Lékařská mikrobiologie

Transkript

1 Lékařská mikrobiologie Část obecná Učební text pro studenty Fakulty zdravotnických studií ZČU v Plzni Studijní obor: Ochrana veřejného zdraví Vypracovala: MUDr. Drahomíra Rottenbornová 1

2 1. Úvod do lékařské mikrobiologie 1.1. Předmět lékařské mikrobiologie Mikrobiologie je věda pojednávající o živých organismech mikroskopické velikosti. Lékařsky významné mikroorganismy jsou prvoci, houby (kvasinky a plísně), bakterie a viry. Ačkoli parazitiční červi (helminti) nemají mikroskopickou velikost, způsobují infekce, jež se vyšetřují mikrobiologickými metodami, a tak se řadí též do mikrobiologie. Lékařská mikrobiologie se zabývá mikroby majícími význam v humánní medicíně. Obecnými vlastnostmi mikrobů se zabývá obecná mikrobiologie, jednotlivé mikroby pak popisuje mikrobiologie speciální Mikrobiologie a medicína Mikrobiologie přispěla medicíně rozhodující měrou k jejím největším úspěchům v diagnostice, prevenci a léčbě nemocí. Při zlepšené výživě a podmínkách bydlení, jichž dosáhla v 19. století rozvinutá společnost, vnesla převratné zlepšení zdraví a pocitu jistoty, neboť zdvojnásobila délku života, a zatímco dříve přežila jen malá část narozených, nyní umožňuje většině narozených dětí vyrůst bez strachu o zdraví a život. Ve vyspělých zemích dramaticky poklesla úmrtnost na infekční choroby. Pokles je třeba kromě terapeutických a preventivních možností medicíny přičíst zlepšení životních podmínek a výživy, jež přispěly k zvýšení obranyschopnosti pacientů do té míry, že nemocní se z infekčních onemocnění spontánně uzdravily. Zdolání epidemií a smrtelných infekčních onemocnění je tak výrazné, že za nejvýznamnější problémy lékařství se dnes považují kardiovaskulární choroby, duševní poruchy a degenerativní choroby. Odvrácení pozornosti od infekčních onemocnění je však ošidné a může být velmi nebezpečné. V celosvětovém měřítku nejsou infekce ještě zdaleka zlikvidovány. Asi 10 milionů lidí v zemích třetího světa, převážně dětí, umírá každý rok na infekční průjmová onemocnění, spalničky, malárii, tetanus, záškrt, černý kašel. Je však tragické, že společnost ve skutečnosti má prostředky k tomu, aby zabránila téměř všem těmto úmrtím. I v našich podmínkách jsou infekční onemocnění běžná. Prudký vzestup alimentárních nákaz je důsledkem intenzivního zemědělství a posunu ve způsobu stravování směrem k rychlému občerstvení připravovanému z polotovarů. Nové léčebné metody, jež snižují obranyschopnost imunitního systému a časté používání intravenózních katétrů a různých umělých náhrad poskytují příležitost mikrobům, jež jsou prakticky všudypřítomní. Mnoho pacientů se také nakazí při pobytu ve zdravotnickém zařízení. A k překvapení lékařů se objevují noví původci onemocnění (tab.1.). Díky mohutnému rozvoji cestovního ruchu přibývá importovaných nákaz. 2

3 Tab.1 Některá nově poznaná infekční agens Agens Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Cryptosporidium parvum Gardnerella vaginalis Helicobacter pylori viry hepatitid C, D, F, G lidský herpesvirus 6 HIV Legionella pneumophila parvovirus rotavirus Onemocnění lymeská nemoc gastroenteritida průjem bakteriální vaginóza gastritida hepatitida exanthema subitum AIDS legionelářská nemoc pátá nemoc průjmové onemocnění, zejm. dětí 1.3. Přehled mikrobiálních agens Bakterie jsou jednobuněčné organismy velké kolem 1 µm, s jednoduchou stavbou (nemají např. pravé jádro) a označujeme je jako buňky prokaryotní. Věda o bakteriích se nazývá bakteriologie. Nejjednoduššími živými útvary jsou viry. Nemají buněčnou stavbu ani vlastní metabolismus, měří kolem 20 až 200 nm, nedají se pěstovat na neživých objektech a odolávají účinku antibiotik. Nauka o nich se nazývá virologie. Ta se zabývá i tzv. priony (proteinové infekční částice), původci některých onemocnění CNS. Parazitologie jako další podobor mikrobiologie se zabývá studiem jak jednobuněčných příslušníků živočišné říše (prvoci, protozoa), tak vícebuněčných (členovců, červů). Mykologie je nauka o mikroskopických houbách (kvasinky, plísně) Dějiny mikrobiologie Mikroorganismy spatřil jako první na světě kolem roku 1675 Holanďan Antony van Leeuwenhoek ( ), nizozemský obchodník se suknem, později městský úředník, jehož koníčkem bylo broušení čoček. Ze zvětšovacích skel sestrojil jednoduchý mikroskop, jež zvětšoval asi dvěstěkrát a rozlišoval objekty menší než jeden mikron. Výsledky svých pozorování zasílal londýnské učené společnosti Royal Society. V materiálu, jako jsou voda, bláto, sliny a střevní obsah zdravých jedinců, nalezl četné mikroorganismy, a protože se pohybovaly, považoval je za živé ( animacula ). Všiml si také, že velké množství mikroorganismů lze spatřit ve vodních nálevech rostlinné a živočišné hmoty, které byly při pokojové teplotě odstaveny po dobu jednoho nebo dvou týdnů. Domníval se, že tyto mohutné populace pocházely z několika zárodků původně přítomných v oněch nálevech nebo že se tam dostaly ze vzduchu. Jiní měli za to, že organismy, které pozoroval, vznikly samoplozením, tj. spontánní přeměnou organické hmoty v mikroorganismy, a tato domněnka opanovala spory dalších 200 let. Teorie samoplození byla s konečnou platností vyvrácena v letech Louisem Pasteurem ( ), který dokázal, že mikroby se dostávají na místo z okolního prostředí. R formuloval teorii, že kvašení je způsobeno mikroby a předpokládal, že 3

