliv diaminobenzidin je strukturou příbuzný benzidinu, nebylo hlášeno, že diaminobenzidin má rakovinotvorné vlastnosti. Při likvidaci postupujte v souladu s místními a celostátními předpisy. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 23/40

24 Rakovina žaludku Skladování - žaludek Příprava vzorku - žaludek Pokud se nepoužívá na automatizovaných přístrojích Automated Link Platforms výrobce Dako, uchovávejte při 2 8 C. Výrobky HercepTest Peroxidase-Blocking R eagent, HercepTest Visualization Reagent, HercepTest DAB Substrate Buffer a HercepTest DAB Chromogen uchovávejte v temnu při 2 8 C. Nepoužívejte soupravu po datu exspirace vytištěném na obalu. Pokud se reagencie skladují za jiných podmínek, než jaké jsou uvedeny v příbalovém letáku, musí uživatel provést jejich kontrolu (14a, 14b). Pamatujte, že podložní skla s kontrolními vzorky musí být rovněž skladována při 2 8 C. Neexistují žádné známky toho, že by tyto produkty byly nestabilní. Proto je nutno provádět pozitivní a negativní kontroly současně s pacientovými vzorky. Pokud zpozorujete neočekávané zabarvení, které nelze vysvětlit změnami laboratorních postupů a máte podezření, že se jedná o problém s látkou HercepTest, obraťte se na technickou podporu společnosti Dako. Se vzorky s adenokarcinomem žaludku, včetně gastroezofageálního spojení z biopsie, excize a resekce, je nutno nakládat tak, aby byla zachována tkáň pro imunocytologické barvení. U všech vzorků by se měly používat standardní způsoby zpracování tkáně (15). Při testování malých vzorků biopsie zajistěte pro hodnocení IHC intaktní morfologii nádoru a přítomnost dostatečného množství nádorových buněk. Jestliže se provádí analýza s HercepTest na vzorcích biopsie, je pro docílení věrohodného výsledku stavu HER2 potřeba analyzovat vzorky biopsie z více (7-8) oblastí nádoru. Řezy zalité v parafínu Pouze tkáně uchovávané v neutrálním pufrovaném formalínu a zalité v parafínu jsou vhodné k použití. Řezy by se měly nařezat do bloků o tloušťce 3 nebo 4 mm a měly by se fixovat po dobu hodin v neutrálním pufrovaném formalínu. Ve studii ToGA byly vzorky z biopsie fixovány po dobu 6 8 hodin (odkazy na studii, viz (36)). Tkáně se potom dehydrují v řadě alkoholů a xylenu a potom jsou napuštěny rozpuštěným parafínem a skladovány při teplotě ne více než 60 C. Řádně fixované a zalité tkáně exprimující protein HER2 vydrží před řezáním a montáží na podložní sklo neurčitou dobu, pokud se skladují na chladném místě (15 25 C) (15,16). Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988 (Zákon o zdokonalení klinických laboratoří z roku 1998) od profesionálních uživatelů ve Spojených státech vyžaduje v 42 CFR (b) aby bylo dodrženo následující: Laboratoř musí uchovávat barvená podložní skla nejméně 10 let od data testu a bločky vzorků nejméně dva roky od data testu (16). Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce 4 5 µm, namontovat na podložní skla a usušit na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin (nebo až do jejich uschnutí) nebo při 37 C p řes noc nebo při 60 C po dobu jedné hodiny. UPOZORNĚNÍ: Nadměrné zahřívání po dobu delší než jedna hodina při teplotě 60 C může způsobit výrazné snížení nebo ztrátu specifické, s HER2 související, imunoreaktivity (17). V zájmu zachování antigennosti se musí řezy tkání namontované na podložních sklech (SuperFrost Plus, Poly- L-lysine nebo silanizovaná skla) barvit do 4 6 týdnů od nařezání, pokud se skladují při pokojové teplotě (20 25 C) (18). Podložní skla požadovaná pro vyhodnocení HER2 a ověření přítomnosti nádoru se musí připravovat současně Doporučuje se vytvořit minimálně 5 podložních skel, 1 sklo pro přítomnost tumoru, 2 skla pro vyhodnocení proteinu HER2 (jedno sklo pro inkubaci s králičím anti-lidským proteinem HER2 a jedno sklo pro činidlo pro negativní kontrolu) a 2 záložní skla. V zájmu zachování antigennosti se musí řezy tkání namontované na podložních sklech (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine nebo silanizovaná skla) barvit do 4 6 týdnů od nařezání, pokud se skladují při pokojové teplotě (20 25 C) (18). Použití testu HercepTest u odvápněných tkání dosud nebylo ověřeno a nedoporučuje se. Další podrobné informace o přípravě vzorků naleznete v dokumentu společnosti Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods" (19) a v odkazech 15 a 16. Zpracování tkání před barvením Pro optimální účinnost zkoušky musí být použita metoda vyhledávání specifického epitopu v 0,01 mol/l citrátovém pufru. Vyhledávací roztok epitopu je dodáván v soupravě HercepTest. Tato metoda zahrnuje zahřívání řezů tkání namontovaných na podložních sklech, které se ponořují do 0,01 mol/l citrátového pufru (20) v kalibrované vodní lázni nebo na Dako PT Link (Kód PT101 a PT200) při požadované teplotě (95 99 C). Laboratoře, umístěné ve vyšších nadmořských výškách, musí stanovit optimální metodu udržování potřebné teploty. Byly testovány další metody vyhledávání epitopu, ale nepřinesly reprodukovatelné výsledky. Odchylky od opsaného postupu mohou vést k nesprávným výsledkům. Příprava činidla - žaludek Je vhodné připravit před barvením následující činidla: Vyhledávací roztok epitopu Rozřeďte před započetím plánovaného barvícího postupu dostatečné množství roztoku, lahvička 7 (roztok k vyhledávání cíle x 10) v poměru 1:10 pomocí destilované nebo deionizované vody. Nespotřebovaný roztok lze používat při pokojové teplotě po dobu jednoho týdne nebo skladovat při 2 8 C po dobu jednoho m ěsíce. Rozředěný roztok zlikvidujte, pokud je zakalený. Další informace naleznete v uživatelské příručce k příslušné Dako Automated Link platform(s). Promývací pufr Rozřeďte dostatečné množství Dako Wash Buffer (kód S3006) 1:10 pomocí destilované nebo deionizované vody. Nespotřebovaný pufrový roztok lze používat při pokojové teplotě po dobu jednoho týdne nebo skladovat při 2 8 C po dobu jednoho m ěsíce. Pufr zlikvidovat, pokud je zakalený. Další informace naleznete v uživatelské příručce k příslušné Dako Automated Link platform(s). ( ) P04456CZ_01_SK / str. 24/40

