PEPTIDY A BÍLKOVINY. Kapalinová chromatografie peptidů a bílkovin

Transkript

1 PEPTIDY A BÍLKOVINY Obsah kapitoly Separace peptidů a bílkovin : kapalinová chromatografie Možnosti detekce peptidů a bílkovin Separace peptidů a bílkovin: elektromigrační metody Hmotnostní spektrometrie peptidů Analýza peptidů v potravinách Analytická proteomika Kapalinová chromatografie peptidů a bílkovin gelová permeační chromatografie GPC, SEC size exclusion chromatography iontoměničová chromatografie IEC ion exchange chromatography chromatografie v systému obrácených fází RPC reversed phase chromatography chromatografie s hydrofobní interakcí HIC hydrophobic interaction chromatography afinitní chromatografie AC 1

2 Detekce peptidů a bílkovin v HPLC a kapilární elektroforéze UV λ = 280 nm, λ < 230 nm derivatizace a UV/VIS detekce ninhydrin A 570 dabsylchlorid A 430 DTNB selektivní detekce thiolových skupin absorpční maxima při 412 a 357 nm O 2 N S COOH S SSR + RSH + NO 2 O 2 N O 2 N COOH COOH COOH SH Detekce peptidů a bílkovin v HPLC a kapilární elektroforéze FLD vlastní fluorescence bílkovin (Trp) derivatizace a FLD reakce s o-ftalaldehydem a merkaptoethanolem reakce s dansylchloridem MS 2

3 SEC resp. GPC peptidů a bílkovin Gely modifikované dextrany (Sephadex, Superdex), agarosové gely Rozměry kolon 4,6 250 mm, mm, mm Mobilní fáze konc. roztoky močoviny (6M), guanidinu vodný roztok elektrolytu (0,2-0,5 M) + pufr (např. fosfátový 0,02M) nebo samotný pufr (Tris-HCl) někdy přídavek org. rozpouštědla (10-30 %, MeOH nebo ACN) Separační mechanismy Malá separační účinnost IEC bílkovin Stacionární fáze: katexy -SO 3 -, -COO - anexy -CH 2 CH 2 -N + Et 3, -CH 2 CH 2 -NH + Et 2 Gradientová eluce: kyselý pufr (katexy) nebo alk. pufr (anexy) + rostoucí konc. elektrolytu Separace podle náboje IEC dělení bílkovin na silně kyselém katexu (1): chymotrypsin (2): cytochrom c (3): lysozym 3

4 RPC peptidů a bílkovin dělení podle hydrofobních vlastností předpokládaný retenční čas peptidu lze vypočítat jako sumu retenčních příspěvků aminokyselin s korekcí na uspořádání molekuly stacionární fáze: SiC 18, SiC 8, SiC 4, SiPh porézní grafitický uhlík mobilní fáze 1. voda (vodný tlumivý roztok) + ACN nebo MeOH (někdy THF) 2. (1) + iontově párové činidlo (0,1 % TFA tj. CF 3 COOH, případně HFBA) zpravidla gradientová eluce ( ACN nebo MeOH) (s konstantní konc. TFA) Příklad RPC separace peptidů a aromatických karboxylových kyselin Hypercarb PGC 4,6 100 mm 5 µm A: voda + 0,1 % TFA B: ACN + 0,1 % TFA 4

5 HIC peptidů a bílkovin hydrofobní stacionární fáze mobilní fáze: vodný roztok elektrolytu o vysoké koncentraci (několik mol/l) gradient: pokles koncentrace elektrolytu hydrofobní interakce slábne výhodné pro separaci proteinů v nativním stavu RPC a HIC separace peptidů RPC: A: 0,1 % TFA ve vodě, B: 0,1 % TFA v 50 % ACN HIC: A: 2M (NH 4 ) 2 SO 4 + 0,025 M K 2 HPO 4 (ph 6,5) B: 0,025 M K 2 HPO 4 (ph 6,5) 5

