Analýza léčiv Prof. RNDr. Vladimír Král, DSc

Transkript

1 Analýza léčiv Prof. RNDr. Vladimír Král, DSc VŠCHT, ACH II, 2012

2

3

4

5

6 Analysis of NCE launches in NCE 2012

7 2011 was a good year with 35 NCE launches 27 small molecules, 7 biologics and 1 vaccine Small mol Biologic New active substances launched worlwide Split by Indication NCE

8 Drug Discovery Process Exploratory Drug Discovery Drug Development Compound library generation Combichem New Target Identification Target Qualification Validation Lead Identification Lead Optimization Preclinical Development Clinical Development NDA Drug Assay Development Discovery Center w/primary & secondary screening & Pre-ADME In vitro & invivo ADMET Clinical Trials & Clinical monitoring Analytical the process. screening assays becoming more important of 8

9 Stadia vývoje léku Registrace Fáze 3 Skupiny pacientů: Srovnání se standardní léčbou 1 sloučenina sloučenin Tkáňová homogenita (Bio)chemická syntéza Preklinické zkoušení Účinky na tělesné funkce, mechanismus účinku, toxicita Fáze 2 Vybraní pacienti: Účinek na onemocnění; bezpečnost, mechanismus účinku, dávkování, farmakokinetika Buňky Fáze 4 Fáze 1 Zdravé osoby: Izolované orgány Mechanismus účinku na tělesné funkce, určení lékové formy, farmakokinetika 10 sloučenin Obecné používání léku Dlouhodobé hodnocení prospěšnosti a rizik Zvířata EKG, krevní obraz EEG, krevní tlak

10 Každý lék je produktem znalostí a práce V současnosti činí průměrná doba mezi objevením léku a jeho použitím v medicíně 15 let. Období vývoje (roky) Registrační fáze Klinická fáze Preklinická fáze Doba mezi syntézou léku a udělením registrace 60. léta 70. léta 80. léta

11 Co je to generikum Preparát u něhož uplynula patentová ochrana, a který je zaregistrován jiným výrobcem na základě dat klinického zkoušení orinálního přípravku Výrobce musí pouze doložit, že jím vyrobená kopie má stejné farmakokinetické vlastnosti

12 Inovativní a generické přípravky v době registrace průměrné trvání výzkumu a vývoje 15 let průměrné trvání výzkumu a vývoje 1 rok cca 70 registračních studií 2 registrační studie účinnost a bezpečnost prokázána prům. u pacientů opakovaným podáváním po dobu 2-5 let bezpečnost prokázána u 24 zdravých probandů po jedné dávce = originální přípravek = generický přípravek

13 Drug Discovery Pathway Primary Screening [Hits] ADME Efficacy Discovery & Development Preclinical Studies Selection of candidate drug Preformulations Stability Studies Safety Toxicology Leads 13

14

15 Od Structurní analyzy k analýze nečistot: API, LF NMR MS nuclear magnetic resonance mass spectrometry evaluation by MS and (or) NMR F O O OH N F structures confirmation impurities identification reactions monitoring excipients analysis polymorphic problems O

16 Typy analýz, separační metody MS GC-MS structural screening, identification residual solvents, identification NMR 250 MHz identificatio n API in liquid state identification of impurities in liquid state quantitative analysis materials for DMF LC-MS structural screening, identification 500 MHz liquid impuridentific ation API and ities in liquid state quantitative analysis materials for DMF HR-MS high-res elemental composition quantitative analysis 500 MHz solid characterizati on of polymorphs identification and quantification of excipients in solid state

17 Drug discovery: Metody analýzy kombinatoriálních knihoven Využití chemických a biologických analytických metod k vývoji léčiva

18 Metody analýzy kombinatoriálních knihoven High-troughput analytické techniky identifikace vzorku (strukturní analýza) určení čistoty vzorku kvantitativní analýza