25 Rakovina žaludku Roztok substrát-chromogen (DAB) Připravte roztok substrát-chromogenu v uživatelských lahvích přidáním 25 µl DAB chromogenu na 1 ml DAB substrátového pufru a promíchejte. Hotový substrát-chromogenový roztok (DAB) je stabilní po dobu přibližně 5 dnů, je-li skladován při 2 8 C. Roztok je t řeba před použitím řádně promíchat. Případná přítomnost sraženiny v roztoku neovlivní kvalitu barvení. Uživatelská láhev obsahující roztok substrát-chromogenu se před použitím musí nadefinovat v přístroji Dako Automated Link platform. Další informace naleznete v uživatelské příručce k příslušné Dako Automated Link platform(s). POZNÁMKA: Barva DAB Chromogenu se může lišit od čiré až po světle hnědě levandulovou. To však funkci tohoto produktu neovlivní. Řeďte prosím v souladu s postupem uvedeným v příbalovém letáku. Přidání příliš velkého množství DAB chromogenu do DAB pufrového substrátu způsobí poškození pozitivního signálu. Kontrastní barvivo Zabarvený výsledný produkt barvicí reakce DAB není rozpustný v alkoholu ani ve vodě. V případě potřeby kontrastního barviva můžete použít Automated Link Platforms Hematoxylin (kód SK308). Potřebné kroky a inkubační doby jsou předem naprogramovány v softwaru systému Dako Link. Příprava činidla není zapotřebí. Montovací médium Doporučuje se bezvodé, permanentní montážní médium. Vodní montáž je však také přípustná. Pro vodní montáž se doporučují montážní média, jako například Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-touse (kód S3025) nebo Dako Glycergel Mounting Medium (kód C0563). Glycergel před použitím zkapalněte zahříváním na přibližně 40 (±5) C. Postup barvení - žaludek Poznámky k postupu Uživatel by si měl tyto pokyny pozorně přečíst a před použitím se seznámit se všemi součástmi a nástroji (viz kapitola Bezpečnostní opatření). Nenechejte řezy tkání při procesu barvení nikdy vyschnout. Suché řezy tkání mohou vykazovat zvýšení nespecifického zabarvení. Všechny potřebné kroky a inkubační doby k odstranění parafínu, vyhledání epitopu a barvení jsou předem naprogramovány softwarem systému Dako Link. Podrobné pokyny k programování a vkládání podložních skel a plnění činidel naleznete v uživatelské příručce k systému Dako Automated Link platform(s). Je-li postup barvení přerušen, podložní skla je třeba ponechat v pufrové lázni po inkubaci primární protilátky po dobu až jedné hodiny při pokojové teplotě (20 25 C), aby nebyla ovlivn ěna účinnost barvení. Odstranění parafínu a rehydratace Před barvením musí být podložní skla s tkáněmi zbavena parafínu, aby se odstranilo médium, ve kterém je tkáň zalita, a aby mohla být rehydratována. Zajistěte úplné odstranění parafínu. Přítomnost zbytků zalévacího média způsobí zvýšené nespecifické zabarvení. Tento krok by měl být prováděn při pokojové teplotě (20 25 C). 1. Vložte podložní skla do xylenové lázně a inkubujte 5 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 2. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do bezvodého etanolu na 3 (±1) minuty. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 3. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do 95 % etanolu na 3 (±1) minuty. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 4. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do destilované nebo deionizované vody na minimálně 30 sekund. Začněte postup barvení, jak je popsáno v části Protokol barvení, Vyhledávání epitopu.. Roztoky xylenu a alkoholu je nutno vyměnit po 40 podložních sklech. Místo toluenu nebo xylenu lze použít substituty, například Histoclear. POZNÁMKA: Činidla a návody dodané v této soupravě byly navrženy pro optimální účinnost. Další ředění činidel nebo změna inkubačních teplot může vést k nesprávným nebo nesouhlasným výsledkům. Rozdíly v zpracování tkání a v technických postupech v laboratoři uživatele mohou znehodnotit výsledky studie pro použití vybraných pacientů pro terapii s Herceptinem. Protokol barvení Všechny potřebné kroky a inkubační doby a barvení jsou předem naprogramovány softwarem systému the Dako Automated Link platforms. Po odstranění parafínu, po rehydrataci a vyhledávání epitopu pracuje přístroj s podložními skly způsobem uvedeným níže. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 25/40

26 Rakovina žaludku Krok 1: Vyhledávání epitopu Naplnit nádrž modulu Dako PT Link nebo barvící nádobu, např. nádobu Coplin, roztokem Epitope Target Retrieval Solution (viz příprava reagentu). Nádrž Dako PT Link (Kód PT101 a PT200): Zahřejte naředěný roztok Epitope Target Retrieval Solution v nádrži Dako PT Link na 85 C. Roztok pro vyhledáván í epitopu se po zahřátí zakalí. Umístěte řezy vyvážené na pokojovou teplotu, po odstranění parafínu do stojanů na sklíčka barvícího automatu a ponořte sklíčka do předem zahřátého roztoku Epitope Target Retrieval Solution. Nechejte Dako PT Link zahřát na 97 C a inkubujte po dobu for 40 (±1) minut při 97 C. Nechejte řezy v nádrži Dako PT Link ochladit na teplotu 85 C. Vyjměte nádoby PT Link se řezy z přístroje Dako PT Link. Ponechte nádoby s odkrytým víkem na stole dalších 10 minut chladit. Opláchněte řezy promývacím pufrem. Další informace naleznete v Uživatelské příručce k barvicímu systému Dako PT Link. Nádoby Coplin: Vložte barvicí nádoby obsahující roztok Epitope Retrieval Solution do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a roztok vyhledávání epitopu na C. Roztok pro vyhledávání epitopu se po zahřátí zakalí. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a aby nedocházelo k odpařování. Ponořte řezy vyvážené při pokojové teplotě do předehřátého roztoku Epitope Retrieval Solution v nádobách na barvení. Přiveďte teplotu vodní lázně a roztoku Epitope Target Retrieval Solution zpět na C. Inkubujte 40 (±1) minut při C. Vyjm ěte celou nádobu se sklíčky z vodní lázně. Nechte podložní skla zchladnout v roztoku na vyhledávání epitopu po dobu 20 (±1) minut při pokojové teplotě. Slijte roztok na vyhledávání epitopu a opláchněte řezy v promývacím pufru. Pro docílení optimální účinnosti máčejte řezy v promývacím pufru po dobu 5 20 minut po vyhledávání epitopu a před barvením. POZNÁMKA: Roztok vyhledávání epitopu je určen pouze pro jednu aplikaci. Nepoužívejte opakovaně. Krok 2: Postup barvení Po vyhledání epitopu se podložní skla vyjmou z ponořovacích nádob a umístí se do stojanů na sklíčka Dako Automated Link platforms. Přístroj provede barvící proces přidáním příslušného činidla, sledováním inkubační doby a oplachováním podložních skel mezi jednotlivými přidávanými činidly. Inkubační doby pro činidlo jsou předem naprogramovány v softwaru Dako Link. Krok 3: Kontrastní barvivo Podložní skla lze obarvit kontrastním barvivem Hematoxylin (kód SK308) pro Automated Link Platforms. V softwaru Dako jsou k dispozici 2 barvící protokoly. Jeden zahrnuje kontrastní barvení hematoxylinem, druhý nikoliv. Inkubační doba pro hematoxylin je předem naprogramována v protokolu, který zahrnuje kontrastní barvení. Další informace o programovacích protokolech naleznete v uživatelské příručce k systému Dako Automated Link platform(s). Krok 4: Montáž Doporučuje se bezvodé, permanentní montovací médium. Vodní montáž je však také přípustná. Vzorky mohou být namontovány a zakryty montážním médiem na bázi vody, například Dako Faramount (kód S3025) nebo Dako Glycergel (kód C0563). POZNÁMKA: Podložní skla lze číst, kdykoli je to vhodné. Pokud jsou však podložní skla po dobu více než jednoho týdne zakryta vodným montážním médiem a vystavena intenzivnímu světlu, může dojít k určitému vyblednutí. Z důvodu minimalizace vyblednutí skladujte podložní skla ve tmě a při pokojové teplotě (20 25 C). Kontrola kvality - žaludek Odchylky od doporučených postupů fixace tkání, zpracování a zalévání v laboratoři uživatele mohou způsobit výraznou variabilitu výsledků, která si kromě používání podložních skel s kontrolními vzorky dodaných společností Dako navíc vyžádá pravidelné provádění vlastních kontrol. Profesionální uživatelé ve Spojených státech se musí seznámit se směrnicí pro kontrolu kvality College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, viz také CLSI (dříve NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23) a dalšími informacemi uvedenými v odkazu 24. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 26/40

