Bc. Alžběta Kolorosová EXTRAKCE VYBRANÝCH SLOUČENIN RTUTI Z REÁLNÝCH VZORKŮ PRO SPECIAČNÍ ANALÝZU POMOCÍ RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS

Transkript

1 U N I V E R Z I T A K A R L O V A V P R A Z E P ř í r o d o v ě d e c k á f a k u l t a Studijní program: Klinická a toxikologická analýza Bc. Alžběta Kolorosová EXTRAKCE VYBRANÝCH SLOUČENIN RTUTI Z REÁLNÝCH VZORKŮ PRO SPECIAČNÍ ANALÝZU POMOCÍ RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS Extraction of Selected Mercury Compounds from Real Samples for Speciation Analysis Employing RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS D i p l o m o v á p r á c e Vedoucí diplomové práce: RNDr. Václav Červený, Ph.D. Praha 2015

2 - 2 - Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků získaných v této práci mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity. V Praze dne 2. května 2015.

3 - 3 - Poděkování Chtěla bych poděkovat vedoucímu své diplomové práce RNDr. Václavu Červenému, Ph.D. za odborné vedení, dobré rady, vstřícnost a přátelský přístup. Poděkování patří také Mgr. Ondřeji Linhartovi za předání zkušeností s metodou a ochotu pomoci nejen v laboratoři. Dále bych chtěla poděkovat kolegům z laboratoře č. 107 za všeobecné rady a doporučení. Největší dík patří mé rodině a příteli za jejich neustálou podporu.

4 - 4 - Abstrakt Předkládaná práce se zabývá extrakcí specií rtuti (methylrtuti, ethylrtuti, fenylrtuti a dvojmocné rtuti) z reálných vzorků rybí tkáně a jejich stanovením pomocí HPLC na reverzních fázích, UV-fotochemického generování studené páry rtuti a detekcí atomovou absorpční spektrometrií s křemennou detekční trubicí. Byly porovnávány účinnosti různých extrakčních činidel a rozkladových metod. Z extrakčních činidel bylo nejlepších výsledků dosaženo se směsí 6,25% (m/v) hydroxidu tetramethylamonného s 0,05 mol l 1 kyselinou chlorovodíkovou, která měla zároveň i pozitivní vliv na UV-generování a separaci sledovaných sloučenin rtuti. U mikrovlnné extrakce byla odhalena sorpce na teflonové inserty způsobující zhoršenou opakovatelnost, a proto byla jako vhodnější vyhodnocena extrakce za zvýšené teploty (50-60 C) ve skleněných nádobách. Výsledky stanovení specií rtuti po jejich extrakci z reálných vzorků byly porovnány s kontrolním stanovením celkového množství rtuti ve vzorku pomocí AMA 254. Předkládaný postup extrakce ve spojení s RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS poskytuje kvalitní výsledky při speciační analýze rtuti z tkání ryb. Klíčová slova: extrakce, speciační analýza, rtuť, UV-fotochemické generování studené páry rtuti, rybí tkáň

5 - 5 - Abstract The extraction of mercury species (methylmercury, ethylmercury, phenylmercury and inorganic mercury(ii)) from fish tissue, its determination by reverse phase HPLC, UV-photochemical generation of cold vapour, and detection by atomic absorption spectrometry is described in this work. Various extraction agents and digestion methods were compared in order to find the best alternative. The mixture of 6.25% tetramethylammonium hydroxide and 0.05 mol l 1 hydrochloride acid was chosen as the best extraction agent. In addition to the high extraction efficiency, the solution involved positively not only UV-photochemical generation, but also separation of observed species. On the contrary, the poor repeatability was achieved with the microwave-assisted digestion due to the proved sorption of mercury species on the Teflon vessels. Therefore, the extraction by high temperature (50-60 C) in glass bottles was preferred. The results of the determination of the mercury species after the extraction from the real samples were compared to the outcomes obtained by AMA 254. The proposed extraction technique together with the RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS is suitable for the speciation analysis of mercury. Key words: extraction, speciation analysis, mercury, UV-photochemical generation of cold vapour, fish tissue.

6 - 6 - Seznam zkratek AAS AMA 254 cetoh chg c2me cp EDTA EtHg + FIA Hg +II HPLC IUPAC l LDR LOD LOQ MeHg + mf PhHg + atomová absorpční spektrometrie jednoúčelový atomový absorpční spektrometr ke stanovení rtuti koncentrace ethanolu koncentrace rtuti koncentrace 2-merkaptoethanolu koncentrace pufru kyselina ethylendiamintetraoctová ethylrtuťný ion průtoková injekční analýza rtuťnatý ion vysokoúčinná kapalinová chromatografie International Union of Pure and Applied Chemistry (Mezinárodní unie pro čistou a užitou chemii) délka reakční trubice lineární dynamický rozsah mez detekce mez stanovitelnosti methylrtuťný ion mobilní fáze fenylrtuťný ion ppb jednotka koncentrace odpovídající ng ml 1 PTFE polytetrafluorethylen RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS Vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzních fázích, UV- fotochemické generování studené páry rtuti a detekce atomovou absorpční spektrometrií s křemennou detekční trubicí S plocha píku t čas td teplota detekční trubice

7 tr tk TMAH U UV Vd var vmf w retenční čas teplota kolony hydroxid tetramethylamonný napětí ultrafialové objem dávkovací smyčky průtoková rychlost argonu průtoková rychlost mobilní fáze procentuální zastoupení látky ve vzorku WHO The World Health Organisation (Světová zdravotnická organizace)

8 - 8 - Obsah Seznam zkratek Obsah Úvod Teoretická část Specie a speciační analýza Rtuť Chemické a fyzikální vlastnosti Rtuť a životní prostředí Toxicita specií Prevence a léčba otrav Extrakce Extrakce sloučenin rtuti Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) UV-fotochemické generování Atomová absorpční spektrometrie Experimentální část Použité přístroje a příslušenství Použité chemikálie Aparatura Experimentální podmínky Výsledky a diskuze Výběr vhodného extrakčního činidla Mikrovlnná extrakce s TMAH a HCl Mikrovlnná extrakce s TMAH a HCl z reálných vzorků

9 Základní charakteristiky stanovení specií rtuti Extrakce za zvýšené teploty s TMAH a HCl Extrakce specií rtuti z reálných vzorků pomocí TMAH a HCl za zvýšené teploty Závěr Použitá literatura

