VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO TECHNOLOGICKÁ V PRAZE. Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav konzervace potravin a technologie masa

Transkript

1 VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav konzervace potravin a technologie masa DISERTAČNÍ PRÁCE Využití kapilární elektroforézy v analýze potravin Vypracoval: Ing. Martin Dušek Školitel: Doc. Ing. František Kvasnička, CSc. Studijní program: Chemie a technologie potravin Obor: Technologie potravin Praha 2004

2 Práce byla vypracována na Ústavu konzervace potravin a technologie masa Vysoké škole chemicko technologické v Praze v období od září 2000 října Prohlašuji, že jsem v předložené disertační práci použil jen pramenů, které cituji a uvádím v seznamu použité literatury. Ve Voticích, březen 2004 Martin Dušek

3 Na tomto místě bych chtěl vyjádřit vděčnost mému školiteli Doc. Ing. Františku Kvasničkovi, CSc. za jeho cenné rady a komentáře a za poskytnutí tolik potřebné motivace k mé práci. Můj velký dík také patří Prof. Dr. Ernstu Kenndlerovi, který mi umožnil pracovat ve své laboratoři a získat tak mnoho dalších praktických zkušeností. Dále bych chtěl poděkovat všem svým kolegům, kteří se vždy ochotně podělili o své zkušenosti a znalosti.

4 SOUHRN Tato disertační práce se zabývá využitím kapilárních elektromigračních metod (CE), zejména kapilární izotachoforézy a kapilární zónové elektroforézy, v analýze potravin. Na základě legislativy platné v ČR, byly vybrány takové analyty polyfosfáty, karboxylové kyseliny, kyselina glutamová jejichž obsah je v potravinách limitovaný a u kterých bylo také předpokládáno, že použití CE metod může výrazně zjednodušit jejich stanovení. Kapilární izotachoforéza (CITP), kapilární zónová elektroforéza (CZE) a jejich online spojení (CITP-CZE) byly optimalizovány pro stanovení polyfosfátů, kdy byla hledána metoda co nejúčinnějšího stanovení jak v polyfosfátových směsích, tak v masných výrobcích. Proměřením vzorků čisté svaloviny byl zjištěn poměr mezi volnými přirozeně přítomnými fosfáty a bílkovinami v mase, který byl použit pro výpočet obsahu přidaných fosfátů v těchto masných výrobcích. Ve vybraných vzorcích masných výrobků byly stanoveny přidané fosfáty novou CITP metodou a tyto hodnoty byly srovnány s výsledky získanými standardní spektrofotometrickou metodou. Pro stanovení karboxylových kyselin ve vzorcích siláží byla použita kapilární zónová elektroforéza a pro stanovení vybraných organických kyselin ve vejcích dvoudimenzionální kapilární izotachoforéza. Změny obsahu kyseliny pyrohroznové, mléčné, jantarové, 3-hydroxymáselné, glutamové, pyroglutamové, octové a citronové byly sledovány v průběhu 38 dnů skladování vajec při 5, 14 a 30 C. Během těchto skladovacích pokusů byl u vajec zjišťován také celkový počet mikroorganizmů (CPM) a byla hledána závislost mezi CPM a obsahem jednotlivých kyselin. U kyseliny mléčné, jantarové a 3-hydroxymáselné bylo dále sledováno, zda jejich obsah do 28 dnů překročí limitní hodnoty, které jsou vyhláškou 200/2003 Sb. považovány za kriteria čerstvosti vajec. Pro devět vybraných vzorků byl obsah kyseliny mléčné, jantarové a 3-hydroxymáselné stanovený CITP porovnán s hodnotami zjištěnými použitím komerčních enzymových setů. Kyselina glutamová v 15 vzorcích instantních polévek byla stanovena kapilární izotachoforézou a získané výsledky byly srovnány s hodnotami získanými použitím vysokoúčinné kapalinovou chromatografie separací derivátů kyseliny glutamové na reverzní fázi (RP HPLC). Všechny výše uvedené aplikace elektromigračních metod je možné úspěšně použít jako alternativní metody k používaným klasickým či chromatografickým technikám.

5 SUMMARY This thesis deals with application of capillary electrophoresis methods (CE), namely capillary isotachophoresis and capillary zone electrophoresis for food analyses. On the basis of the Czech food legislation, several compounds were chosen, such as polyphosphates, carboxylic acids and glutamic acid. Levels of these compounds in food products are limited and furthermore the use of the capillary electrophoresis method makes easier their analysis comparing with classical methods. Capillary isotachophoresis (CITP), capillary zone electrophoresis (CZE) and their on-line coupling (CITP-CZE) were optimised for the determination of added phosphate and polyphosphates in food additives and meat products. The ratio between free phosphate and meat proteins (16,2 mg.g -1 ) was found on the basis of the analysis of six different kind of raw meat. The ratio was used for the calculation of the amount of added phosphates in meat products. The obtained results were compared with routinely used spectrophotometric method on thirty-five samples of meat products and good accordance was found. Capillary zone electrophoresis was used for the determination of carboxylic acids in silage and for the determination of these acids in eggs two-dimensional capillary isotachophoresis was applied. During 38 days storage of eggs at the temperature 5, 14 and 30 C the changes of the lactic, acetic, succinic, 3-hydroxybutyric, glutamic, pyroglutamic, pyruvic and citric acid were observed. Together with the analysis of acids the microbial contamination was determined. The time and the concentration of these acids corresponding to trigger microbial contamination of eggs ( of microorganisms/ml) were determined. Further, the observation whether the concentration of lactic, succinic and 3-hydroxybutyric acids during 28 days storage exceeded limited value was made. The isotachophoretic determination of these acids was compared with the enzymic ones. An amount of glutamic acid in fifteen samples of instant soup was determined by the capillary isotachophoresis. The obtained results were compared with HPLC method (fluorimetric detection of FMOC derivate of glutamic acid). It was proved that the electrophoretic methods are suitable alternative to classic or chromatographic method for the determination of the above-mentioned compounds in food.

6 Klíčová slova: kapilární zónová elektroforéza, kapilární izotachoforéza, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, polyfosfáty, přidaný fosfát, karboxylové kyseliny, kyselina glutamová, masné výrobky, siláž, vejce, instantní polévky Keywords: capillary zone electrophoresis, capillary isotachophoresis, high performance liquid chromatography, polyphosphates, added phosphate, carboxylic acids, glutamic acid, meat products, silage, eggs, instant soups

7 OBSAH Seznam originálních publikací...5 Seznam použitých symbolů a zkratek Úvod Současný stav řešené problematiky Princip elektromigračních technik Elektroosmotický tok (EOF) Instrumentace CE metod Rozdělení kapilárních elektromigračních technik Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Micelární elektrokinetická kapilární elektrochromatografie (MEKC) Kapilární elektrochromatografie (CEC) Kapilární izotachoforéza (CITP) Princip kapilární izotachoforézy Způsob detekce a vyhodnocení analytů v CITP Volba vedoucích a koncových elektrolytů Základní doporučené operační systémy Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Kapilární izoelektrická fokuzace (CIEF) Technika spojování separačních kapilár column-coupling Využití kapilárních elektromigračních metod v analýze potravin Stanovení potravinářských aditiv Fosfát a polyfosfáty Přirozený obsah fosforu v mase Polyfosfáty v masných výrobcích Metody stanovení fosfátu a polyfosfátů Stanovení přidaného fosfátu v masných výrobcích Karboxylové kyseliny v silážích Vznik karboxylových kyselin v silážích Hodnocení kvality siláže Metody stanovení karboxylových kyselin v siláží Karboxylové kyseliny ve vejcích