27 Rakovina žaludku Tabulka 8: Účel každodenní kontroly kvality. Tkáň: Fixována a zpracována jako vzorek pacienta Pozitivní kontrola: Tkáň nebo buňky obsahující cílový antigen, který je třeba detekovat (může se nacházet ve tkáni pacienta). Ideální kontrola je jednou týdně pozitivní barvení tkáně nejcitlivější na degradaci protilátky nebo antigenu. Negativní kontrola: Tkáně nebo buňky, které by měly být negativní (mohou se nacházet ve tkáni pacienta nebo tkáni pro pozitivní kontrolu). Tkáň pacienta Podložní skla s kontrolním vzorkem dodávaná společností Dako. Specifická protilátka a detekční systém Řídí všechny kroky analýzy. Ověřuje reagens a postupy použité pro barvení proteinu HER2. Detekce neplánované křížové reaktivity protilátky s buňkami nebo buněčnými složkami. Detekce specifického zabarvení. Pouze postup kontrolního barvení Nespecifická protilátka* nebo pufr a stejný detekční systém, jako byl použit pro specifickou protilátku Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. * Sérum ze stejných druhů jako specifická protilátka, není však zaměřeno proti stejnému cílovému antigenu. K detekci nespecifické vazby protilátky, např. vazby Fc části protilátky ke tkáni. Podložní sklo s kontrolními vzorky (dodávané) Každé dodané podložní sklo s kontrolními vzorky obsahuje tři slisované linie lidských buněk karcinomu prsu fixované ve formalínu a zalité v parafínu s hodnotami intenzity zabarvení 0, 1+ a 3+. V každém barvícím cyklu by se mělo barvit jedno podložní sklo. Hodnocení linií buněk na podložních sklech s kontrolními vzorky dodanými společností Dako rozhoduje o platnosti cyklu barvení. Tkáň pro pozitivní kontrolu Kontrolní vzorky by měly být čerstvé fixované vzorky z pitvy/biopsie/operace zpracované a zalité co nejdříve stejným způsobem jako vzorek (vzorky) pacienta. Pozitivní kontroly tkáně jsou známkou správně připravených tkání a použití správných metod barvení. Pro každou sadu testovacích podmínek by měla být v každém cyklu barvení použita jedna tkáň pro pozitivní kontrolu. U tkání použitých pro pozitivní kontroly tkáně by se mělo projevit slabé pozitivní zabarvení, aby mohly tkáně detekovat mírné změny v citlivosti primární protilátky. Podložní skla s kontrolními vzorky dodané s touto soupravou nebo různě zpracované vzorky ze vzorku (vzorků) pacienta ověřují pouze činnost reagencie, ale neověřují přípravu tkáně. Jako ideální tkáň pro pozitivní kontrolu použijte dříve zjištěný protein HER2, 2+ hyperexprimující tkáň adenokarcinomu žaludku, včetně gastroezofageálního spojení. POZNÁMKA: Známé tkáně pro pozitivní kontrolu by měly být používány pouze ke sledování správné funkce zpracovaných tkání a testovacích reagencií, NIKOLIV jako pomůcka k formulaci specifické diagnózy vzorků pacienta. Pokud se při pozitivních kontrolách tkáně neprojeví příslušné pozitivní zabarvení, je nutno považovat výsledky pacientových vzorků za neplatné. Tkáň pro negativní kontrolu Při každém barvícím cyklu používejte fixovanou tkáň pro negativní kontrolu (o níž víme, že je protein HER2 negativní) zpracovanou a zalitou identickým způsobem jako vzorek (vzorky) pacienta, aby byla ověřena specificita primární protilátky a aby se projevilo specifické zabarvení pozadí. Tračník, játra nebo štítná žláza jsou vyhovující jako tkáně pro negativní kontrolu. Rozmanitost různých typů buněk, které se nacházejí ve většině řezů tkání, nabízí vnitřní oblasti pro negativní kontrolu (to by měl ověřit uživatel). Pokud se projeví specifické zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Další informace o programování kontrolních podložních skel naleznete v uživatelské příručce k systému Dako Automated Link platform(s). Nespecifické činidlo pro negativní kontrolu Použijte dodané reagens pro negativní kontrolu místo primární protilátky s řezem každého vzorku pacienta a vyhodnoťte tak nespecifické zabarvení a umožněte lepší interpretaci specifického zabarvení v oblasti antigenu. Inkubační doba činidla pro negativní kontrolu by měla odpovídat inkubační době primární protilátky. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 27/40