10 Úvod Toxické jsou všechny sloučeniny rtuti. Lipofilní organické sloučeniny rtuti snadněji prostupují biologickými membránami do buněk, kde mohou ovlivnit mnoho biologických procesů, a proto jsou toxičtější a nebezpečnější než anorganické. 1 Kvalita i množství specie rtuti vyskytující se ve vzorku jsou tedy velmi důležité, protože určují jeho celkovou toxicitu. Jedním z klíčových kroků speciační analýzy je extrakce sloučenin rtuti z reálných vzorků. Při výběru nejvhodnějšího extrakčního činidla a postupu je nutné přihlížet k tomu, aby jeho vlivem nedocházelo k vzájemné přeměně sloučenin, nebo snížení účinnosti UV-generování a separace. Zároveň však musí poskytovat dostatečně vysokou extrakční účinnost. Tato práce navazuje na diplomovou práci Mgr. Ondřeje Linharta s názvem Speciační analýza vybraných sloučenin rtuti pomocí HPLC, UV-fotochemického generování studené páry rtuti a její detekce AAS, obhájenou v roce Hlavním cílem této práce je nalezení vhodného extrakčního činidla a postupu extrakce vybraných specií rtuti (Hg +II, methylrtuť, ethylrtuť a fenylrtuť) z reálných vzorků pro speciační analýzu pomocí HPLC na reverzních fázích, UV-fotochemického generování studené páry rtuti a atomové absorpční spektrometrie v křemenné detekční trubici (RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS). 2

11 Teoretická část 2.1 Specie a speciační analýza International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) definuje specii jako formu prvku, která je vyjádřena složením izotopů, komplexem, molekulární strukturou, elektronovým nebo oxidačním stavem. Speciační analýza je analytická činnost vedoucí k identifikaci nebo měření jednotlivých specií ve vzorku Rtuť Rtuť je pro svůj vliv na životní prostředí a lidské zdraví jedním z nejvíce studovaných prvků. 4 Staří Římané, kteří již znali její toxické účinky, ji pojmenovali podle posla bohů Merkura 5 a symbol Hg odvodili z latinského slova hydrargyrum, což znamená tekuté stříbro. 6, 7 Také alchymisté této látce přisuzovali neobyčejné vlastnosti a věřili, že s její pomocí je možné přeměnit běžné kovy ve zlato. 7 Její jediná ruda cinabarit HgS (neboli rumělka) byla ve středověku používána k výrobě pigmentu 6 a amalgámy, slitiny rtuti s některými kovy, dříve sloužily k pozlacování či získávání zlata ze zlatonosných rud. Ovšem při těchto postupech se uvolňovalo velké množství rtuti do atmosféry, a proto se již většinou nepoužívají. 7 Po staletí byla rtuť také významnou složkou léků. Obsahovala ji diuretika, antiseptika, kožní masti, projímadla a v 16. století sloužila k léčbě syfilidy. Dnes už byla ve většině případů nahrazena bezpečnějšími látkami. 6 Ještě v minulém století byly používány fungicidy obsahující organickou rtuť k moření obilí určeného k setbě. Avšak v roce 1972 došlo v Iráku k hromadné otravě rtutí, když tamní obyvatelé místo zasetí přímo konzumovali takto ošetřené obilí. 4,5 Dnes se rtuť používá převážně v elektrotechnickém průmyslu, stomatologii, tlakoměrech a jiných přístrojích Chemické a fyzikální vlastnosti Elektronová konfigurace valenční vrstvy rtuti je [Xe] 6s 2 4f 14 5d 10. Stabilizuje se ztrátou dvou elektronů na konfiguraci elektronové osmnáctky a dosažením oxidačního čísla II. Při dalším způsobu stabilizace se vzájemně vážou dva atomy rtuti vazbou zprostředkovanou jedním párem 6s 2, přičemž druhý se uvolňuje. Vzniká tím dvojice atomů s celkovým oxidačním stavem II, čímž je

12 formálně u jednoho atomu dosaženo oxidačního stavu I. Rtuť se tedy vyskytuje v oxidačních číslech Hg 0, Hg +I a Hg +II. 8 Za normálního tlaku a teploty je jako jediný kov kapalná. 5,9 Má však vysokou tenzi par (2,53 Pa při 25 C), a proto i malé množství kovové rtuti může (pokud není zajištěna dostatečná výměna vzduchu) dosáhnout rovnovážného stavu i ve větším prostoru. 7, Rtuť a životní prostředí K uvolnění velkého množství rtuti do ovzduší dochází hlavně při spalování uhlí obsahujícího její sloučeniny. Dalším nejvýznamnějším antropogením zdrojem znečištění jsou továrny vyrábějící sodu a chlor elektrolýzou solanky. 11 Dříve ke znečištění životního prostředí také značně přispívala rtuť používaná k extrakci zlata ze zlatonosných rud. 12 Rtuť se může objevit i na místě velmi vzdáleném od zdroje emise. Vysoká stálost spolu s různými transportními mechanismy jako vulkanické emise, větrem roznášený prach, gejzíry či termální proudy dělají ze rtuti globální polutant. 11, 13 Protože pára rtuti je chemicky stabilní monoatomický plyn, může v atmosféře urazit dlouhé vzdálenosti. Reakcí s ozonem, hydroxylovými nebo halogenovými radikály je pak oxidována na Hg +II, který je rozpustný ve vodě a s deštěm se vrací zpět na zem. 13 Odtud se může rtuť vypařovat zpět do atmosféry nebo být mikroorganismy přeměněna na některou z organických forem. 6 Díky neustálému cyklu vypařování a kondenzace se rtuť postupně dostává do Arktických oblastí, kde je fáze vypařování vzhledem k nízkým teplotám velmi pomalá, a rtuť se zde kumuluje. Jednou z nejvýznamnějších specií nacházející se ve vzorcích životního prostředí je methylrtuť, na kterou je sulfát redukujícími bakteriemi přeměňována rtuť anorganická. 13, 14 Při této transformaci hraje důležitou roli methylační činidlo methylcobalamin vznikající jako intermediát syntézy u bakterií produkujících methan. Z tohoto důvodu vody a sedimenty, ve kterých dochází k anaerobnímu rozkladu, poskytují dobré podmínky pro vznik methylrtuti. 12 Tyto reakce jsou však vratné a demethylace bývá usnadněna mikroorganismy nebo fotolytickým rozkladem. 4