19 Metody analýzy kombinatoriálních knihoven Využití chemických a biologických analytických metod k vývoji léčiva

20 Strukturní analýza složek knihoven Nejcitlivější metoda: hmotnostní spektrometrie (MS) 1) identifikace biologické aktivity u vzorku vázaného na pryskyřici 2) analýza tohoto vzorku MS Nejdůležitější pro dosažení srovnatelnosti dat je způsob ionizace. Nejčastěji užívané jsou: ESI (Electrospray ionization) MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)

21 Specifika Farmaceutická analýza úloha ve vývoji léčiv Akademický, versus farmaceutický vývoj (DMF, dossier)

22 Specifické testy API, LF Profil nečistot, známé, neznáme nečistoty, limity % fyzikálně chemické vlastnosti velikost částic polymorfie chiralita obsah vody anorganické nečistoty mikrobiální limity

23 Analytické metody, API, LF Separační HPLC, UPLC, GC, TLC, CE Klasické titrace, gravimetrické Termické DSC, TGA

24 Analytické metody spektroskopické UV-Vis, IR, Raman, NMR difrakční RTG prášková difrakce vnitřní struktura mikroskopie optická, elektronová

25 Analytické metody PSD: laser difrakce Analýza velikosti částic, Mikro, nanočástice Difrakční metody

26 Disoluce Nezbytný předpoklad pro absorpci léčiv Souvislost in vitro testování a in vivo dostupnosti Důležitý nástroj pro návrh, výrobu, hodnocení a kontrolu kvality lékových forem Definice: Disoluce je proces, kterým pevná substance vstupuje do solventu a stává se roztokem. Farmaceutické pevné lékové formy se rozpouštějí v biologických médiích a následně se absorbují

27 permeabilita vysoká nízká Biofarmaceutický klasifikační systém (BCS) rozpustnost vysoká nízká 1. třída 2. třída 3. třída 4. třída

28 Disoluční metody Hodnocení různých disolučních metod Výběr nové oficiální zkoušecí procedury Vliv na hlavní obory farmacie, registrační autority, výrobu léků První zkouška disoluce: (1970) - princip: Standardní litrová nádoba, vodní lázeň vytemperovaná na 37 C, rotující košíček (stejných rozměrů jako současný), rychlost otáčení 100 ± 4 % rpm

29 Schema disoluce on-line

30 dissolved amount in % Volba disolučního média, pokrytí hodnot fyziologického ph time in minutes w ater 0,1 M HCl 0,01 M HCl phosphate buffer ph 6,8

31 Validace analytických metod Definice podle ISO 8402 (1994): Potvrzení zkoumáním a poskytnutí objektivního důkazu, že jsou splněny jednotlivé požadavky pro specifické zamýšlené použití.

32 Parametry ověřované při validaci přesnost linearita rozsah správnost detekční a kvantitativní limit korekční odezvový faktor selektivita robustnost

33 Přesnost Míra shody mezi jednotlivými výsledky Tři základní úrovně opakovatelnost mezilehlá přesnost reprodukovatelnost

34 Accuracy vs. Precision Good accuracy Poor precision Poor accuracy Good precision Good accuracy Good precision

35 Linearita a rozsah Přímá závislost mezi odezvou přístroje a koncentrací analytu. Rozsah závisí na typu zkoušky

36 Správnost Odchylka výsledků od správné hodnoty. modelové vzorky přídavek standardní látky resp. nečistot jiná nezávislá metoda

37 Detekční limit (LOD) Nejnižší detegovatelná koncentrace analytu. Nestanovuje se kvantitativně. výpočet: LOD = (3,3 * σ)/s poměr signálu k šumu

38 Kvantitativní limit (LOQ) Nejnižší koncentrace analytu, kterou lze stanovit kvantitativně s přijatelnou přesností a správností. výpočet: LOQ = (10 * σ)/s poměr signálu k šumu graficky