28 Rakovina žaludku Ověření testu Před prvním použitím barvicího systému v diagnostické metodě by měl uživatel ověřit funkci testu tak, že jej vyzkouší u několika v laboratoři dostupných tkáních se známou IHC charakteristikou, které představují známé pozitivní a negativní tkáně. Seznamte se s postupy pro kontrolu kvality popsané v této části příbalového letáku a s požadavky pro kontrolu kvality programu CAP Certification Program for Immunohistochemistry nebo CLSI (dříve NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23). Tyto postupy pro kontrolu kvality musí být provedeny vždy, když se změní šarže protilátky nebo když se změní parametry testu. Pro ověření testu jsou vhodné adenokarcinomy žaludku, včetně gastroezofageálního spojení, se známými intenzitami zabarvení od 0 3+ proteinu HER2 a negativní tkáně, např. tračník, játra nebo štítná žláza. Interpretace zabarvení - žaludek Pro stanovení hyperexprese proteinu HER2 by měla být vyhodnocována intenzita a vzor pouze membránového zabarvení pomocí škály uvedené v tabulce 9. Vyhodnocení podložních skel by měl provádět patolog pomocí světelného mikroskopu. Pro vyhodnocení imunohistochemického barvení a jeho ohodnocení je vhodné zvětšení objektivu 10x. Použití zvětšení objektivu 5 40x je vhodné pro potvrzení skóre. Cytoplazmatické zabarvení by se mělo považovat za nespecifické zabarvení a nemělo by být zahrnováno do hodnocení intenzity membránového zabarvení (8). Další informace o pomůckách při diferenciaci zabarvení 0, 1+, 2+ a 3+ a reprezentativní obrázky intenzity a vzorů zabarvení naleznete v Dako s HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer ( Příručka k interpretaci zabarvení při testu HercepTest - žaludek ) společnosti Dako. Hodnotí se pouze vzorky pacientů s adenokarcinomem žaludku, včetně gastroezofageálního spojení. V případě výskytu metaplazie tenkého střeva a adenokarcinomu žaludku ve stejném vzorku se hodnotí pouze komponenta adenokarcinomu žaludku. K interpretaci výsledků obarvených vzorků z biopsie s HercepTest se doporučuje shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk. Shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk sestává z 5 propojených nádorových buněk obarvených na HER2. Tabulka 9. Interpretace a vyhodnocení imunohistochemického barvení HER2 Skóre Vzorky z operace Barvící vzor V < 10 % nádorových buněk nebyla pozorována žádná reaktivita nebo žádná membránová reaktivita Nejasné / sotva znatelné membránové zbarvení bylo zjištěno ve 10 % nádorových buněk; buňky byly reaktivní pouze na části své membrány Slabé až střední úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení ve 10 % nádorových buněk Silné úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení ve 10 % nádorových buněk Vzorky z biopsie Barvící vzor V žádné nádorové buňce (nebo <5 ve shluku) nebyla pozorována žádná reaktivita nebo žádná membránová reaktivita Shluk nádorových buněk ( 5 buněk) s nejasným / sotva znatelným membránovým zbarvením bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk Shluk nádorových buněk ( 5 buněk) se slabým až středním úplným, bazolaterálním nebo laterálním, membránovým zabarvením bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk Shluk nádorových buněk ( 5 buněk) se silným úplným, bazolaterálním nebo laterálním, membránovým zabarvením bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk Hodnocení nadměrní exprese HER2 Negativní Negativní Neprůkazné Pozitivní Pokyny vycházející z poznatků Hofmann et al. (39). HercepTest se interpretuje pro hyperexpresi proteinu HER2 jako negativní (intenzita zabarvení 0 a 1+ ), neprůkazné (intenzita zabarvení 2+ ) a pozitivní (intenzita zabarvení 3+). HercepTest není vhodný k provádění prognóz pacienta a lékaře a nebyl pro tento účel ověřen. Aby barvící cyklus byl platný a aby bylo možno uskutečnit semikvantitativní zkoušku intenzity zabarvení vzorku tkáně, je třeba podložní skla pro každý barvící cyklus testovat v pořadí uvedeném v tabulce 10. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 28/40

29 Rakovina žaludku Tabulka 10: Pořadí hodnocení podložních skel. Pořadí čtení skel 1. Podložní sklo s kontrolními vzorky obsahující tři buněčné linie Zdůvodnění Přítomnost hnědého zabarvení membrány buněk 3+ (proužkování) SK-BR-3 kontrolní buněčné linie 3+, částečné hnědé proužky 1+ MDA- 175 kontrolní buněčné linie a žádné zabarvení 0 MDA-231 kontrolní buněčné linie označuje, že je zkouška platná. V malém až středním počtu buněk slabě pozitivní 1+ MDA-175 kontrolní buněčné linii je přítomno tečkované a nesouvislé membránové zabarvení. V této buněčné linii lze pozorovat také bodové imunologické zabarvené v cytoplazmě Golgiho oblasti. 2. Podložní sklo s tkání pro pozitivní kontrolu 3. Podložní sklo s tkání pro negativní kontrolu 4. Podložní sklo s tkání pacienta zabarvené pomocí činidla pro negativní kontrolu. 5. Podložní sklo s tkání pacienta zabarvené pomocí primární protilátky. Přítomnost hnědého zabarvení v MDA-231 kontrolní buněčné linii O (negativní na barvení proteinem HER2) označuje, že během zkoušky zde bylo nespecifické zabarvení. Výsledky zkoušky mohou být v důsledku přílišného zabarvení neplatné. Mělo by se objevit hnědé membránové zabarvení. Zabarvení cytoplazmy a negativních tkání by nemělo být silnější než 1+. NEPŘÍTOMNOST specifického zabarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost křížové reaktivity sady s buňkami / částmi buněk. Pokud se projeví specifické membránové zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Nepřítomnost specifického membránového zbarvení potvrzuje specifické značení cílového antigenu primární protilátkou. Jiné než žlutohnědé nebo hnědé zabarvení vyskytující se v cytoplazmě vzorků zpracovaných činidlem pro negativní kontrolu, například v pojivové tkáni, leukocytech, erytrocytech nebo v nekrotické tkání by se mělo považovat za nespecifické zabarvení pozadí a mělo by být hlášeno v kapitole komentáře v datovém listu. Když je ve vzorku zjištěna hyperexprese proteinu HER2, projeví se to jako hnědé proužky nacházející se na buněčné membráně nádorových buněk zpracovaných primární protilátkou. 1. Podložní sklo s kontrolními vzorky (dodávané): Nejprve je třeba prozkoumat kontrolní sklíčko obarvené HercepTest, které potvrdí správnou funkčnost všech reagencií. Přítomnost hnědého produktu reakce (3,3 - diaminobenzidin, DAB) na membráně buňky indikuje pozitivní reaktivitu. Přítomnost hnědého zabarvení membrány buněk po celém obvodu (proužkování) v SK-BR-3 kontrolní buněčné linii 3+, částečné hnědé proužky v MDA-175 kontrolní buněčné linii 1+ a žádné zabarvení v MDA kontrolní buněčné linii označuje, že je zkouška platná. Jestliže jakákoli kontrolní buněčná linie neodpovídá těmto kritériím, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. 2. Tkáň pro pozitivní kontrolu: Jako další je třeba zkontrolovat podložní sklo se vzorky pro pozitivní kontrolu. Toto podložní sklo ověřuje, zda fixační metoda a vyhledávání epitopu jsou účinné. K interpretaci výsledků použijte intaktní buňky, protože nekrotické a degenerované buňky se často zabarvují nespecificky (25). Zabarvení by mělo být pozorováno v nádorových buňkách jako hnědé zabarvení membrány buněk. Hnědé zabarvení cytoplazmy a negativních tkání na vzorku by nemělo být silnější než skóre intenzity zabarvení Tkáň pro negativní kontrolu: Tkáň pro negativní kontrolu je nutno otestovat po tkáni pro pozitivní kontrolu, abychom ověřili specificitu značení cílového antigenu primární protilátkou. Nepřítomnost specifického zabarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost křížové reaktivity sady s buňkami / částmi buněk. Pokud se projeví specifické zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Negativní podíly tkání pro pozitivní kontrolu mohou být také použity jako tkáň pro negativní kontrolu, ale toto musí být uživatelem ověřeno. Je třeba mít na zřeteli, že slabou reakci (intenzita zabarvení 0 1+) lze pozorovat u většiny normálních epiteliálních tkání. Vhodné tkáně pro negativní kontrolu zahrnují: tračník, játra a štítnou žlázu. Pokud se vyskytne nespecifické zabarvení, bude difúzní. Sporadické zabarvení pojivové tkáně lze také pozorovat v řezech z tkání příliš fixovaných formalínem Tkáň pacienta: Vzorky pacienta zabarvené během testu HercepTest zkontrolujte jako poslední. Intenzitu pozitivního zabarvení je nutno posuzovat v kontextu jakéhokoli nespecifického zabarvení pozadí reagencií pro negativní kontrolu. Jako u každého imunocytochemického testu, negativní výsledek znamená, že antigen nebyl detekován, nikoli, že antigen není v testovaných buňkách / tkáni přítomen. Další informasce o imunoreaktivitě testu HercepTest naleznete v kapitolách Souhrn a vysvětlení, Omezení a Charakteristiky účinnosti. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 29/40