13 2.2.3 Toxicita specií Ačkoliv toxické jsou všechny specie rtuti, organické sloučeniny jsou více nebezpečné než anorganické. Díky lipofilní povaze totiž snadněji prostupují membránami a vnikají do buněk, kde mohou ovlivňovat velké množství biologických procesů. Kvantita a povaha (tj. rozpustnost, mobilita a biologická dostupnost) specií rtuti vyskytujících se ve vzorku jsou zvláště důležitými parametry, protože určují jeho celkovou toxicitu. 7 Kovová rtuť není při podání per os jedovatá, protože není absorbována střevní stěnou. 6, 13 Nicméně vdechování jejích par může být smrtelné. 15 Při inhalaci totiž neutrální atomy snadno procházejí přes membránu plic, krví jsou distribuovány po těle a překonávají i hematoencefalickou bariéru. V nervových buňkách je Hg 0 oxidována mitochondriemi na Hg +II, která se pevně váže na thiolové skupiny proteinů. 13 Výsledkem může být sterické přeuspořádání biomolekul narušující jejich funkci. Může způsobit inhibici enzymové aktivity (př. inhibice syntézy hemu), přerušení tvorby mikrotubulů, nebo přerušení syntézy bílkovin a DNA. 6 Inhalace páry rtuti může vyvolat akutní zánět průdušek, zvětšení štítné žlázy, intersticiální pneumonii, záněty dásní, hematologické změny, třes, slepotu, vrozené vady (mentální retardace s mozkovou obrnou) a psychopatologické symptomy jako plachost, paralýzu, nespavost, popudlivost nebo deprese. 6, 12, 16 Rtuť má také ototoxické účinky, neboli je toxiciká pro střední ucho, a způsobuje ireverzibilní poškození centrálního sluchového systému. 17 Anorganické soli rtuti jsou toxické i po požití, protože leptají sliznici trávicího ústrojí a poškozují ledviny. 18 Ačkoliv vysoká dávka chloridu rtuťnatého je toxická pro buňky renálních tubulů (akutní toxicita), časté nízké dávky mohou vyvolat imunologická onemocnění glomerulů (chronická toxicita). 6 Bylo také prokázáno, že sloučeniny rtuti jsou spojeny se samčí reprodukční toxicitou. Expozice Hg snižuje pohyblivost spermií a může mít škodlivé účinky na spermatogenezi a tvorbu steroidních hormonů. 19 Smrtící dávky pro sloučeniny dvojmocné rtuti se udávají v rozmezí 0,2-1,0 g per os. 5 Z organických sloučenin je nejnebezpečnější methylrtuť. Dobře se vstřebává z trávicího traktu a přibližně 90 % z celého množství požité methylrtuti je absorbováno do krve. 20 Následně je distribuována po celém těle. V krvi zůstává

14 asi 5 %, přičemž koncentrace v erytrocytech je 20krát vyšší než v plazmě. Hlavními cílovými orgány jsou periferní a centrální nervový systém a ledviny. Methylrtuť snadno překonává nejen hematoencefalickou bariéru, ale i placentu. Dochází tak k její kumulaci v mozku plodu a následkem může být 5 až 7 krát vyšší koncentrace než v krvi matky. 5 Takováto prenatální expozice může způsobit rozsáhlé poškození mozku plodu a methylrtuť se tedy řadí mezi látky teratogenní. 6 Pokud se dostane do buňky, váže se na thioskupiny biomolekul a tím narušuje jejich funkci. 13 Jakožto lipofilní látka se methylrtuť usazuje v drobných živočiších, a poté stoupá potravním řetězcem (biomagnifikace). Proto může být například ve dravých rybách až 10 5 krát vyšší koncentrace methylrtuti než v okolních vodách. 4 Tato organická sloučenina má silné bioakumulační tendence a více než 95 % rtuti nalezené ve vodních živočiších je v této formě. 20 Konzumace takto kontaminovaných potravin je hlavní expoziční cestou methylrtuti pro člověka. 6 Tragicky byla její toxicita ukázána v Minamata Bay v Japonsku v letech , kde chemická továrna vypouštěla odpady obsahující rtuť do moře. Ve vodě byla anorganická rtuť mikroorganismy přeměněna na methylrtuť, která se kumulovala v rybách. Na následnou otravu po požití kontaminovaného masa zemřelo přibližně místních obyvatel a více než dalších bylo zdravotně postiženo. 12 Protože je methylrtuť neurotoxická, její expozice se projevuje mravenčením, brněním, poruchami koordinace pohybů, nemotorností, obtížemi při polykání, špatnou artikulací, pocity slabosti, ztrátou zraku a sluchu. 6 Ethylrtuť má podobné účinky jako methylrtuť, ale na rozdíl od ní je transformace ethylrtuti na anorganickou rtuť v těle mnohem rychlejší, což vede zejména k poškození ledvin a také nižší koncentraci v mozku. 6 Akutní otrava rtutí se projeví přibližně 30 minut po požití odpornou kovovou chutí v ústech, pálením, obtížným polykáním, sliněním, bolestmi na prsou a v břiše. Při velkých dávkách může dojít již v tomto prvním stádiu ke kolapsu a smrti. Později nastupují bolesti žaludku, zvracení, průjmy, tenesmy a anurie, které trvají asi 2 dny. Následuje přechodné zlepšení trvající přibližně 1 týden, ale poté se stav opět zhoršuje a nastává smrt. V pitevních nálezech po akutních otravách se nalézají změny především v zažívacím traktu a ledvinách. V ústech, jícnu a žaludku bývá šedobílý povlak po poleptání. 5, 15