8 Obsah karboxylových kyselin ve vejcích Legislativní požadavky na obsah karboxylových kyselin ve vejcích Změny organických kyselin bez vlivu exogenní kontaminace Změny karboxylových kyselin způsobené činností mikroorganizmů Metody stanovení organických kyselin Kyselina glutamová Použití glutamátu sodného v potravinách Pravidla pro použití glutamátu sodného v potravinách Vliv konzumace glutamátu na lidské zdraví Stanovení přidaného glutamátu v potravinách Stanovení kyseliny glutamové HPLC Stanovení kyseliny glutamové CE metodami Cíle disertační práce plán pokusů Použité chemikálie a materiál Použité chemikálie Použité přístroje Stanovení fosfátů a polyfosfátů Použité vzorky Stanovení polyfosfátů CE metodami Příprava vzorku Podmínky analýzy Stanovení celkového fosforu Příprava roztoků Spektrofotometrické stanovení celkového fosforu Stanovení celkového dusíku Stanovení dusíku a fosforu v čisté bílkovině Získané výsledky a jejích diskuse Elektroforetické stanovení polyfosfátů Spektrofotometrické stanovení přidaných fosfátů Izotachoforetické stanovení přidaných fosfátů Poměr mezi volným fosfátem a bílkovinami v mase Srovnání metod stanovení přidaných fosfátů

9 Závěr Stanovení polyfosfátů kapilárními elekromigračními metodami Stanovení přidaných fosfátů kapilární izotachoforézou CZE a CITP stanovení karboxylových kyselin v silážích Vzorky siláží a jejich úprava Podmínky analýzy Výsledky a diskuse CZE CITP Srovnání CZE a CITP Závěr CITP stanovení karboxylových kyselin ve vejcích Použité vzorky Stanovení sušiny Podmínky CITP-CITP analýzy Příprava vzorků pro kapilární izotachoforézu CITP-CITP stanovení organických kyselin Postup mikrobiologického stanovení Příprava médií pro mikrobiologické stanovení Enzymové metody Příprava vzorku Postup měření Výpočet Získané výsledky a jejich diskuse Stanovení sušiny Izotachoforetické stanovení organických kyselin ve vejcích Skladovací pokus melanže Skladovací pokus skořápkových vajec Změna obsahu kyseliny pyrohroznové Změna obsahu kyseliny mléčné Změna obsahu kyseliny glutamové a octové Změna obsahu ostatních kyselin

10 Srovnání čerstvých vajec a jejich skladovaných melanží Srovnání CITP-CITP a enzymové metody Závěr Stanovení kyseliny glutamové Příprava vzorků Izotachoforetické stanovení glutamové kyseliny Stanovení glutamové kyseliny metodou HPLC Derivatizace HPLC stanovení Výsledky a jejich diskuse Separace glutamové kyseliny metodou CITP Separace glutamové kyseliny metodou HPLC Srovnání metod CITP a HPLC Závěr Závěr Literatura

11 SEZNAM ORIGINÁLNÍCH PUBLIKACÍ Výsledky disertační práce byly publikovány v následujících třech článcích (I-III) a šesti příspěvcích na vědeckých konferencích (A-F). I Dušek, M.; Kvasnička, F.; Lukášková, L.; Krátká, J. Isotachophoretic determination of added phosphate in meat products. Meat Science 2003, 65, II Dušek, M.; Kvasnička, F.; Moravcová, J. Stanovení organických kyselin v silážích kapilární izotachoforézou a kapilární zónovou elektroforézou. Chemické Listy. (zařazen k tisku, vyjde v čísle 07/04) III Moravcová, J.; Kleinová, T.; Loučka, R.; Tyrolová, I.; Kvasnička, F.; Dušek, M.; Čeřovský, M. Effect of additives on cumestrol content in laboratory alfalfa silages. Czech Journal of Animal Science 2003, 48, PŘÍSPĚVKY NA KONFERENCÍCH A Dušek, M.; Lukášková, L.; Kvasnička, F.; Votočková, P; Krátká, J. Stanovení obsahu fosfátů v masných výrobcích. XXXII. Symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin, Skalský Dvůr u Bystřice nad Pernštejnem (přednáška) B Dušek, M.; Mittelbach, R.; Kvasnička, F.; Krátká, J. HPLC a CITP stanovení kyseliny glutamové v potravinách. XXXIII. Symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin, Skalský Dvůr u Bystřice nad Pernštejnem (přednáška) C Dušek, M.; Kvasnička, F.; Krátká, J. Stanovení organických kyselin v silážích kapilární izotachoforézou (CITP) a kapilární zónovou elektroforézou (CZE). IV. Konference mladých vědeckých pracovníků, Brno (přednáška) 5

12 D Dušek, M.; Kvasnička, F. Determination of polyphosphates by capillary isotachophoresis and by on-line coupled CITP-CZE. Separation in the Bioscience - SBS 2001, Praha (poster) E Dušek, M.; Kvasnička, F. Determination of polyphosphates by capillary electrophoresis with conductivity detection. Euregionale 2002 in Aachen Spring - Symposium of the GDCh-JCF, Aachen (poster) F Dušek, M.; Macková, P.; Kvasnička, F.; Míková, K. Využití CITP stanovení karboxylových kyselin pro hodnocení kvality vajec. XXIV. Symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin, Skalský Dvůr u Bystřice nad Pernštejnem (poster) 6

13 SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK α-cd α-cyclodextrin β-cd β-cyclodextrin 2-MCE 2-merkaptoethanol 3-HBDH 3-hydroxybutyrát dehydrogenáza AMP adenosin-5-monofosfát ATP adenosin-5-trifosfát BF bifurkační blok BGE základní elektrolyt (background electrolyte) BHA butylhydroxyanisol BHT butylhydroxytoluen BHBA kyselina 3-hydroxymáselná (β-hydroxymáselná, 3-hydroxybutanová) BICIN N,N-bis(hydroxyethyl)glycin CAPS kyselina 3-(cyklohexylamino)-1-propan sulfonová CE kapilární elektromigrační metody CEC kapilární elektrochromatografie CGE kapilární gelová elektroforéza CIEF kapilární izoelektrická fokuzace CITP kapilární izotachoforéza CMC kritická micelární koncentrace (critical micellar concentration) CoA koenzym A CPM celkový počet mikroorganizmů CTAB cetyltrimethylamonium bromid CZE kapilární zónová elektroforéza (capillary zone electrophoresis) DAD UV detektor diodového pole (diode array detector) DBD-PZ 4-N,N-dimethylaminosulfonyl-7-piperazin-2,1,3-benzoxadiazol DMMAC N,N-dimethyl-2-merkapto-ethyl-amonium chlorid Dns-Cl dansyl chlorid EACA kyselina -amino-n-kapronová EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová EOF elektroosmotický tok (electroosmotic flow) FEP fluorovaný kopolymer ethylenu a propylenu