39 Selektivita Schopnost metody analyzovat danou substanci v přítomnosti jiných látek, jejichž přítomnost lze očekávat Stresové testy substance hotový přípravek

40 Robustnost Míra vlivu proměnných podmínek při provádění analýza na její výsledky výběr kolony složení mobilní fáze ph vodné složky mobilní fáze průtoková rychlost teplota kolony stabilita roztoků příprava vzorků

41 Robustnost výběr kolony složení mobilní fáze ph vodné složky m.f. průtoková rychlost teplota kolony stabilita roztoků příprava vzorků strmost gradientu

42 Pharma Future Importance of enantioselective synthesis chiral analysis (75% of future drugs) example: chiral prazoles

43 Pharmaceutical Industry

44 Chromatografické separační metody Rozdělení chromatografických metod podle charakteru mobilní fáze podle principu (podle interakcí zodpovědných za dělení složek) podle uspořádání stacionární fáze (sloupcová, plošná) podle způsobu transportu analyzované směsi (eluční, frontální, vytěsňovací)

45 Plynová chromatografie (GC) Plynová chromatografie (angl. gas chromatography GC) je chromatografická metoda, při ktere je mobilní fází plyn. Je vhodná na separace plynných a nízko vroucích kapalných směsí.

46 Stacionární fáze v plynové chromatografii Plynová chromatografie se obvykle dělí na chromatografii v systému plyn - pevná látka (GSC) a na chromatografii plyn - kapalina (GLC). V metodě GSC je stacionární fází adsorbent (aktivní uhlí, silikagel, molekulová síta) V metodě GLC je stacionární fází kapalinový film zakotvený na inertním nosiči V případě GSC je distribuce mezi obě heterogenní fáze založena na adsorpci nebo sítovém efektu, v případě GLC na rozpouštění

47 Kapalné stacionární fáze v plynové chromatografii V praxi nalézají větší uplatnění než adsorbenty U zakotvené kapalné fáze je požadována nízká tenze par, malá viskozita, chemická stabilita při pracovní teplotě, dobrá rozpouštěcí schopnost pro složky směsi, selektivita Jako zakotvené kapalné stacionární fáze mohou být použity polyethylenglykoly, polypropylenglykoly, polyestery, polysiloxany Pro účinnou separaci je důležitá volba vhodných nosičů zakotvených fází. - Materiál nosiče musí být chemicky inertní, jeho sorpční aktivita musí být minimální Sorpční aktivita nosiče se omezuje praním nosiče v minerálních kyselinách nebo alkalických hydroxidech a úpravou pomocí chlorsilanů Jako nosiče se nejčastěji používají různé druhy křemelin, vypalované nosiče, teflon, silikagel, skleněné kuličky

48 Nosný plyn v metodě GC Nosný plyn by se měl svým chováním blížit plynu ideálnímu K ideálnímu chování má velice blízko helium, je však dosti drahé Nejčastěji používanými nosnými plyny jsou dusík, argon, vodík a helium Nosný plyn nesmí, s ohledem na stacionární fázi a chromatografované látky, obsahovat vodu a kyslík

49 Schéma plynového chromatografu 1. Dávkovací systém (injektor) 2. Chromatografická kolona 3. Detektor 4.Termostaty pro injektor, kolonu a detektor 5. Vyhodnocovací zařízení (zapisovač, počítač) Obrázek 1: schéma plynového chromatografu Průtok mobilní fáze kolonou musí být optimalizován (van Deemterův vztah) Průtok injektorem a detektorem je obvykle vyšší než průtok kolonou Mezi injektor a kolonu je obvykle zařazen dělič toku (splitter) Podobně mezi kolonou a detektorem se nachází zařízení na úpravu toku