15 Mezi příznaky chronických otrav patří záněty dásní, poškození nervového systému (třes, psychické změny), poškození ledvin, merkurialismus, stomatitida, svalová atrofie, vypadávání vlasů, poruchy paměti, tremor, polyneuritida a kachexie. 5, 15, 18 močí. 5 Vylučování rtuti z těla probíhá většinou žlučí, pouze asi 10 % je eliminováno Prevence a léčba otrav V rámci prevence otrav rtutí je od roku 2006 v Evropské unii zakázáno její používání v teploměrech a dalších měřicích přístrojích. 4 The World Health Organisation (WHO) stanovila maximální přijatelnou dávku celkové rtuti na 5 g kg 1 a methylrtuti 1,6 g kg 1 za týden 4, 16 a The Enviromental Protection Agency (EPA) vymezila příjem methylrtuti na nejvýše 0,1 g kg 1 tělesné váhy pro dospělého člověka za den. 4 Kvůli značné toxicitě je nutné při zacházení se rtutí a jejími sloučeninami dávat pozor a dodržovat bezpečnost práce. Při manipulaci je potřeba pracovat v dobře větraných prostorech a v případě rozlití ji okamžitě uklidit. Aby nedocházelo k úniku toxických par, měla by být rtuť skladována v suchých, dobře větraných prostorech ve vzduchotěsných nádobách. 9 Pokud přeci jen dojde k otravě, léčebný postup by měl směřovat ke snížení koncentrace rtuti v orgánu nebo místě poranění. Podávají se chelatační činidla jako cystein, EDTA, nebo penicilamin, která se rtutí utvoří komplex a usnadní její vylučování. Nicméně chelatační terapie není moc účinná při expozici alkylovanou rtutí. U velmi vážných případů (jako je akutní renální selhání) může být použita i hemodialýza Extrakce Základním principem extrakčních metod je převod látky z jedné fáze do druhé díky různé rozpustnosti v těchto fázích. Protože se polární látky lépe rozpouštějí v polárních rozpouštědlech a nepolární v nepolárních, musí být extrahovaná látka co nejvíce podobná kapalině, do které se vyluhuje, aby extrakce byla účinnější. 21 Tato technika bývá používána za účelem separace, čištění,

16 či zakoncentrování rozpuštěné látky. 22 Extrakce kovových prvků, jako je např. rtuť, je většinou založena na jejich koplexotvorných vlastnostech. 23 Lze provádět extrakci tuhé látky kapalinou, při které se potřebná látka vyluhuje z pevné složky vhodným rozpouštědlem, nebo z kapaliny do kapaliny. Ta je založena na rozdělování látky mezi dvě navzájem nemísitelné kapaliny díky rozdílné síle interakcí mezi molekulami látky a těmito rozpouštědly. Většinou bývá jako jedna z fází použit vodný roztok a jako druhá organické rozpouštědlo Extrakce sloučenin rtuti Extrakcí specií rtuti z různých matric ve spojení s rozličnými detekčními technikami se zabývalo již několik studií. Například Sousa et al. vyvinuli extrakci sloučenin rtuti z plazmy pomocí směsi 10% (v/v) HCl, 0,05% (m/v) L-cysteinu a 0,10% (v/v) 2-merkaptoethanolu s následnou sonikací (15 minut) a stanovení vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií, generováním studené páry a hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (HPLC-CV-ICP-MS). 24 Roztok 1% (w/v) L-cysteinu HCl H2O byl jako extrakční činidlo využit také vědeckým týmem S. Hight. Oproti předchozí práci byla matricí tkáň mořských živočichů a k jejich rozkladu byla použita zvýšená teplota (60 C, 120 minut). Vychladnuté a přefiltrované vzorky byly analyzovány pomocí HPLC-ICP-MS. Nicméně bylo zjištěno, že v průběhu extrakce dochází k částečné dealkylaci spikované ethylrtuti na anorganickou rtuť. Proto přítomnost anorganické rtuti v takto připraveném vzorku znamená výskyt Hg v jiné formě než methylrtuti. Obdobně je i methylrtuť stabilní v takovémto roztoku pouze po dobu kratší než 8 h. Dealkylaci lze však minimalizovat používáním skleněných nádob a analýzou extraktů v den přípravy. 25 Extrakcí sloučenin rtuti z rybí tkáně se zabýval také Lan-Fang Chang et. al. Tentokráte vědci k extrakci použili 0,2% (v/v) 2-merkaptoethanol v 2% (v/v) methanolovém roztoku. Následně byly vzorky rozloženy v mikrovlnné troubě při 65 C po dobu 2 minut s nájezdním časem 3 minuty. Po ochlazení, centrifugaci (10 min, 3500 rpm) a filtraci (velikost pórů filtru 0,22 µm) byly vzorky stanoveny kapalinovou chromatografií spojenou s vysokoúčinným nebulizérem s přímým

17 vstřikem a hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (LC DIHEN- ICP-MS). 26 V práci Geng Leng a jeho kolegů posloužil 2-merkaptoethanol nejen jako extrakční, ale i komplexotvorné činidlo pro separaci specií, a proto jeho koncentrace ovlivňovala extrakční účinnost, retenční čas i tvar píků. Se zvyšující se koncentrací 2-merkaptoethanolu vzrostla výtěžnost extrakce specií rtuti, ale zároveň klesalo rozlišení píků Hg +II a MeHg +, které při koncentraci nad 0,5 % nebylo nadále akceptovatelné. Také teplota extrakce hrála významnou roli, protože při teplotě extrakce vyšší než 40 C docházelo k přeměně ethylrtuti na anorganickou rtuť, a také methylrtuť se rozpadala při teplotách vyšších než 80 C. Ve výsledném optimalizovaném extrakčním procesu byl ke vzorkům sedimentu přidáván 0,1% (v/v) roztok 2-merkaptoethanolu a poté následovala mikrovlnná extrakce (40 C, 8 min). Po úpravě centrifugací (3 min, 1500 rpm) a filtrací (porozita 0,22µm) byly vzorky nastříknuty na kolonu vysokoúčinné kapalinové chromatografie spojené s generováním studené páry rtuti a detekcí atomovou fluorescenční spektroskopií (HPLC VGAFS). 27 Na rozdíl od předchozích studií, López et al. použili 2-merkaptoethanol ve spojení s enzymy. Vzorky s přídavkem 0,75% (w/v) proteázy XIV a 2,5% (v/v) 2-merkaptoethanolu byly sonikovány 5 minut. Po odstranění pevných zbytků centrifugací (15 min, 7600 rpm) byl supernatant analyzován LC-ICP-MS. Výhodou je, že tato metoda je poměrně rychlá a nedochází při ní k vzájemným přeměnám mezi speciemi. 28 Množství sloučenin rtuti v přírodních vodách stanovoval R. Faltera s kolegy. Nejprve byly vzorky vod filtrovány k odstranění pevných částic a také ph bylo upraveno octanem amonným na 6,5. Pak byly specie rtuti komplexovány pyrrolidindithiokarbamátem sodným a vzorek byl zakoncentrováván na prekoncentrační koloně (průtok 2,5 ml min -1, 2 h). Následně byly sloučeniny desorbovány z kolony směsí acetonitrilu s vodou pufrovanou octanem amonným a kyselinou octovou. Obsah jednotlivých sloučenin rtuti ve vzorku byl stanoven vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií, UV post kolonovou oxidací, generováním studené páry rtuti a detekcí atomovou absorpční spektrometrií (HPLC-UV-PCO-CVAAS). 29

