Kvantitativní detekce houbových patogenů v rostlinných pletivech s využitím metod molekulární biologie

Transkript

1 Kvantitativní detekce houbových patogenů v rostlinných pletivech s využitím metod molekulární biologie Leona Leišová Přírodovědecká fakulta UK, Praha 2009

2 Metody kvantifikace: Nepřímé metody odhad míry napadení HTZ stanovení obsahu mykotoxinů a dalších sekundárních metabolitů Přímé metody Kompetitivní PCR Real-time SYBR Green PCR Taq Man real-time PCR

3 Kompetitivní PCR Specifické primery Kompetitor DNA o známé koncentraci extrahovaná z mycelia pěstovaného in vitro Doohan et al. 1999: Plant Pathol. 48: Stanovení obsahu Fusarium culmorum a Fusarium graminearum v pletivu obilek pšenice Triticum aestivum Výhody: relativně levná metodika Nevýhody: je zatížena velkou chybou odečtu intenzit produktů PCR po elektroforetické separaci

4 SYBR-Green real-time PCR Specifické primery SYBR-Green = fluorescenční interkalační barvivo Fraaije et al. 2002: Plant Pathol. 51: Stanovení obsahu rzi pšeničné Erysiphe graminis v listových pletivech pšenice Triticum aestivum Výhody: přesnější odečty intenzit fluorescenčního záření produktů (CCD kamera) než u kompetitivní PCR Nevýhody: dražší metodika, problémy se specifičností reakce a s interpretací výsledků

5 OYDV Disociační křivky Elektroforéza LYSV

6 Taq Man real-time PCR Specifické primery Taq Man sonda = specifický oligonukleotid s fluorescenční značkou na 3 konci a se zhášečem fluorescence na 5 konci

7 Leišová et al. 2004: 7th Conference of EFPP, Aberdeen 2004, Stanovení obsahu patogena Pyrenophora teres v pletivech ječmene Hordeum vulgare - Stanovení obsahu Fusarium culmorum v pletivu obilek ječmene Hordeum vulgare a pšenice Triticum aestivum Výhody: nejpřesnější metoda ze všech tří uvedených, s vysokou mírou specifičnosti Nevýhody: nejdražší metoda ze všech tří uvedených

8 Stanovení obsahu Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene Hordeum vulgare Druhově specifické primery a Taq Man sondy na bázi AFLP, klonování, sekvencování, T-coffee, Primer Express Optimalizace real-time PCR ABI PRISM 7700, 7900 P.teres f. maculata P.teres f. maculata P.teres f.teres DT340i DT350j P.tere s f.teres DT376b P.teres f.maculata

9 Uspořádání real-time PCR Uniplex Taq Man sonda-fam (patogen) Multiplex Taq Man sonda-fam (patogen), Taq Man sonda-vic (housekeepingový gen hostitele) Uniplexové uspořádání RT PCR s primery a sondou DT376b-FAM; templát: ředicí řada směsi DNA P. teres a ječmene Multiplexové uspořádání RT PCR s primery a sondami DT376b-FAM a RacB-VIC; templát: ředicí řada směsi DNA P. teres a ječmene

10 Interpretace výsledků Taq Man real-time PCR Amplifikační plot DT376b Obrazová analýza LUCIA Kalibrační křivka Ct/ c (ng/ul) Ct Hv/ Ct Dr y = x R = FillArea 5 6 7

11 Stanovení obsahu Fusarium culmorum v pletivech obilek pšenice Triticum aestivum a ječmene Hordeum vulgare Druhově specifické primery na bázi druhově specifických amplikonů, PCR, sekvencování, primery a Taq Man sondy Optimalizace real-time PCR Uniplexové uspořádání real-time PCR Testování na přítomnost inhibitorů PCR 32,00 30,00 Ct 28,00 26,00 24,00 y = -1,6179Ln(x) + 32,457 R2 = 0, ,00 20,00 Fu98s1 1,0 10,0 100,0 c 1000,0

12 Interpretace výsledků real-time PCR Fu98s1 Obilky ječmene napadené Fusarium culmorum Stanovení obsahu deoxynivalenolu (DON) Obilky pšenice napadené Fusarium culmorum

13 Možnosti metody Taq Man Real-Time PCR Kvantitativní detekce jakéhokoliv patogena (viry, bakterie, houby) v pletivech hostitele - odhad míry napadení použití fungicidu výběr osiva pro výsev či pro další zpracování testování odrůd na rezistenci Studium účinků patogenů na hostitelské rostliny při různých podmínkách napadení Studium intenzity obrany hostitelské rostliny vůči patogenu

14 Poděkování Ing. Ladislav Kučera Ing. Dagmar Kučerová Ing. Věra Minaříková Dr. Jana Šárová Mgr. Alena Hanzalová Mgr. Iva Kudlíková RNDr. Světlana Sýkorová Ing. Jana Chrpová Ing. Václav Šíp NAZV QC1361 RNDr. Jaroslava Ovesná GAČR 521/02/0099 Děkuji za pozornost!

15