Plynová chromatografie - GC 1.1 Princip metody Fyzikálně-chemická metoda dělení plynů a par využívající rozdělování složky mezi dvě nestejnorodé fáze,

Transkript

1 Plynová chromatografie, GC - I Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2 Plynová chromatografie - GC 1.1 Princip metody Fyzikálně-chemická metoda dělení plynů a par využívající rozdělování složky mezi dvě nestejnorodé fáze, nepohyblivou (stacionární) a pohyblivou (mobilní), přičemž pohyblivou fází je plyn GC je metoda vhodná pro dělení nejen plynů, ale i obecně všech těkavých látek, bez ohledu na jejich skupenství při laboratorní teplotě Pokud je stacionární fází pevná látka, jedná se o chromatografii plyn-pevná látka (GSC). Separace závisí na adsorpčních vlastnostech stacionární fáze a na vlastnostech nosného plynu Pokud je stacionární fází kapalina, jde o chromatografii plynkapalina (GLC). Separace je založena na rozpouštění složky ve stacionární fázi. Kapalina tvořící stacionární fázi bývá nanesena ve formě tenkého filmu na vhodném nosiči s velkým povrchem

3 Při separaci jsou dělené složky neseny kolonou inertním nosným plynem Složky se dělí mezi nosný plyn a stacionární fázi Stacionární fáze selektivně zadržuje určité komponenty. Na základě jejich rozdílných distribučních konstant dojde k dělení na koloně, vytvoří se zóny složek Více či méně rozdělené komponenty postupně opouští kolonu v proudu nosného plynu a jsou zaznamenávány detektorem jako závislost odezvy detektoru na čase

4 Zařízení pro plynovou chromatografii se skládá z následujících nejdůležitějších částí: 1. Regulace tlaku nosného plynu 2. Regulace průtoku nosného plynu 3. Dávkovač s vyhříváním 4. Chromatografická kolona 5. Detektor s vyhříváním 6. Termostat 7. Zesilovač signálu detektoru 8. a 9. Integrátor a zapisovač (datastanice)

5 1.2 Teorie plynové chromatografie Základní charakteristikou pro dělenou látku v GC je hodnota retenčního (elučního) času nebo objemu t R resp. V R Doba, která uplyne od nástřiku do kolony po eluci látky z kolony, resp. objem plynu, jenž projde kolonou od nástřiku látky po její eluci z kolony Vzájemný vztah retenčního času a retenčního objemu je dán rovnicí: V = t F (1) R R m kde F m je objemová rychlost mobilní fáze za časovou jednotku Retenční objem V R (nazýván také zdánlivý eluční objem) je dán součtem dvou objemových veličin: V V + V R = (2) R M V R je redukovaný retenční objem (skutečný objem), V M je mrtvý retenční objem kolony

6 Průměrná rychlost mobilní fáze v koloně je přímo úměrná tlakovému spádu na koloně podle Darcyho zákona: u 0 B0 p ηl = (3) kde B 0 je specifická permeabilita [cm 2 ], p = p i p 0 je rozdíl tlaků na vstupu a výstupu z kolony, η je dynamická viskozita nosného plynu [gs -1 cm -1 ], L je délka kolony [cm], u 0 s pruhem je průměrná lineární rychlost v koloně, která neobsahuje žádnou náplň [cm s -1 ] Volný průřez naplněné kolony se vyjadřuje jako intersticiální porozita ε, běžné hodnoty ε jsou Skutečná průměrná lineární rychlost v koloně je rovna: u B0 p ηεl = (4) V diferenciální podobě lze rovnici (4) přepsat v podobě: B dp = (5) ηε dx u 0

7 Pokud potřebujeme vypočítat průměrnou rychlost u s pruhem podle rovnice (4), je k výpočtu nutno určit specifickou permeabilitu B 0, která je dána pro ε=0.42 vztahem: B d 2 p = (6) Při běžných výpočtech lze pracovat s průměrnou lineární rychlostí a s průměrným objemovým průtokem

8 V plynové chromatografii není lineární rychlost toku mobilní fáze (plynu) v koloně po její celé délce konstantní Nelinearita rychlosti toku je důsledkem kompresibility nosného plynu s následným vznikem nelineárního tlakového spádu na koloně

