EnVision FLEX Mini Kit, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus)

Transkript

1 EnVision FLEX Mini Kit, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Kód K vydání Souprava obsahuje činidla postačující na testů. Pro přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus. Volitelná činidla: Kód Název výrobku Testy K8004 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) K8005 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) K8006 EnVision FLEX Antibody Diluent K8007 K8018 K8019 K8022 EnVision FLEX Wash Buffer (20x) EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) EnVision FLEX+ Mouse (LINKER), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Další volitelné položky K8020 FLEX IHC Microscope Slides 500

2 Obsah Strana Použití k určenému účelu... 3 Souhrn a vysvětlení... 3 Činidla... 4 A. Dodávané materiály... 4 B. Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky... 4 C. Volitelná činidla... 4 Bezpečnostní opatření... 5 Skladování... 6 Příprava činidel... 7 Sběr vzorků a příprava... 7 Postup... 8 A. Postup předběžného zpracování... 8 B. Postup barvení... 9 Kontrola kvality Interpretace výsledků Omezení Vysvětlivky k symbolům... 11

3 Použití k určenému účelu K diagnostice in vitro. Detekční systém Dako EnVision FLEX je určen k použití v imunohistochemii společně s barvícími automaty Dako Autostainer/Autostainer Plus. Systém detekuje primární myší a králičí protilátky a reakce se vizualizuje pomocí EnVision FLEX DAB+ Chromogen. Jestliže se použije s EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) (kód K8019) nebo EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (kód 8022) lze dosáhnout amplifikace signálu primárních králičích protilátek nebo primárních myších protilátek. Činidla EnVision FLEX jsou určena k použití na tkáňových řezech fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. Souhrn a vysvětlení Detekční systém Dako EnVision FLEX je flexibilní systém, který poskytuje optimální zabarvení na barvících automatech Dako Autostainer/Autostainer Plus, jestliže se použije doporučený protokol uvedený v této příbalové informaci. Před barvením je třeba tkáňové řezy fixované běžným způsobem a zalité v parafínu nejdříve deparafinovat a hydratovat a potom předběžně zpracovat tepelně indukovaným vyhledáváním epitopu (HIER) použitím roztoku na vyhledávání cíle, specifikovaném v tomto příbalovém letáku pro primární protilátku. Přečtěte si rovněž část Postup, kde naleznete pokyny k přípravě vzorků 3-v-1. Kód K8024 zahrnuje roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (DM828). Lze rovněž doporučit použití EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (kód K8004) nebo EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (kód K8005). Některé primární protilátky vyžadují k optimálnímu zabarvení namísto HIER enzymatické předběžné zpracování tkání. Endogenní peroxidázu je třeba blokovat činidlem EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (SM821) obsaženým v této soupravě. Vzhledem k účinnému postupu promývání a přítomnosti stabilizačních proteinů v činidlech výrobce Dako, není potřeba další blokovací krok ke snížení nespecifického dobarvení pozadí. Doporučuje se použít pufr EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (DM831) obsažený v této soupravě nebo jako volitelné činidlo (kód K8007). Primární protilátky nejsou součástí této soupravy. Doporučujeme použít primární protilátky k okamžitému použití Dako FLEX Ready-to-Use Primary Antibodies nebo koncentrované primární protilátky Dako concentrated Primary Antibodies. EnVision FLEX Antibody Diluent (kód K8006) se doporučuje pro ředění koncentrovaných primárních protilátek Dako concentrated Primary Antibodies. EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) (kód K8019) lze přidat pro volitelnou amplifikaci signálu králičích primárních protilátek. Pokud se používají myší primární protilátky, pro signální amplifikaci je možné použít roztok EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (kód K8022 nebo zahrnutý v kódu K8012). Pro orientaci: EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) poskytuje 2 3násobnou amplifikaci signálu a EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) poskytuje 4 5tinásobnou amplifikaci signálu. Detekční činidla v této soupravě Dako EnVision FLEX /HRP detection reagent (DM822) obsahují dextranový řetězec, na který se váže velký počet molekul peroxidázy (HRP) a molekul sekundární protilátky. Pro vazebnou reakci se používá unikátní chemikálie, která umožňuje vazbu až 100 molekul HRP a až 20 molekul protilátky na řetězec. Substrátový systém v této soupravě se skládá ze dvou komponent: EnVision FLEX DAB+ Chromogen (DM827), koncentrovaný roztok diaminobenzidinu (DAB) a EnVision FLEX Substrate Buffer (DM823), s obsahem peroxidu vodíku. Před použitím se musí chromogen EnVision FLEX DAB+ Chromogen naředit pufrem EnVision FLEX Substrate Buffer. Substrátový systém vytváří hnědě zbarvený koncový produkt v místě cílového antigenu. Pro kontrastní barvení se doporučuje EnVision FLEX Hematoxylin (kód K8018). Činidlo poskytuje jasně modré nukleární barvení. Obarvené tkáně nebo řezy lze montovat buď vodným médiem nebo montovacím médiem na bázi organického rozpouštědla.