18 Yongguang Yin a jeho vědecký tým aplikovali alkalickou rozkladovou metodu na vzorky mořských živočichů z místního přístavu. Skleněná vialka se vzorky a 25% (w/v) roztokem KOH v methanolu byla třepána přes noc. Poté bylo přidáno 6 ml dichlormethanu a po kapkách 1,5 ml koncentrované HCl, se kterými byl vzorek centrifugován (15 min, 3000 rpm). K oddělené dichlormethanové fázi byl přidán 10 mmol l 1 thiosíran sodný a směs byla znovu třepána (45 min). Po centrifugaci a separaci byla vodná fáze použita ke speciační analýze pomocí UV-fotochemického generování, HPLC a detekcí AFS. 30 Obdobnou metodu pro extrakci sloučenin rtuti ze sedimentů použili i Ramalhosa et al. Pouze na místo třepání přes noc byla aplikována ultrazvuková lázeň po dobu 3 hodin. Také převod specií rtuti do vodné fáze nebyl proveden thiosíranem sodným, ale vypařením organické fáze probubláváním dusíkem. Obsahy jednotlivých specií rtuti ve vzorcích byly stanoveny HPLC CV-AFS. 31 Rahman s kolegou ve svém výzkumu porovnávali několik metod používaných k extrakci specií rtuti z půd. Hodnocen byl zejména potenciál přeměňovat methylrtuť na anorganickou rtuť a obráceně. Ke stanovení celkového obsahu rtuti byl použit přístroj DMA-80 (Direct Mercury Analyser), kdežto HPLC-ICP-MS sloužila ke speciační analýze. Z pěti zkoumaných metod byly pouze tři vyhodnoceny jako vhodné pro speciační analýzu, protože nepřeměňovaly specie. Zároveň však měly nižší extrakční účinnost pro anorganickou rtuť. V první z nich byla ke vzorku přidána 1,2mol l 1 HNO3 a vzorek byl sonikován při 55 C 15 minut. Následovala 5 minutová centrifugace při 3000 rpm. Další metoda využívala jako extrakční činidlo 2mol l 1 HNO3, se kterou byl vzorek vystaven mikrovlnnému záření (60 W, 4 minuty) a po filtraci byly extrakty analyzovány. Ve třetí byl vzorek spolu s roztokem 2% HCl a 10% ethanolu sonikován (60 C, 7 min) a následně centrifugován (5 min, 3200 rpm). Nejlepších výsledků bylo dosaženo s poslední zmíněnou metodou. 32 Porovnáváním různých extrakčních metod se zabýval i tým Zhaojun Yuna. Hodnocena byla extrakční účinnost 25% (m/v) hydroxidu tetramethylamonného, 25% (m/v) KOH v methanolu, 6mol l 1 HCl a roztoku KBr s CuSO4 (3:1, v/v) ve spojení s třepáním, ultrazvukovou nebo mikrovlnnou extrakcí. Specie rtuti ze vzorků ropy byly stanovovány HPLC-CV-AFS. Žádné činidlo ve spojení pouze

19 s třepáním nedosahovalo uspokojivé extrakční účinnosti. Při použití ultrazvuku byla výtěžnost extrakce MeHg + vyšší než u třepání, nicméně hodnoty pro EtHg + byly velmi nízké, což nasvědčovalo částečnému rozkladu organických sloučenin rtuti. Mikrovlnná extrakce při 30 W nebyla dostatečně silná pro vyluhování MeHg + a EtHg + z ropy, naopak při 90 W docházelo k rozpadu organických sloučenin rtuti. Co se extrakčních činidel týče, jak HCl, tak TMAH poskytovaly uspokojivé výsledky. Avšak TMAH lépe extrahoval MeHg +, a proto byl upřednostněn. Za nejvhodnější postup je autory považována mikrovlnná extrakce, při které byly vzorky spolu s TMAH vystaveny mikrovlnnému záření o výkonu 60 W po dobu 5 minut. Po ochlazení na laboratorní teplotu byla k roztoku přidána koncentrovaná HCl a dichlormethan. Takto upravený vzorek byl třepán (45 min) a centrifugován (15 min, 3000 rpm). K oddělené dichlormethanové fázi byl pipetován 10mM roztok síranu sodného a směs byla opět třepána (15 min) a centrifugována (15 min, 3000 rpm). Na závěr byla vodná fáze filtrována (0,22 µm) a takto připravený roztok byl přímo nastříknut na HPLC kolonu. 33 Také Gao a jeho kolega srovnávali čtyři výše zmíněná extrakční činidla pro uvolnění specií rtuti ovšem z odpadních kalů. Vzorek byl vždy s jedním z činidel sonikován při teplotě 70 C po dobu 30 minut. Tento krok následovalo přetřepávání do dichlormethanu a poté pomocí roztoku thiosíranu sodného zpět do vodné fáze. Vzorky byly, stejně jako v předchozím případě, analyzovány HPLC-CV-AFS. I v této studii autoři vyhodnotili TMAH za nejvhodnější extrakční činidlo. 34 Hydroxid tetramethylamonný si jako extrakční činidlo zvolil také Vidler et al. Při extrakci specií rtuti z rybí tkáně nebo vlasů byl vzorek přímo navážen do skleněného insertu a spolu s 25% roztokem TMAH vystaven mikrovlnnému záření (40 W, 4 min). Ochladlý roztok byl neutralizován kyselinou octovou, centrifugován (5 min, rpm), filtrován (0,45µm) a stanovován HPLC-ICP-MS. 35 Metodou kapilární plynové chromatografie spojené s atomovým fluorescenčním detektorem přes pyrolýzu (GC-pyro-AFS) byly stanovovány sloučeniny rtuti extrahované z referenčních materiálů rybí tkáně ve výzkumu autora Nevado a jeho kolegů. Vzorek s přídavkem 25% TMAH byl vystaven