30 Rakovina žaludku Další doporučení k interpretaci výsledků barvení během testu HercepTest Adenokarcinomy žaludku, včetně gastroezofageálního spojení testované na hyperexpresi proteinu HER2 dávala skóre 0 až 3+. Zatímco případy se skóre 0 a 3+ je zcela jasná, malé procento zbývajících vzorků s intenzitou 1+ a 2+ se může zdát těžko interpretovatelné. K interpretaci zabarvení pro HercepTest ve vaší laboratoří použijte následující pokyny. 1. K ověření účinnosti zkoušky je třeba vyhodnotit kontrolní buněčné linie. 2. Vyhodnoťte podložní skla pro pozitivní a negativní kontrolu. 3. Pro první vyhodnocení se doporučuje barvení vzorků tkání hematoxylinem a eozinem (H&E). (Nádor nemusí být zjevný, díváte-li se na vzorek barvený testem HercepTest. K ověření přítomnosti nádoru je od patologa vyžadováno podložní sklo barvené pomocí H a E). Test HercepTest je třeba provést na párovém řezu (sériový řez) ze stejného parafínového bloku vzorku. 4. Nejdříve vyhodnoťte řezy barvené na hyperexpresi proteinu HER2 s nejmenším zvětšením. Většina pozitivních případů bude zřetelná již při malém zvětšení. 5. Pro případy se skóre 1+ použijte k ověření membránového zabarvení zvětšení objektivu 40x. 6. Pro případy se skóre 2+ použijte k ověření membránového zabarvení zvětšení objektivu 10 20x. Vzorky z operace 1. Ke stanovení procenta pozitivních nádorových buněk je třeba použít dobře uchovávané a barvené oblasti vzorku. 2. Jestliže většina nádorových buněk vykazuje úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení, je skóre barvení 2+ nebo Je-li úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení silné intenzity ve více než nebo rovno 10 % nádorových buněk ve vzorcích z operace, skóre vzorku je Je-li úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení slabé až střední intenzity ve více než nebo rovno 10 % nádorových buněk ve vzorcích z operace, skóre vzorku je Jestliže je více než nebo 10 % nádorových buněk ve vzorcích z operace zabarveno pouze v časti své membrány, s nejasnou / sotva znatelnou intenzitou, je skóre vzorku Jestliže méně než 10 % nádorových buněk ve vzorcích z operace má zabarvení, bez ohledu na vzorec zabarvení (např. kompletní, bazolaterální nebo laterální nebo část membrány), je skóre Jestliže není viditelné žádné zabarvení, skóre vzorků z operace je 0. Vzorky z biopsie 1. Shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk sestává z 5 propojených nádorových buněk obarvených na HER2. 2. Jestliže se zde nachází shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk, které vykazují úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení, skóre vzorků z biopsie je 3+, bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk. 3. Jestliže se zde nachází shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk, které vykazují slabě až středně úplné, bazolaterální nebo laterální, membránové zabarvení, skóre vzorků z biopsie je 2+, bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk. 4. Jestliže se zde nachází shluk alespoň 5 obarvených nádorových buněk, které vykazují nejasné / sotva znatelné membránové zbarvení a jsou zabarveny pouze v části své membrány, skóre vzorků z biopsie je 1+, bez ohledu na procento zabarvených nádorových buněk. 5. Jestliže není viditelné žádné zabarvení, skóre vzorků z biopsie je Jestliže není pozorováno žádné membránové zabarvení (bez ohledu na intenzitu zabarvení) u méně než 5 nádorových buněk v shluku, skóre vzorků z biopsie je 0. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 30/40