4 Činidla A. Dodávané materiály DM821 DM822 DM827 DM823 DM828 DM831 EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent 3 x 13 ml, k okamžitému použití Fosfátový pufr obsahující peroxid vodíku, 15 mmol/l NaN 3 a detergent. EnVision FLEX /HRP 3 x 13 ml, k okamžitému použití Dextran navázaný s molekulami peroxidázy a molekulami kozí sekundární protilátky proti králičím a myším imunoglobulinům. V pufrovém roztoku obsahujícím stabilizující protein a konzervační látku. EnVision FLEX DAB+ Chromogen 1 x 3 ml 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrochlorid v organickém rozpouštědle. Barva činidla může kolísat od silně fialové až po bezbarvou; rozdíly v barvě nemají žádný vliv na účinnost soupravy. EnVision FLEX Substrate Buffer 7 x 13 ml Pufrový roztok s obsahem peroxidu vodíku a konzervačním činidlem. EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) 3 x 30 ml, 50x koncentrováno Tris/EDTA pufr, ph 9 EnVision FLEX Wash Buffer (20x) 2 x 1 L, 20x koncentrovaný fyziologický roztok pufrovaný Tris, který obsahuje Tween 20, ph 7,6 (±0,1). B. Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Přístroj Dako Autostainer/Autostainer Plus Dako PT Link Dako Proteinase K, Ready-to-Use (je-li potřeba) Dako FLEX Ready-to-Use Primary Antibodies nebo vhodně naředěné koncentrované primární myší nebo králičí protilátky od výrobce Dako Dako FLEX Ready-to-Use Rabbit nebo Mouse Universal Negative Control nebo jiné vhodné činidlo pro negativní kontrolu pro primární protilátku Nádoby k přístroji Dako Mikroskopická sklíčka, např. FLEX IHC Microscope Slides Běžná laboratorní činidla k odstranění parafínu z parafínových tkáňových řezů Montovací médium (vodné nebo na bázi organického rozpouštědla) a krycí sklíčka C. Volitelná činidla K8004 DM828

5 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) 3 x 30 ml, 50x koncentrováno Tris/EDTA pufr, ph 9 K8005 DM829 K8006 DM830 K8007 DM831 K8018 DM826 K8019 DM825 K8022 SM824 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) 3 x 30 ml, 50x koncentrováno citrátový pufr, ph 6,1 EnVision FLEX Antibody Diluent 120 ml, k okamžitému použití Tris pufr, ph 7,2 s obsahem 15 mmol/l NaN 3 a protein. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) 1 L, 20x koncentrovaný fyziologický roztok pufrovaný Tris, který obsahuje Tween 20, ph 7,6 (±0,1). EnVision FLEX Hematoxylin 10 x 13 ml, k okamžitému použití Vodný roztok hematoxylinu. EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) 3 x 13 ml, k okamžitému použití V pufrovém roztoku obsahujícím stabilizující protein a antimikrobiální činidlo. Obsahuje dostatek činidla pro testů, založeno na použití µl na test. EnVision FLEX+, Mouse (LINKER) 3 x 13 ml, k okamžitému použití V pufrovém roztoku obsahujícím stabilizující protein a antimikrobiální činidlo. Obsahuje dostatek činidla pro testů, založeno na použití µl na test. Bezpečnostní opatření 1. Určeno pro profesionální uživatele. 2. EnVision FLEX /HRP, EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) a EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) obsahuje materiál živočišného původu a vzhledem k výrobním postupům nelze vyloučit stopy lidského materiálu. Jako u každého výrobku biologického původu je nutno dodržovat řádná bezpečnostní opatření. 3. Nevystavujte EnVision FLEX DAB+ Chromogen, EnVision FLEX Substrate Buffer nebo EnVision FLEX Substrate Working Solution během procedury silnému světlu. 4. P EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) a EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) obsahuje 5-<10% Nonoxinol: H319 H411 Varování Způsobuje vážné podráždění očí. Toxický pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky.