9 Podle modifikovaného Boylova zákona platí: p u 0 p u 0 = (7) kde p je tlak v libovolném místě kolony a u je lineární rychlost plynu v tomto místě Spojením rovnic (5) a (7) s následnou integrací výsledné rovnice ve dvou rozmezích, a dále vzájemným vydělením obou získaných rovnic dostaneme konečný vztah: x L p p 2 i 2 i p p 2 = (8) 2 0 Ze vztahu (8) můžeme vypočítat tlak p nebo okamžitou rychlost u v kterémkoliv místě kolony

10

11 pro výpočet korekce na tlakový spád navrhli James a Martin výraz pro kompresibilitní faktor j: = 1 p p 1 p p 2 3 j 3 0 i 2 0 i (9)

12 Hodnoty kompresibilitního faktoru j

13 Pomocí kompresibilitního faktoru j lze korigovat v plynové chromatografii vliv tlakového spádu na koloně a hodnotu redukovaného retenčního objemu Lze tak dostat čistý retenční objem V N, ten je vyjádřen vztahem: = j V = V p 3 p 2 p p 0 V R R 3 i i N (10) Retenční hodnota V N nemůže být charakteristickou veličinou pro danou látku, protože je závislá na množství zakotvené fáze w L [g] v koloně a na její teplotě T c [K] Proto byl zaveden specifický retenční objem V g, který dává do vztahu čistý retenční objem při 0 C a hmotnost stacionární fáze, je tak zahrnut vliv množství stacionární fáze a teploty na čistý retenční objem V N (Littlewood): V V 273 T w 3 [cm g -1 g = N (11) C L ]

14 1.2.2 Vliv teploty na retenční hodnoty Rovnice (11) ukazuje, že teplota má značný vliv na retenční objem eluované složky Při izotermní chromatografii je nutno dodržovat přesnou konstantní teplotu, pokud mají být naměřena spolehlivá retenční data Obecně platí, že práce při nižší teplotě vede obvykle k lepšímu rozlišení, ale současně platí, že snižování teploty vede k rozšiřování píků, které v extremním případě nemusí být vyhodnotitelné Aplikací Daltonova a Henryho zákona lze obdržet vztah: h S m log Vg = + c (12) 2.303RTC kde h S m je parciální molární výparné teplo komponenty ze stacionární fáze Logaritmus specifického retenčního objemu vynesený proti 1/T c poskytuje lineární závislost Pro různé látky může být sklon křivky odlišný, porovnáním směrnic lze najít optimální teplotu pro separaci sledovaných látek V některých případech dokonce dochází ke křížení lineárních závislostí (především pro vzájemně odlišné látky) Obecné pravidlo, že snížení teploty vede obvykle ke zlepšení rozlišení, má tedy jen omezenou platnost

15 Závislost specifického retenčního objemu složek na reciproké hodnotě absolutní teploty na koloně

16 Gradientová eluce Pokud se liší směs dělených komponent body varu o více než 100 K, potom při teplotě kolony, která je ve středu tohoto teplotního intervalu, eluují méně těkavé složky ve tvaru širokých píků s dlouhými retenčními časy a těkavé složky se nerozdělí úplně Proto je vhodné aplikovat teplotní gradient, který dovoluje dělit těkavé komponenty za nízké teploty a složky s omezenou těkavostí za zvýšené teploty Teplota, při níž se složka eluuje v teplotním gradientu se označuje retenční teplota T R a je definována: T T + r t R = (13) 0 R T 0 je počáteční teplota kolony [K], r je rychlost teplotního vzrůstu [K/min] a t R je retenční čas [min] Přibližně platí, že při zvýšení teploty o K se zkrátí redukovaný retenční čas složky na polovinu

17 1.2.3 Rozšíření zóny složky v plynové chromatografii Náplňové kolony Pro GC se nejčastěji používá rychlostní teorie van Deemterova (viz oddíl 4.3.3): H H + H + H = (oddíl ; rovnice 57) F L S kde H je celková výška teoretického patra zkoumaného systému, H F je příspěvek vířivé difúze, H L je příspěvek molekulární difúze, H S je příspěvek odporu proti přenosu hmoty ve stacionární fázi Vztah (57) je pro GC obvykle modifikován takto: B H A + + Cu u = (16) A, B a C jsou konstanty odpovídající příspěvkům vířivé (turbulentní) difúze, molekulární (podélné) difúze a odporu proti přenosu hmoty ve stacionární fázi u s pruhem je průměrná lineární rychlost mobilní fáze na koloně