20 mikrovlnnému záření (krok 1: ohřev z laboratorní teploty na 180 C, 10 min; krok 2: 180 C, 10 min). Po proběhnutí programu a ochladnutí byly specie rtuti derivatizovány, aby vyhovovaly potřebám GC. Tento typ extrakce dle autorů nepozměňuje chemickou formu rtuti. 36 Hintelmann a jeho výzkumný tým spikovali izotopy obohacenými speciemi rtuti různé druhy vzorků. Výsledky ukázaly, že mnoho technik běžně používaných k izolaci sloučenin rtuti vytváří dodatečnou MeHg + z anorganických iontů Hg +II přítomných ve vzorku. První zkoumaná extrakce byla 5mol l 1 HCl, se kterou byl vzorek třepán 2 hodiny. Poté byly specie převedeny do toluenu, zakoncentrovány na vakuové odparce (45 C) a převedeny do 1mmol l 1 thiosíranu sodného. Na závěr bylo upraveno ph na 5,5 a vzorek byl nastříknut do HPLC-ICP-MS. V průběhu extrakce docházelo ke konverzi specií pouze při spikování izotopů přímo do vzorku sedimentu. Pokud byl vzorek obohacen až po separaci kyseliny od tuhých zbytků, nebyla pozorována žádná přeměna a dodatečná methylace je tedy pravděpodobně spojena s pevnými částicemi sedimentu. Dále byla zkoumána extrakce za zvýšené teploty (4 h, 60 C) s 20% (v/v) TMAH. Tato extrakce způsobovala největší přeměnu anorganické rtuti na methylruť (1,7-4,3 % označených specií). U vzorků sedimentů a půd, kde jsou koncentrace MeHg + všeobecně nízké může vést takováto dodatečná přeměna ke značným chybám. Naopak rybí tkáň a podobné vzorky jsou méně problematické kvůli relativně nízkému poměru Hg +II a MeHg +, tudíž vzniklá chyba je prakticky zanedbatelná Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Princip chromatografické separace látek spočívá v distribuci složek směsi mezi dvě navzájem nemísitelné fáze, přičemž jedna z nich se pohybuje (mobilní fáze) a druhá ne (stacionární fáze). 38 Molekuly různých analytů mají rozdílnou afinitu ke stacionární fázi a při průchodu kolonou s ní opakovaně interagují, čímž jsou opožďovány oproti mobilní fázi. 39 Látky, které se váží silněji na stacionární fází, se kolonou pohybují pomaleji než látky s interakcemi slabšími. 38 Stacionární fáze je buď pevný, porózní, povrchově aktivní materiál ve formě malých částic, anebo slabé vrstvy kapaliny nanesené na pevný nosič či stěnu

21 kolony. 40 Při HPLC analýzách se používají krátké kolony naplněné malými částicemi a mobilní fáze je čerpána pod vysokým tlakem. 41 HPLC s reverzní fází (RP-HPLC) je jedním z nejčastěji používaných typů chromatografie. Při separaci látek využívá především disperzních sil (hydrofobní nebo van der Waalsovy interakce), které jsou jedny z nejslabších mezimolekulárních sil, a díky tomu je možné oddělit i strukturně velmi podobné sloučeniny. 39 V této metodě je stacionární fáze hydrofobní a bývá tvořena polymerním materiálem nebo řetězcem, nejběžněji oktadecylem či oktylem, chemicky navázaným na silikagel. Naopak mobilní fáze je polární, a proto se nejčastěji používají směsi organických rozpouštědel (např. acetonitril, methanol, isopropanol) s vodou či pufrem v různém poměru. 42 Doba, kterou stráví analyt v koloně, se nazývá retenční čas (tr). Jedná se o čas charakteristický pro danou látku za daných experimentálních podmínek a slouží k její identifikaci při chromatografické analýze. 38 Plocha píku (S) odpovídá množství analytu ve vzorku a používá se ke kvantitativním výpočtům UV-fotochemické generování Základním principem UV-fotochemického generování je přeměna netěkavého prekurzoru (specií rtuti) v přítomnosti nízkomolekulární karboxylové kyseliny (mravenčí, octová, propionová a malonová), alkoholu (methanol), aldehydu (formaldehyd, acetaldehyd) nebo 2-merkaptoethanolu vlivem UV záření na těkavou sloučeninu (monoatomickou studenou páru Hg 0 ). 43 Reakční mechanismus UV-fotochemického generování není ještě zcela objasněn a doposud vzniklé teorie se podstatně liší. Guo et al. navrhují radikálový mechanismus, podle kterého by organické kyseliny podstupovaly dvě rozdílné cesty (reakce 1 a 2) za tvorby uhlovodíků, CO2, CO a H2, přičemž v průběhu reakce by vznikaly hydroxylové a karbonylové radikály redukující analyt. Při použití kyseliny octové by reakce 2 byla méně častá. 44 (1) (2)

22 Han a jeho výzkumný tým souhlasí s výše uvedenými rovnicemi, nicméně zastávají teorii, že Hg +II je redukována na Hg 0 vznikajícím H2 nebo CO (v případě kyseliny mravenčí). 43 Su et al. se zabývali fotodisociací kyseliny mravenčí a zjistili, že tvorba H2O a CO je energeticky preferována spíše než tvorba radikálů. 45 Na tomto základě postavil Bendl s kolegy teorii, že při UV-fotochemickém generování nedochází vůbec k radikálové reakci, ale ke vzniku ketenu CH2CO (při použití kyseliny octové), který poté redukuje analyt. 46 (3) Radikálový mechanismus byl také navržen při použití 2-merkaptoethanolu a je zobrazen na Obr merkaptoethanol (4), který ve své molekule obsahuje jak hydroxylovou, tak merkapto skupinu, tvoří po ozáření UV světlem radikál HOĊHCH2SH (5). Následně se elektron z atomu uhlíku přesune intramolekulárním přesmykem na atom síry za vzniku HOCH2CH2Ṡ radikálu, který redukuje Hg +II a sám je přeměněn na HOOCCH2Ṡ radikál (6). Na závěr se výsledné radikály rekombinují na HOCH2CH2S-SCH2COOH (7) nebo intermolekulární esterifikací na cyklický disulfid ester(8). 47 Obr. 1 Mechanismus UV-generování studené páry rtuti při použití 2-merkaptoethanolu 47 Na rozdíl od chemického generování, kde přechodné kovy (Ni, Co, Cu) interferují s redukčním činidlem nebo katalyticky rozkládají hydrid analytu na svém povrchu, nečiní jejich přítomnost při UV-fotochemickém generování žádné problémy. Také odpadá potřeba redukčního činidla NaBH4 (popř. SnCl2), jehož vodné roztoky jsou nestabilní a bývají častým zdrojem kontaminace. 48

