PSA ELISA test pro kvantitativní stanovení celkového prostatického specifického antigenu (PSA) v lidském séru

Transkript

1 PSA ELISA test pro kvantitativní stanovení celkového prostatického specifického antigenu (PSA) v lidském séru Obj. číslo: testů kompletní souprava Účel použití Prostatický specifický antigen (PSA) je glykoprotein (serinová proteasa) s molekulární hmotností 28.4 kda 1, vytvářený v buňkách epitelu prostaty. PSA je detekován nejen u mužů, ale také u žen s rakovinou prsu (30-40%). V mužském séru může být PSA detekován jako volná nebo komplexní molekula imunologickými metodami. Celkové PSA je detekováno tímto testem ELISA. Zvýšené hladiny PSA se nalézají u benigních, maligních a metastatických rakovin prostaty. Protože rakovina prostaty je druhá nejvíce převažující forma zhoubného nádoru u mužů, zjištění zvýšených úrovní PSA hraje ve včasné diagnostice důležitou roli. Hladiny PSA v séru byly v diagnostice a terapeutickém monitorování pacientů díky zvýšené citlivosti shledány jako užitečnější než stanovení prostatické kyseliny fosfátové (PAP) 2. Princip - sendvičová EIA - Test PSA ELISA firmy HUMAN je založen na klasické sendvičové technice ELISA, využívající vysoké afinity systému Biotin-Streptavidin. Streptavidinem je potažen povrch mikrotitračních jamek. V prvním inkubačním kroku jsou vzorky, kalibrátory nebo kontroly, enzymový konjugát (monoklonální protilátky proti PSA značené peroxidázou nebo biotinylované) smíchány za formování sendvičového komplexu, který je vázán na povrch jamek interakcí biotinu s imobilizovaným streptavidinem. Na konci inkubace jsou přebytečný enzymový konjugát a nenavázaný antigen vymyty. Je přidán substrát a vzniká modré zbarvení, která se po zastavení reakce ukončovacím roztokem mění na žluté. Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci PSA ve vzorku. Absorbance kalibrátorů a vzorků je stanovena s využitím čtečky mikrodestiček ELISA (HUMAREADER). Koncentrace vzorků je vyhodnocena pomocí kalibrační křivky, která je vytvořena pomocí kalibrátorů o známé koncentraci PSA. Obsah soupravy [MIC] 12 Mikrotitrační destičky (v jednodestičkovém držáku) 8-jamkové ulamovatelné řádky, potažené streptavidinem [CAL] A - F Kalibrátory (bílé víčko) 6x2.0mlPřipraveno k použití, v lidském séru PSA koncentrace: 0 (A), 5 (B), 10 (C), 25 (D), 50 (E), a 100 (F) ng/ml [CON] 13 ml Konjugát Protilátka-Enzym (bílé víčko) připraveno k použití, žluté ph 7.45 ± 0.1 anti-psa (myší) biotinylované nebo značené HRP [WS] 20 ml Promývací roztok (černé víčko) Koncentrát pro asi 1000 ml ph 8.8 ± 0.4 MOPSem pufrovaná sůl 5 mmol/l [SA] 7.0 ml Substrátová reagencie A (žluté víčko) ph 3.5 ± 0.1 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 1 g/l Acetátový pufr 0.05 mol/l [SB] 7.0 ml Substrátová reagencie B (modré víčko) ph 4.5 ± 0.1 Peroxid močoviny 0.8 g/l Acetátový pufr 0.05 mol/l [STOP] 7.5 ml Ukončovací roztok (červené víčko) Kyselina sírová 0.5 mol/l 1 Lepící páska Konzervanty: Celková koncentrace <0,04% Bezpečnostní poznámky Nepolykejte reagencie. Zabraňte potřísnění očí, kůže a sliznic. Se všemi vzorky a [CAL] zacházejte jako s materiálem potenciálně infekčním. [CAL] byly kontrolovány na úrovni dárců na přítomnost protilátek proti HCV a HIV-1/2 a HBsAg s negativním výsledkem. Používejte ochranné oblečení a jednorázové rukavice dle zásad správné laboratorní praxe. Všechny materiály, kontaminované vzorky pacientů nebo [CAL], musí být inaktivovány schválenými postupy (autoklávování nebo chemické