31 Rakovina žaludku Všeobecná omezení - žaludek Omezení specifická pro tento výrobek - žaludek 1. Imunocytochemie je diagnostický proces obsahující více kroků, který vyžaduje specializované vyškolení ve výběru vhodných reagencií, výběru tkání, fixaci a zpracování; přípravě imunocytochemického podložního skla a interpretaci výsledku zabarvení. 2. Zabarvení tkáně závisí na manipulaci s tkání a na jejím zpracováním před barvením. Nesprávná fixace, zmražení, rozmražení, umývání, sušení, zahřívání, řezání neb kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může vést ke vzniku artefaktů, zachycení protilátky nebo falešně negativním výsledkům. Výsledky mohou být nekonzistentní v důsledku použití různých metod fixace a zalití nebo v důsledku vnitřních nepravidelností v tkáni. 3. Přílišné nebo neúplné kontrastní zabarvení může ohrozit správnou interpretaci výsledků. 4. Klinická interpretace jakéhokoli pozitivního zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být vyhodnocena v kontextu klinického projevu, morfologie a jiných histopatologických kritérií. Klinická interpretace jakéhokoli zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být doplněna morfologickými studiemi a řádnými kontrolami a také dalšími diagnostickými testy. Za interpretaci barveného preparátu zodpovídá kvalifikovaný patolog, který zná použité protilátky, reagencie a použité metody. Barvení se musí provádět v certifikované, licencované laboratoři s příslušným oprávněním a pod dohledem patologa zodpovědného za hodnocení barvených podložních skel a zaručení adekvátnosti pozitivních a negativních kontrol. 5. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy B, které obsahují povrchový antigen (HBsAg) hepatitidy B, mohou s křenovou peroxidázou vykazovat nespecifické zabarvení (26). 6. Reagencie mohou vykazovat neočekávané reakce v dříve netestovaných typech tkání. Možnost neočekávaných reakcí ve skupinách testovaných tkání nelze zcela vyloučit v důsledku biologické variability exprese antigenu v novotvarech nebo jiných patologických tkáních (27). Se zdokumentovanými neočekávanými reakcemi se obraťte na technickou podporu společnosti Dako. 7. Falešně pozitivní výsledky se mohou vyskytovat v důsledku neimunologické vazby proteinů nebo produktů reakce se substrátem. Mohou být také způsobeny aktivitou pseudoperoxidázy (erytrocyty) a endogenní aktivitou peroxidázy (cytochrom C) (27). 8. Postup barvení se provádí při předem naprogramované teplotě v rozmezí (20 25 C). 1. Antigen přítomný v MDA-175 kontrolní buněčné linii1+ může být po určité době degradován. Posuzujte výsledky podložních skel s kontrolními vzorky ve spojení s datem exspirace podložních kontrolních skel. Negativní zabarvení buněk MDA-175 může znamenat pouze degradaci podložních skel s kontrolními vzorky. Podložní skla s kontrolními vzorky musí být skladována při 2 8 C. 2. Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny degradací antigenu v tkáních, ke které může po určité době docházet. Vzorky by měly být barveny do 4 6 týdnů od montáže tkání na podložní skla, pokud jsou skladovány při pokojové teplotě (20 25 C) (28). 3. Nenahrazujte reagencie soupravy reagenciemi z jiných čísel šarží nebo ze souprav od jiných výrobců. 4. Z hodnocení cytoplazmatického zabarvení by se mohly získat falešně negativní výsledky. Při interpretaci výsledků posuzujte pouze intenzitu membránového zabarvení. 5. Barvení linií kontrolních buněk by mělo být použito pouze pro ověření postupu barvení a nemělo by se používat pro hodnocení reakce barvení v tkáňových řezech. 6. Silné fokální zabarvení (3+), tj. občas lze pozorovat aktivní body. To může být výsledek nerovnoměrné fixace nebo zpracování tkáně. Doporučuje se imunologické barvení druhého tkáňového bloku ze stejného vzorku. 7. Použití testu HercepTest na vzorcích fixovaných jinými fixačními prostředky než neutrálním pufrovaným formalínem dosud nebylo ověřeno. 8. Připomínáme, že normální epitely tonzily a jícnu se mohou zabarvit až do intenzity Je nutno se vyvarovat použití rozdrcených vzorků rakoviny žaludku a interpretace uměle vzniklého zabarvení v blízkosti bioptického okraje. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 31/40

32 Rakovina žaludku Charakteristiky účinnosti - žaludek Pozadí Bezpečnost a účinnost trastuzumabu (Herceptin ) byla prokázána v klinické studii (zkouška ToGA) (37, 38). Studie byla navržená jako otevřená, randomizovaná, multicentrická studie fáze III u HER2-pozitivních pacientů s inoperabilním, lokálně pokročilým, rekurentním a/nebo metastazujícím adenokarcinomem žaludku nebo gastroezofageální junkce. Pro zkoušku ToGA byla definována pozitivita HER2 jako pozitivní výsledek IHC (3+) (HercepTest, Dako) a/nebo pozitivní výsledek metodou HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Po začlenění do studie byli pacienti randomizováni do skupiny léčené chemoterapií (5- FU nebo capecitabin a cisplatin) nebo chemoterapií plus trastuzumabem. Hlavním hlediskem úspěšnosti léčby bylo cekové přežití (overall survival, OS). V této studii bylo randomizováno celkem 594 pacientů, 584 pacientů dostávalo studiový lék a bylo zahrnuto do skupiny kompletních analýz (full analyses set, FAS). Z hlediska hlavního cíle studie byla kombinovaná léčba chemoterapie a trastuzumabu statisticky významně lepší než léčba samotnou chemoterapií. Median OS se zvýšil z 11,1 měsíců na 13,8 měsíců (p=0,0046) s mírou rizika 0,74 (95 % CI: 0,60,91). Kaplan-Meierovy křivky přežití (OS) jsou zobrazeny na obrázku 1. Pravděpodobnost přežití 1,0 0,9 0,8 0,7 Log-rank test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 11,1 13,8 Čas (měsíce) Č. vlevo Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Léčebná skupina Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Obrázek 1. Kaplan-Meierova křivka OS (n=584). Jakmile byla k dispozici data, byly provedeny předem určené exploratorní analýzy podskupin podle stavu HER2. Následně byly definovány dvě nové podskupiny HER2 na základě skóre IHC: Skupina 1 (skupina s nízkou expresí HER2): IHC 0/FISH+ a IHC 1+/FISH+ (n=131) Skupina 2 (skupina s vysokou expresí HER2): IHC 2+/FISH+ a IHC 3+ / FISH+ nebo FISH- nebo FISH bez výsledku (n=446) Po opakování primárních analýz OS u skupiny 2, vysoká exprese HER2 (n=446) byl přínos kombinované léčby dokonce vyšší. Median OS ve skupině pacientů léčených kombinací chemoterapie a trastuzumabu se zvýšil na 16 měsíců v porovnání k 11,8 měsícům u pacientů léčených samotnou chemoterapií. Míra rizika se v této analýze snížila na 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Kaplan-Meierovy křivky přežití (OS) pro skupinu s vysokou expresí HER2 jsou zobrazeny na obrázku 2. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 32/40