23 Atomová absorpční spektrometrie Při atomové absorpční spektrometrii je záření určité vlnové délky (energie) absorbováno volnými atomy sledovaného prvku v základním stavu, které jsou tímto excitovány. Intenzita záření prošlého prostorem s analytem je proto nižší než intenzita záření vstupujícího. Energetická hodnota fotonů je charakteristická pro daný prvek a výsledná absorbance odpovídá množství stanovovaných atomů. 49 Tenze páry rtuti za laboratorní teploty je natolik vysoká, že umožňuje stanovení rtuti v detekční trubici bez zahřívání, zatímco ostatní těkavé sloučeniny generované UV-fotochemicky, elektrochemicky nebo čistě chemicky je nutno nejprve atomizovat za použití teplot vyšších než 900 C.

24 Experimentální část 3.1 Použité přístroje a příslušenství V experimentální části práce byly použity tyto přístroje a příslušenství: UHPLC sestava RS 3000 (Dionex, USA) kolona s reverzní fází Gemini (C18, 110 Å, 3 μm, 150 x 2,4 mm, Phenomenex, USA) Fotoreaktor se skládal z: nízkotlaké rtuťové zářivky (výkon: 20 W, pracovní vlnová délka: 253,7 nm, Ushio, Japonsko), PTFE hadičky (délka: 1 m, Supelco, Německo) a zdroje napětí Modus SB 118 (Modus, Česká republika) atomový absorpční spektrometr Varian SpectrAA-300A (Varian, Austrálie) rtuťová výbojka s dutou katodou (napájecí proud: 4 ma, pracovní vlnová délka: 253,7 nm, šířka spektrálního intervalu: 0,5 nm, Varian, Austrálie) křemenná detekční trubice ve tvaru písmene T spojená se separátorem fází s nuceným odtahem odporové vyhřívání (napájecí proud: 2A, Statron, Německo) průtokoměr (Cole-Parmer, USA) peristaltická pumpa Materflex (Cole-Parmer, USA) HPLC pumpa LKB 2150 (Bromma, Švédsko) injekční stříkačka (objem: 10 ml, Hamilton, USA) dávkovací smyčka (objem: 100 μl, Rheodyne, USA) dávkovací ventil 9725i (Rheodyne, USA) TYGON hadičky různých průměrů MDS-2000 (CEM, USA) stolní centrifuga (Chirana, Česká Republika) filtry (FP 30/0,2 CA S; 0,2 μm, max 7 bar, Whatman,Velká Británie) Analytické váhy RC 210D (Sartorius, USA) 3.2 Použité chemikálie Zásobní roztok standardu specie rozpuštěné v deionizované vodě: chlorid rtuťnatý (Sigma-Aldrich, USA)

25 Zásobní roztoky standardů jednotlivých specií rozpuštěných v ethanolu: chlorid methylrtuťný (Sigma-Aldrich, USA) chlorid ethylrtuťný (Supelco, Německo) chlorid fenylrtuťný (Supelco, Německo) K extrakci a přípravě extrakčních činidel byla použita: kyselina chlorovodíková (37%, Merck, Německo) 2-merkaptoethanol (Sigma-Aldrich, USA) thioglykolová kyselina (Merck, Německo) pyrrolidindithiokarbamát sodný (Sigma-Aldrich, USA) hydroxid draselný (Lech-Ner, Česká republika) L-cystein (L-cystein hydrochlorid monohydrát, čistota: více jak 98%, Sigma-Aldrich, USA) bromid draselný (Chemopol, Česká republika) síran měďnatý (Biogema, Slovensko) hydroxid tetramethylamonný (25%, Sigma-Aldrich, USA) dichlormethan (čistota: více jak 99,8%, Sigma-Aldrich, USA) methanol (čistota: více jak 99,9%, Sigma-Aldrich, USA) Mobilní fáze se skládala z: ethanol (Merck, Německo) 2-merkaptoethanol (Sigma-Aldrich, USA) kyselina octová (Sigma-Aldrich, USA) octan sodný (Sigma-Aldrich, USA) Další chemikálie: argon (čistota: 99,998%, Linde Technoplyn, Česká republika) kyselina dusičná (65%, Merck, Německo) k čištění insertů acetonitril (čistota: více jak 99,9%, Sigma-Aldrich, USA) k uchovávání kolony 18,2 MΩ cm deionizovaná voda z přístroje Milli QPLUS (Millipore, USA)

26 Aparatura Schéma použité aparatury je uvedeno na Obr. 2. Mobilní fáze byla čerpána pumpou, jež je součástí UHPLC sestavy. Po nadávkování vzorku dávkovací smyčkou do toku mobilní fáze byly specie rtuti separovány RP-HPLC kolonou vyhřívanou na 40 C. Ve fotoreaktoru pak byly sloučeniny v prostředí kyseliny octové a 2-merkaptoethanolu vlivem UV-záření přeměňovány na elementární rtuť. Ta se po vytěkání z roztoku stala tzv. studenou párou rtuti, která byla detekována AAS. Fotoreaktor byl sestaven z nízkotlaké rtuťové zářivky a kolem ní těsně omotané PTFE hadičky. Před UV-generátor byl zapojen přívod nosného plynu argonu, který unášel reakční směs do separátoru fází. Odtud byla plynná fáze odváděna do detekční trubice a kapalná fáze odčerpávána další peristaltickou pumpou do odpadu. Detekční trubice byla odporově vyhřívána na přibližně 100 C, aby se zamezilo sorpci rtuti při kondenzaci vodní páry. Obr. 2 Schéma aparatury pro speciační analýzu rtuti pomocí RP-HPLC-UV-CVG- QTAAS 1 - mobilní fáze, 2 - UHPLC pumpa, 3 - dávkovací smyčka, 4 - odpad, 5 - vyhřívaná RP- HPLC kolona, 6 - průtokoměr, 7 - argon, 8 - UV-fotochemický generátor, 9 - separátor fází, 10 - odporové vyhřívání, 11 - detekční trubice, 12 - peristaltická pumpa