50 Dávkování vzorku v plynové chromatografii Na způsob dávkování vzorku do kolony se kladou velké nároky - Vzorek je nutné vpravit do kolony co nejrychleji a má zaujmout co nejmenší prostor - Množství dávkovaného vzorku by mělo zaujmout prostor odpovídající jednomu teoretickému patru - Objem injektoru by měl být malý, protékat by měl injektorem velký proud plynu - Kapalné vzorky je nutné okamžitě zplynit, aby přišly do kolony v podobě par - Teplota nástřiku má být asi 50 C nad bodem varu analyzované látky - Nejčastěji se dávkuje mikrostříkačkou opatřenou jehlou, která propíchne septum

51 Chromatografické kolony v GC Náplňové kolony Trubice o průměru 2 až 5 mm obsahující adsorbent nebo nosič se zakotvenou kapalnou fází Délka náplňových kolon bývá od desítek centimetrů do několika metrů Kolony se zhotovují ze skla nebo nerezové oceli Kapilární kolony Stacionární fáze je rozprostřena na vnitřních stěnách kapiláry Průměr kapiláry je menší než 0,5 mm Délka kapilárních kolon bývá 20 až 200 metrů Materiálem pro výrobu kapilárních kolon bývá křemen

52 Detektory v plynové chromatografii Detektor je zařízení, které obecně zviditelňuje analytický signál Teplotu detektoru v GC je slabě vyšší než teplotu kolony (aby nedocházelo ke kondenzaci analytů) Objem detektoru bývá velmi malý (může být i menší než µl); - je-li objem detektoru velký, dochází k rozmývání chromatografických píků Detektory jsou buď univerzální, nebo jsou selektivní

53 Detektory v plynové chromatografii Tepelně vodivostní detektor (TCD, katarometr) Plamenový ionizační detektor (FID) Plamenový ionizační detektor s alkalickým kovem (AFID) Detektor elektronového záchytu (ECD) Heliový ionizační detektor (HeD) Hmotnostně spektrometrický detektor (MS) Velice citlivý detektor vhodný pro identifikaci analyzovaných složek směsi Organické molekuly se v MS fragmentují MS detektor je detektorem univerzálním K vyhodnocení záznamu z MS detektoru obvykle používáme databanku (identifikace komponent) Nejproblematičtější částí GC/MS je interface spojující plynový chromatograf s hmotnostním spektrometrem Lépe se s MS detektorem spojují kapilární kolony než kolony náplňové Kombinace GC-MS patří dnes k nejprogresivnějším analytickým technikám

54 Stabilitní testování účinných látek a léčivých přípravků

55 Chemická stabilita pevných léčiv Léčivo uvedené na trh musí být chemicky stabilní do expirace, resp. po expiraci koncentrace rozkladných (degradačních) produktů stoupne nad určitou mez (limity stanoví národní regulační autorita nebo jsou uvedeny v Lékopise Pharmacopei nebo ve směrnici ICH International Conference on Harmonization) Léčivo musí být do expirace stabilní zejména vůči: Stání na vzduchu Teplotě Vlhkosti Působení světla Kombinacím všech těchto vlivů

56 Stabilitní testy způsob stanovení expirace léčiva zahrnují organoleptické hodnocení, fotostabilitu, fyzikální, chemické, biologické a mikrobiologické zkoušky. Chemické zkoušky zahrnují stanovení obsahu API, vybraných excipientů, degradačních produktů a nečistot Zátěžový (stresový) Zrychlený Dlouhodobý

57 Stabilitní testování Účel : Stabilitní testování slouží k ověření stability ÚL nebo LP, což je vlastnost léčiva, zachovat si ve stanovených mezích, po určitou dobu a za stanovených podmínek skladování deklarované jakostní znaky, a tím i bezpečnost účinnost a aplikovatelnost

58 Směrnice pro stabilitní testování ICH International Conference on Harmonization Sjednocení požadavků národních registračních autorit na stabilitní zkoušení