33 Rakovina žaludku Pravděpodobnost přežití 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Čas (měsíce) Č. vlevo Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Léčebná skupina Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Obrázek 2. Kaplan-Meierova křivka OS pro skupinu s vysokou expresí HER2 (n=446). ToGA prokázala, že kombinace testování IHC a FISH je prediktivní pro účinek kombinované léčby chemoterapií a trastuzumabem, avšak podle následných exploratorních analýz se zdá, že pacienti s vyšší úrovní exprese proteinu HER2 (IHC2+/FISH+ a IHC3+) z toho více profitují. To je možné vysvětlovat faktem, že protein je cílem lečby trastuzumabem. Další informace o zkoušce ToGA naleznete v příbalové informaci pro Herceptin. Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost intra-run Reprodukovatelnost intra-run byla testována v jedné laboratoři s 3 vzorky různých hodnot IHC intenzity zabarvení. Každý vzorek byl spouštěn trojmo. Protokol je určen pro automatické barvení. Všechny vzorky vykázaly 100 % opakovatelné výsledky. Reprodukovatelnost intra-run byla testována v jedné laboratoři s 11 vzorky různých hodnot IHC intenzity zabarvení. Každý vzorek byl spouštěn trojmo. Protokol je určen pro manuální barvení. Všechny vzorky vykázaly 100 % opakovatelné výsledky. Reprodukovatelnost mezi cykly a mezi laboratořemi Analýzy s HercepTest 60 různých vzorků rakoviny žaludku získaných z oblasti žaludku nebo gastroezofageálního spojení představujících chirurgické resekce a biopsie byly prováděny po dobu pěti různých dnů na třech různých pracovištích provádějících studii. Těchto 60 vzorků ve studii bylo rovnoměrně rozděleno do tří kategorií stavu HER2. Šest patologů provedlo celkem hodnocení stavu HER2. Shoda mezi dny (negativní, nejasné, pozitivní) byla v rozsahu 83,1 % až 98,3 %. Ve 47 z 60 možných porovnání byla shoda 90,0 % a více. Tabulka 11 uvádí specifické příklady porovnání mezi jednotlivými dny s průměrnou shodou 91,2 %, 92,5 % a 92,5 % pro tato tři pracoviště. Shoda mezi pracovišti byla 82,7 %, 75,0 % a 88,0 %, v případě porovnávání mezi dvěma pracovišti (viz Tabulka 12). V souladu s exaktním testem Fishera, nebyly výsledky mezi pracovišti rozdílné. Shoda mezi jednotlivými hodnotiteli na každém místě byla 88,0 %, 83,6 % a 81,0 % pro všechna tři studijní pracoviště (tabulka 13). Analýzy HercepTest se vzorky rakoviny žaludku na třech studijních pracovištích prokázaly dobrou shodu mezi hodnotiteli, pokud se týče hodnocení mezi dny, místy i hodnotiteli. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 33/40

34 Rakovina žaludku Table 11. Celková shoda v procentech, mezi dny - subset 12 z 60 porovnání Hodnotitel 1 Hodnotitel 2 Průměrná shoda CI95 LL 1 shoda CI95 LL 1 shoda Pracoviště 1 Pracoviště 2 Pracoviště 3 1. den oproti 2. dnu 85,0 74,4 93,3 84,9 3. den oproti 4. dnu 93,3 84,9 93,3 84,9 1. den oproti 2. dnu 95,0 87,3 83,1 72,0 3. den oproti 4. dnu 96,7 89,7 95,0 87,3 1. den oproti 2. dnu 90,0 80,5 91,7 82,7 3. den oproti 4. dnu 96,7 89,7 91,7 82,7 91,2 92,5 92,5 1 CI95 LL: nižší limit intervalu spolehlivosti 95 %. Tabulka 12. Celková shoda v procentech, mezi pracovišti Shoda CI95 LL 1 Průměrná shoda 1. pracoviště oproti 2. pracovišti 1. pracoviště oproti 3. pracovišti 2. pracoviště oproti 3. pracovišti 1. den oproti 1. dnu 83,3 72,4 2. den oproti 2. dnu 85,0 74,4 3. den oproti 3. dnu 85,0 74,4 4. den oproti 4. dnu 81,7 70,5 5. den oproti 5. dnu 78,3 66,7 1. den oproti 1. dnu 80,0 68,6 2. den oproti 2. dnu 73,3 61,2 3. den oproti 3. dnu 78,3 66,7 4. den oproti 4. dnu 68,3 55,9 5. den oproti 5. dnu 75,0 63,0 1. den oproti 1. dnu 88,3 78,5 2. den oproti 2. dnu 86,7 76,4 3. den oproti 3. dnu 90,0 80,5 4. den oproti 4. dnu 86,7 76,4 5. den oproti 5. dnu 88,3 78,5 82,7 75,0 88,0 1 CI95 LL: nižší limit intervalu spolehlivosti 95 %. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 34/40

35 Rakovina žaludku Tabulka 13. Shoda mezi pozorovateli v procentech Shoda CI 95 LL 1 Průměrná shoda Pracoviště 1 Pracoviště 2 Pracoviště 3 Den 1 91,7 82,7 Den 2 91,7 82,7 Den 3 93,3 84,9 Den 4 83,3 72,4 Den 5 80,0 68,6 Den 1 86,4 76,0 Den 2 83,3 72,4 Den 3 83,3 72,4 Den 4 83,3 72,4 Den 5 81,7 70,5 Den 1 80,0 68,6 Den 2 78,3 66,7 Den 3 80,0 68,6 Den 4 78,3 66,7 Den 5 90,0 80,5 1 CI95 LL: nižší limit intervalu spolehlivosti 95 %. 88,0 83,6 81,0 Imunoreaktivita Tabulka 14 shrnuje imunoreaktivitu testu HercepTest s doporučeným panelem normálních tkání. Všechny tkáně byly fixovány formalínem, zality v parafínu a barveny protilátkou HercepTest podle pokynů uvedených v příbalové informaci. Tabulka 14. Shrnutí reaktivity HercepTest u normálních tkání. Typ tkáně (počet testovaných) Tkáň nadledvinek (3) Kostní dřeň (3) Mozek/Cerebellum (3) Mozek/Cerebrum (3) Prsní tkáň (3) Děložní čípek (3) Tlusté střevo (3) Jícen (3) Srdce (3) Ledviny (3) Játra (3) Plíce (3) Buňky mezotelu (3) Vaječníky (3) Pankreas (3) Příštítná tělíska (3) Periferní nerv (3) Hypofýza (3) Prostata (3) Slinná žláza (3) Kosterní sval (3) Kůže (3) Tenké střevo (3) Slezina (3) Žaludek (3) Varle (3) Brzlík (3) Štítná žláza (3) Tonzila (3) Děloha (3) Zabarvení pozitivního prvku tkáně a vzor zabarvení Prsní žláza (2 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk) Epiteliální buňky (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk, membrána a cytoplazma, granulární) Epiteliální buňky folikulu (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk, membrána a cytoplazma) Skvamózní epitel (1 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, <5 % buněk. 2 ze 3 tkání, intenzita barvení 2+, % buněk, membrána a cytoplazma) Endometriální tkáň (2 ze 3 tkání, intenzita barvení 1+, % buněk, cytoplazma, granulární) Zaznamenané zabarvení ve všech tkáních bylo membránové, pokud není uvedeno jinak. Všechny tři vzorky z každého typu tkáně měly stejnou intenzitu zabarvení, pokud není uvedeno jinak. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 35/40