6 P280 P273 P264 P305 + P351 + P338 P337 + P313 P501 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. Zabraňte uvolnění do životního prostředí. Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. Přetrvává-li podráždění očí: Vyhledejte lékařskou pomoc. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. 5. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) obsahuje 10-30% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride: H319 H315 P280 P264 P302 + P352 + P P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Varování Způsobuje vážné podráždění očí. Dráždí kůži. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. PŘI STYKU S KŮŽÍ: Omyjte velkým množstvím vody a mýdla. Kontaminovaný oděv svlékněte. Kontaminovaný oděv před opětovným použitím vyperte. Při podráždění kůže: Vyhledejte lékařskou pomoc. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. Přetrvává-li podráždění očí: Vyhledejte lékařskou pomoc. 6. Pro EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent je bezpečnostní list pro profesionální uživatele k dispozici na vyžádání. 7. EnVision FLEX DAB+ Chromogen obsahuje 1 5 % 3,3 -diaminobenzidin tetrahydrochloridu a je označena: Nebezpečí H350 Může vyvolat rakovinu. H341 Podezření na genetické poškození. P201 Před použitím si obstarejte speciální instrukce. P202 Nepoužívejte, dokud jste si nepřečetli všechny bezpečnostní pokyny a neporozuměli jim. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. P308 + P313 PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. P405 Skladujte uzamčené. P501 Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. 8. Volitelné činidlo EnVision FLEX Antibody Diluent (kód K8016) obsahuje azid sodný (NaN 3 ), který je v čisté formě vysoce toxický. Přestože se koncentrace azidu sodného ve výrobku neklasifikuje jako nebezpečná, může reagovat s olovem a mědí v odpadním potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy těchto kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množstvím vody, aby nedocházelo k usazování azidů kovů v potrubí. 9. Používejte odpovídající osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. 10. Nespotřebované roztoky je nutno likvidovat v souladu s místními a celostátními předpisy. Skladování Uchovávejte činidla EnVision FLEX a EnVision FLEX+ při 2 8 C. Uchovávejte EnVision FLEX Hematoxylin (kód K8018) při pokojové teplotě v temnu. Nepoužívejte po

7 datu exspirace vytištěném na lahvičce. Pokud se činidla skladují za jakýchkoli jiných než uvedených podmínek, musí uživatel tyto podmínky ověřit. Připravený pracovní substrátový roztok Substrate Working Solution se musí skladovat v temnu při 2 8 C a je nutno ho spotřebovat během 5 dnů. Pokud zpozorujete neočekávané zabarvení, které nelze vysvětlit změnami laboratorních postupů a máte podezření, že se jedná o problém s tímto produktem, obraťte se technické služby společnosti Dako. Příprava činidel A.1 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (DM828, kód K8004) Před započetím plánovaného barvícího postupu nařeďte dostatečné množství roztoku EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) v poměru 1:50 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Jestliže se pro předběžné zpracování používá nádrž Dako PT Link, ředění je možné provést vyprázdněním obsahu ampulky s roztokem Target Retrieval Solution (50x) do nádrže Dako PT Link a přidáním destilované nebo deionizované vody až po vyznačenou rysku (ryska plnění). Roztoky zlikvidujte, pokud jsou zakalené. Když se používá společně s PT Link pro předběžné zpracování 3-v-1, je možné naředěný roztok použít 3krát během 5 dní, jestliže je skladován při pokojové teplotě. A.2 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (DM829, kód K8005) Před započetím plánovaného barvícího postupu nařeďte dostatečné množství roztoku EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) v poměru 1:50 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Jestliže se pro předběžné zpracování používá nádrž Dako PT Link, ředění je možné provést vyprázdněním obsahu ampulky s roztokem Target Retrieval Solution (50x) do nádrže Dako PT Link a přidáním destilované nebo deionizované vody až po vyznačenou rysku (ryska plnění). Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Roztoky zlikvidujte, pokud jsou zakalené. Když se používá společně s PT Link pro předběžné zpracování 3-v-1 je možné naředěný roztok použít 3krát během 5 dní, jestliže je skladován při pokojové teplotě. A.3 EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (DM831, kód K8007) Před započetím plánovaného barvícího postupu nařeďte dostatečné množství roztoku EnVision FLEX Wash Buffer (20x) v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Aby se minimalizovala tvorba pěny, provádějte ředění přidáváním koncentrovaného pufru Wash Buffer do předem odměřeného množství destilované nebo deionizované vody. Roztok opatrně promíchávejte, až bude homogenní. Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Roztoky zlikvidujte, pokud jsou zakalené. Když se používá společně s PT Link pro předběžné zpracování 3-v-1 je možné naředěný roztok použít 3krát během 5 dní, jestliže je skladován při pokojové teplotě. A.4 EnVision FLEX Substrate Working Solution Roztok EnVision FLEX Substrate Working Solution s obsahem DAB se připraví pečlivým smícháním 1 kapky EnVision FLEX DAB+ Chromogen (DM827) na 1 ml EnVision FLEX Substrate Buffer (DM823). Použít EnVision FLEX Substrate Working Solution během 5 dnů (skladovat v temnu při 2 8 C). Sběr vzorků a příprava Vzorky mohou být tkáňové řezy fixované ve formalínu a zalité v parafínu. Doba fixace závisí na fixačním prostředku a na typu/tloušťce tkáně. Například tkáňové bločky o tloušťce 3 4 mm je potřeba fixovat v neutrálním pufrovaném formalínu po dobu hodin. Optimální tloušťka parafínových řezů je zhruba 4 µm. Vzorky se musí namontovat na mikroskopická sklíčka, např. FLEX IHC Microscope Slides (kód K8020). Řezy je třeba na sklíčka montovat pokud možno bez jakýchkoli záhybů. Příliš mnoho nerovností by mělo dopad na výsledný barevný produkt. POZNÁMKA: Mikroskopická sklíčka musí mít šířku vhodnou pro přístroj Dako Autostainer/Autostainer Plus. Popis vhodných mikroskopických sklíček je uveden v Návodu k obsluze k příslušnému přístroji Dako. Parafinové řezy musí být montovány po vyjmutí z předehřáté vodní lázně s obsahem destilované nebo deionizované vody. Vodní lázeň nesmí obsahovat žádné přísady (například želatinu, poly-l-lysin, atd.). Řezy se suší zahříváním, obvykle při teplotě ne vyšší než 60 C na dobu až 60 minut. Pro zajištění dobré přilnavosti řezů ke sklíčkům je důležité nechat z nich před započetím procesu sušení okapat vodu.