18 Poznámka: Vzhledem ke stlačitelnosti plynu, kdy se podél kolony lineární rychlost mnění, je zřejmé, že v případě plynové chromatografie je vhodné ve van Deemterově rovnici pracovat s průměrnou rychlosti toku mobilní fáze u s pruhem Průměrná lineální rychlost plynu u s pruhem je prakticky vyjadřována jako poměr délky kolony L [cm] k elučnímu času neretardované složky t M [s], obvykle vzduchu nebo methanu Grafickým vyjádřením závislosti H u je hyperbola s minimem H při určité průměrné rychlosti u s pruhem Minimum odpovídá optimální lineární rychlosti, tzn. lineární rychlosti poskytující maximální účinnosti Vzhledem ke stlačitelnosti plynu je ovšem patrno, že optimální lineární rychlost může být pouze v omezené části kolony Optimální průtok bývá ~ 4 7 cm/s pro dusík a argon

19

20 Van Deemterova rovnice v rozvinutém tvaru (jak bylo diskutováno dříve) má tuto formu: H 2ψD u 2 3 k d 2 m f = 2λ dp + + u (17) 2 ( 1+ k) DS λ kosntanta, která vyjadřuje rovnoměrnost náplně, ψ je korekční faktor na křivolakost kanálků v koloně

21 Vířívá (turbulentní) difúze 2λd p Závisí na velikosti částic nosiče, na tvaru nosiče, na kvalitě naplnění kolony Konstanta λ se mění v závislosti s velikostí nosiče. Snadněji se dosáhne rovnoměrného naplnění u sorbentů s větší velikostí částic Velikost částic λ Mesh mm Snížení členu A se dosahuje použitím částic sorbentu s malým jednotným zrněním, malým průměrem kolon a malým tlakovým spádem na koloně

22 Molekulární (podélná) difúze 2ψDm u Závisí na vlastnostech nosného plynu i dělené látky Systém D m [cm 2 s -1 ] Teplota [ C] Argon/n-oktan Dusík/n-oktan Helium/methanol Molekulární difúze se snižuje s rostoucí hustotou nosného plynu, tj. zvýšeným tlakem nebo molekulovou hmotností plynu Dusík nebo argon je vhodnější než helium a vodík v oblastech nižších lineárních rychlostí nosného plynu Korekční faktor ψ se s rostoucí velikostí částic zvyšuje k limitní hodnotě ψ = 1. Obvykle se tato hodnota pro náplňové kolony rovná ~

23

24 Opor proti přenosu hmoty 2 3 k d 2 f 2 ( 1+ k) D S u Vztah zanedbává odpor proti přenosu hmoty v plynné fázi Vyjadřuje jen odpor ve fázi stacionární Snížení členu C se lze dosáhnout tenkým souvislým filmem zakotvené fáze o malé viskozitě

25 Závěry, které lze odvodit z van Deemterovy rovnice mají praktický význam a jsou použitelné ke zvýšení účinnosti dělení a) Průměr částic: Účinnost kolony se zvýší při použití nosiče s malým rovnoměrným zrněním b) Průtok: Nejlepší účinnosti je možno dosáhnout pokud je užit optimální průtok nosného plynu, optimum se zjistí měřením závislosti H na u s pruhem c) Nosný plyn: Volba nosného plynu bývá závislá na detektoru. Obecně se nejvyšších účinností dosahuje s nosným plynem o vyšší molekulové hmotnosti, dusík nebo argon. Pokud je cílem rychlost analýzy bez nutnosti nejvyšších účinností, dává se přednost plynům s malou molekulovou hmotností, vodíku

26 d) Typ zakotvené fáze: Fáze by měla mít malou viskozitu a dobrou rozpustnost pro dělenou látku e) Množství zakotvené fáze: Nízký obsah fáze (1-5%), tenký film, vede k rychlému dělení při nízké teplotě. Ovšem je třeba, vzhledem k malé kapacitě kolony, dávkovat jen malá množství vzorku a nosič musí být neaktivní f) Tlak: Maximální účinnost je získána při minimálním tlakovém spádu na koloně

