ZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST POTRAVIN

Transkript

1 ZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST POTRAVIN Možnosti stanovení Listeria monocytogenes popis metod a jejich princip Mária Strážiková Aleš Holfeld

2 Obsah Charakteristika Listeria monocytogenes Listerióza Metody detekce L. monocytogenes v potravinách Kultivační metody Imunochemické metody Molekulárně-genetické metody Další metody Prevence Literatura

3 Doména : Bacteria Kmen: Firmicutes Třída : Bacilli Řád : Bacillales Čeled: Listeriaceae Rod: Listeria Listeria monocytogenes - G+, fakultativně anaerobní, nesporulující bakterie - patogenní MO, jednotlivé nebo v krátkých řetízcích - saprofyt a epifyt v travicím traktu člověka a živočichů - výskyt: voda, bahno, rostliny, trávicí trakt volně žijích zvířat - produkují katalasu, fermentují glukózu, hydrolyzují eskulin

4 Listerióza infekční onemocnění, bezpříznakové záněty mozkových blan, infekce CNS (menigitidy, septikémie, potraty) rizikové skupiny: těhotné ženy, osoby se slabou imunitou kontaminace masa při porážce zvířat primární kontaminace: v mléce, syrových výrobcích, syrová zelenina (hnojení fekáliemi) přenos na člověka: konzumace kontaminovaného potravin zdroje: maso a tepelně neopracované mastné výrobky, syrové mléko a mléčné výrobky (měkké a plísňové sýry), zelenina

5 Přenos infekce

6 Metody detekce Základní a moderní kultivační techniky Imunochemické techniky ELISA, IMS Molekulárně-genetické postupy PCR, qpcr Komerční soupravy Další techniky

7 Základní kultivační metoda ČSN EN ISO :1999 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes - Část 1: Metoda průkazu časově náročná metoda (5-8 dnů)

8 Moderní kultivační metody - založené na biochemických vlastnostech (důkaz enzymu) API Listeria test 10 mikrozkumavek s dehydratovaným chromogenním substrátem princip: testovaní enzymových reakcí nebo fermentace sacharidů, charakteristické pro jednotlivé druhy listerií přítomnost enzymů (arylamidasa, mannosidasa, glukosidasa) fermentace sacharidů (D-arabitol, D-xylosa, rhamnosa, α-methyl-d-glukosid) vyhodnocení: vizualizace dle interpretační tabulky nebo identifikačním softwarem

9 RAPID L. mono test princip: průkaz aktivity enzymu fosfolipasy - modré zbarvení kolonií, a na schopnosti využívat xylosu - vytvoření patrné žluté zóny vyhodnocení: L. monocytogenes vykazuje fosfolipasovou aktivitu a není schopná využívat xylosu - čistě modrá barva bez doprovodné halo zóny.

10 ALOA a COMPASS L. mono Agar princip: průkaz β-glukosidasy vyhodnocení: modré až modrozelené zabarvení kolónii L. monocytogenes - působením fosfolipasy C - specifické pro fosfatidylinositol (PI-PLC) - vytváří kolem kolonií žlutou halo zónu

11 Imunochemické metody rychlé metody jednoduché provedení detekce složitých matric relativně nízká cena princip: interakce protilátek s antigenem používány in vitro polyklonální, monoklonální nebo rekombinantní protilátky vytvořené proti antigenním strukturám, které jsou charakteristické pouze pro bakterie rodu Listeria

12 Imunochromatografická technika na membráně nejčastěji sendvičové uspořádání první typ protilátky je imobilizován na povrch membrány, druhá protilátka je konjugována s barevnými latexovými částicemi a je nanesena spolu se vzorkem na počátek membrány - pohyb pomocí kapilárních síl přítomnost antigenu interakce s protilátkou detekce : imunokomplex se váže na imibilizovanou protilátku - barevná linka v testovací oblasti

13 Enzymová imunoanalýza ELISA = Enzyme linked immunosorbent assay jeden z imunoreaktantů vázan na tuhou fázi a druhý je značený enzymem tzv. nekompetitivní (sendvičový) postup: na tuhu fázy imobilizované protilátky poté přidán vzorek - buňky interagují s protilátkou po odstranění nenavázaných složek protilátka značená enzymem detekce: enzymová reakce - přeměna bezbarvého substrátu na barevný produkt