6 Elektromigrační metody dělení peptidů a bílkovin gelová elektroforéza ve sloupcích (trubičkách) nebo v plošném uspořádání agarosové gely polyakrylamidové gely (PAGE) kapilární elektroforéza (CE) kapilární zónová elektroforéza (CZE) micelární elektrokinetická (kapilární) chromatografie (MEKC, MECC) kapilární isoelektrická fokusace (CIEF) kapilání gelová elektroforéza (CGE) (kapilární) isotachoforéza (CITP, ITP) Isoelektrická fokusace (IEF) v gelu s gradientem ph se jednotlivé částice pohybují z místa startu do místa, kde ztratí náboj (pi) gradient ph se v gelu vytvoří předchozím vložením napětí a je stabilizován přítomností nízkomolekulárních amfolytů (oligoaminooligokarboxylových kyselin) ph klesá od katody k anodě dělení podle pi: lze rozlišit látky s rozdílem pi > 0,001 6

7 SDS-PAGE elektroforéza dělení v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS) asociáty SDS s jednotlivými bílkovinami získávají prakticky stejný náboj vazba cca 1,4 g SDS na 1 g bílkoviny v gelu se jednotlivé částice dělí podle velikosti molekuly Detekce bílkovin v gelu vazba organického barviva amidočerň, methylenová modř, Comassie blue vypírání z gelu roztokem kys. octové reakce s fluoreskaminem (reagují všechny prim. aminy) O O O O fluoreskující derivát redukce Ag + na kovové stříbro (velmi citlivé) specifická detekce reakce s protilátkou blotting 7

8 Dvourozměrná gelová elektroforéza 2D GE nejčastěji IEF SDS-PAGE 2D GE gluteninů pšeničných odrůd Okapi a Avalon 1. IEF v ultratenké vrstvě (0,25 mm) 2. SDS-PAGE Kapilární elektroforéza, CE Dávkování vzorku hydrostatická metoda hydrodynamická metoda elektrokinetická metoda Elektroosmotický tok vnitřní povrch křemenné kapiláry je nabit záporně vznik elektrické dvojvrstvy EOF 8

9 CZE peptidů a bílkovin Dělení částic podle jejich náboje závisí na IEB a ph pufru Význam složení pufru interakce molekul proteinů s povrchem kapiláry rozšiřování zón, prodlužování analýzy potlačení interakce: iontové síly, přídavek aminu (putrescin) příliš alkalický pufr záporný náboj proteinu i stěny EOF, migrace částic analytu příliš kyselý pufr záporný náboj stěny mizí, kladný náboj proteinu EOF slábne (mizí při ph < 3) MEKC peptidů a bílkovin přídavek surfaktantu do pufru aniontové surfaktanty: SDS, alkansulfonové kyseliny kationtové surfaktanty: dodecyltrimethylamonium bromid, cetyltrimethylamonium bromid, tetradecyltrimethylamonium chlorid při separaci se uplatňuje selektivní tvorba micel surfaktant-analyt neionogenní surfaktant nebo aniontový surfaktant zůstává záporný povrch kapiláry kationtový surfaktant povrch kapiláry získává kladný náboj směr EOF se obrací 9

10 MEKC analogů angiotensinu Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe Pufr 10 mm Tris + 10 mm Na 2 HPO mm DTAB, ph 7,05 (1): [Ile 7 ]-Ang III, (2): [Val 4 ]-Ang III, (3): Ang III, (4): [Val 5 ]-Ang II, (5): Ang II, (6): Des-Asp 1 -Ang I, (7): Ang I Postup při vývoji CE metody dělení bílkovin výběr detekčních podmínek např. absorbance při 200, 214, 280 nm výběr separačního módu, pufru, jeho ph nejprve 100 mm boritan, ph 8,3-8,6 nebo 50 mm fosfát ph 7,5 optimalizace teploty kapiláry t zkrácení migračních časů optimalizace napětí zlepšení rozlišení dělených látek použití aditiv pufru (MeOH nebo ACN, diaminy ) optimalizace nastřikovaného objemu vzorku nástřik tlakem, závislost rozlišení na objemu 10

11 Vícerozměrné separace postupná analýza frakcí z předchozí separace SEC RPC SEC IEC RPC SEC CE LC LC comprehensive two-dimensional liquid chromatography LC LC CE Příklad postupné analýzy chromatografických frakcí při izolaci a charakterizaci metalothioneinů 11

12 Možné uspořádání při LC LC Příklad chromatogramu IEC SEC A glukosa oxidasa B ovalbumin C β-laktoglobulin A D trypsinogen E α-chymotrypsinogen F konalbumin G ribonukleasa H hemoglobin Příklad uspořádání LC LC CE 12