8 Postup K dosažení optimálních výsledků používají přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus techniky založené na různých principech. Před spuštěním protokolu na přístrojích Dako Autostainer/Autostainer Plus se nejdříve podrobně seznamte s Návodem k obsluze konkrétního přístroje Dako. Za účelem získání rekrodukovatelného vyhledávání epitopu se doporučuje vkládat nosiče sklíček vždy zcela zaplněné. Tím je zajištěna stejná intenzita zahřívání řezů v každém cyklu. A. Postup předběžného zpracování Doporučený postup přípravy vzorků 3-v-1 použito na PT Link: Deparafinaci, rehydrataci a tepelné vyhledávání epitopu (HIER) je možné provádět na tkáňových řezech fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu použitím postupu přípravy 3-v-1: 1. Připravte pracovní roztok naředěním koncentrovaného EnVision FLEX Target Retrieval Solution v poměru 1:50 destilovanou nebo deionizovanou vodou. 2. Naplnit nádrže PT Link dostatečným množstvím pracovního roztoku (1,5 l), aby se tkáňové vzorky zakryly. 3. Nastavte přístroj PT Link na předehřívání roztoku na 65 C. 4. Ponořit namontované, ve formalínu fixované, v parafínu zalité tkáňové řezy do předehřátého roztoku Target Retrieval Solution (pracovní roztok) do nádrží PT Link inkubovat po dobu minut při 97 C. Optimální doba inkubace musí být stanovena u živatelem. 5. Nechejte řezy ochladit v PT Link na 65 C. 6. Vyjměte každý stojan se sklíčky barvícího automatu z nádrže přístroje PT Link a ihned ho ponořte do nádoby/nádrže (např. stanice PT Link Rinse Station, kód PT109) s naředěným pufrem EnVision FLEX Wash Buffer (20x) pokojové teploty. 7. Ponechat sklíčka v naředěném pufru EnVision FLEX Wash Buffer (20x) pokojové teploty po dobu 5 minut. 8. Umístěte sklíčka do přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus a pokračujte barvením. Během předběžného zpracování a během imunohistochemického barvení nesmí řezy vyschnout. 9. Po obarvení se doporučuje provést dehydrataci, čištění a permanentní montáž. POZNÁMKA: Když se používá společně s PT Link pro předběžné zpracování 3-v-1 je možné naředěný roztok použít 3krát během 5 dní, jestliže je skladován při pokojové teplotě. Postup HIER pomocí PT Link: Po odstranění parafínu a hydrataci pufrem (vodou) je potřeba většinu řezů tkání předběžně zpracovat tepelně indukovaným vyhledáváním epitopu (HIER): 1. Připravte pracovní roztok naředěním koncentrovaného EnVision FLEX Target Retrieval Solution (50x) v poměru 1:50 destilovanou nebo deionizovanou vodou. 2. Naplňte nádrže PT Link dostatečným množstvím (1,5 L) pracovního roztoku, aby byly tkáňové řezy úplně zakryty. 3. Nastavte přístroj PT Link na předehřívání roztoku na 65 C. 4. Manuálně odstraňte parafín a rehydratujte tkáňové řezy namontované na podkladních sklech. Pro zvýšení přilnavosti řezů tkání ke sklíčku se doporučuje používat potažená podložní skla nebo silanizovaná skla. 5. Ponořit tkáňové řezy při pokojové teplotě do předehřátého roztoku EnVision FLEX Target Retrieval Solution (pracovní roztok) a inkubovat po dobu minut při 97 C. Optimální doba inkubace musí být stanovena uživatelem. 6. Nechejte řezy ochladit v PT Link na 65 C. 7. Vyjměte každý stojan se sklíčky z nádrže přístroje PT Link a ihned ho ponořte do nádoby/nádrže (např. stanice PT Link Rinse Station, kód PT109) s naředěným pufrem EnVision FLEX Wash Buffer (20x) pokojové teploty. 8. Ponechat sklíčka v naředěném pufru EnVision FLEX Wash Buffer (20x) pokojové teploty po dobu 5 minut.