14 FITC FMOC GABA GC GTP HEPES His HPLC HPMC HSAA HV IDP IEC INT IPD ITP LE L-LDH LOD LOQ MEKC MES MF MO MPA MS MTAB NAC NAD NADH fluorescein isothiokyanát 9-fluorenylmethyl chloroformiát kyselina γ-aminomáselná plynová chromatografie (gas chromatography) glutamát-pyruvát transamináza kyselina N-2-hydroxyethylpiperazin-N -ethansulfonová L-histidin vysokoúčinná kapalinová chromatografie (high performance liquid chromatography) hydroxypropylmethylcelulosa N-hydroxysuccinimidyl-α-(9-akridine)-acetát zdroj stejnosměrného vysokého napětí inosin-5-difosfát iontově výměnná chromatografie (ion exchange chromatography) iononitrotetrazonium chlorid nepřímý fotometrický detektor inosin-5-trifosfát vedoucí elektrolyt (leading electrolyte) L-laktát dehydrogenáza limit detekce (limit of detection) limit kvantifikace (limit of quantification) micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (micellar electrokinetic chromatography) kyselina 2-[N-morfolin]ethansulfonová mobilní fáze mikroorganizmus kyselina merkaptopropionová hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry) myristyltrimethylamonium bromid N-acetylcystein nikotinamidadenin dinukleotid hydrogennikotinamidadenin dinukleotid 8

15 NBDI NBD-PZ NPM NDA OPA P1 P2 P3 P4 PEP PK PDC RP RSD PVP SC SCS SD 2 SDS SPE TAPS TBHQ TE THF TLC TRICIN TRIS TTAB o-(4-nitrobenzyl)-n,n -diisopropylisourea 4-nitro-7-piperazin-2,1,3-benzoxadiazol nejvyšší povolené množství naftalen dikarboxaldehyd o-ftalaldehyd monofosfát difosfát trifosfát tetrafosfát fosfoenolpyruvát pyruvátkináza 2,6-pyridindikarboxylová kyselina reverzní fáze relativní standardní odchylka stanovení (relative standard deviation) polyvinylpyrrolidon cholát sodný sukcinyl-koenzym A-syntetáza směrodatná odchylka (standard deviation) laurylsulfát sodný (sodium dodecyl sulphate) extrakce na pevné fázi (solid phase extraction) kyselina N-[tris(hydroxymethyl)]-3-methylaminopropan sulfonová tercbutylhydroxychinon koncový elektrolyt (terminating electrolyte) tetrahydrofuran tenkovrstvá chromatografie (tin layer chromatography) N-(2-hydroxymethyl)aminomethan tris(hydroxymethyl)aminomethan tetradecyltrimethylammonium bromid 9

16 1. ÚVOD Pojem elektroforéza v sobě zahrnuje celý soubor procesů založených na migraci nabitých částic - iontů v stejnosměrném elektrickém poli. Po dlouhou dobu od chvíle, kdy Tiselius v roce 1937 poprvé použil elektroforézu jako analytickou metodu pro separaci bílkovin, byla efektivita separace značně omezena konvekcí a difúzí tepla. Proto byly první metody založené na separaci v takových materiálech (gelech), v jejichž prostředí byly tyto negativní procesy eliminovány. V době, kdy začaly být dostupné křemenné kapiláry s vnitřním průměrem menším než 100 µm a s prvními komerčními CE přístroji, dochází k prudkému rozvoji CE metod a jejich aplikace nacházejí uplatnění v rozličných oblastech, jenž zahrnují průmyslovou (Stover, 1990), farmaceutickou, potravinářskou (Kvasnička, 2000) a biochemickou analýzu. Jen do roku 1997 je publikováno více než 4000 článků a různých aplikací kapilárních elektromigračních metod (Tagliaro et al., 1997). Oproti ostatním analytickým metodám jsou výhodami CE metod vysoká separační účinnost (N > 10 4 až 10 6 ) při krátkém času analýzy, malý objem dávkovaného vzorku (1 50 µl), je možné volit mezi několika operačními módy (CZE, CITP, MEKC, CGE, CEC, CIEF), snadná optimalizace metod a ve valné většině případů také vodné separační prostředí. V této práci jsou v rámci doktorandského studia řešeny tři dílčí projekty. Prvním z projektů je stanovení polyfosfátů (D, E) přidaných fosfátů (I, A) v masných výrobcích. Druhým je stanovení karboxylových kyselin kapilární zónovou elektroforézou v silážích (II, III, C) a kapilární izotachoforézou ve vejcích (F). Posledním z těchto projektů je stanovení kyseliny glutamové v instantních polévkách (B). 10

17 2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 2.1. PRINCIP ELEKTROMIGRAČNÍCH TECHNIK Elektromigrační metody jsou založeny na rozdílné rychlosti pohybu různě nabitých částic v elektrickém stejnosměrném poli. Na nabitou částici působí v elektrickém poli síla (F 1 ), která je úměrná náboji částice z i a intezitě elektrického pole E. F z 1 i E (2.1) Proti síle F 1 působí síla reprezentující odpor prostředí, která je úměrná okamžité rychlosti nabité částice ν i. F 2 k (2.2) i V okamžiku, kdy se obě síly vyrovnají (F 1 = F 2 ), začne se nabitá částice pohybovat konstantní rychlostí (ν i ). z i E i (2.3) k kde k je konstanta úměrnosti iontu kulovitého tvaru a podle Stokesova zákona platí, že k 6 (2.4) r i Charakteristickou konstantu libovolného iontu je jeho pohyblivost (mobilita) µ i, což je jeho rychlost vztažená na jednotkovou intenzitu elektrického pole. Použitím mobility lze zapsat rovnici (2.3) jako: E (2.5) i i kde ν je rychlost (m.s -1 ), µ i elektroforetická pohyblivost iontu (m 2.V -1.s -1 ) a E je intenzita stejnosměrného elektrického pole (V.cm -1 ). Elektroforetická pohyblivost µ i je pro daný ion a prostředí konstantní a kombinací rovnic (2.3), (2.4) a (2.5) je vyjádřená jako: i zi 6 r i (2.6) kde q je náboj iontu, r je poloměr iontu a η je viskozita prostředí. Z této rovnice je jasné, že malé ionty s vysokým nábojem mají vysokou mobilitu, zatímco nízkou mobilitu mají málo nabité velké ionty. V nekonečně zředěných roztocích je iontová mobilita pro daný ion konstantní a nazývá se absolutní mobilita, µ 0. Prakticky, elektroforetické separace 11