13 Hmotnostní spektrometrie peptidů a bílkovin FAB-MS fast atom bombardment ESI-MS electrospray ionization MALDI-MS matrix-assisted laser desorption/ionization přístroje obvykle používají TOF analyzátor v proteomice hlavní analytická metoda MALDI-MS Sloučeniny používané jako matrice 1 α-kyano-4- hydroxyskořicová kys. (CCA) 2 sinapová kys. (SA) 3 2,5-dihydroxybenzoová kys. (DHB) 13

14 MALDI-MS spektrum imunoglobulinu ESI-MS bílkovin Klastry vícenásobně nabitých iontů (M + zh) z+ Výpočet M : m/z = q zvolený pík na začátku řady: q 1 z 1 = M + z 1 m p další pík vzdálenýodprvního o j-1klastrů: ESI-MS spektrum lysozymu λ q 2 (z 1 j) = M + (z 1 j) m p z 1 = j (q 2 m p ) / (q 2 q 1 ) M = z 1 (q 1 -m p ) 14

15 MS/MS peptidů a bílkovin nejčastěji ESI CID MS/MS fragmentace molekulových iontů peptidů Příklad MS/MS peptidu Spektra peptidu Tyr-Gly-Gly-Phe-Met (YGGFM) 15

16 ESI-MS spektra EC peptidů a γ-glu-cys-gly (GSH) b - γ-glu-cys- γ-glu-cys-gly (PC 2 ) CID - MS/MS spektra EC peptidů a γ-glu-cys-gly, mateřský ion 308 b - γ-glu-cys- γ-glu-cys-gly, mateřský ion

17 Analýza peptidů v potravinách Karnosin, anserin a balenin H 2 N H N COOH H 2 N H N COOH H 2 N H N COOH O CH 2 O CH 2 O CH 2 N NH N N CH 3 N N H 3 C peptidy svalové tkáně možnost rozlišení druhu masa podle poměru karnosin/anserin markery přídavku živočišné bílkoviny Stanovení karnosinu a anserinu extrakce ze vzorku a deproteinace methanolem nebo roztokem HClO 4 stanovení IEC kolona Spherisorb SCX (4,6 250 mm) mobilní fáze A: 20 % ACN v 6 mm HCl B: A+ 0,8M NaCl pokolonová derivatizace s OPA+ME fluorimetrická detekce λ ex = 340 nm, λ em = 445 nm Chromatogram vzorku krmiva křivky shora dolů: vzorek a přídavky 0,5, 1 a 5 ppm karnosinu a anserinu 17

18 Jiná metoda stanovení karnosinu a anserinu předkolonová derivatizace peptidů dabsylchloridem stanovení LC-MS Analytická proteomika Proteom soubor všech proteinů určitého organismu Proteomika obor zabývající se studiem proteomu Analytická proteomika analýza kombinací separačních metod a hmotnostní spektrometrie s cílem identifikace jednotlivých bílkovin (určení M r, sekvence aminokyselin a posttranslačních modifikací) Základní přístupy k analýze proteomu Bottom-up proteomika (klasický postup): izolace bílkoviny, její enzymová hydrolýza a MS analýza peptidových štěpů Top-down proteomika: izolace bílkoviny a MS analýza fragmentací molekuly Shotgun proteomika: směs bílkovin je enzymově rozštěpena, vzniklé peptidy jsou separovány a sekvenovány tandemovou MS 18

19 Klasický postup proteomické analýzy 1. Oddělení proteinové frakce z biologického materiálu (srážení a denaturace) 2. Separace proteinů a jejich izolace 2D gelová elektroforéza, vyříznutí částí gelu s jednotlivými bílkovinami vícerozměrná chromatografie SEC, IEC, RPC, sběr frakcí 3. Enzymová hydrolýza jednotlivých čistých bílkovin (např. trypsin, ph 7-8, 4-12 h, 37 C, štěpí vazby Arg-X a Lys-X zastavení reakce okyselením) 4. Hmotnostní spektrometrie (nejčastěji MALDI-MS) peptidových štěpů vzniklých hydrolýzou 5. Vyhledání struktur bílkovin v databázi sekvencí podle M r peptidových štěpů 19