9 9. Umístěte sklíčka do přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus a pokračujte barvením. Během předběžného zpracování a během imunohistochemického barvení nesmí řezy vyschnout. 10. Po obarvení je potřeba sklíčka namontovat pomocí vodného nebo permanentního montovacího média. POZNÁMKA: Když se používá společně s PT Link pro předběžné zpracování 3-v-1 je možné naředěný roztok použít 3krát během 5 dní, jestliže je skladován při pokojové teplotě. Postup HIER použitím nádob Coplin: Po odstranění parafínu a hydrataci pufrem (vodou) je potřeba většinu řezů tkání předběžně zpracovat tepelně indukovaným vyhledáváním epitopu (HIER): 1. Vložte nádoby na barvení obsahující naředěný roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution (50x) do vodní lázně. 2. Zahřejte vodní lázeň a nádoby naplněné roztokem EnVision FLEX Target Retrieval Solution (pracovní roztok) na C. Zakryjte nádoby víke m, aby se stabilizovala teplota a zamezilo se odpařování. 3. Ponořte řezy vyvážené při pokojové teplotě do předehřátého roztoku EnVision FLEX Target Retrieval Solution (pracovní roztok) do nádob na barvení. 4. Přiveďte teplotu vodní lázně a roztoku EnVision FLEX Target Retrieval Solution zpět na C. Inkubujte 20 ( ±1) minut při C. 5. Vyjměte celou nádobu se sklíčky z vodní lázně. Nechejte podložní skla zchladnout v roztoku EnVision FLEX Target Retrieval Solution po dobu 20 (±1) minut při pokojové teplotě. 6. Slijte roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution a opláchněte řezy naředěnýcm pufrem EnVision FLEX Wash Buffer (20x) pokojové teploty na dobu 1 5 minut. 7. Umístěte stojan s propláchnutými sklíčky do přístroje Dako Autostainer/Autostainer Plus. Ihned započněte předem naprogramovaný cyklus barvení. POZNÁMKA: Když se pro postup HIER používají nádoby Coplin, je možné použít naředěný roztok Target Retrieval Solution a naředěný pufr Wash Buffer pouze jedenkrát (pouze na jedno použití). Několik epitopů nesnáší HIER a některé vyžadují enzymatické předběžné zpracování. Další pokyny naleznete v příbalovém letáku k jednotlivým primárním protilátkám výrobce Dako. Tkáňové řezy nesmí během zpracování nebo během následného imunohistochemického barvení vyschnout. Z důvodu vyšší přilnavosti řezů tkání k podložním sklům se doporučuje používat podložní skla FLEX IHC Microscope Slides (kód K8020). B. Postup barvení Dako FLEX Ready-to-Use Primary Antibodies lze použít s detekčním systémem Dako EnVision FLEX+ a aplikovat na tkáňové řezy fixované ve formalínu, zalité v parafínu. Návod na ředění koncentrovaných primárních protilátek Dako je uveden v příbalovém letáku k jednotlivým koncentrovaných primárním protilátkám. Koncentrované primární protilátky lze ředit pomocí EnVision FLEX Antibody Diluent (DM830, kód K8006). V softwaru přístrojů Autostainer/Autostainer Plus jsou předem naprogramovány kroky barvení a inkubační doby, za použití následujících protokolů: Šablona protokolu: Šablona protokolu: FLEX_200 (200 µl dávkovací objem) nebo FLEX_300 (300 µl dávkovací objem) Automatické programy pro barvící cykly: FLEX (FLEX protokol) FLEX_Mo (FLEX+ Mouse (LINKER) protokol) FLEX_Rb (FLEX+ Rabbit (LINKER) protokol) Doplňkový krok je třeba nastavit na proplachovat pufrem v barvicím cyklu s 10 sklíčky. Barvíte-li v cyklu 10 sklíček, nastavte doplňkový krok na žádný. Tím se zajistí srovnatelné doby promývání. Všechny kroky inkubace by měly probíhat při pokojové teplotě. Další informace v návodu k obsluze příslušného přístroje. Pokud nejsou na používaných přístrojích Dako Autostainer/Autostainer Plus připraveny protokoly, kontaktujte technické služby výrobce Dako.