59 Velikost a tvar částic Proč je sledovat a co ovlivňují: 1) Fyzikálně-chemické vlastnosti látky: redukce velikosti vzrůst aktivního povrchu rychlejší rozpouštění rychlejší absorpci látky tělem rychlejší průběh chemických reakcí 2) Transport léčiva v těle: Př. Velikost částic, které se usadí v plicích je 4-10 mikrometrů, menší: jsou exhalovány větší: zůstanou v hrdle 3) Výrobu léčiva: syntézu a formulaci příprava a výroba kapslí a tablet, ta je ovlivněna vlastnostmi související s velikostí částic filtrovatelnost, směšování a oddělování, distribuce jednotlivých složek v tabletě

60 Plasma Concentration, µg/ml Pharmacokinetics NanoCrystal Tablet, 200 mg Commercial Capsule, 200 mg Time (hr)

61 How to influence absorption Window of absorption Incomplete absorption Complete absorption

62 Aqueous Phase Stabilization of nanoparticles Crystalline Drug Substance Adsorbed Polymer Polymeric Stabilizer nm

63 PSD Velikost částic Práškový vzorek Léková forma

64 Práškový vzorek Krok č. 2 směs složek čistá látka nad 1 mikrometr pod 1 mikrometr směs od nano- do milimetru Nad mikrometr mikroskop + analýza obrazu, laserová difrakce, spektrální techniky Pod mikrometr laserový rozptyl, skenovací elektronové mikroskopy Směs komplexní problém

65 Prášky jako výchozí substance Velikost částic. -Průměr (Feretův, Martinův), střední průměr, rozdělení částic dle velikosti (distribuce rozdělení do tříd). -Měřící metody: optickým mikroskopem, laserovou technikou, sedimentační analýza, sítová analýza.

66 PSD

67 Měření velikosti částic Optická mikroskopie, laser Dopl.ČL 2006 str látky lze pozorovat i fotit Charakterizace - krystalinity, - velikosti částic, - tvaru částic (jehlicovité, sloupcovité, šupinovité, destičkovité, lištové, stejnoměrné), - otázky shlukování (stupeň popsán termíny: lamely, agregáty, aglomeráty, konglomeráty, sférolity, drůzy), - vlastnosti částic a povrchové charakteristiky.

68 Metodika Výběr dle předpokládané velikosti části Nad mikrometr Obrazová analýza optická mikroskopie Laserová difrakce Pod mikrometr Dynamický světelný rozptyl Obrazová analýza elektronová mikroskopie Laserový dynamický rozptyl Laserová difrakce Obrazová analýza 1nm 100 nm 1 μm 10 μm 100 μm 1mm 10 mm

69 Analýza obrazu - podmínky Pro obrazovou analýzu je stěžejní: vhodně připravený reprezentativní vzorek, částice by neměly tvořit shluky minimální velikost částice cca 5 mikrometrů sejmutí kvalitního obrazu, tedy kvalitní mikroskop pro měření musí být vybrány objekty, u kterých je možné provádět kvantifikaci charakteristiky tvaru, velikosti a distribuce částic

70 Analýza obrazu postup práce příklad Sejmutý obraz Binární obraz částice vybrané k měření

71 Analýza obrazu výsledky - příklad

72 Laserová difrakce - princip Velké částice způsobují ohyb laserového paprsku pod malým úhlem a paprsek dopadající na detektor má velkou intenzitu Malé částice způsobují difrakci laserového paprsku pod velkým úhlem, ale paprsek dopadající na detektor má nízkou intenzitu. Kyveta se vzorkem Laser (He-Ne) Naměřený difrakční obraz je použit k výpočtu distribuce velikosti částic. Omezení: vysoká spotřeba vzorku Problém tvaru krystalů sferizace

73 Laserová difrakce výstup měření Výstupem vlastního měření je grafické vyjádření distribuce velikosti částic (frekvenční či kumulativní křivka, histogram). Frekvenční křivka Distribuční křivka Frekvenční křivka charakterizuje distribuci velikosti částic vztaženou na objem částic Kumulativní, distribuční křivka udává procentické zastoupení částic ve vzorku o velikosti menší než je velikost zvolená.