14 Molekulárně-genetické metody určení MO na základně genetické informace princip : specifické komplementace (hybridizace) mezi hledaným úsekem jednovláknové nukleové kyseliny z lyzovaných buněk bakterie a sondou sonda - synteticky připravená krátká sekvence nukleotidů komplementární k hledanému úseku vysoce citlivé metody PCR, qpcr, hybridizace, amplifikace specifických úseků RNA, LCR

15 Polymerásová řetězová reakce PCR = polymerase chain reaction enzymová metoda namnožení definovaného úseku DNA in vitro postup: denaturace při teplotě ~95 C hybridizace primeru při teplotě ~68 C, vazba DNA polymerasy extense při teplotě 72 C detekce: agarosová elektroforéza s ethidiumbromidem - elektroforeogram pod UV světlem další možnost: radioaktivně nebo fluorescenčně značené primery

16

17 Elektroforeogram

18 Kvantitativní PCR real-time PCR, qpcr založena na principu klasické PCR dvě možnosti: měření fluorescence v průběhu zvýšení fluorescence interkalačního barviva (SYBR Green) v UV světle po navázání na dsdna TaqMan - schopnost DNA-polymerasy odbourávat oligonukleotidy od 5 - konce sonda modifikována fluorescenční značkou na 5 -konci a zhášečem na 3 -konci

19 Hybridizace hybridizace mezi hledaným úsekem jednovláknové nukleové kyseliny a sondou sonda - komplementární k hledanému úseku značena např. chemiluminiscenční značkou po hybridizaci přidáno selekční činidlo - slouží k rozlišení hybridizované a volné sondy

20 Amplifikace specifických úseků RNA úsek bakterialní RNA přepsán do komplementární DNA (cdna) reverzní transkriptasou ribonukleasa H z Escherichia coli (RNAasa H) uvolní cdna z hybridu DNA-RNA po syntéze komplementárního řetězce je cdna DNA-dependentní-RNA polymerasou přepsána zpět do molekul RNA opakovaním tohoto kroku - namnožení cílového úseku sondy - krátké oligonukleotidové sekvence komplementární ke specifickým sekvencím bakteriální RNA 2 druhy primerů detekce : agarosová elektroforéza, kvantitativní PCR

21 Ligasová řetězová reakce (LCR) obdobné jako PCR využití dvou párů primerů páry jsou komplementární ke dvěma sousedním oblastem stejného vlákna DNA dvojice primerů nepřekrývá celý hledaný úsek DNA - ponechána mezera, která je doplněna termostabilní polymerasou DNA následuje spojení obou úseků termostabilní ligasou mnohonásobným opakováním se zvětšuje množství hledaného úseku DNA ve vzorku

22 Komerční soupravy na principu molekularně-genetických a imunochemických metod

23

24 Další metody DNA čipy Biosenzory Spektrometrické metody FT-IR, Raman

25 Prevence všeobecné pokyny jako při nákaze jako např. salmonelózou syrovou potravinu živočišného původu jako hovězí, vepřové nebo drůbež důkladně vařte syrovou zeleninu před tím, než ji sníte, důkladně omývejte neuvařené maso dávejte odděleně od zeleniny, uvařených potravin a zakoupených hotových potravin vyhněte se konzumaci syrového (nepasterizovaného) mléka nebo potravin ze syrového mléka po manipulaci s neuvařenými potravinami si umyjte ruce, omyjte nože a prkénko

26 Literatura Blažková M., Karamonová L., Fukal L., Rauch P. Listeria monocytogenes nebezpečný patogen a jeho detekce v potravinách Chemické listy 99, 2005, s S. Jadhav et al., Journal of Microbiological Methods 88, 2012, s Charakteristika Listeria monocytogenes a její výskyt v potravinách, Červinková Pavla, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně Helen H. Lee, Ligase chain reaction, Department of Haematology, University of Cambridge, Cambridge, U.K.,

27 Děkujeme za pozornost!