10 Optimální časy inkubace primární protilátky a EnVision FLEX /HRP závisí na aplikované primární protilátce. Další pokyny naleznete v příbalovém letáku k jednotlivým primárním protilátkám výrobce Dako. Uživatel musí aplikovaný protokol ověřit. Po ukončení barvící procedury je třeba vzorky namontovat. Po ukončení předběžného zpracování sklíček postupem 3-v-1 se doporučuje provést dehydrataci, čištění a permanentní montáž. Sklíčka zpracovávaná postupem HIER je možné montovat pomocí vodného nebo permanentního montovacího média. Pro montáž vodným roztokem se doporučují například montovací média Dako Glycergel Mounting Medium, kód C0563 nebo Faramount Aqueous Mounting Medium kód S3025. Kontrola kvality Každý barvicí cyklus musí zahrnovat kontrolní vzorek o kterém je známo, že je pozitivní za účelem zajištění správné účinnosti všech aplikovaných činidel. Pokud se při pozitivních kontrolách neprojeví pozitivní zabarvení, je nutno považovat výsledky testovacích vzorků za neplatné. Aby bylo možno identifikovat nespecifické zabarvení, musí se použít činidla pro negativní kontrolu. Jestliže není možné jednoznačně rozlišit nespecifické zabarvení od specifického zabarvení, je třeba považovat test vzorku za neplatný. Interpretace výsledků Pracovní substrátový roztok s Substrate Working Solution obsahem diaminobenzidinu barví hnědě místa s cílovým antigenem rozpoznané primární protilátkou. Hnědé zabarvení musí být přítomno na vzorku pro pozitivní kontrolu v očekávaném místě cílového antigenu. Je-li přítomno nespecifické zabarvení, objeví se spíše jako difúzní, hnědé zabarvení na sklíčcích zpracovávaných s činidly pro negativní kontrolu. Jádro se kontrastním barvivem hematoxylin zabarví do modra. Omezení 1. Platí pouze pro automatizované přístroje Dako Autostainer. Pokud se provádí manuální barvení, musí uživatel stanovit a ověřit optimální postup, pokud není v příbalové informaci ke konkrétní primární protilátce uvedeno jinak. 2. Používejte pouze tkáňové řezy fixované ve formalínu a zalité v parafínu. Pokud se používají zmrazené řezy, musí uživatel stanovit a ověřit optimální postup, pokud není v příbalové informaci ke konkrétní primární protilátce uvedeno jinak. Změny postupu mohou mít vliv na počet testů provedených pomocí této soupravy.

11 Vysvětlivky k symbolům Katalogové číslo Teplotní ro zmezí Použitelné do Piktogram GHS(viz část o bezpečn ostních opatřeních ) In vitro dia gnostický zdravotnický prostředek Obsah p ostačující p ro <n> testů Výrobce Seznamte se s návodem k použití Obsah p ostačující p ro <n> testů Piktogram GHS(viz část o bezp ečnostních opatřeních) Systémy DAKO EnVision jsou kryty patentem USA 5,543,332 a patentem pro Evropu 594,772. Vyrobeno: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel Fax