18 neprobíhají v nekonečně zředěných roztocích, ale v roztocích o konečných koncentracích. V tomto případě iontová pohyblivost není konstantní a závisí na koncentraci elektrolytového systému. Rychlost migrace iontů v takovémto systému je menší než v podmínkách nekonečného zředění a je dána rovnicí: E (2.7) i a kde µ a je aktuální pohyblivost. Odchylka od ideálních podmínek může být vyjádřena jako korekční faktor, f, jenž zejména závisí na iontové síle prostředí. Aktuální pohyblivost je tedy možné vyjádřit z iontové pohyblivosti pomocí rovnice (2.8), act f (2.8) 0 přičemž korekční faktor f je funkcí náboje částice (z i ) a iontové síly prostředí (I) a pro silné organické kyseliny je možné jej vyjádřit rovnicí (2.9) (Friedl et al., 1995). f exp( 0,77 z I ) (2.9) i i V případě, že ionty přítomné v roztoku nejsou plně disociované, ovlivňuje stupeň jejich disociace α pohyblivost iontu a mluvíme pak o jeho efektivní pohyblivosti, µ eff. Pro monovalentní látky je efektivní pohyblivost možné vyjádřit jako: eff act 0 f (2.10) Pro monovalentní slabé kyseliny a zásady platí, že stupeň disociace závisí na jejich disociační konstantě pk a a na ph pufrujícího prostředí, rovnice (2.11). 1 pka ph (2.11) 1 10 Vzhledem k tomu, že iontové sloučeniny jsou v roztoku přítomné jako různě nabité částice A 0, A 1, A 2 A k s odlišnou iontovou pohyblivostí µ 0, µ 1, µ 2 µ k a aktuální koncentraci c 0, c 1, c 2 c k, je možné efektivní pohyblivost µ eff iontu i vyjádřit také jako: 1 x (2.12) eff, i k k ci i ca i 0 i 0 i i kde c A je celková koncentrace látky A, x i je molární zlomek iontu i. Princip elektroforetické separace je tedy založen na rozdílných pohyblivostech iontů. Nejúčinnější separace dvou látek (slabých kyselin a zásad) je tedy při ph rovném průměru jejich disociačních konstant. Tento způsob se nazývá separace podle hodnot pk. Pokud je limitní pohyblivost separovaných kyselin dostatečně odlišná, je možné 12

19 tyto látky separovat za takového ph, kdy jsou plně disociovány. Tento způsob se nazývá separace podle pohyblivosti (Churáček et al., 1990) Elektroosmotický tok (EOF) Elektroosmotický tok je významná součást kapilárních elektroforetických separací a představuje hlavní způsob pohybu iontů v hydrodynamicky otevřeném systému. Uvnitř křemenné kapiláry dochází vlivem přítomnosti elektrolytu ke generování tří vrstev. První je záporně nabitá stěna kapiláry, nepohyblivá vrstva, druhou pak tvoří difusní vrstva kationtů vyrovnávající záporný náboj kapilární stěny. V elektrickém poli se pak tato přilehlá vrstva pohybuje směrem ke katodě. Takto generovaný elektroosmotický tok může být větší než jsou vlastní elektroforetické pohyblivosti iontů obsažených ve vzorku. Důsledkem tohoto je, že kationty i anionty mohou být separovány současně během jedné analýzy. První v pořadí migrují nejmenší kationty s nejvyšším nábojem, přičemž rychlost se snižuje se snižujícím nábojem, po kationech společně s EOF migrují všechny elektroneutrální látky. Separační pořadí aniontů, migrujících po EOF, je opačné než pořadí kationtů a největší anionty s nejnižším nábojem migrují dříve než malé a více nabité anionty. Obrázek 1. Migrace iontů v přítomnosti elektroosmotického toku (EOF). Velikost EOF je možné vyjádřit jako rychlost nebo pohyblivost pomocí vzorců: E (2.13) EOF 13

20 EOF (2.14) kde ζ je zeta potenciál, ε je dielektrická konstanta a η je viskozita. Generovaný elektroosmotický tok závisí na složení elektrolytu tak, že klesá se snižujícím se ph (slabší disociace silanolových skupin) a stoupá s jeho rostoucí iontovou silou. Pohyblivost analytu v systému s generovaným elektroosmotický tokem je dána jako součet efektivní pohyblivosti iontu µ eff, a pohyblivosti EOF, µ EOF. eff EOF (2.15) Prakticky lze hodnotu pohyblivosti vypočítat z experimentálních parametrů podle rovnice l l L (2.16) t E t V kde V je vložené napětí, l je efektivní a L je celková délka kapiláry a t je migrační čas. Kombinací rovnic (2.15) a (2.16) lze vypočítat hodnotu efektivní pohyblivost iontu Instrumentace CE metod Základní CE přístroj se skládá z dávkovacího systému, separační kapiláry, obvykle o vnitřním průměru od 20 do 100 µm, v případě izotachoforetického analyzátoru ZKI 02 o průměru 800 a 300 µm, a délce od 20 do 100 cm, zdroje vysokého stejnosměrného napětí, elektrod a detektoru. Objem dávkovaného vzorku činí nl, tj. 1 2 % objemu kapiláry, což klade vysoké nároky na přesnost dávkování. Vzorek může být do systému dávkován hydrodynamicky, elektrokineticky a nebo ventilem s fixním objemem. Nejčastěji používanou metodou detekce analytů je UV detekce, další možností je použití fluorescenční, vodivostní, elektrochemické ampérometrické detekce a v poslední době také hmotnostní (MS) detekce (Tagliaro et al., 1998). 14

21 Obrázek 2. Základní schéma CE přístroje ROZDĚLENÍ KAPILÁRNÍCH ELEKTROMIGRAČNÍCH TECHNIK Mezi kapilární elektromigrační metody patří: - kapilární zónová elektroforéza (CZE) - micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MEKC nebo MECC) - kapilární elektrochromatografie (CEC) - kapilární izotachoforéza (CITP) - kapilární gelová elektroforéza (CGE) - kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Elektromigrace probíhá buď v nosném (základním) elektrolytu, jehož koncentrace je řádově větší než koncentrace vzorku, a nebo v diskontunuálním prostředí, kde se ionty vzorku výrazně podílejí na přenosu náboje separačním sloupcem (kolonou, kapilárou). Kapilární zónová elektroforéza patří do první skupiny, neboť používá nosný elektrolyt o stejném složení i koncentraci v celém systému a separace probíhá za konstantního proudu a napětí. Izoelektrická fokusace je příkladem separace v nosném elektrolytu nekonstantního složení, což je nejčastěji pufr s lineárním gradientem ph. Diskontunuálním prostředím může být samotný vzorek metoda pohyblivého rozhraní a kapilární izotachoforéza. 15