4 obdobným způsobem by mikroby mohly vyvolávat i choroby. Navrhl ke konzervaci potravin pasterizaci jejich krátkodobé zahřátí na st. C, objevil očkování proti vzteklině, sněti slezinné (anthraxu) a choleře drůbeže. Objevil mikroby vytvářející spory a mikroby schopné žít za nepřístupu vzduchu. Mechanismus množení bakterií nepohlavním příčným dělením objevil De Daussure (1760) a nutnost vysoké teploty pro sterilizaci Ferdinand Cohn, který v roce 1877 zjistil, že některé bakterie tvoří termorezistentní spóry. Teorie, že nemoc je způsobena zárodky, získávala uznání pomalu, ačkoli již dávno bylo zjištěno, že epidemická onemocnění, jako neštovice, spalničky skvrnitý tyfus nebo syfilis, se přenášejí z člověka na člověka. Italský renesanční učenec Girolamo Fracastro popsal již v roce 1546 tři způsoby přenosu: přímým kontaktem s tělem nemocného, kontaktem s kontaminovanými předměty a přenosem na dálku vzduchem. Fracastrovy názory byly téměř zapomenuty v době, kdy van Leeuwenhoek objevil mikroorganismy. Zárodková teorie však nebyla plně uznávána až do roku 1876, kdy pruský venkovský lékař Robert Koch ( ) podal zprávu o svých pozorováních ohledně anthraxu, Prokázal, že jen bakterie jsou příčinou onemocnění. Za své zásluhy dostal Koch místo vědeckého pracovníka v Berlíně, kde vybudoval úspěšnou bakteriologickou školu. On sám objevil původce tuberkulózy a cholery, zasloužil se o vypracování nových přesných bakteriologických postupů, zavedl sterilizaci laboratorních nástrojů horkým vzduchem při teplotě 135 st.c. Za výzkumy a objevy v oboru tuberkulózy obdržel Nobelovu cenu. Krátce po tom, co bylo definitivně prokázáno patogenní působení bakterií, byly popsány patogenní prvoci a houby, např. původce malárie (1880). Viry bylo velmi obtížné nalézt a popsat, protože většinu z nich nelze pozorovat ve světelném mikroskopu a nelze je pomnožovat v neživé kultivační půdě. Proto se také Pasteurovi a jeho spolupracovníkům nepodařilo izolovat původce vztekliny u nemocných psů nebo vlků. Ve svých pokusech s virovou mozaikovou nemocí tabáku Ivanowski přenesl nemoc na zdravé rostliny naočkováním šťávy z infikovaných rostlin, již předtím filtroval filtrem z jemného porcelánu, který zadržoval bakterie. Vzápětí byly prokázány filtrovatelné viry jako původci celé řady onemocnění (slintavky a kulhavky dobytka, žluté zimnice aj.). Virologie se vyvíjela pomalu až do doby po 2. světové válce, kdy byl objeven elektronový mikroskop a zavedeno pěstování virů na buněčných kulturách. Z vědců českého původu se do historie mikrobiologie zapsal zejména Stanislav Prowazek, objevitel původce skvrnitého tyfu Rickettsia prowazeki, dále George Novy, po němž je pojmenováno Clostridium Novyi, původce onemocnění měkkých tkání a Dušan Lambl, po němž se u nás vžilo pojmenování Lamblia intestinalis pro prvoka Giardia intestinalis, původce průjmového onemocnění. 4

5 2. Základní vlastnosti bakterií 2.1. Velikost, tvar a uspořádání bakterií Velikost bakterií bývá 0,2-60 µm. Většina bakterií patogenních pro člověka měří kolem 1 až 3 µm. Tvar bakterií je buď kulovitý nebo protáhlý. Kulovité bakterie se nazývají koky, protáhlým formám se říká tyčinky. Krátké tyčinky se nazývají jako kokobacily, kokotyčky, velmi protáhlé tyčinky se nazývají vlákna. Prohnuté tyčinky se jmenují vibria, spirálové spirochety. Jak koky tak tyčinky nemusí být pravidelné: koky mohou být oploštělé či naopak zašpičatělé, některé tyčinky mohou mít tvar vřetenovitý, jiné kyjovitý. Některé tyčinky či spíše vlákna se mohou větvit. Když se bakterie dělí, mohou zůstat jedna ke druhé přichyceny. Uspořádání, které tak vznikne, závisí na rovině buněčného dělení (dvojice, čtveřice, řetízky, hloučky u koků, řetízky, palisády u tyčinek). Tvar a uspořádání bakterií viz obr.1-3. Obr. 1: Tvar a uspořádání koků a) koky ve shlucích (Staphylococcus aureus) b) koky v řetízcích (Streptococcus pyogenes) c) lancetovité koky ve dvojicích (Streptococus pneumoniae) d) oploštělé koky ve dvojicích (Neisseria gonorrhoeae) e) koky ve čtveřicích (Micrococcus luteus) 5

6 Obr. 2: Tvar a uspořádání rovných tyčinek a) nejběžnější vzhled (Escherichia coli) b) jemné streptobacily (Haemophilus ducreyi) c) silné kokobacily (Moraxella lacunata) d) robustní tyčinky se zaoblenými konci (Clostridium perfringens) e) silné tyčinky s ostrými rohy (Bacillus anthracis) f) kyjovité, palisádovitě uspořádané (Corynebacterium diphtheriae) g) štíhlé, palisádovitě uspořádané (Mycobacterium tuberculosis) h) větvené tyčinky s náznaky fragmentace (Nocardia asteroides) i) vřetenovité tyčinky (Fusobacterium fusiforme) j) drobné tyčinky (Haemophilus influenzae) Obr. 3: Tvar a upořádání prohnutých a spirálovitých tyčinek a) rohlíčkové tyčinky (Vibrio cholerae) b) hrubé spirály (Spirilum minus) c) nepravidelné spirály (Borrelia recurrentis) d) jemné pravidelné spirály (Treponema pallidum) e) velmi jemné spirály se zahnutými konci (Leptospira icterohaemorrhagiae) 6

7 2.2. Barvitelnost dle Grama Robert Koch zavedl k pozorování bakterií fixované preparáty obarvené anilinovými barvivy. Dánský lékař Hans Christian Joachim Gram ( ) objevil, že bakterie se dají rozdělit do dvou skupin na základě schopnosti či neschopnosti obarvených buněk podržet si barvivo v přítomnosti alkoholu nebo acetonu. Postup barvení: 0. fixace preparátu methanolem nebo nad plamenem 1. krystalická violeť - 20 sekund, obarví bakterie tmavomodře až modrorofialově 2. Lugolův roztok - 20 sekund, v obarvených buňkách vznikne komplex barviva s jodem 3. aceton - krátce, některé bakterie si komplex krystalické violeti s jodem podrží (tvz. grampozitivní), jiné se rychle odbarví (gramnegativní) 4. zředěný karbolfuchsin - 20 sekund, dobarví gramnegativní bakterie, ty jsou pak červené Podstata Gramova barvení souvisí se složením bakteriální buněčné stěny (obsah lipidů, peptidoglykan). Gramovo barvení je důležité pro klasifikaci bakterií. Jeho pomocí se odliší navzájem velké skupiny bakterií, jako grampozitivní koky, gramnegativní koky, grampozitivní tyčinky a gramnegativní tyčinky. Barvením dle Grama často zahajujeme identifikaci neznámého kmene izolovaného od pacienta. Výsledek barvení klinického vzorku, např. mozkomíšního moku, přináší cennou a rychlou informaci pro ošetřujícího lékaře. Na jeho základě může zvolit vhodné antibiotikum pro léčbu dříve, než mikrobiolog příslušné agens vypěstuje, určí a zjistí jeho citlivost na antibiotika. Existují bakterie v podstatě grampozitivní, jejichž stěna obsahuje takové množství látek voskovitého charakteru, že barviva nepřijímají a běžným postupem se obarvit nedají. Přinutíme-li je přijmout barvivo barvením za horka, pak zase vzdorují odbarvování kyselinami, louhy a alkoholy. Říkáme jim acidorezistentní a jejich zástupcem je např. Mycobacterium tuberculosis, původce tuberkolosy. Příklady barvitelnosti dle Grama viz tab.2. Tab. 2: Příklady barvitelnosti dle Grama grampozitivní gramnegativní Acidorezistentní Staphylococcus Escherichia, Salmonella, Mycobacterium Streptococcus Proteus, Vibrio, Bacillus Haemophilus, Pseudomonas, částečná acidorezistence Laktobacillus Bordetella, Francisella, Nocardia Clostridium Neisseria, Bacteroides Listeria bakteriální spory Corynebacterium špatně se barvící spory kvasinek a plísní Actinomyces Borrelia, Treponema, kvasinky, plísně Leptospira, Mycoplasma, Rickettsia, Chlamydia 7