27 Kapilární kolony Kolony neobsahují náplň Člen odpovídající turbulentní difúzi je eliminován Z druhého členu odpovídajícímu podélné difúzi odpadá korekční faktor ψ Je nutno respektovat skutečnost, že tloušťka filmu na stěnách kapiláry je velmi malá. Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi je srovnatelný s odporem proti přenosu hmoty ve fázi mobilní Modifikovaná van Deemterova rovnice je formulována následovně: B H = + C u + CG u (18) u konstanta C G je definována takto: C G (1 + 6k + 11k )d 2 ( + k) D m 2 = (19) d je průměr kapiláry

28 2.1 Kolony pro plynovou chromatografii Používány jsou dva typy kolon: a) Náplňové b) Kapilární Náplňové Kapilární Analytické Preparativní Otevřené Plněné Vnitřní průměr d [mm] Délka L [m] Permeabilita [cm 2 ] H [mm]

29 Náplňové kolony Trubice naplněné granulovaným materiálem, adsorbentem (GSC) nebo nosičem pokrytým kapalnou stacionární fází (GLC) Kapilární kolony Nejběžnější jsou otevřené kapiláry, funkci nosiče zastávají vnitřní stěny kapiláry, které jsou pokryty adsorbentem nebo kapalnou stacionární fází Zvýšení obsahu stacionární fáze je dosahováno úpravou vnitřních stěn naleptáním, tím se několikanásobně zvětší vnitřní povrch kapiláry a je možno zakotvit větší množství fáze a následně dávkovat více vzorku Méně používané jsou plněné kapilární kolony, u kterých je vnitřní prostor vyplněn vhodným nosičem. Stacionární fáze je zakotvena na stěnách i na nosiči. Plnění není pravidelné, objem náplně zaujímá ~ 2/3 objemu kolony. Permeabilita kolon je ve srovnání s otevřenými kapilárami menší, ale větší než pro náplňové kolony Materiál pro náplňové kolony Měkká nerezová ocel, měď, hliník, polymery, sklo

30 Délka kolony Počet teoretických pater roste s prodlužováním kolny, ovšem za předpokladu konstantní lineární rychlosti mobilní fáze kolonou S růstem rozdílu vstupního a výstupního tlaku na koloně se zmenšuje oblast kolony pracující za optimálního průtoku, to vede k poklesu účinnosti. Rozdíl tlaků je dán nejenom délkou kolony, ale i její permeabilitou. Proto jsou v praxi užívány délky náplňových kolon v rozmezí m. Vnitřní průměr kolony Určuje (u GLC společně s ohledem na smočení nosiče) kapacitu náplně Se vzrůstajícím vnitřním průměrem kolony se zvětšuje objemová rychlost, pokud má být lineární rychlost konstantní Dělící účinnost není ovlivněna vnitřním průměrem kolony při izotermní chromatografii Kolony s menším průměrem jsou efektivnější při práci v teplotním gradientu, protože se teplotní rovnováha ustavuje rychleji Vliv tvaru kolony Nejčastější jsou kolony stočené do spirály. Případný ostrý ohyb má za důsledek snížení kvality dělení

31 Náplňové kolony pro GSC Obvykle vyšší retence solutů na pevných sorbentech ve srovnání s GLC Proto lze dělit plyny a vysoce těkavé složky, které se na kolonách GLC nesorbují Klasické adsorbenty: aktivní uhlí, silikagel, alumina, syntetické zeolity - molekulová síta Novější materiály: mikroporézní polymery Klasické adsorbenty mají některé negativní vlastnosti, proto jsou částečně nahrazovány porézními polymery Hlavní nedostatky klasických adsorbentů: 1. Katalytický vliv: Většina adsorbentů je použitelná i jako katalyzátor chemických reakcí (oxidace) 2. Malá kapacita: Adsorbenty jsou snadno přetížitelné. Je třeba dávkovat velmi malá množství vzorku. Snadno dojde k deformaci píků spojenou s nereprodukovatelností retenčních časů. Retenční časy jsou v takovém případě funkcí velikosti nástřiku

