CEA ELISA test pro kvantitativní stanovení karcinoembryonického antigenu (CEA) v lidském séru

Transkript

1 CEA ELISA test pro kvantitativní stanovení karcinoembryonického antigenu (CEA) v lidském séru Obj. číslo: testů kompletní souprava Účel použití Karcinoembryonický antigen (CEA) je glykoprotein s molekulární hmotností 180 kda syntetizovaný během normálního vývoje plodu v gastrointestinálním traktu a pankreasu a je vylučován do oběhového systému. U dospělých není syntéza CEA zcela redukována. U nekuřáků může být zjištěn imunologickými metodami 1. CEA je nejvíce používán jako ukazatel rakoviny gastrointestinálního traktu. Celkový CEA je primárně asociovaný s kolorektální rakovinou, zvýšené hladiny CEA mohou způsobit i jiná nádorová onemocnění, včetně rakoviny prsu, plic, žaludku, vaječníků a jiných orgánů. Benigní stavy, které způsobují vyšší než normální hladiny, zahrnují zápal plic, jater (cirrhosa) a gastrointestinálního traktu a benigní rakovinu 2,3. Silní kuřáci, jako skupina, mají základní koncentraci CEA vyšší než je normální. Kvantitativní stanovení CEA je používáno při monitorování pacientů s diagnostikovaným nádorovým onemocněním, u kterých byly pozorovány zvýšené koncentrace CEA 4. Princip - sendvičová EIA - Test CEA ELISA firmy HUMAN je založen na klasické sendvičové technice ELISA, využívající vysoké afinity systému biotin-streptavidin. Streptavidinem byl potažen povrch mikrotitračních jamek. V prvním inkubačním kroku jsou vzorky, kalibrátory nebo kontroly a enzymový konjugát (monoklonální protilátky proti CEA značené peroxidasou nebo biotinylované) smíchány za vzniku sendvičového komplexu, který je vázán na povrch jamek interakcí biotinu s imobilizovaným streptavidinem. Na konci inkubace jsou přebytečný enzymový konjugát a nenavázaný antigen vymyty. Je přidán substrát a vyvine se modré zbarvení, které se po zastavení reakce ukončovacím roztokem mění na žluté. Intenzita zabarvení je přímo úměrná koncentraci CEA ve vzorku. Absorbance kalibrátorů a vzorků je stanovena destičkovým ELISA spektrofotometrem (HUMAREADER). Koncentrace vzorku je interpolována pomocí kalibrační křivky, která je stanovena z kalibrátorů o známé koncentraci CEA. Obsah soupravy [MIC] 12 Mikrotitrační destičky (v jednodestičkovém držáku) 8-jamkové ulamovatelné řádky, potažené streptavidinem [CAL] A - F Kalibrátory (bílé víčko) 6x2.0mlPřipraveno k použití, v lidském séru CEA koncentrace: 0 (A), 5 (B), 10 (C), 25 (D), 50 (E), a 250 (F) ng/ml [CON] 13 ml Konjugát Protilátka-Enzym (bílé víčko) připraveno k použití, žluté ph 7.45 ± 0.1 anti-cea (myší) biotinylované a anti-cea (kozí) značené HRP [WS] 20 ml Promývací roztok (černé víčko) Koncentrát pro asi 1000 ml ph 8.8 ± 0.4 MOPSem pufrovaná sůl 5 mmol/l [SA] 7.0 ml Substrátová reagencie A (žluté víčko) ph 3.5 ± 0.1 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 1 g/l Acetátový pufr 0.05 mol/l [SB] 7.0 ml Substrátová reagencie B (modré víčko) ph 4.5 ± 0.1 Peroxid močoviny 0.8 g/l Acetátový pufr 0.05 mol/l [STOP] 7.5 ml Ukončovací roztok (červené víčko) Kyselina sírová 0.5 mol/l 1 Lepící páska Konzervanty: Celková koncentrace <0,04%