8 2.3. Stavba bakteriální buňky Cytoplasma bakteriální buňky je obklopena cytoplasmatickou membránou. Na ni obvykle nasedá pevná bakteriální stěna. Na jejím povrchu může být bakteriální pouzdro nebo vrstva slizu, tzv. glykokalix. Z povrchu některých bakterií vystupují bičíky, případně výběžky zvané pili neboli fimbrie. V cytoplasmě se nalézají nuleoid, ribosomy, vakuoly, inkluze, granula, plazmidy, u některých bakterií spory Cytoplasmatická membrána Cytoplasmatická memebrána se skládá z dvojité vrstvy fosfolipidů, v níž jsou vnořeny různé bílkoviny. Ty se uplatňují zejména v transportu živin do buňky, v respiračních pochodech, v sekreci látek z cytoplasmy do zevního prostředí (bakteriální toxiny aj.) Buněčná stěna Buněčná stěna je silná a tuhá vrstva chránící celý obsah bakteriální buňky. Udržuje základní tvar buňky. Struktura stěny se liší u bakterií grampozitivních a gramnegativních. Buněčná stěna grampozitivních bakterií je jednodušší, silnější. Buněčná stěna gramnegativních bakterií je sice tenčí, ale stavěna daleko složitěji. Brání prostupu řady molekul, které jinak snadno proniknou stěnou bakterií grampozitivních, např. některých barviv (krystalická violeť), antibiotik, či solí žlučových kyselin (to usnadňuje přežívání gramnegativních bakterií v zažívacím traktu). Struktury stěny tvoří tělové O-antigeny a endotoxin. Prostor mezi stěnou a cytoplasmatickou membránou může obsahovat enzymy schopné inaktivovat antibiotika (např. tzv. betalaktamázy). Bakterie, které vlivem různých agens rozrušujících buněčnou stěnu, stěnu ztratily, se nazývají L-formy bakterií (podle Listerova ústavu v Londýně). V této formě mohou vliv těchto nepříznivých činitelů přežít Extracelulární polymery Na povrchu buněčné stěny některých bakterií se mohou nacházet polymery vytvářející buď pouzdra (polysacharidová pouzdra pneumokoků, klebsiel, polypeptidové pouzdro anthraxového bacila) ) nebo slizovou vrstvu (polysacharidový sliz u některých koagulasanegativních stafylokoků). Opouzdřené kmeny mikrobů obvykle lépe odolávají obranným pochodům organismu, např. fagocytóze. Adherují na různé povrchy, na nichž vytvářejí vrstvu zvanou biofilm. Biofilmy nalézáme např. na zubní sklovině či na povrchu intravenózního katetru Bičíky Bakteriální bičíky jsou zvlněné vláknité útvary sloužící pohybu. Nalézáme je jen u některých bakterií. Bakterie může mít jeden či více bičíků. Jsou složeny z bílkovin a tvoří bičíkový H-antigen. 8

9 Pili (Fimbrie) Fimbrie jsou tenké štětinovité výběžky na povrchu gramnegativních bakterií. Pravděpodobně usnadňují přilnutí (adhesi) bakterií na povrch epitelu v respiračním, střevním či urogenitálním traktu. Tzv. sex pili slouží k přenosu DNA z buňky donorové (samčí) do buňky recipientní (samičí). Sex pili jsou také oblíbeným místem přichycení některých bakteriofágů Cytoplasma a struktury v ní uložené Cytoplasma je vodný roztok ohraničený cytoplasmatickou membránou. Jako ostatní prokaryota nemají bakterie pravé jádro obklopené jadernou membránou, ale pouze místa, v nichž je uložen bakteriální chromozom.. Nazývají se nukleoidy a obsahují molekulu bakteriální DNA. Bakteriální ribosomy jsou menší a jinak stavěné než ribosomy eukarytních buněk. Proto některá antibiotika mohou inhibovat proteosyntézu na bakteriálních ribosomech aniž ovlivní funkci ribosomů v buňkách hostitelského makroorganismu. Inkluze jsou polymerizované zásobní látky, jejichž množství je závislé na kultivačních podmínkách. Plazmidy jsou malé cirkulární molekuly DNA, existující nezávisle na bakteriálním chromozomu. Dovedou se samostaně replikovat. Nesou poměrně málo genů, které nejsou pro bakterie nezbytné. Nesou např. geny pro tvorbu sex-pilů nebo geny pro syntézu enzymů schopných rozkládat nebo modifikovat antibiotika. Mohou se snadno přenášet z jedné bakterie na druhou a způsobit rozšíření rezistence na různá antibiotika Bakteriální spory Některé rody grampozitivních půdních bakterií reagují na určité změny v prostředí (např. na úbytek živin a vody) tvorbou tzv. spor. V lékařské mikrobiologii se jedná o rody Bacilllus a Clostridium.Jsou to vysoce odolné útvary, v jejichž podobě jsou bakterie schopny odolávat rozmanitým vlivům prostředí a po léta přežívat nepříznivé podmínky. Např. vysoce termorezistentní spory Clostridium botulinum přežijí až pětihodinový var. Zničí je jen autoklávování (působení vodní páry za zvýšeného tlaku). Stejně jako k teplu jsou spory odolné k UV záření, vysychání a celé řadě dezinfekčních prostředků. Dostane-li se spora do příznivých podmínek, vyklíčí. Začne přijímat vodu, rozkládat stabilizující bílkoviny a syntetizovat nové proteiny. Pukají sporové obaly a vzniká nová vegetativní buňka Metabolismus bakterií Metabolismus je soubor biochemických reakcí syntetických (anabolismus) a degradačních (katabolismus). Bakteriální metabolismus se odlišuje od metabolismu živočišných a rostlinných buněk svou vysokou intenzitou a odlišným průběhem některých reakcí. Pro metabolické potřeby získávají bakterie živiny z prostředí. Podle jejich nároků na živiny dělíme bakterie na autotrofní, kterým stačí jen anorganické látky, CO 2 a světlo a na heterotrofní, které potřebují kromě anorganických i organické látky (všechny lékařsky významné bakterie). 9