22 Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Kapilární zónová elektroforéza je nejrozšířenější módem kapilární elektroforézy a jde o techniku principiálně nejjednodušší. Pohyb nabitých částic je způsoben napěťovým spádem v elektrickém poli, přičemž ionty migrují ve směru a v poměru určeném jejich nábojem a pohyblivostí a při migraci kapilárou vytváří v základním elektrolytu samostatné zóny, které jsou neostré. V hydrodynamicky otevřeném systému kationty migrují jako první v pořadí, neboť směr jejich migrace je stejný jako směr migrace elektroosmotického toku (EOF). Neutrální látky se eluují následovně, ale nejsou separovány, protože nemají vlastní mobilitu a migrují pouze s EOF. Anionty se eluují jako poslední, neboť směr jejich migrace je opačný než EOF (viz. kapitola 2.1.1). CZE separace probíhá v kapiláře naplněné základním elektrolytem (BGE). Základní elektrolyt použitý pro separaci by měl mít dostatečnou pufrovací kapacitu, nízkou absorpci světla (při použití přímé UV detekce) a nízkou vodivost s ohledem na tvorbu Joulova tepla. Vodivost roztoku zůstává prakticky během celého separačního děje konstantní a tudíž i potenciálový spád se během separace nemění Micelární elektrokinetická kapilární elektrochromatografie (MEKC) Micelární elektrokinetická kapilární elektrochromatografie je technika kombinující princip kapilární zónové elektroforézy a chromatografie na reverzní fázi. MEKC umožňuje separaci elektroneutrálních látek, pomocí přídavku povrchově aktivní látky do základního elektrolytu, a to v koncentraci větší než je její kritická micelární koncentrace (např. CMC pro SDS je 8 až 9 mm). Po překročení CMC dojde v prostředí základního elektrolytu k tvorbě micel, jejichž hydrofobní řetězce se vždy orientují dovnitř micely a hydrofilní skupiny se orientují vně do vodného prostředí. Anioaktivní povrchově aktivní látky jako je SDS migrují k anodě, to je opačně než je směr EOF. Vzhledem k tomu, že rychlost EOF je větší než migrační rychlost micel, je jejich výsledný směr pohybu shodný se směrem elektroosmotického toku. Výsledný separační princip je tedy složen z migrace částic ve volném roztoku a distribuce částic mezi volným roztokem a micelární pseudofází. Více hydrofobní analyt interaguje silněji s micelami a je tedy micelami déle zadržován. 16

23 Kapilární elektrochromatografie (CEC) Kapilární elektrochromatografie je svým principem nejblíže kapalinové chromatografii. Tok mobilní fáze je v CEC vyvolán aplikací vysokého napětí na kapiláru a je totožný s EOF. Hlavní výhodou je tedy pístový rychlostní profil elektroosmotického toku mobilní fáze, což umožňuje dosahovat při separaci několikanásobně vyšších účinností. Použitím rozdílných náplní kapiláry je možné měnit selektivitu stanovení, stejně jako u kapalinové chromatografie Kapilární izotachoforéza (CITP) Princip kapilární izotachoforézy Izotachoforetické (ITP) stanovení je založeno na rozdílné pohyblivosti iontů stejného znaménka ve stejnosměrném elektrickém poli. V ITP je v jedné analýze možné dělit buď anionty, nebo kationty. Separace se může provádět na nosiči (papír, sloupec, gel) nebo ve volném roztoku. Ve volném roztoku se nejčastěji realizuje v kapiláře a odtud název kapilární ITP. Tato separační metoda je využitelná pro separaci ionogenních látek jako jsou organické kyseliny a báze, aminokyseliny, peptidy, proteiny, kovové ionty apod. Izotachoforéza pracuje s malými množstvími vzorku. Umožňuje stanovit ještě desítky ng látek, což při nástřiku jednotek až desítek l vzorku vede k analyzovatelným koncentracím na úrovni jednotek až desítek mg.l -1 (mg.kg -1 ). Tato technika se vyznačuje vysokou přesností a citlivostí. Dalšími výhodami jsou minimální úprava vzorku, nízké provozní náklady, univerzálnost a vysoká citlivost. V ITP se používají dva základní elektrolyty - vedoucí a zakončující. V případě analýzy aniontů vedoucí elektrolyt obsahuje anion L, který má nejvyšší pohyblivost z celé separované směsi. Součástí vedoucího elektrolytu je protiion P opačného znaménka než vedoucí ion, který zaručuje během analýzy definované ph. Zakončující elektrolyt obsahuje anion T, který má nižší pohyblivost než kterýkoliv ze separovaných iontů. Vzorek A, B se vkládá do rozhraní těchto elektrolytů. Po zapnutí stejnosměrného elektrického proudu migrují zóny v pořadí jejich pohyblivosti. Za zónou vedoucího aniontu L se vyděluje nejpohyblivější ze směsi (A), za ním migruje zóna směsi aniontů A a B a před zónou zakončujícího aniontu T migruje zóna B. Po dosažení ustáleného stavu (viz. Obrázek 3), tj. po úplné separaci všech složek se tyto pohybují stejnou 17

24 rychlostí v těsně za sebou oddělených zónách v pořadí klesající pohyblivosti. V ustáleném stavu tedy platí rovnice (2.17) kde E E E konst. (2.17) L, L i a L i i T T T jsou efektivní pohyblivosti vedoucího, separovaného a koncového iontu a E L, E i a E T jsou intenzity elektrického pole v odpovídajících zónách. Pro tento stav typický pro izotachoforézu je charakteristické: i. každá ze zón obsahuje pouze jeden druh aniontu (pokud bylo dosaženo úplné separace) ii. ve všech zónách je přítomen stejný protiion shodný s protiiontem vedoucího elektrolytu iii. koncentrace příslušného aniontu je podél zóny konstantní a mimo ni nulová, zóny jsou uspořádány v pořadí klesající efektivní pohyblivosti od vedoucího k zakončujícímu iontu (kromě případu inverze pohyblivosti) iv. fyzikální vlastnosti (koncentrace, elektrická vodivost, intenzita elektrického pole, ph, teplota) se mění od zóny k zóně skokem a toto dovoluje použití fyzikálně-chemických metod detekce pro vyhodnocení separace Konstantní koncentrace iontu v jeho zóně a ostré ohraničení jednotlivých zón je při izotachoforetické separaci zaručené tzv. samozaostřujícím efektem. V případě, že anion A se difúzí dostane do zóny B, kde je vyšší intenzita elektrického pole, bude tento urychlený a vrátí se do vlastní zóny. Analogicky, když se anion B dostane do zóny A o nižší intenzitě elektrického pole, je jeho migrace zpomalená a vrátí se do vlastní zóny. V důsledku tohoto jsou hranice mezi zónami velmi ostré (cca 0,1 mm) a fyzikální vlastnosti (E, ph, teplota, vodivost, UV absorpce apod.) se na hranicích mění skokem, což umožňuje použití fyzikálních metod detekce. Koncentrace iontu v zóně není libovolná, ale je vázaná tzv. Kohlrauschovou regulační funkcí (2.18), která je základem kvantitativního vyhodnocení ci cl i L L i P p z z L i (2.18) kde c i a c L jsou látkové koncentrace separované látky a vedoucího elektrolytu v jejich zónách po dosažení ustáleného stavu; µ i, µ L a µ P jsou pohyblivosti separovaného vedoucího iontu a protiiontu a z i, z L jsou náboje odpovídajících iontů. Praktickým 18

25 důsledkem této skutečnosti je, že v případě nadávkování koncentrovaného vzorku se koncentrace sníží na koncentraci odpovídající ustálenému stavu a naopak při nadávkování zředěného vzorku dochází k zakoncentrování (viz. Obrázek 4), což je žádané zvláště v případě stopové analýzy. V ITP je běžné 10 3 až 10 5 násobné zakoncentrování během separace. Obrázek 3. Separace směsi aniontů A a B izotachoforetického principu; a) situace na počátku analýzy; b) situace po určité době od startu analýzy; c) situace po dosažení ustáleného stavu; d) grafické znázornění průběhu napětí (V), intenzity elektrického pole (E) a koncentrace (c) po dosažení ustáleného stavu. 19