36 Rakovina žaludku Řešení problémů - žaludek Informace o dalších řešeních naleznete v již zmiňované příručce (19) společnosti Dako v části Řešení problémů nebo se obraťte na technickou podporu společnosti Dako a nahlaste neobvyklé zabarvení. Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 1. Nedochází k 1a. Chyba programování. Činidla 1a. Zkontrolujte protokol podložního barvení nejsou použita ve správném skla a ověřte, zda byt zvolen podložních skel. pořadí. správný program. 1b. Azid sodný v promývacím 1b. Používejte pouze Dako Wash 2. Podložní skla jsou slabě zabarvena. 3. Přílišné zabarvení pozadí podložních skel. 4. Tkáň se odděluje od podložních skel. roztoku. 1c. Nadměrné zahřívání namontovaných tkáňových řezů před deparafinací a tepelně indukovaném vyhledávání antigenu může vést ke ztrátě viditelné HER2 imunoreaktivity. 2a. Nepřiměřené vyhledávání epitopu. 2b. Nepřiměřené inkubační doby činidel. 2c. Byl použit nevhodný způsob fixace. 2d. Nadměrné zahřívání namontovaných tkáňových řezů před deparafinací a tepelně indukovaným vyhledávání antigenu může způsobit výrazné snížení viditelné HER2 imunoreaktivity. 2e. Bylo aplikováno nedostatečné množství činidla. Buffer, kód S c. Nechejte tkáňové řezy uschnout na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin nebo až do jejich uschnutí. Alternativně je možné je sušit přes noc při 37 C nebo při 60 C po dobu maximálně jedné hodiny. Sušení tkáňových řezů při zvýšené teplotě se smí provádět pouze v kalibrované troubě s rovnoměrným rozložením tepla (17). 2a. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda bylo použito správné vyhledávání epitopu. 2b. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda byly doby inkubace činidel správné. 2c. Zkontrolujte, zda není tkáň pacienta příliš fixována a zda je použit schválený fixační prostředek. 2d. Nechejte tkáňové řezy uschnout na vzduchu při pokojové teplotě po dobu alespoň 12 hodin nebo až do jejich uschnutí. Alternativně je možné je sušit přes noc při 37 C nebo při 60 C po dobu maximálně jedné hodiny. Sušení tkáňových řezů při zvýšené teplotě se smí provádět pouze v kalibrované troubě s rovnoměrným rozložením tepla (17). 2e. Zkontrolujte velikost tkáňového řezu (22 mm x 22 mm) a množství aplikovaného činidla. 3a. Parafín není zcela odstraněn. 3a. Používejte čerstvé čisticí roztoky. 3b. K montáži řezů na podložní skla byly použity škrobové přísady. 3c. Podložní skla nejsou důkladně opláchnutá. 3d. Při barvení došlo k vysušení řezů. 3e. Byl použit nevhodný způsob fixace. 3f. Nespecifická vazba činidel k tkáni. 4a. Použití nesprávných podložních skel. 3b. Pro lepení řezů na podložní skla nepoužívejte žádné přísady. Mnohé přísady jsou imunoreaktivní. 3c. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda byla podložní skla řádně opláchnuta. 3d. Zkontrolujte, zda se na podložní skla nanáší odpovídající množství činidla. 3e. Zkontrolujte, zda bylo použito doporučené fixativum. Jiná fixativa mohou zapříčinit přílišné zabarvení pozadí. 3f. Zkontrolujte, zda je vzorek dobře fixován nebo zda se u něj nevyskytuje nekróza. 4a. Používejte silanizovaná podložní skla, například Dako Silanized Slides, (kód S3003), SuperFrost Plus nebo poly-l-lysinem potažená podložní skla. ( ) P04456CZ_01_SK / str. 36/40

37 Rakovina žaludku Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 5. Příliš silné specifické 5a. Byl použit nevhodný způsob 5a. Dohlédněte, aby byly použity pouze zabarvení. fixace. schválené způsoby fixace. 5b. Inkubační doby činidel jsou příliš 5b. Zkontrolujte protokol podložního dlouhé. skla a ověřte, zda byly doby inkubace činidel správné. 5c. Byl použit nevhodný pufrový 5c. Používejte pouze Dako Wash roztok. Buffer, kód S Slabé zabarvení podložního skla s kontrolní linií buněk Roztok pro vyhledávání epitopu se po zahřátí zakalí. 8. Roztok pro vyhledávání epitopu je po uchovávání kalný (před zahřáním). 6a. Následoval nesprávný protokol vyhledávání epitopu. 6b. Neproběhla reakce s roztokem substrát-chromogenu (DAB). 6c. Degradace podložního skla s kontrolním vzorkem. 6a. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda bylo použito správné vyhledávání epitopu. 6b. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda byl správně připraven chromogen. Zkontrolujte protokol podložního skla a ověřte, zda byly doby inkubace chromogenu správné. 6c. Zkontrolujte datum expirace soupravy a podmínky pro skladování soupravy vytištěné na obalu. 7. Po zahřátí se roztok zakalí. 7. To je normální a nemá to žádný vliv na kvalitu zabarvení. 8. Roztok byl uchováván nesprávně nebo vypršelo datum jeho použitelnosti. 8. Zkontrolujte datum exspirace soupravy a podmínky pro uchovávání soupravy vytištěné na obalu. Roztok pro vyhledávání epitopu zlikvidujte. POZNÁMKA: Pokud nelze za příčinu problému považovat žádnou z uvedených příčin nebo pokud se nepodaří problém doporučeným postupem vyřešit, obraťte se s žádostí o pomoc na technickou podporu společnosti Dako. Další informace o technikách barvení a přípravě vzorků naleznete v již zmiňované příručce společnosti Dako (19) (k dispozici ve společnosti Dako) Atlas of Immunohistology (29) a Immunoperoxidase Techniques. Practical Approach to Tumor Diagnosis (Praktický přístup k diagnóze nádorů) (30). ( ) P04456CZ_01_SK / str. 37/40

38 Reference 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985; 229: Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986; 319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985; 229: Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. Nature 1986; 319: Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990; 45: Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990; 5: Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990; 2: Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an anti-p185 HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185 HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989; 9: Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185 HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993; 37: Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-her2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998; 58: a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003 b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6, Dako California Inc., Data on file 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fourth Edition. Dako, Carpinteria, California; Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996; 4: Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989; 92: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983; 14: Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994; 54: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986 ( ) P04456CZ_01_SK / str. 38/40

39 31. Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010 (in press). 32. Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastroesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 38. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 39. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52: Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012; 43;11: ( ) P04456CZ_01_SK / str. 39/40

40 Vysvětlivky k symbolům Katalogové číslo Teplotní rozmezí od do Číslo šarže Křehké, zacházejte opatrně In vitro diagnostický zdravotnický prostředek Skladujte ve tmě Použitelné do Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Viz návod k použití Obsah vystačí na <n> testů Výrobce Vyrobeno: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel Fax V USA distribuováno: Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, California 93013, USA Tel. 805/ , Toll Free: 800/ Ordering Information: Tel. 800/ Fax 805/ Technická podpora: Tel. 800/ ( ) P04456CZ_01_SK / str. 40/40