10 Pro růst heterotrofních bakterií je nutný zdroj dusíku (aminokyseliny), zdroj uhlíku (cukry, aminokyseliny), soli natria, kalia, fosforu, síry, vápníku, magnesia a některých dalších prvků. V lékařské mikrobiologii dodáváme při kultivaci tyto živiny ve formě komplexních médií, obsahujících masový výtažek, peptidy a krev. Růstové faktory jsou organické sloučeniny, které si nedovedou bakterie samy syntetizovat a musíme je proto dodávat hotové. Jsou to např. vitaminy B 2, B 6, A, C, koenzymy, aminokyseliny, složky NK, séra, krve apod. Hlavním zdrojem energie jsou cukry. Také aminokyseliny jsou nejprve upraveny a dále se zpracovávají jako cukry. Schopnosti fermentovat různé cukry se užívá při diagnostice některých bakterií (tzv. enterobakterií). Podle vztahu ke kyslíku dělíme bakterie na aerobní, které rostou jen za přítomnosti kyslíku, anaerobní, které v přítomnosti kyslíku nerostou, kyslík je pro ně toxický, fakultativně anaerobní, které rostou za aerobních i anaerobních podmínek, mikroaerofilní, které k růstu vyžadují kyslík v nižší koncentraci než je atmosférická (2%) a kapnofilní, které se pěstují za zvýšené tenze CO 2. Rozdělení mikrobů podle nároků na složení atmosféry viz. tab.3. Tab. 3: Rozdělení mikrobů podle nároků na složení atmosféry aerobní anaerobní fakultativně anaerobní mikroaerofilní kapnofilní Vibrio, Neisseria, Bordetella, Mycobacterium Clostridium difficille, Bacteroides fragillis, Treponema pallidum většina lékařsky významných bakterií Campylobacter gonokoky, meningokoky Význam metabolismu je značný. Je využíván ve výrobě vitaminů, léčiv, antibiotik, v kvasném a mléčném průmyslu. Znalosti metabolismu jsou potřebné při přípravě diagnostických půd, při identifikaci bakterií a ve výzkumu nových antibakteriálních přípravků. Metabolity bakterií jsou často faktory patogenity (toxiny) Růst a množení bakterií Bakterie se množí příčným dělením ve dvě dceřinné buňky. Doba potřebná k rozdělení (generační doba) je v průměru kolem 30 minut, nápadně delší je např. u mykobakterií, kde činí i více než deset hodin. Bakterie potřebují ke svému množení dostatek vhodných živin, případně růstových faktorů, vhodné koncentrace plynů v atmosféře, vhodnou teplotu (optimální teplota pro většinu patogenních bakterií je kolem 37 0 C), vhodné ph, osmotický tlak. Za ideálních podmínek probíhá dělení bakterií geometrickou řadou. Během každé generační doby se počet buněk zdvojnásobí. Ve skutečnosti netrvá ale tato situace nekonečně dlouho. Bakteriální buňky postupně vyčerpají živiny nebo jsou inhibovány zplodinami svého metabolismu. (Růstová křivka bakteriální populace viz obr.4). 10

11 Obr. 4: Růstová křivka bakteriální populace Bakterie mohou růst buď v podobě izolovaných buněk nebo v podobě biofilmu. V běžném životě jsme se sním již všichni setkali: jedná se o ony slizké povlaky vytvářející se na povrchu předmětů ve vlhkém prostředí. Biofilmy jsou strukturovaná mikrobiální společenství, uložená v mezibuněčné hmotě a adherující k povrchům. V podobě biofilmu jsou bakterie více chráněny před nepříznivými podmínkami prostředí. V makroorganismu (např. lidském těle) pak úspěšně vzdorují účinku fagocytů, protilátek a antibiotik. Biofilmy působí jako ložiska, z nichž se chorobný proces stále obnovuje a která ani obrana těla ani terapeutické zásahy nejsou schopny eliminovat. Příklady onemocnění, v jejichž patogenezi se uplatňuje tvorba biofilmu, jsou zubní kaz, zánět středního ucha, osteomylitida, zánět žlučových cest, subakutní bakteriální endokarditida nebo zánět plic při cystické fibróze. Velmi snadno se biofilmy vytvářejí na površích různých pomůcek a náhrad zaváděných do organismu (intravenózní katetry, umělé srdeční chlopně, kloubní náhrady, chirurgické stehy, cévní štěpy, nitroděložní tělíska, močové katetry, kontaktní čočky) Pěstování bakterií Kultivace je nejdůležitější diagnostickou metodou přímého průkazu většiny bakterií. Na kultivačních půdách rostou obvykle také kvasinky a plísně, kultivovat lze též některé parazity. Viry nelze kultivovat na umělých půdách vůbec, množí se jen na zvířatech, na kuřecích zárodcích, na tkáňových nebo orgánových kulturách Podmínky kultivace Bakterie mají značně různorodý metabolismus, a proto také rozdílné nároky na kultivaci. Při volbě půdy a podmínek kultivace se snažíme simulovat podmínky, které mají bakterie v lidském nebo zvířecím organismu. 11

12 Při kultivaci musí být splněny následující podmínky: 1. Dostatek vhodných živin. Živiny jsou obsaženy v kultivačních půdách. 2. Vlhkost půd. 3. Optimální ph půdy.většina bakterií vyžaduje pro růst ph blízké neutrálnímu. 4. Izotonie média. Většině bakterií vyhovuje 0,5-1% NaCl. 5. Vhodná kultivační teplota. Optimální kultivační teplota pro lidské patogenní bakterie je 37 0 C. Některé bakterie však lépe rostou při nižších (kvasinky, plísně, yersinie, listerie) nebo vyšších teplotách (Campylobacter jejuni). 6. Optimální délka kultivace. Většina bakterií roste na pevných půdách za hodin. Delší kultivaci (48 hodin)vyžadují např. kvasinky, kampylobactery, gardnerely. Několikadenní kultivaci vyžadují anaerobní bakterie, několikatýdenní kultivace je nutná u Mycobacterium tuberculosis. 7. Vhodná atmosféra pro kultivaci.viz vztah mikrobů ke kyslíku Druhy kultivačních půd Bakterie se pěstují na tak zvaných kultivačních půdách neboli kultivačních médiích. Podle konzistence rozeznáváme půdy tekuté a pevné. Tekuté půdy slouží především pro pomnožení bakterií, což se obvykle projeví zákalem půdy, nedovolují však získat čistou kulturu nutnou pro bližší určení mikroba. Příkladem tekutých půd jsou nejrozmanitější druhy bujonů, cukrové půdy založené na peptonové vodě, Šulova půda k pěstování mykobakterií aj. Pevné půdy se užívají při diagnostice častěji. Růst bakterií se projeví tvorbou kolonií, podle kterých můžeme alespoň orientačně určit rod bakterií, můžeme zjistit, zda se jedná o jeden nebo více druhů bakterií a můžeme získat jejich čistou kulturu, nezbytnou pro další podrobné určení. Tuhé půdy se připravují z půd tekutých přidáním agaru. Agar je mořská řasa složená z polysacharidů. Přesterilizované agarové půdy se vylévají do Petriho misek nebo do zkumavek. Výhodou pevných půd je možnost pěstovat na nich mikroby v podobě izolovaných kolonií. Bakteriální kolonií rozumíme společenství buněk vzniklé z původně třebas i jediné životaschopné buňky. Počet jejích potomků v kolonii může být až stovky miliard, toto množství vytváří na povrchu pevné kultivační půdy viditelný útvar, kolonii. Velikost a vzhled kolonií jsou poměrně charakteristické pro určité mikroby a mohou tak sloužit k jejich předběžné diagnostice. Bakteriolog hodnotí na bakteriální kolonii následující znaky: velikost, tvar, profil, okraje, povrch, transparence, barva, změny v okolí kolonie, konzistenci, zápach. Podle složení a účelu, k němuž je používáme, lze kultivační půdy dělit na: základní, obohacené, selektivní, diagnostické, selektivně diagnostické, půdy pomnožovací, půdy k anaerobní kultivaci, půdy k antibiotickým zkouškám, půdy k uchování kultur a půdy transportní. 1. Půdy základní Základní půdou, ze které se připravuje většina ostatních půd, je masopeptonový bujon, který je složen z masového extraktu, směsi peptidů (peptonu) a z malého množství NaCl. Přidáním 1-2% agaru vznikne z bujonu masopeptonový (živný) agar. 12