26 Obrázek 4. Koncentrační efekt v izotachoforéze. Stejné množství n X látky X bez ohledu na analyzovaný objem (V X1 < V X2 ) a koncentraci (c X1 > c X2 ) za stejných separačních podmínek (v různých průřezech kapiláry) po dosažení ustáleného stavu se bude nacházet ve stejném objemu V X, protože koncentrace c X v zóně je určena Kohlrauschovou regulační funkcí Způsob detekce a vyhodnocení analytů v CITP Detektor je umístěný na konci kapiláry a analytické údaje se vyhodnocují "online". V současnosti jsou nejpoužívanějšími typy detekce vodivostní a gradientová (univerzální detekce), které využívají rozdílné vodivosti resp. gradientu elektrického pole v jednotlivých zónách. Mezi nejpoužívanější specifické detektory patří UV detektor. Optimální variantou je kombinace univerzálního detektoru s UV detektorem. Kvalitativní informaci v ITP poskytuje výška vlny na záznamu z univerzálního detektoru. Výška se nejčastěji vyjadřuje jako poměrné číslo RSH (Relative Step Height) získané poměrem rozdílu výšky vlny látky X a vlny vedoucího iontu h X h L a rozdílu výšky vlny zakončujícího a vedoucího iontu h T - h L (viz. Obrázek 5). Při identifikaci neznámé látky X se zjištěná hodnota RSH porovná s hodnotou RSH standardu St analyzovaného za shodných podmínek. Zóny se v kapiláře pohybují konstantní rychlostí (konstantní hnací proud) a koncentrace iontu v zóně je také konstantní. Z toho vyplývá, že doba průchodu zóny detektorem je přímo úměrná nadávkovanému množství látky. Ostrá rozhraní mezi zónami umožňují velmi přesné měření délky zóny a tedy i vysokou přesnost výsledků. 20

27 l X l St T R St X h X - h L h St - h L h T - h L L čas Obrázek 5. Izotachoforegram rozdělené dvousložkové směsi neznámé látky X a standardu St; R je signál detektoru (ohmický odpor), h i je výška vln příslušných složek a l i je jejich délka Volba vedoucích a koncových elektrolytů Velmi důležitým problémem při volbě elektrolytového systému pro jakýkoliv typ elektroforézy (a tedy i pro izotachoforézu) je ionizace analyzovaných látek. K jejich separaci je třeba, aby byly alespoň částečně disociovány či protonizovány, tj. aby jejich efektivní pohyblivost byla dostatečně velká. Z praktického hlediska je ještě akceptovatelná minimální pohyblivost m 2.V -1.s -1. Hodnota ph se volí tak, aby se využila optimální pufrační kapacita systému. V některých případech (při dělení iontů silných elektrolytů) pufrační schopnost protiionu není nutná, jindy je třeba dvou nebo více pufrujících protiiontů. Koncový elektrolyt vhodný pro separaci kationtů má mít nižší ph než vedoucí elektrolyt, při analýze aniontů platí opačný požadavek. V izotachoforéze je pufrování zón poněkud 21

28 složitější než v ostatních typech elektroforézy. Není zde žádný základní elektrolyt a celé pufrování je úkolem pouze protiionového systému. Toto pufrování není jednoduché, neboť poměry v protiionovém systému se mění od zóny k zóně. V izotachoforéze průběh ph od vedoucí zóny ke koncové podléhá přesným zákonitostem. V anionové izotachoforéze ph zón ve směru od vedoucí ke koncové zóně stoupá, v kationové klesá. Jednoznačně platí toto pravidlo v případě silných elektrolytů. Obecně lze říci, že čím kyselejší je vedoucí elektrolyt při kationové analýze, tím kyselejší jsou zóny vzorku. Při anionové analýze je situace analogická s tím rozdílem, že průběh ph je opačný. Doporučuje se, aby pk látky, jež je zdrojem koncového iontu, bylo vyšší než pk nejslabší kyseliny analyzované směsi (jinak by se mohly ztrácet méně kyselé komponenty v zakončujícím elektrolytu). Obecná pravidla pro volbu operačního systému shrnuje Tabulka I. Jako vedoucí ion je zpravidla volen rychlý ion plně disociované látky, která je k dispozici ve vysoké čistotě. Jako koncové ionty je ve vodných systémech vždy nutné brát v úvahu H 3 O + (kationická analýzy) či OH - (anionická analýza), které musí vždy tvořit potenciálně poslední zónu. Vzhledem k tomu, že tyto ionty mají ve vodě nejvyšší pohyblivost ze všech iontů, mohou se pohybovat mnohem rychleji a důsledkem může být nekontrolovaný pohyb těchto iontů přes izotachoforetická rozhraní, a tím narušení izotachoforézy. Tabulka I. Obecná pravidla pro volbu elektrolytových systémů (Boček et al., 1987). Parametr Kation-ová analýza Anion-ová analýza Vedoucí ion K +, Na +, NH + 4, H 3 O + Cl -, NO - 3, OH - Zakončující ion H 3 O +, slabá báze OH-, slabá kyselina Protiion Slabá kyselina HA Slabá báze BH Podmínka ionizace analytů ph pk BH + 1 ph pk HA Základní doporučené operační systémy Kationty: vedoucí anion K + - (0,001 0,05 M-KOH) + protiion + 0,05 0,2 % aditivum (hydroxyethylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon) 22

29 Tabulka II. Základní doporučené operační systémy po stanovení kationtů (Boček et al., 1987). ph L Protiion Zakončující kation 4,0 5,5 octová H 3 O + (octová kyselina), -alanin, EACA, kreatinin, TBA 5,5 6,5 MES, kakodylová EACA, Histidin, imidazol, kreatinin, TRIS 6,5 7,5 HEPES TRIS, His, 7,8 8,8 TAPS TRIS, BICIN, TRICIN 8,8 9,8 boritá TRIS, triethanolamin 9,0 10,0 glycin TRIS, lysin, ethanolamin, 9,8 10,8 -alanin NH + 4, ethanolamin Anionty: vedoucí anion Cl - (0,002 0,02 M-HCl) + protiion + 0,05 0,2 % aditivum (hydroxyethylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon) Tabulka III. Základní doporučené operační systémy pro stanovení aniontů (Boček et al., 1987). ph L Protiion Zakončující anion 2,0 3,0 Glycin Kyselina octová, propionová, kapronová, glutamová 2,5 3,5 Glycylglycin Kyselina octová, propionová, kapronová, glutamová 3,0 4,0 -alanin Kyselina octová, propionová, kapronová, glutamová 4,0 5,0 6-aminokapronová Kyselina kapronová, glutamová, MES 4,5 5,5 Kreatinin Kyselina kapronová, glutamová, MES 5,5 6,5 Histidin Kyselina kapronová, glutamová, MES, HEPES 6,5 7,5 Imidazol Kyselina MES, HEPES, TAPS 7,5 8,5 Tris (TAPS, glycin, -alanin) + Ba(OH) 2 8,5 9,5 Ammediol (CAPS, glycin, -alanin, EACA) + Ba(OH) 2 9,0 10,0 Ethanolamin (CAPS, EACA, GABA) + Ba(OH) Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Kapilární gelová elektroforéza je vlastně kapilární zónová elektroforéza ve vhodné gelové matrici. Separačním principem je tedy migrace nabitých částic v prostředí molekulárního síta vlivem vloženého potenciálového spádu. Gelová elektroforéza aplikovaná v kapilárním měřítku přináší několik výhod oproti klasickému deskovému uspořádaní. Je možné použít 10 až 100-krát větší elektrické pole, bez projevení se negativního vlivu Joulova tepla. Dalšími výhodami jsou detekce analytů přímo v kapiláře a možnost automatizace stanovení. Hlavní nevýhodami jsou malá reprodukovatelnost přípravy gelem plněných kapilár a jejich nízká životnost. 23