2 ošetření) v souladu s příslušnými předpisy. [STOP] dráždí oči, kůži a sliznice. Při kontaktu pečlivě omývejte velkým množstvím vody a konzultujte s lékařem. Stabilita Při skladování při teplotě 2 8 C jsou reagencie stabilní do data exspirace uvedeného na jednotlivých štítcích. Po otevření musí být reagencie uloženy při teplotě 2 8 C a použity během 60 dnů (viz Poznámky). [MIC] - uzavřeno v hliníkovém obalu se sušidlem - před otevřením musí mít pokojovou teplotu - nepoužité: vraťte se sušidlem zpět do obalu a skladujte při 2-8 C. (viz poznámka) Nedotýkejte se horního okraje ani vnitřku jamek prsty! Příprava reagencií Zahřejte před použitím všechny reagencie na pokojovou teplotu (15-25 C). Nepoužívané reagencie by měly být skladovány vždy při 2-8 C Pracovní promývací roztok [WASH] -slabý zákal, který se může objevit v koncentrátu [WS], se při ředění úplně rozpustí -zřeďte [WS] tak, že vylijete obsah lahvičky do 1000 ml čerstvé deionizované vody ve vhodné nádobě. Několikrát lahvičku [WS] roztokem [WASH] propláchněte. Stabilita po zředění: 60 dní při C. Pracovní roztok substrátu [SUB] - pro použití na delší časový úsek: připravte potřebné množství smícháním stejných dílů [SA] a [SB]. Používejte pouze čisté plastikové lahvičky vypláchnuté neionizovanou vodou. - pro použití během 30 dní: Slijte obsah lahviček [SA] a [SB] dohromady, promíchejte a skladujte při 2-8 C. - se [SUB] zacházejte opatrně a zabraňte kontaminaci! Nepoužívejte, jestliže roztok vypadá modře. - Skladujte chráněné před světlem. - Stabilita: 30 dní při 2-8 C Vzorky Sérum Nepoužívejte vysoce lipemické a hemolyzované vzorky. Vzorky je možné skladovat při 2-8 C 5 dní nebo 30 dní při -20 C. Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Rozmražené vzorky musí být homogenizovány. Odstraňte částice centrifugací nebo filtrací. Pracovní postup Dodržujte postup přesně! Poznámky k postupu P1: Nemíchejte složky s jinými čísly šarží. Nezaměňujte víčka lahviček (nebezpečí kontaminace). Nepoužívejte reagencie po jejich datu exspirace. P2: Nepoužívejte reagencie, které mohou být kontaminovány nebo vypadají či páchnou jinak než je obvyklé. P3: Zaznamenávejte pečlivě vzorky a kontroly do formuláře dodávaného s kitem P4: [MIC] vyberte požadovaný počet stripů (řádek) destičky a řádně upevněte v držáku. P5: Nechte probíhat reakce kontrol, [CAL] a vzorků duplicitně (od každého dvě). Pipetujte kontroly a vzorky i [CAL] přímo na dno mikrojamek. P6: Vždy přidávejte reagencie v tomtéž pořadí, abyste minimalizovali rozdíly v reakčním čase mezi jamkami. Toto je důležité pro reprodukovatelné výsledky. Pipetování vzorků by nemělo překročit 10 minut. Jinak pipetujte kalibrační křivku v naznačených polohách v poločase série. Jestli se používá více než jedna destička, opakujte dávce odpovídající (kalibrační) křivku pro každou destičku. P7: Odstraňte vzduchové bubliny před inkubací a odečítání absorbance. P8: [SUB] inkubujte ve tmě. [SUB] iniciuje kinetickou reakci, která je zakončena přidáním [STOP]. P9: [MIC] jemně kývejte s destičkou sekund po každém pipetovacím kroku, abyste důkladně promíchali obsah jamek, aniž vylijete roztoky. Je-li to možné, míchejte na automatické míchačce. Promývací procedura Promývací procedura je kritická. Nedostatečné promytí sníží přesnost nebo falešně zvýší absorbanci. W1: Odstraňte lepící pásku, vylijte obsah jamek a přidejte [WASH] do každé jamky, po 30 sekundách navlhčování vylijte a opakujte promytí. W2: V případě automatického promývání začněte s [WASH] a promyjte stripy 3x.. Ujistěte se, že promývač úplně plní všechny jamky a účinně vylívá obsah po 30 sekundách (zbývající kapalina po vylití v jamce< 15ml). W3: Po promytí odstraňte zbývající kapalinu buničinou s destičky obrácené vzhůru nohama. Pipetovací schéma Reagencie a vzorky musí mít před použitím pokojovou teplotu