74 Laserová difrakce výstup měření K charakteristickým parametrům patří: D (0.5) udává velikost při které je 50% částic menších a 50 % větších. Jde vlastně o medián dělící plochu frekvenční křivky na dvě stejné části. D(0,1); D(0,9) udává velikost pod níž se nachází 10 resp. 90 % částic a charakterizuje tak okraje distribuce

75 Práškový vzorek čistá látka nad 1 mikrometr laserová difrakce Např. Mastersizer 2000 k dispozici na QC Princip: Ohyb laserového paprsku na částici Detekce difraktovaného/prošlého paprsku difrakčního obrazu Omezení: vysoká spotřeba vzorku Problém tvaru krystalů - sferizace

76 Práškový vzorek čistá látka nad 1 mikrometr analýza obrazu

77 Např. (N)IR Imaging Princip: Práškový vzorek čistá látka i směs nad 1 mikrometr spektrální metody Plošný detektor vyfotografování objektu (jejich sady) v (N)IR oblasti s příslušným rozlišením Diferenciace částic podle spekter Omezení: Velikost částic difrakční limit Problém fokusace Statistická významnost homogenizace vzorku, rovnoměrné rozprostření částic všech velikostí

78 Princip: Záření se rozptyluje Zachycení rozptýleného paprsku různá geometrie Detekce + korelace s referencí základ Brownův pohyb Výsledná křivka Omezení: Práškový vzorek čistá látka pod 1 mikrometr laserový rozptyl Vícenásobný rozptyl Velmi nízká intenzita signálu Problém větších částic - sedimentace

79 Práškový vzorek čistá látka pod 1 mikrometr laserový rozptyl Převzato z

80 Světelný dynamický rozptyl - postup Měření intenzity rozptýleného světla se provede vícekrát s malou časovou odchylkou. korelátor - výpočet korelační funkce počítač - výpočet distribuce velikosti částic.

81 cumulative distribution Q(x) / % density distribution q*(x) Světelný dynamický rozptyl - příklad NANOPHOX (0122 P), Cross correlation VALSARTAN / CMOL PVP , 21:44:55,656 x 10 = 248,96 nm x 50 = 313,09 nm x 90 = 397,97 nm particle size / nm Kumulativní distribuce Velikost částice [nm] počet částic o této velikosti [%] ,11 343,11 368,92 0 1,12 3,74

82 Princip: Práškový vzorek čistá látka kolem 1 mikrometru a níže elektronová mikroskopie Svazek elektronů interakcí se vzorkem polem urychlené elektrony (sekundární elektrony, zpět odražené elektrony, charakteristické X-ray, ) Sekundární elektrony topografie povrchu Primární elektrony prostorová distribuce prvků/sloučenin X-ray krystalografické informace Omezení: Náklady na měření při statisticky významném počtu měřených částic. Omezení velikostí částic problém fokusace

83 Elektronová mikroskoie - princip Zobrazení částic pod mikrometr morfologie materiálový kontrast

84 Elektronová mikroskoie - detektory Scanning Transmition Electron Mycroscopy (STEM) Detektor prošlých elektronů umožňuje zobrazování ve světlém i tmavém poli. S jeho použitím je možné pozorovat tvar částic, vidíme jejich obrys nikoli však morfologii povrchu (obdobně jako v transmisním mikroskopu). Wet/STEM: sledování částic na průchod v emulzích a suspenzích. Detektory enviromentální řady: Nevyžadují úplné vakuum - měření pod konstantním tlakem plynu v měřící komoře Kontrola vlhkosti uvnitř komory mikroskopu možnost dynamických experimentů. ledování dynamických procesů Komory s vodní párou Suchý fragment aspirinu Vodní pára začíná kondenzovat na povrchu fragmentu Rozpouštění fragment v kapičce vody Obr.převzaty z: Business briefing: future drug discovery (Carl Zeiss SMT)