30 Kapilární izoelektrická fokuzace (CIEF) Kapilární izoelektrická fokuzace je velmi rozšířenou metodou pro separaci proteinů. Principem je separace amfolytů v ph gradientu na základě rozdílných hodnot jejich izoelektrických bodů (pi). Vzorek se aplikuje ve směsi se základním amfolytem (směs spojitě pokrývající kyselé, neutrální až zásadité amfolyty), jenž definuje gradient ph v kapiláře. Po aplikaci napětí dojde po určité době ke stavu, ve kterém všechny amfolyty dosáhnou polohy v kapiláře odpovídající jejich izoelektrickému bodu (ph = pi). Tento stav se projeví poklesem proudu procházejícího kapilárou k nulové hodnotě. Metoda izoelektrické fokuzace má tedy dvě fáze, a sice vlastní fokuzaci a fázi detekce-mobilizace (aplikace tlaku, chemická mobilizace) Technika spojování separačních kapilár column-coupling Tato technika využívá spojení dvou kapilár bifurkačním blokem a umožňuje tak využit předseparační kapiláru pro oddělení makrosložek vzorku a na analytické kapiláře provést separaci žádaných látek (Kanianský & Marák, 1990; Kanianský et al., 1999; Kvasnička et al., 2001; Valcárcel et al., 2001). Další výhodou dvoukolonového uspořádání je možnost použít pro separaci elektrolyty o různé koncentraci (CITP-CITP systém koncentrační kaskády), nebo systému dvou různých elektrolytů (dvourozměrná izotachoforéza 2D-CITP) a nebo CITP-CZE separační mód, který umožňuje zvýšit účinnost CZE separace zakoncentrováním analytů v CITP kroku (Foret et al., 1990). Na Obrázku 6 je znázorněna CITP-CZE separace. (A) ITP separace předseparační kapilára; separace probíhá mezi vedoucím (LE) a koncovým elektrolytem (TE), zóny analytů (1, 2, 3 a 4) jsou zakoncentrovány do oddělených zón, kde makrosložka matrice (1) má nejvyšší pohyblivost ze složek vzorku. (B) CZE separace separační kapilára; separace probíhá v prostředí základního elektrolytu (BGE), naprostá většina makrosložka matrice (1) byla v bifurkačním bloku oddělena, ostatní analyty (2, 3 a 4) migrují separační kapilárou v oddělených zónách. Toto uspořádání je vhodné pro analýzu stopových koncentrací ionogenních látek v nadbytku iontů v matrici a umožňuje tak až 100 krát zvýšit detekční limit v porovnání s CITP (Foret et al., 1993). 24

31 Obrázek 6. Schématická ilustrace spojení kapilární izotachoforézy (CITP) a kapilární zónové elektroforézy (CZE). (A) CITP separace, (B) CZE separace, I 1 směr toku proudu v CITP módu, I 2 směr toku v CZE módu, BF bifurkační blok. V literatuře je popsáno využití CITP-CZE pro analýzu anorganických iontů (Kanianský et al., 1994) a Fe 3+ jako Fe(III)-EDTA komplex (Blatný et al., 1997) v říční vodě, EDTA v majonézách (Kvasnička & Míková, 1996), flavonoidů v rostlinných extraktech (Urbánek et al., 2002), lysozymu ve vaječném bílku (Kvasnička, 2003) a pro farmaceutické aplikace (Gyseler et al., 1999). 25

32 2.3. VYUŽITÍ KAPILÁRNÍCH ELEKTROMIGRAČNÍCH METOD V ANALÝZE POTRAVIN Potraviny se obecně skládají z velmi mnoha látek rozdílných chemických vlastností. S příchodem moderních analytických metod, plynové (GC) a kapalinové chromatografie (HPLC), byly tyto metody již od počátku požívány pro analýzu potravin. Zejména kapalinová chromatografie je pro analýzu potravin hojně využívaná, avšak tato metoda má v některých případech nedostatečné separační možnosti. V porovnání s elekromigračními metodami nelze HPLC stanovení jednoduše selektivně modifikovat pro vybrané analyty a HPLC stanovení je také řádově finančně nákladnější. Stanovení netěkavých a nestabilních látek plynovou chromatografii je bez předchozí derivatizace nemožné a tím se její oblast použití v analýze potravin značně zužuje. Kapilární elektromigrační metody mohou tedy, s výjimkou stanovení lipidů, sloužit jako alternativní analytické techniky s vysokou variabilitou a mnohostranným použitím v analýze potravin (Dong, 1999; Kvasnička, 2000). Pro stanovení analytů v potravinách je možné využít všech kapilárních elektromigračních metod, ale velká většina aplikací je založena na využití kapilární izotachoforézy (CITP), a to zejména pro analýzu biogenních kationtů, anorganických kyselin a jejich solí (Blatný & Kvasnička, 1999), kapilární zónové elektroforézy (CZE) a micelární elektrochromatografie (MECK), jež umožňuje stanovit elektroneutrální a nepolární látky. Např. syntetická barviva (Frazier et al., 2000), vitamin A, antioxidanty a konzervační látky v nealkoholických nápojích (Thompson et al., 1995). Jednou z velkých výhod použití obecně všech elektromigračních metod je snadná příprava vzorků, kdy obvykle postačuje připravit vodné roztoky či extrakty. Analytické rozbory potravin se provádějí pro stanovení jejich kvality a zdravotní nezávadnosti, tudíž jde tedy o tři základní oblasti, v nichž se uplatňují CE metody: (i) stanovení složení deklarovaného výrobcem stanovení organických kyselin (mléčné, octové, jablečné, vinné, citrónové, izocitrónové (Ježek & Suhaj, 2001), fumarové (Kvasnička & Voldřich, 2000b), kyseliny askorbové a dehydroxyaskorbové (Cancalon, 1999) v ovocných šťávách, džusech a vínech, sacharidů, flavonoidů, vitaminů (Cancalon, 2003), aminokyselin (lysin, methionin, 3-methylhistidin) (Kvasnička, 1999), bílkovin stanovení ovoalbuminu a lysozymu (Stover, 1988; 26