13 2. Půdy obohacené Některé náročnější bakterie rostou na základních půdách špatně, jiné vůbec. K jejich kultivaci slouží půdy obohacené. Příslušné základy půd se obohacují bílkovinnými koncentráty a hydrolyzáty, vitaminy, bovinním nebo koňským sérem. Nejběžnějším obohacovadlem je krev. 3. Půdy diagnostické Vzniknou z půd základních přidáním složek, které různě reagují na způsob metabolismu bakterií. Výsledkem je pak odlišný růst jednotlivých rodů nebo druhů bakterií. Diagnostická půda obsahuje substrát, na nějž se nechá bakterie působit event. i indikátor, který ozřejmí změny substrátu. Většinou sledujeme, zda mikrob dovede některé substráty štěpit (sacharidy, aminokyseliny), event. zda je schopen z nich vytvářet jiné látky (sirovodík, indol), zda je schopen substrát využít k růstu (citrát sodný, sacharidy, růstové faktory. K identifikaci mikroba lze využít i jeho schopnosti růst za přítomnosti určité látky, průkaz fyziologických vlastností (pohyblivost) a průkaz určitých enzymů. 4. Půdy selektivní Termínem selektivní se označují půdy, na nichž vyrůstají jen některé mikroby a růst nežádoucích mikrobů je na nich potlačen. Z mikrobiálních směsí tedy na těchto půdách narostou jenom mikroby, o jejichž vypěstování máme zájem. Selektivní půdy se skládají ze živného základu a z inhibitoru růstu nežádoucích mikrobů (soli, antibiotika, žluč, barviva aj.). 5. Půdy selektivně diagnostické Půdy selektivně diagnostické kombinují principy půd selektivních a diagnostických. Kromě živného agarového základu tedy obsahují inhibitor růstu nežádoucích mikrobů, vhodný substrát a také indikátor jeho změn. Očkují se na ně vzorky, v nichž předpokládáme přítomnost hledaného patogena ve směsi s velkým množstvím průvodní mikroflóry (vzorky stolice, potravin, pitevního a klinického materiálu). 6. Půdy pomnožovací Půdy pomnožovací jsou většinou tekuté, slouží k pomnožení bakteriálních patogenů tam, kde jsou přítomny v malém množství. 7. Půdy k anaerobní kultivaci Půdy k pěstování anaerobů se vyznačují nízkým oxidoredukčním potenciálem. To se dociluje mimo jiné jejich obohacením o redukující látky, jako jsou glukóza, cystein, thiosloučeniny, L-cystein a podobně. 8. Půdy k antibiotickým zkouškám Ke zjišťování citlivosti mikrobů na antibiotika slouží MH-agar (Mueller-Hintonové) nebo MH-bujon. 9. Půdy k uchování kultur Neměly by obsahovat sacharidy, aby z nich vznikající organické kyseliny kulturu nezahubily. 13

14 10. Půdy transportní Úkolem transportních půd je udržet mikroby během přepravy do laboratoře životaschopné a uchovat je ve stejném počtu, v jakém se vyskytovaly v místě odběru. Transportní půdy musí být dostatečně vlhké, místo živin obsahují látky, které omezují metabolismus a látky absorbující toxické produkty metabolismu (např. aktivní uhlí). Dnes se nejčastěji užívá Amiesova půda nebo půda Stuartova. Příklady kultivačních půd viz. tab. 4. Tab. 4: Příklady kultivačních půd základní masopeptonový bujon, živný agar, peptonová voda obohacené - krví: krevní agar, čokoládový agar (gonokoky, meningokoky, hemofily), Levinthalova (hemofily), Bordet- Gengouova (bordetely) - sérem: Löfflerova (záškrt), Šulova (mykobakteria) - vaječné: Löwenstein-Jensenova (mykobakteria), McCoyova (franciselly) - glukosou: Sabouraudova (kvasinky, plísně) - sacharosou: bujon pro hemokultivaci diagnostické - štěpení substrátu (amiokyselin, urey, nitrátů) - tvorba typických látek (sirovodík, indol) - růst v přítomnosti substrátu - fyziologické vlastnosti (pohyb) - průkaz enzymů (oxidasa, katalasa) selektivní - krevní agar s 10% NaCl (stafylokoky) - selenitový bujon (salmonelly) - alkalická peptonová voda (Vibrio cholerae) - půda pro kampylobaktery selektivně diagnostické - pro G-: Endova (univerzální), desoxycholát DC (salmonelly, shigelly), CIN (yersinie), TCŽS (vibria) - pro G+: Clauberg (corynebakteria), Slanetz-Bartley (enterokoky) pomnožovací játrový bujon (většina bakterií), VL bujon (pro anaeroby), selenitový bujon (salmonelly, shigelly) k anaerobní kultivaci VL bujon, krevní agar CDC k antibiotickým zkouškám Mueller-Hintonové agar a bujón k uchovávání kultur Dorsetova transportní Amies (univerzální), Stuartova (gonokoky) 14

15 3. Patogenita mikroorganismů 3.1. Dělení mikroorganismů podle působení na lidský organismus Jen malá část všech mikroorganismů, které se nacházejí v živé přírodě, má schopnost vyvolat onemocnění (je patogenní). Většina mikroorganismů žije ve vodě, v půdě a podobných prostředích a k tomu, aby mohla proniknout do organismu, není vybavena. Na základě schopností mikrobů vyvolat onemocnění je dělíme na: 1. nepatogenní: makroorganismu (člověku, zvířeti) neškodí, tj. nemají schopnost vyvolat onemocnění, mohou osidlovat povrchy lidského těla (tzv. komenzálové) 2. patogenní: hostitele poškozují přímo svojí přítomností nebo produkcí toxických látek mají tedy schopnost vyvolat onemocnění 3. podmíněně patogenní: hostiteli škodí pouze za určitých okolností: a) při narušení obranyschopnosti hostitele - jiným onemocněním (cukrovka, nádorová onemocnění) - podáváním léků (antibiotika, cytostatika, imunosupresiva) - těžkými operacemi, transplantacemi b) při zanesení mikrobů z pro ně charakteristické lokality ( např. z kůže, ze střeva) do lokality jiné: (při operaci, zaváděním umělohmotných katetrů, kloubních náhrad, náhrad srdečních chlopní aj.) 3.2. Nepatogenní mikroorganismy. Normální mikroflóra člověka. Každý jedinec je po narození postupně osídlen nepatogenními mikroby ze zevního prostředí. Mikrobiální kolonizace novorozence začíná již průchodem porodními cestami, kde je exponován vaginální mikrobiální flóře matky. Po porodu se setkává s bakteriemi z prostředí a těmi, které kolonizují nemocniční personál a ostatní jedince. Během krátké doby si dítě vytváří vlastní normální mikrobiální flóru. Naše kůže a sliznice jsou trvale či dočasně kolonizovány určitými mikrobiálními druhy, jejichž výběr je pro danou lokalitu charakteristický. Zde se tyto druhy vůči hostiteli jako patogeny nechovají. V jiných lokalitách se mohou uplatnit jako podmíněné patogeny (např. bakterie zanesené z okolí řitního otvoru při zavádění močového katetru do močového měchýře mohou způsobit zánět močových cest; některé bakterie kolonizující horní cesty dýchací zanesené při intubaci do distálnějších partií dýchacího traktu mohou způsobit pneumonii; bakterie z dutiny ústní, které se dostaly do krevního oběhu po extrakci zubu, mohou na změněných srdečních chlopních vyvolat endokarditidu apod.). Za normální mikroflóru se považují některé bakterie, event. kvasinky a prvoci, zatím ne viry (pro jejich intracelulární parazitismus) Význam normální mikroflóry Existence mikroorganismů, které jsou trvale přítomné na tělesném povrchu, závisí na fyziologických faktorech, teplotě, vlhkosti, nutričních a inhibičních látkách. Změny ve složení normální mikroflóry lze pozorovat v závislosti na životním stylu člověka, prostředí, ve kterém žije, na věku. Její přítomnost není nutná pro život. Na některých místech je bakteriální flóra nutná a potřebná pro udržení zdraví a normální funkci. Například některé bakterie v tlustém střevě syntetizují vitamíny B a K, jiné se zde podílejí na dokončení štěpení potravy. 15