3 Krok 1 Jamka [µl] A1...D2 kalibrátory E2... vzorky (*a)[cal] A-F; dvakrát Vzorky, Kontroly; dvakrát [CON] Promíchejte a přikryjte [MIC] lepící páskou. (*b) Inkubujte 30 min při C Promyjte 3 x jak je popsáno (viz W1 - W3) [WASH] Krok 2 [SUB] Inkubujte 15 min při C (viz P8) [STOP] Opatrně promíchjte. Změřte absorbanci at 450 nm hned, jakmile je to možné nebo během 10 min. po skončení reakce, za použití referenční vlnové délky nm (je-li to možné). poznámka: pro zlepšení citlivosti pro nižší koncentrace použijte následující postup pro Krok 1 v krocích označených (*): (*a) použijte pouze 5 [CAL] (A, B, C, D, E) (*b) Inkubujte 60 min at C Pokračujte, jak je popsáno výše. Platnost testu Výsledky testu jsou platné, jsou-li splněna následující kritéria: 1) Maximální absorbance (kalibrátor F) O.D. max 1,5 2) Analyzuje se na 3 úrovních: Koncentrace PSA-S při 80 % O.D. max. = 65 ± 15 ng/ml Koncentrace PSA-S při 50 % O.D. max. = 30 ±8 ng/ml Koncentrace PSA-S při 20 % O.D. max. = 10 ± 4 ng/ml Výpočet Kalibrační křivka se používá k odečtení koncentrace CEA v neznámých vzorcích. 1. Vyneste na milimetrový papír absorbance duplicitních kalibrátorů proti odpovídající koncentraci CEA v ng/ml (nepočítejte z dvojic průměrnou hodnotu a vyneste obě hodnoty absorbance). 2. Vytvořte regresní přímku. 3. Koncentraci CEA v neznámém vzorku (S) zjistíte tak, že od hodnoty průměrné absorbance vzorku na svislé ose vedete přímku až protne křivku, tomuto bodu odpovídá na horizontální ose příslušná koncentrace (v ng/ml). Pro ilustraci viz obrázek. Interpretace výsledků Rakovina prostaty, druhá nejčastější forma mužského zhoubného bujení, vykazuje silný nárůst výskytu u mužů po dosažení 50 roků. Nejcitlivější metoda pro diagnostiku a terapeutické monitorování je kvantitativní stanovení PSA v séru. Koncentrace PSA má dobrou korelaci k velikosti a stavu vývoje nádoru. Hladiny PSA jsou zvýšené nejen v případě maligního karcinomu, ale také u benigní hypertrofie prostaty (BHP). Stanovení hodnoty PSA samotné není proto pro určení rakoviny dostatečné. Musí být použito ve spojení s jinými klinickými projevy a diagnostickými parametry (např. digitální rektální vyšetření, sonografie prostaty). Vysoké hladiny PSA se po chirurgickém odstranění prostaty velmi rychle snižují. Pokud přetrvávají, je to obvykle indikací reziduálních maligních ložisek nebo metastáz. Zvýšení hodnot PSA při konzervativní terapii indikuje rozvoj rakoviny prostaty v ranném stádiu (až o 6 měsíců dříve než jiné diagnostické metody). Stanovení volného PSA může být nápomocné při vyloučení BPH a stavů rakoviny prostaty 3. Očekávané hodnoty Zdravý muž Hladina PSA < 4 ng/ml

4 Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní očekávané hodnoty vzhledem k používaným přístrojům, metodám odběru krve a testovacím technikám obecně v této laboratoři užívaným. Parametry testu Test ELISA PSA firmy HUMAN má analytickou citlivost 0,122 ng/ml vzorku pro 30min. proceduru a 0,107 ng/ml vzorku pro 60 min. proceduru. Vzorky s koncentrací PSA nad 100 ng/ml musí být zředěny (1 + 9) normálním sérem (PSA 0 ng/ml) a znovu analyzovány. Výsledek násobte 10. Analýza je standardizována v souladu se standardem EU pro PSA - BCR č.613. Typické údaje o parametrech testu lze najít ve Verification Report na: or Poznámka Výrobky jsou i po otevření stabilní do data exspirace. Jejich kontaminace ovšem přímo souvisí s počtem otevření lahviček. Proto je z důvodu bezpečnosti stanoven 60denní limit pro používání po prvním použití. Opatrná manipulace dle zásad správné laboratorní práce (*) poskytuje možnost používat reagencie i po uplynutí 60 dnů. Reagencie musí vždy splnit kritéria kontroly kvality! (* To zahrnuje: Uzavírat lahvičky správnými zátkami a těsně je dotahovat / množství reagencií potřebné pro analýzu odebrat z velkých balení, mohou-li tyto reagencie přijít do styku s kontaminujícími látkami (např. séry pacientů) / reagencie co nejdřív vracet do chladničky (2 8 C). Literatura 1. Chen, Z., et al Clin Chem 41, (1995) 2. Wild, D., The immunoassay Handbook, Stockton Press, 452 (1994) 3. Junker, R. et al Clin Chem 43, (1997) Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbh Max-Planck-Ring 21 - D Wiesbaden - Germany Telefon: Telefax: human@human.de

5 EL-PSA INF GB