2 Bezpečnostní poznámky Nepolykejte reagencie. Zabraňte potřísnění očí, kůže a sliznic. Se všemi vzorky a [CAL] zacházejte jako s materiálem potenciálně infekčním. [CAL] byly kontrolovány na úrovni dárců na přítomnost protilátek proti HCV a HIV-1/2 a HBsAg s negativním výsledkem. Používejte ochranné oblečení a jednorázové rukavice dle zásad správné laboratorní praxe. Všechny materiály, kontaminované vzorky pacientů nebo [CAL], musí být inaktivovány schválenými postupy (autoklávování nebo chemické ošetření) v souladu s příslušnými předpisy. [STOP] dráždí oči, kůži a sliznice. Při kontaktu pečlivě omývejte velkým množstvím vody a konzultujte s lékařem. Stabilita Při skladování při teplotě 2 8 C jsou reagencie stabilní do data exspirace uvedeného na jednotlivých štítcích. Po otevření musí být reagencie uloženy při teplotě 2 8 C a použity během 60 dnů (viz Poznámky). [MIC] - uzavřeno v hliníkovém obalu se sušidlem - před otevřením musí mít pokojovou teplotu - nepoužité: vraťte se sušidlem zpět do obalu a skladujte při 2-8 C. (viz poznámka) Nedotýkejte se horního okraje ani vnitřku jamek prsty! Příprava reagencií Zahřejte před použitím všechny reagencie na pokojovou teplotu (15-25 C). Nepoužívané reagencie by měly být skladovány vždy při 2-8 C Pracovní promývací roztok [WASH] -slabý zákal, který se může objevit v koncentrátu [WS], se při ředění úplně rozpustí -zřeďte [WS] tak, že vylijete obsah lahvičky do 1000 ml čerstvé deionizované vody ve vhodné nádobě. Několikrát lahvičku [WS] roztokem [WASH] propláchněte. Stabilita po zředění: 60 dní při C. Pracovní roztok substrátu [SUB] - pro použití na delší časový úsek: připravte potřebné množství smícháním stejných dílů [SA] a [SB]. Používejte pouze čisté plastikové lahvičky vypláchnuté neionizovanou vodou. - pro použití během 30 dní: Slijte obsah lahviček [SA] a [SB] dohromady, promíchejte a skladujte při 2-8 C. - se [SUB] zacházejte opatrně a zabraňte kontaminaci! Nepoužívejte, jestliže roztok vypadá modře. - Skladujte chráněné před světlem. - Stabilita: 30 dní při 2-8 C Vzorky Sérum Nepoužívejte vysoce lipemické a hemolyzované vzorky. Vzorky je možné skladovat při 2-8 C 5 dní nebo 30 dní při -20 C. Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Rozmražené vzorky musí být homogenizovány. Odstraňte částice centrifugací nebo filtrací. Pracovní postup Dodržujte postup přesně! Poznámky k postupu P1: Nemíchejte složky s jinými čísly šarží. Nezaměňujte víčka lahviček (nebezpečí kontaminace). Nepoužívejte reagencie po jejich datu exspirace. P2: Nepoužívejte reagencie, které mohou být kontaminovány nebo vypadají či páchnou jinak než je obvyklé. P3: Zaznamenávejte pečlivě vzorky a kontroly do formuláře dodávaného s kitem P4: [MIC] vyberte požadovaný počet stripů (řádek) destičky a řádně upevněte v držáku. P5: Nechte probíhat reakce kontrol, [CAL] a vzorků duplicitně (od každého dvě). Pipetujte kontroly a vzorky i [CAL] přímo na dno mikrojamek. P6: Vždy přidávejte reagencie v tomtéž pořadí, abyste minimalizovali rozdíly v reakčním čase mezi jamkami. Toto je důležité pro reprodukovatelné výsledky. Pipetování vzorků by nemělo překročit 10 minut. Jinak pipetujte kalibrační křivku v naznačených polohách v poločase série. Jestli se používá více než jedna destička, opakujte dávce odpovídající (kalibrační) křivku pro každou destičku. P7: Odstraňte vzduchové bubliny před inkubací a odečítání absorbance. P8: [SUB] inkubujte ve tmě. [SUB] iniciuje kinetickou reakci, která je zakončena přidáním [STOP]. P9: [MIC] jemně kývejte s destičkou sekund po každém pipetovacím kroku, abyste důkladně promíchali obsah jamek, aniž vylijete roztoky. Je-li to možné, míchejte na automatické míchačce. Promývací procedura Promývací procedura je kritická. Nedostatečné promytí sníží přesnost nebo falešně zvýší absorbanci. W1: Odstraňte lepící pásku, vylijte obsah jamek a přidejte [WASH] do každé jamky, po 30 sekundách navlhčování vylijte a opakujte promytí. W2: V případě automatického promývání začněte s [WASH] a promyjte stripy 3x.. Ujistěte se, že promývač úplně plní všechny jamky a účinně