16 Vymýcení normální střevní mikroflóry, např. při léčbě širokospektrými antibiotiky může vést k přemnožení kvasinek, k poruše štěpení a vstřebávání potravy a z toho vyplývajícím průjmům a jiným zažívacím potížím. Bakterie přítomné na kožních a slizničních površích pouhou svojí přítomností nebo svými metabolickými produkty brání růstu jiných, patogenních druhů (př. Lactobacillus vaginalis v pochvě dospělé ženy). Na druhé straně i příslušníci normální mikroflóry mohou za jistých okolností vyvolat onemocnění. Třeba jsou-li zaneseny do krevního oběhu nebo do tkání a jsou-li přítomny predispoziční faktory, mohou se stát patogenními. Například viridující streptokoky jsou normální součástí mikroflóry horních cest dýchacích. Jestliže se ve velkém množství (např. po extrakci zubu) dostanou do krevního oběhu a nasednou na změněné srdeční chlopně, mohou vyvolat endokarditidu. Onemocnění vyvolané normální mikroflórou nazýváme oportunní infekce Příklady osídlení Kůže největší osídlení je v místech s větší vlhkostí (podpaždí, třísla, perineum), v místech přechodu kůže ve sliznici (kolem tělních otvorů). Zde se ke kožní mikroflóře přidružuje i mikroflóra přilehlých sliznic. Dýchací cesty: bohatě jsou kolonizovány horní cesty dýchací (nos, nosohltan), plíce jsou sterilní. Trávicí trakt: silná je kolonizace dutiny ústní, tlustého střeva. Urogenitální trakt: masivní je kolonizace zevního genitálu, sliznice přední části močové trubice, pochvy. Krev a vnitřní tkáně jsou za normálních podmínek sterilní. Tab. 5: Příklady osídlení normální mikroflórou: Kůže Staphylococcus epidermidis, kožní korynebakteria, kožní saprofytická mykobakteria, kvasinky Spojivky Staphylococcus epidermidids Nos stafylokoky, nepatogenní korynabakteria, pneumokoky, hemofily, neisserie, viridující streptokoky Tonsily, pharynx podobné osídlení jako v nose, časté nosičství patogenních mikrobů (Streptococcus pyogenes, Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis) Dutina ústní viridující streptokoky, nepatogenní neisserie, korynebakteria, hemofily, některé enterobakterie (E.coli, klebsiely), anaeroby (anaerob. streptokoky, Veillonella, fusobakterie, nepatogenní treponemy) Tenké střevo v distální části laktobacily, ústní streptokoky, kvasinky Tlusté střevo z 95% anaeroby (Bacteroides, Bifidobacterium, klostridia,), E. coli aj. enterobakterie (Enterobacter, Klebsiella), enterokoky, kvasinky, nepatogenní prvoci 16

17 Močové cesty Zevní genitál Vagina přední část močové trubice (Staphylococcus epidermidis, kožní korynebakteria, nehemolytické streptokoky jako kůže Od puberty laktobacily, malé množství koryneformních tyček, anaerobů, kvasinek 3.3. Patogenní mikroorganismy. Faktory patogenity a virulence. Patogenitou nazýváme schopnost mikroorganismů poškodit makroorganismus (způsobit onemocnění). Je vázána na určitý druh. Mikroby mohou být patogenní pouze pro člověka (antropopatogenní), nebo pouze pro zvíře (zoopatogenní) či pro zvíře i člověka (antropozoopatogenní). Míra patogenity (tzv. virulence) je u jednotlivých mikrobiálních druhů různá. Je dána množstvím faktorů patogenity, které vytvářejí určitý mikrobiální kmen. Vysoce virulentní kmen snadno proniká do organismu a poškozuje jej i při velmi malé infekčnín dávce. Patogenita, resp. virulence, se dá dělit na tři základní složky: kontagiozitu, invazivitu a toxicitu Kontagiozita Kontagiozita neboli přenosnost je schopnost mikroba přenášet se mezi jednotlivými hostiteli. Úspěch přenosu mikroba na nového hostitele závisí na několika faktorech, a to na: a) počtu mikrobů vylučovaných z organismu b) jejich rezistenci vůči zevnímu prostředí c) počtu mikrobů nutných k infekci nového hostitele d) chování hostitele. ad a) Většinou se mikroby vylučují z postižených povrchů ( i vnitřních). Někteří mikrobi vyžadují, aby byli z těla vysáti členovci. Počet mikrobů, kteří opouštějí tělo, bývá značný. Např. při respiračních virózách obsahuje 1 ml sekretu miliardy virionů. Tyto vysoké počty jsou k účinnému přenosu nutné, protože naprostá většina vyloučených agens se neuplatní a zaniká. Doba, během níž dochází k vylučování původce infekce, se nazývá období nakažlivosti. ad b) Co se týče stability v zevním prostředí, pak mikroby, které odolávají vyschnutí a teplu, se mohou šířit lépe. Některé si vytvořili obzvlášť rezistentní formy spory bakterií nebo cysty některých prvoků. Choulostivé mikroorganismy se úspěšně přenášejí přímým kontaktem mezi hostiteli (např. pohlavně přenosná agens) nebo pomocí vektorů (hmyzích přenašečů) či kontaminovanou vodou. ad c) Velké rozdíly mezi mikroby jsou v jejich počtu, který je nutný k infekci nového hostitele (tzv. infekční dávka).velmi nízká je infekční dávka např. u shigell, gonokoků či u Mykobakterium tuberculosis desítky a stovky bakterií. Naproti tomu infekční dávka salmonell je mnohonásobně vyšší, zhruba

