Laboratoř sekvenace DNA Servisní laboratoř biologické sekce PřF UK

Transkript

1 Laboratoř sekvenace DNA Založena 2003, momentálně jsme 2 zaměstnankyně, máme dvě spolupracovnice na DPP a jsme finančně soběstačné, včetně platů. Rok Počet sekvenací Počet fragmentací

2 Fragmentační analýza - analýza mikrosatelitů, SNP genotypizace, AFLP, RFLP, MLPA a další aplikace. - na 16 kapilárním genetickém analyzátoru 3130xL (Life Technologies) umístěném stále ve Viničné 7. Přístroj má nastaveny spektrální kalibrace se standardy: DS-30 (6FAM, HEX, NED, ROX ) pro červený standard ROX400 a ROX500 DS-33 (6FAM, VIC, NED, PET, LIZ ) pro oranžový standard LIZ500, LIZ600 a LIZ1000 DS-02 (dr110, dr6g, dtamra, drox, LIZ ) pro oranžový standard LIZ120 pro SNaPshoty Cena 33 Kč za vzorek. Formamid a destičky dodáváme. Vnitřní standardy nedodáváme.

3 Sangerovo sekvenování plasmidů a PCR produktů na 24-kapilárním genetickém analyzátoru 3500xL (Life Technologies) v Biocevu. Nejčastější problémy vznikají z důvodu špatné koncentrace či čistoty templátu. Nepodceňujte kontrolu na nanodropu a/nebo gelu. I příliš velké množství DNA blokuje sekvenační reakci! Cena 87 Kč za vzorek. Vzorky dodáváte již předmíchané s primerem na právě jednu reakci. Optimálně získáváme délku 800 bází. Komerčně Macrogen sběrná schránka na Katedře botaniky. Cena výhodná jen při sekvenování celé destičky. Cena za jednotlivý vzorek 4,5 Eura plus 21% dph čili min. 135 Kč.

4 Next-generation sekvenování - na platformě MiSeq (Illumina) nabízíme možnost sekvenování jednak Vašich připravených knihoven a jednak knihoven, které jsme v omezeném množství schopny připravit z Vašich vzorků. Kvalitu Vámi připravené DNA/RNA knihovny pro NGS si před sekvenováním vždy prověříme vhodnou metodou. Vhodnost použití přístroje MiSeq a design projektu s námi konzultujte ještě před začátkem tvorby knihovny. Cena běhu Kč dle délky běhu. Jeden kit je celý využit na jeden běh přístroje. Sekundární analýzu dat neprovádíme. Verze kitu Délka čtení Délka čtení paired-end Počet čtení Množství dat Cena s dph MiSeq Reagent Kit v2 (300 cycles) 300 bp 2 x 150 bp až 15 mil. až 4,5 Gb Kč MiSeq Reagent Kit v2 (500cycles) 500 bp 2 x 250 bp až 15 mil. až 7,5 Gb Kč MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) 150 bp 2 x 75 bp až 25 mil. až 3,8 Gb Kč MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycles) 600 bp 2 x 300 bp až 25 mil. až 15 Gb Kč

5 NGS aplikace doporučené pro MiSeq RNA sekvenování genová exprese, sekvenace transcriptomů a small RNA de novo sekvenování malých genomů (< 20 Mb) Resekvenování malých genomů indel, SNPs 16S Metagenomika 384 vzorků Amplikonové sekvenování HybSeq fragmenty DNA získané hybridizací se sondami ChipSeq fragm. DNA získané chromat. imunoprecipitací Kontrola kvality DNA knihoven Pilotní projekty

6 Příprava DNA a RNA knihoven pro NGS V omezeném rozsahu nabízíme jako službu přípravu knihoven pro NGS. U větších projektů nabízíme zaškolení a pomoc při přípravě Vašich knihoven v našich prostorech s kompletním vybavením. Dále nabízíme sdílení kitů na přípravu knihoven, nemusíte tedy kvůli menším projektům sami pořizovat celý kit. V současné době máme k dispozici tyto kity: TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit (Illumina) TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit (Illumina) Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina) NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs) NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep with Sample Purification Beads (New England Biolabs) QuantSeq 3' mrna-seq Library Prep Kit FWD for Illumina (Lexogen)

7 Kontrola kvality a kvantity RNA, DNA a knihoven je nutná a zásadní ve všech fázích projektu a není radno na ní šetřit! Spektrofotometr Nanodrop 2000 UV-Vis spectrophotometr Fluorometr Quantus Agilent 2100 Bioanalyzér Cena dle typu čipu na vyžádání ( Kč), možnost sdílení čipu, vzorků. High Sensitivity DNA kit - pro kontrolu kvality DNA fragmentů a DNA s vysokou citlivostí (5 500 pg/µl) v 1 µl vzorku. DNA pro analýzu dsdna fragmentů od bp. Pro koncentrace 500 pg/ µl 50 ng/µl. RNA 6000 Nano pro celkovou RNA a mrna v koncentraci ng/µl, informace o stupni degradace celkové RNA (RIN). RNA 6000 Pico totéž pro koncentrace 50 pg/µl 5 ng/µl. LightCycler 480 Real-TimePCR, Roche Cena dle počtu vzorků, možnost sdílení běhu. M220 Focused-ultrasonicator - Covaris 165 Kč za vzorek, včetně sonikačních minizkumavek o objemu 50μl nebo 130μl Pro přípravu knihoven

8 Kontakt: RNDr. Štěpánka Hrdá Mgr. Blanka Hamplová Ph.D. Doporučujeme komunikaci em nebo BIOCEV: Tel /36 Adresa Biocev: Core facility - Genomika, PřF UK, Biocev Průmyslová 595 Vestec

9 Děkuji za pozornost a těšíme se na spolupráci!

10

11 Sanger sequencing Sequencing reaction Price: 87 CZK/sample Read length bp Around 2000 samples/ month Capillary electrophoresis ABI 3500XL - 24 capillaries Source Wikimedia

12 Fragment analysis Price: 40 CZK/sample Our standard: plus 20 Czk/sample Ø Microsatellite analysis Ø AFLP, RFLP Ø SNP genotyping Calibration for 4-dye, 5-dye and 6-dye samples: üds-30 (6FAM, HEX, NED, ROX ) - standard ROX 400, 500 üds-33 (6FAM, VIC, NED, PET, LIZ ) - standard LIZ 500, 600 üds-02 (dr110, dr6g, dtamra, drox, LIZ ) - standard LIZ 120 üds-36 (6FAM, VIC, NED,SID,TAZ,LIZ ) - standard LIZ 600

13 The Core Facility offers not only services but also access to all instruments. Quality and quantity of input material are crucial to efficient library construction and sequencing. The 2100 Bioanalyzer Agilent system provides sizing, quantitation and quality control of DNA, RNA and proteins. The Covaris M220 Focused-ultrasonicator generates fragment sizes between 150 and 5,000 bp in tight, highly reproducible fragment distributions. NanoDrop Spectrophotometer Quantus Fluorometer