32 3. Retenční čas: Adsorpční schopnost bývá velká. Čas k analýze rychle vzrůstá s rostoucí molekulovou hmotností 4. Chvostování píků: Vysoce polární látky chvostují, kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení je tím komplikováno Velikost částic používaných sorbentů se uvádí v milimetrech nebo mesh-počet otvorů v sítu připadající na čtvereční palec Výše již bylo uvedeno, že účinnost separace se zlepšuje se zmenšováním sorbentu, ale současně se zvyšuje tlakový spád na koloně, který působí na dělení nepříznivě. V praxi se užívají zrnění, která jsou kompromisem Průměr kolony Zrnění mm palce mm mesh 1.6 1/ / / / / / / /60

33 Aktivní uhlí Slabě polární (díky chemisorpci kyslíku, síry atd.) Vhodný pro dělení uhlovodíků C1-C6, lehkých a permanentních plynů Nereprodukovatelnost výsledků spojená s nestejnými vlastnostmi jednotlivých šarží Grafitizace vede ke snížení polarity a mikroporozity sorbentu, poskytuje homogenní povrch. Grafitický uhlík je neporézní nepolární inertní adsorbent vhodný pro dělení atmosférických a permanentních plynů (povrch sorbentu ~ m 2 g -1, použitelný do 500 C) Uhlíkatá molekulová síta mají povrch až ~ 1500 m 2 g -1. Vhodná především pro separaci uhlovodíků C1-C3 a permanentních plynů. Nízkomolekulární aldehydy a alkoholy (polární látky) dávají symetrické píky. Látky s vyšší molekulovou hmotností mohou být nevratně sorbovány

34 Alumina a silikagel Polární sorbenty Podobná separační schopnost jako aktivní uhlí Hlavní nevýhodou je závislost dělících schopností na obsahu vody v adsorbentu Alumina má dobrou schopnost dělit poziční izomery Podstatnou vlastností adsorbentů je velikost povrchu a pórů. Povrchy silikagelových sorbentů se pohybují od ~2 do 500 m 2 g -1, velikost pórů od 10 nm do 150 nm Porasil

35 Molekulová síta Velmi vhodná pro sušení plynů, vzhledem k vynikající afinitě pro vodu Pro chromatografické aplikace se užívá síto 5A a 13X (má vztah k velikosti pórů) Hlavní výhodou je schopnost dělit O 2 a N 2 za normální teploty Nevýhodou je trvalá sorpce CO 2 za normální teploty Molekulové síto 13X má větší průměr pórů a je lepší pro rychlou analýzu, síto 5A poskytuje asi dvojnásobné retenční časy a je vhodnější pro stopovou analýzu Aktivované síto dělí při laboratorní teplotě plynné složky v pořadí: vodík, kyslík+argon, dusík, methan, oxid uhelnatý. Pro dělení kyslíku a argonu je nutno použít za laboratorní teploty kolonu o délce 5m, nebo při 78 C kolonu 1m

36 Podobně jako oxid uhličitý, také korozivní plyny jsou úplně adsorbovány Za zvýšené teploty může být síto 5A užito k dělení uhlovodíků s rovným řetězcem, které jsou sorbovány narozdíl od rozvětvených uhlovodíků Permanentní plyny jsou eluovány rychle a téměř bez dělení na neaktivovaném sítu. Aktivace se provádí při 300 C. Množství reziduální vody na sítu má vliv na eluční pořadí oxidu uhelnatého a methanu

37 Polymerní sorbenty Obvykle kopolymery divinylbenzen (DVB)/styren, akrylonitril, ethylenglykol dimethakrylát, aj. Podle složení se liší polaritou, ale vesměs jsou relativně málo polární Tepelná stabilita do 250 C Velikost povrchu je m 2 g -1 Sorbenty jsou vhodné pro analýzu nízkomolekulárních látek do ~200 Da, b.v.~250 C Výhodou je skutečnost, že voda je eluována jako symetrický pík, toho lze využít při stopových analýzách nečistot ve vodách Porapak, Chromosorb , T Tenax TA (2,6-difenyl-p-fenylenoxid) tepelně stálý do 350 C