18 Velikost infekční dávky ovšem velmi závisí na stupni individuální vnímavosti hostitele. Jeli napadený jedinec vůči danému agens již specificky imunní, bude k úspěšné infekci nutný o několik řádů vyšší počet mikrobů, a stejně potom infekce proběhne bez příznaků. ad d) Je zajímavé, jak mikroby dovedou využít chování svého hostitele k usnadnění přenosu. Průjem, obranné reflexy kašel, kýchání mají za úkol odstranit škodlivinu z organismu. Zároveň však přispívají k účinnému šíření patogenů. Zneužití chování hostitele k co nejúčinnějšímu přenosu je někdy až překvapivé. Např. původce moru, Yersinia pestis, se přenáší štípnutím blechy. Yersinie dokáží zvýšit účinnost svého přenosu tím, že svým množením zablokují bleše trávicí trakt. Blecha začne být hladová, štípe o to častěji a zvyšuje tak šanci těchto mikrobů infikovat nového hostitele. Jiný způsob ovlivnění chování hostitele je patrný u Toxoplasma gondii. Potkan, jeden z mezihostitelů tohoto prvoka, ztrácí po infekci strach z koček, jež jsou konečným hostitelem toxoplasmat. Touto přesně zaměřenou změnou potkaního mozku si zvyšuje parazit šanci dokončit svůj životní cyklus Invazivita K složkám invazivity řadíme schopnost mikroba vstoupit do hostitele, což znamená schopnost přilnout (adherovat) na jeho povrchy, množit se na nich a pronikat (penetrovat) jimi do vnitřního prostředí, dále schopnost mikroba množit se ve vnitřním prostředí hostitele, schopnost šířit se uvnitř organismu hostitele a konečně schopnost překonávat jeho obranné mechanismy Adherence Aby se patogenní bakterie mohla uplatnit na povrchu některé z našich sliznic, musí být schopna pevně přilnout čili adherovat na povrch epitelií. Téměř u všech patogenů se vyvinul nějaký způsob adherence, buď pomocí speciálních struktur na povrchu bakterie nebo pomocí zvláštních bílkovin. Obojí se nazývají bakteriální adhesiny. První se označují jako pilli neboli fimbrie, druhé jako nefimbriální adhesiny. Důležitými faktory virulence jsou fimbrie pro některé kmeny Escherichia coli, pro Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, rody Bacteroides a Vibrio. Nefimbriální adhesiny jsou známy např. u yersinií, bordetell, mykoplasmat, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Treponema pallidum. Důležitým typem adherenčního mechanismu je tvorba bakteriálního povlaku neboli biofilmu. První vrstva bakterií se přichycuje přímo na povrch (a to i neživý, např. povrch zavedeného katétru), ostatní jsou uloženy v extracelulární polysacharidové hmotě. (I naše normální slizniční mikroflóra vegetuje ve formě biofilmu, který je vlastně součástí naší nespecifické odolnosti, neboť přes hustý neporušený povlak naší normální mikroflóry patogenní mikroby pronikají k epitelu jen obtížně. Jako virové adhesiny slouží některé proteiny virových obalů nebo povrchové proteiny kapsidy u neobalených virů. Střevní parazité jsou vybaveni strukturami, které jim napomáhají udržet se ve střevě (přísavný disk Giardia intestinalis, háčky Ancylostoma duodenale, přísavky, háčky tasemnic). Dermatofyta (kožní plísně) prorůstají stratum corneum pokožky. Na kůži se udrží tehdy, prorůstají-li keratinizovanou vrstvou rychleji, než se tato vrstva stačí odlučovat. 18

19 Průnik do vnitřního prostředí Některé patogeny účinkují přímo na povrchu našich sliznic, jiné jsou však invazivnější a jsou schopny pronikat do vnitřního prostředí. Většinou je způsob, jak mikrob pronikne našimi sliznicemi, zatím neznámý. Některé známé způsoby průniku mikroorganismů do vnitřního prostředí shrnuje tabulka 6. Tab. 6: Způsob průniku do vnitřního prostředí přímý Příklady: vzácně porušenou kůží leptospiry, larvy schistosom drobnými trhlinkami v pokožce zlaté stafylokoky, pyogenní streptokoky, původce anthraxu, tularemie, virus bradavic drobnými trhlinkami ve sliznici Treponema pallidum, HIV pokousáním virus vztekliny, Pasteurella multocida bodnutím členovce virus klíšť. encefalitidy, borrelie, plasmodia pomocí enzymů Clostridum perfringens, Streptococcus pyogenes vynucenou fagocytózou jinými buňkami shihelly, Yersinia enterocolitica, Listeria než fagocyty monocytogenes, salmonelly, z rozpadajících se buněk virové infekce Schopnost množit se ve tkáních hostitele Bakterie se v organismu mohou množit v krevní plazmě nebo tkáňové tekutině, anebo uvnitř napadené buňky. Druhá možnost je pro ni velmi výhodná, protože v buněčné cytoplasmě je dostatek nezbytných živin a růstových faktorů. V krevní plazmě vadí množení bakterií přítomnost přirozených antibakteriálních látek (komplement, lysozym, protilátky) a především nedostatek volného železa. Bakterie vyžadují železo k tvorbě různých enzymů, a proto jsou vybaveny schopností železo získat. Některé bakterie vyžadují speciální živiny, které jsou přítomné jen v určitých tkáních či orgánech. Například některé ústní streptokoky využívají sacharózu z potravy. Brucella abortus využívá sacharid erythritol z hovězích placent, a proto vyvolává potraty u hovězího dobytka, ne však u člověka. Viry se mohou ve vnitřním prostředí udržet jen tehdy, naleznou-li ve svém okolí vnímavé buňky. Aby byla buňka vnímavá, musí mít na svém povrchu receptor pro virus a musí v ní také proběhnout kompletní virový reprodukční cyklus. Některým mikroorganismům nesvědčí teplota 37 O C, proto se omezují na tělesný povrch (např. kožní plísně, Mycobacterium leprae) Schopnost šířit se organismem Některé mikroby se ve svém množení omezují jen na naše povrchy, vyvolávají pak infekce označované jako povrchové neboli lokální (např. rýma, kapavka, salmonelózy). Jiné mikroby pravidelně pronikají do vnitřního prostředí organismu šíří se jím. Jimi vyvolané infekce označujeme jako generalizované. Příkladem jsou virové exantematické infekce (spalničky, plané neštovice), tyfus nebo skvrnivka. Ale rovněž infekce původně lokální mohou 19