33 Gilges et al., 1994; Baryla & Lucy, 2000; Kvasnička, 2003), kreatininu v masných výrobcích (Kvasnička & Voldřich, 2000a). (ii) stanovení potravinářských aditiv antioxidantů, konzervačních látek, barviv, sladidel (viz. kap ), ochucovadel glutamát, guanosin-5-monofosfát, inosin-5- monofosfát (Kenndler & Huber, 1980) a anorganických solí (polyfosfáty v masných výrobcích a sýrech). (iii) stanovení látek ohrožujících zdraví konzumenta tzn. těžké kovy, rezidua pesticidů a antibiotik, přírodní toxiny glukosinoláty, glykoalkaloidy (Kvasnička et al., 1994), tetrodotoxin, biogenní aminy stanovení MEKC (Nouadje et al., 1995) a CZE (Lange et al., 2002) v mléčných výrobcích, MEKC stanovení v rybách (Křížek & Pelikánová, 1998), víně (Nouadje et al., 1997) a sojové omáčce (Rodriguez et al., 1996). Zákon číslo 110/1997 Sb. ve znění Vyhlášky 53/2002 Sb. takovéto látky přesně definuje a pro každou látku také určuje její maximální přípustné množství v určité potravině Stanovení potravinářských aditiv Barviva Syntetická barviva jsou v potravinách, obvykle v nápojích a sirupech, stanovována kapilární zónovou elektroforézou (CZE). Razze et al. (1995) popisuje separaci barviv v borátovém pufru o ph 7,5 s přídavkem β-cd a hmotnostní detekcí. Další autoři uvádějí separace v alkalickém prostědí základních elektrolytů o ph 9,0 (Liu et al., 1995), ph 9,5 (Royle et al., 1998), ph 10,5 (Berzas Nevado et al., 1999), ph 11,0 (Urquiza & Beltrán, 2000). Analyty se detektují přímou UV detekcí při 200, 220, 254 a 280 nm, přičemž je třeba při použití DAD detektoru volit příslušnou vlnovou délku pro jednotlivé barviva. Karovičová et al. (1991) popisuje CITP separaci syntetických barviv s vodivostní detekcí v prostředí vedoucího elektrolytu o ph 3,5 (10 mm HCl β-alanin) a 5 mm kyselinou octovou jako koncovým elektrolytem. 27

34 Konzervační látky, antioxidanty, sladidla Konzervační látky (kyselina benzoová, sorbová), antioxidanty (BHA, BHT, TBHQ) a sladidla (sacharin, cyklamát, Acesulfam K, Aspartam) se většinou stanovují ve stejných druzích potravin, jako jsou: víno, nealkoholické dietní nápoje, džusy, ovocné sirupy, džemy, sojové omáčky atd.. V literatuře jsou popsána simultánní stanovení těchto analytů micelární elektrochromatografií v nápojích a v dietním džemu (Boyce, 1999; Richard et al., 2000). Při samostatném stanovení konzervačních látek se obvykle používají základní elektrolyty o ph ~9, které mohou být modifikovány přídavkem α-/β-cd (Kuo & Hsieh, 1997) a nebo 5 % acetonitrilu (Cancalon, 1999). Pro stanovení antioxidantů v potravinách se téměř výhradně používá kapilární micelární elektrochromatografie. Stejně jako u stanovení konzervačních látek se pro separaci používají alkalické základní elektrolyty o ph 9 10 s přídavkem SDS (Hall et al., 1994; Abrantes et al., 1997), SC/SDS/methanolu (Boyce & Spickett, 1999). Simultánní stanovení sladidel (sacharin, Acesulfam K, Aspartam) je možné micelární elektrochromatografií (Trenerry, 1998; Richard et al., 2000). Pro samostatné stanovení aspartamu je možné použít kapilární izotachoforézu (Kvasnička, 1987) a kapilární zónovou elektroforézu, kde se separace provádí v alkalickém prostředí fosfátového pufru (Pesek & Matyska, 1997), glycinového pufru ph 9,0 (Walker et al., 1997), borátového pufru ph 9,35 (McDevitt et al., 1998, Sabah & Scriba, 1998) FOSFÁT A POLYFOSFÁTY Používání polyfosfátů jako aditiv v potravinářském průmyslu je zavedeno snad na celém světě již několik desetiletí. Přídavkem polyfosfátů, respektive derivátů kyseliny fosforečné zvyšujeme obsah fosforu nad jeho přirozenou hladinu. Polyfosfáty, jako potravinářské aditivum, jsou nejčastěji používány zejména v masném průmyslu a dále pak při výrobě sýrů Přirozený obsah fosforu v mase Fosfor přirozeně přítomný v mase v množství od 1200 do 2500 mg.kg -1, je jednou z významných složek masa (veškeré živé hmoty). Sloučeniny fosforu jsou klíčové v 28

35 energetickém metabolizmu, kde fungují jako zásobárna energie v podobě ATP, GTP, fosfoenolpyruvátu a kreatinfosfátu. Sloučeniny fosforu s lipidy (fosfolipidy) jsou součástí biomembrán a tvoří tak důležitou část biologických struktur Polyfosfáty v masných výrobcích V masné technologii jsou polyfosfáty přidávány zejména pro zvýšení vaznosti masa (tj. jeho schopnost vázat vodu) a tím ke snížení hmotnostních ztrát při tepelném opracování. Polyfosfáty, jež vyvazují těžké kovy do komplexu, také zabraňují změnám barvy, zpomalují oxidaci lipidů a stabilizují vitamín C. Dále snižují i tepelnou odolnost mikroorganizmů a udržováním bílkovin v rozpustném stavu zlepšují rovněž emulgaci tuků. Požadovaný účinek zvýšení vaznosti pomocí aditivních polyfosfátů se vysvětluje vazbou vápenatých iontů, obecně vícemocných kationtů kovů, čímž dochází k disociaci příčných vazeb ve struktuře svalové tkáně. Uvolněním pevných vazeb aktomyosinu se od sebe filamenta mohou vzdalovat a uvolnit tak prostor pro molekuly vody. Přítomné polyfosfáty také posouvají ph masa do oblasti vzdálené od izoelektrického bodu a tím rovněž přispívají ke zvýšení vaznosti (Pipek, 1995). Nejčastěji jsou používané směsi difosfátu (pyrofosfátu), trifosfátu a tetrafosfátu. Je třeba dodat, že pouze difosfát vyvolává disociaci aktinu a myosinu přímo, kdežto trifosfát a více kondenzované fosfáty až po enzymovém rozkladu na difosfát (Hamm & Neraal, 1977). Enzymy trifosfatáza a pyrofosfatáza, jež jsou přítomny v tepelně neopracovaném mase, jsou odlišně citlivé ke změně teploty (trifosfatáza je méně závislá). Tohoto je využíváno při výběru složení směsí polyfosfátů, neboť rozdílný poměr mezi obsahem trifosfátu a difosfátu může ovlivnit průběh reakcí v mase. Trifosfáty jsou degradovány na difosfát během kratší doby, než se při tepelném opracování dosáhne teploty, při které dojde k inaktivaci trifosfatázy. Proto byl v tepelně opracovaných masných výrobcích nalezen společně s fosfátem pouze difosfát. Nadměrný příjem polyfosfátů v potravě způsobuje, že jejich rezidua v těle konzumenta vyvazují zejména vápenaté a hořečnaté ionty a tím tak o ně organismus ochuzují. Z tohoto důvodu je ze zákona 110/1997 Sb. O potravinách a tabákových výrobcích dle vyhlášky 53/2002 Sb. stanoven maximální povolený přídavek polyfosfátů do masných výrobků, který činí 5000 mg.kg -1, počítáno jako P 2 O 5. 29