3 vylívá obsah po 30 sekundách (zbývající kapalina po vylití v jamce< 15ml). W3: Po promytí odstraňte zbývající kapalinu buničinou s destičky obrácené vzhůru nohama. Pipetovací schéma Reagencie a vzorky musí mít před použitím pokojovou teplotu Krok 1 Jamka [µl] A1...D2 Calibrators E2... Specimen [CAL] A-F; dvakrát Vzorky, Kontroly; dvakrát [CON] Promíchejte a přikryjte [MIC] lepící páskou. Inkubujte 60 min při C Promyjte 3 x jak je popsáno (viz W1 - W3) [WASH] Krok 2 [SUB] Inkubujte 15 min při C (viz P8) [STOP] Opatrně promíchjte. Změřte absorbanci at 450 nm hned, jakmile je to možné nebo během 10 min. po skončení reakce, za použití referenční vlnové délky nm (je-li to možné). Platnost testu Výsledky testu jsou platné, jsou-li splněna následující kritéria: 1) Maximální absorbance (kalibrátor F) O.D. max. 1,5 2) Analyzuje se na 3 úrovních: při 80 %O.D. max. = 200± 50 ng/ml při 50 % O.D. max. = 100 ± 45 ng/ml při 20 % O.D. max. = 25 ± 15 ng/ml Výpočet Kalibrační křivka se používá k odečtení koncentrace CEA v neznámých vzorcích. 1. Vyneste na milimetrový papír absorbance duplicitních kalibrátorů proti odpovídající koncentraci CEA v ng/ml (nepočítejte z dvojic průměrnou hodnotu a vyneste obě hodnoty absorbance). 2. Vytvořte regresní přímku. 3. Koncentraci CEA v neznámém vzorku (S) zjistíte tak, že od hodnoty průměrné absorbance vzorku na svislé ose vedete přímku až protne křivku, tomuto bodu odpovídá na horizontální ose příslušná koncentrace (v ng/ml). Pro ilustraci viz obrázek. Interpretace výsledků CEA je již léta neznámějším a nejakceptovanějším příznakem nádoru. Může být detekován u řady nádorových onemocnění, ale má nízkou klinickou citlivost a specifitu. Pacienti s kolorektální rakovinou zvýšené hodnoty CEA nemusí vykazovat. Postup nebo ústup nemoci nemusí mít vždy za následek zvýšené hladiny CEA. Kuřáci, ale také starší lidé vykazují vyšší rozsah základních hodnot než nekuřáci a mladší osoby. CEA je důležitým příznakem pro metastáze. Vysoké hladiny mohou být očekávány u metastází v kostech, játrech, plicích a při vícečetných metastázích. Trvalé vysoké hladiny po léčbě obvykle indikují zbytkové maligní oblasti nebo metastázy. Stálé snižování je spojeno s příznivou prognózou. Stanovení hodnoty CEA samotné není postačující pro stanovení rakoviny. Musí být použito ve spojení s jinými klinickými projevy a diagnostickými parametry. Očekávané hodnoty Nekuřáci (90%) Kuřáci Hladina CEA (1) < 5 ng/ml < 10 ng/ml Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní očekávané hodnoty vzhledem k používaným přístrojům, metodám odběru krve a testovacím technikám užívaným v této laboratoři.

4 Parametry testu Test CEA ELISA firmy HUMAN má citlivost cca 0,01 ng. To je ekvivalent koncentrace CEA 0,45 ng/ml vzorku. Vzorky s koncentrací CEA nad 250 ng/ml musí být zředěny v poměru 1+9 normálním sérem (CEA < 5 ng/ml) a znovu analyzovány. Výsledek násobte 10. Analýza je standardizována v souladu s WHO 1 st I.R.P. pro CEA (73/601): 1 ng/ml = 0,011 IU/ml. Poznámka Výrobky jsou i po otevření stabilní do data expirace. Jejich kontaminace ovšem přímo souvisí s počtem otevření lahviček. Proto je z důvodu bezpečnosti stanoven 60 denní limit pro používání po prvním použití. Opatrná manipulace dle zásad správné laboratorní praxe (*) poskytuje možnost používat reagencie i po uplynutí 60 dnů. Reagencie musí vždy splnit kritéria kontroly kvality! (* To zahrnuje: Uzavírat lahvičky správnými zátkami a těsně je dotahovat / množství reagencií potřebné pro analýzu odebrat z velkých balení, mohou-li tyto reagencie přijít do styku s kontaminujícími látkami (např. séry pacientů) / reagencie co nejdřív vracet do chladničky (2 8 C). Literatura 1. Wild, D., The immunoassay Handbook, Stockton Press, 444 (1994) 2. Zamcheck, N., Adv Intern Med 19, 413 (1974) 3. Rayncao, G., Chu, T., JAMA 220, 381 (1972) 4. Begent, R., Ann Clin Biochem 21, (1984) Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbh Max-Planck-Ring 21 - D Wiesbaden - Germany Telefon: Telefax: human@human.de

5 EL-CEA INF GB