20 generalizovat. Příčinou může být zvýšená virulence mikroba nebo spíše nějakým způsobem podlomená rezistence makroorganismu. Doba mezi okamžikem nákazy a prvními klinickými příznaky se nazývá inkubační doba. U lokálních infekcí bývá kratší, několik málo dnů. U generalizovaných infekcí bývá delší než týden. Existuje několik způsobů, kterými se mikroby po proniknutí do organismu dovedou dále šířit. Nejdůležitější cesty jsou lymfou, krví, bezprostředně do okolí (per continuitatem) a podél nervů.jednotlivé cesty šíření a jejich příklady jsou uvedeny v tabulce 7. Tab.7: Šíření agens uvnitř organismu Způsob šíření Příklad Lymfou z kůže do regionálních podkožních uzlin pyogenní koky, franciselly, Yersinia pestis ze sliznice orofaryngu a tonzil do krčních respirační viry, EB-virus uzlin z plic do hilových uzlin Mycobacterium tuberculosis ze sliznice genitálu do tříselných uzlin Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis z Peyerových plaků do mezenteriálních uzlin Yersinia enterocolitica Krví agens generalizovaných infekcí břišní tyfus, exantematické virózy, syfilis při pneumoniích vzácněji při ohraničených infekcích meningitidy, pyelonefritidy, hnisání ran Per continuitatem z buňky do buňky viry sekretem po sliznicích patogeni dýchacího, trávicího a urogenitálního traktu z místa přisátí klíštěte do okolí Borrelia burgdorferi z místa poranění do okolní tkáně Clostridium perfringens ze středního ucha na meningy Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae typ b z plicní tkáně na pleuru původci pneumonií Podél nervů herpetické viry, tetanický toxin Šíření podél lymfatických cest je dobře patrné u infekcí vstupujících kůží, pokud vyvolávají větší zánětlivou reakci. Na kůži se projeví typickým rudým pruhem nad zanícenou lymfatickou cévou a zduřením regionální lymfatické uzliny. Zjevné postižení místa vstupu (primární afekt) a příslušné regionální uzliny se nazývá primární komplex. Ve většině případů se šíření infekce vy lymfatických uzlinách zastaví. Pokud infekční agens není v dané uzlině zfagocytováno a zlikvidováno, ale dokonce se v ní množí, je pak odnášeno mízními cévami do ductus lymfaticus a jím do krve. Přítomnost bakterií v krvi, tzv. bakteriémie, není u zdravého jedince ničím neobvyklým. Například během žvýkání, čištění zubů či defekace se celkem běžně dostávají do krve příslušníci normální mikroflóry, obvykle jsou však zachyceni a zničeni makrofágy ve slezině a játrech. 20

21 Odlišná je situace, když do krve pronikají virulentní mikroby z chorobného ložiska, například ze zanícených uzlin. Jsou-li to pyogenní bakterie, projeví se jejich přítomnost tzv. septickými příznaky (horečka, ale někdy i hypotermie, hypotenze, změny v bílém krevním obraze a další). Pokud se agens krví šíří spjato s buňkami, nemusí být příznaky zpočátku patrny (virové infekce, listerie, brucelly). Rozeznáváme primární bakteriémii ( příp. virémii, parazitémii, fungémii), kdy se do krve dostávají mikroby z místa vstupu event. pak z oblastních mízních uzlin, a sekundární bakteriémii - zaplavení krevního oběhu po pomnožení infekčního agens v játrech, slezině nebo v endoteliích krevních kapilár. Sekundární bakteriémie vede k zanesení agens do cílového orgánu, pokud do něj agens neproniklojiž dříve nebo jinou cestou). Cílovým orgánem může být centrální nervový systém, kůže, srdce, ledviny, slinná žláza apod. Schopnost šířit se tkáněmi z postiženého místa bezprostředně do jeho okolí se nazývá šíření per continuitatem. Takto se například dostanou pneumokoky ze zaníceného středouší přes kost spánkovou až na meningy. Některé bakterie jsou vybaveny enzymy, které jim usnadňují šíření ve tkáni (hyaluronidáza Streptococcus pyogenes, lecitinasa a DN-asa Clostridium perfringen. Nervovou cestou se šíří především viry, ale například i améby rodu Naegleria, které mohou přes fila olfactoria proniknout do CNS a vyvolat encefalitidu Schopnost překonávat obranné mechanismy hostitele Během miliónů let evoluce se u makroorganismů vyvíjely jak mechanismy nespecifické rezistence, tak specifické imunity. Souběžně s nimi se u mikrobů vyvíjely faktory virulence, které jim umožnily tyto obranné mechanismy překonávat. Z obranných prostředků řazených mezi nespecifickou čili vrozenou rezistenci, jsou nejdůležitější fagocyty a komplement. Poslední obrannou linií jsou pak produkty specifické imunity, imunní lymfocyty a protilátky Schopnost odolávat účinkům nespecifické rezistence Schopnost odolávat nástrojů nespecifické rezistence je shrnuta v tabulce 8. Mikroorganismy mohou být vybaveny schopností odolávat účinkům komplementu, fagocytóze nebo mohou interferovat s funkcí mediátorů zánětu,cytokinů. Schopnost odolávat účinkům komplementu Komplementový systém je složitý systém bílkovin přítomných v krevním séru. Hraje zásadní úlohu v obraně proti infekci. Je aktivován přítomností mikrobiálních antigenů v makroorganismu. Výsledkem aktivace komplementu jsou především dvě funkce: podpora fagocytózy a lýza buněk. Nejúčinnějším způsobem, jak se patogeny mohou chránit před zhoubným účinkem komplementu, je zabránit jeho aktivaci, např. tvorbou pouzdra, pokrytím protilátkami třídy IgA, tvorbou inhibitorů aktivace komplementu, vazbou inhibitorů aktivace na svůj povrch či tvorbou enzymů, které štěpí, ničí některé složky komplementového systému. 21

22 Některé mikroby sice neumí aktivaci komplementu zabránit, ale dovedou chránit svůj povrch před závěrečnými produkty aktivace komplementu, které by navázány na mikrobiální buňku vedly k její lýze. Schopnost odolávat fagocytóze Fagocytóza představuje nejdůležitější způsob nespecifické obrany proti mikrobů, zejména proti bakteriím. Mikrobiální strategie, jak odolat fagocytóze, je dvojí: buď se mikrob fagocytovat nenechá nebo uvnitř fagocytu přežije. Pravděpodobně nejúčinnějším způsobem, jak se vyhnout fagocytóze, je tvorba pouzdra. Opouzdřené kmeny bakterií bývají vysoce virulentní, odolávají nejen fagocytóze, ale i účinku komplementu. Pouzdro dovedou tvořit prakticky všichni významní původci meningitid a pneumonií Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae. Fagocytóze se vyhýbají i ony mikroby, které dovedou inhibovat aktivaci komplementu, neboť tím zabrání také podpoře fagocytózy. Některé mikroby zase produkují látky, které inhibují pohyb neutrofilů do místa zánětu (tzv. chemotaxe a migrace). Jiné mikroby produkují toxiny a enzymy, kterými zabíjejí fagocytující buňky. K tomu může dojít, ještě než jsou tyto mikroby fagocytovány nebo až po jejich pohlcení. Strategie nechat se zfagocytovat, ale uvnitř fagocytu přežít, je nesmírně výhodná, protože uvnitř buňky je mikrob chráněn vůči dalším obranným mechanismům. Proto některé mikroby usnadňují fagocytózu aktivací komplementu, jiné přinutí k fagocytóze buňky, které tak normálně nečiní tzv. neprofesionální fagocyty, např. epitelie močové roury. Přežití uvnitř buňky si tyto mikroby zajistí například tím, že uniknou z fagosomu před jeho splynutím s lyzosomem a tím se vyhnou působení lyzosomálních enzymů nebo tím, že zablokují toto splynutí. Interference s funkcí cytokinů Komplexním obranným nástrojem nespecifické rezistence je zánět. Je zprostředkován tzv. cytokiny, látkami uvolňovanými z některých buněk. Některé bakterie dovedou cytokinů využít dokonce jako růstových faktorů, některé viry jsou poměrně rezistentní vůči účinku protivirového interferonu. 22