27 Pro měření metodou FIA byla použita stejná aparatura, pouze bez zapojení HPLC kolony. 3.4 Experimentální podmínky Optimalizací experimentálních podmínek pro speciační analýzu sloučenin rtuti pomocí RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS se ve své diplomové práci zabýval Mgr. Ondřej Linhart, viz Tab. 1 a Tab. 2. V předkládané diplomové práci byly jím zjištěné optimální experimentální podmínky aplikovány na všechna měření. Tab. 1 Složení mobilní fáze 2 Složka Hodnota ethanol 40 % (v/v) 2-merkaptoethanol 0,1 % (v/v) octanový pufr CH3COOH/CH3COONa 20/20 mmol l 1 Tab. 2 Optimalizované experimentální podmínky pro speciační analýzu rtuti pomocí RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS 2 Parametr Hodnota Průtoková rychlost mobilní fáze 0,5 ml min 1 Dávkovaný objem 100 µl Teplota kolony 40 C Průtoková rychlost nosného plynu 85 ml min 1 Délka reaktoru 1 m Teplota detekční trubice 100 C Vlnová délka (generování i detekce) 253,7 nm Šířka spektrálního intervalu 0,5 nm Napájecí proud výbojky s dutou katodou 4 ma

28 Výsledky a diskuze Výběr vhodného extrakčního činidla Na základě literární rešerše bylo zvoleno a následně testováno několik extrakčních činidel. Při výběru vhodného extrakčního činidla byl kladen důraz zejména na to, aby činidlo mělo dostatečně vysokou extrakční účinnost, nepřeměňovalo specie na jiné a nebránilo ani separaci, ani UV-generování, které je velmi náchylné na interference. Při experimentech byla vždy provedena tři měření a ze získaných chromatogramů byly získány uváděné výsledky jako medián a výběrová směrodatná odchylka. Extrakce kyselinou chlorovodíkovou a ethanolem Nejprve byla zkoumána extrakce specií rtuti směsí kyseliny chlorovodíkové a ethanolu. Do odměrné baňky obsahující vždy pouze jednu z vybraných specií o koncentraci 200 ppb bylo přidáno 7,5 ml směsi 2% (v/v) kyseliny chlorovodíkové s 10% (v/v) ethanolem. Takto připravené roztoky byly vloženy do ultrazvuku na 7 minut. Po uplynutí této doby bylo pomocí NaOH o koncentraci 2 mol l 1 upraveno ph na 6 a odměrná baňka byla doplněna mobilní fází na daný objem. Na Obr. 3 jsou uvedeny chromatogramy vzorků jednotlivých specií po extrakci v porovnání s chromatogramy specií v základním vzorku (standard dané specie o stejné koncentraci pouze v mobilní fázi). Při této extrakci došlo u Hg +II, MeHg + a EtHg + k mírnému zvýšení signálu oproti základnímu vzorku, naopak u PhHg + k poklesu. Nicméně všechny organické sloučeniny rtuti byly v průběhu procesu částečně přeměněny na Hg +II (tr= 270 s). Zmíněná konverze je nejvíce patrná u fenylrtuti, kde došlo k velkému nárůstu signálu v daném retenčním čase, a i neznámé specie rtuti (pravděpodobně nečistoty obsahující rtuť) byly přeměněny. Tento způsob extrakce mění poměr mezi jednotlivými sloučeninami rtuti, a proto není vhodný pro speciační analýzu rtuti.

29 Obr. 3 Chromatogramy standardů Hg +II, MeHg +, EtHg + a PhHg + po extrakci směsí kyseliny chlorovodíkové s ethanolem, ultrazvuku a úpravě ph NaOH (červeně) v porovnání s chromatogramy základních vzorků jednotlivých specií (zeleně) vzorek: 200 ppb dané specie + 7,5 ml 2% (v/v) HCl a 10% (v/v) EtOH + 2 mol l 1 NaOH + mf, ph= 6; základní vzorek: 200 ppb dané specie + mf; mf: cetoh= 40 % (v/v), c2me= 0,1 % (v/v), cp= 20 mmol l 1 ; Vd= 100 µl, var= 85 ml min 1, vmf= 0,5 ml l 1, l=1 m, tk= 40 C, td= 100 C Mikrovlnná extrakce 2-merkaptoethanolem Dále byla zkoumána mikrovlnná extrakce 2-merkaptoethanolem. Ke standardu každé specie o koncentraci 200 ppb byly přidány 3 ml 0,1% (v/v) 2-merkaptoethanolu a následně byl spuštěn přednastavený program mikrovlnné extrakce (60 W po dobu 8 minut s limitem tlaku 276 kpa). Vychladlé vzorky byly analyzovány a porovnány se základními vzorky stejné koncentrace (Obr. 4). Nicméně i při tomto extrakčním procesu byly organické formy rtuti převedeny na anorganickou rtuť. Rozklad je nejvíce patrný u EtHg +, naopak fenylrtuť, která se významně přeměňovala působením prvního testovaného extrakčního činidla, se rozpadala minimálně. Tato extrakce není vhodná pro speciační analýzu rtuti, protože stejně jako výše uvedená mění poměr mezi jednotlivými speciemi.

30 Z důvodu menší časové náročnosti, nižší spotřeby roztoků a zejména vyhnutí se případnému poškození kolony byla ostatní činidla nejprve testována metodou FIA. Obr. 4 Chromatogramy standardů jednotlivých specií po mikrovlnné extrakci 2-merkaptoethanolem (červeně) ve srovnání s chromatogramy jejich základních vzorků (zeleně). vzorek: 200 ppb dané specie + 3 ml 0,1% (v/v) 2-merkaptoethanolu + mf; základní vzorek: 200 ppb dané specie + mf; mf: cetoh= 40 % (v/v), c2me= 0,1 % (v/v), cp= 20 mmol l 1 ; Vd= 100 µl, var= 85 ml min 1, vmf= 0,5 ml l 1, l=1 m, tk= 40 C, td= 100 C Extrakce hydroxidem draselným (v methanolu) s následným vytřepáním do dichlormethanu Extrakční činidlo bylo vytvořeno rozpuštěním hydroxidu draselného v methanolu za vzniku jeho 25% (m/v) roztoku. Každý standard specie rtuti

31 o koncentraci 200 ppb byl třepán s 2 ml extrakční směsi po dobu 3 hodin. Aby při dalším kroku sloučeniny snáze přešly do organické fáze, bylo po kapkách přidáno 1,5 ml koncentrované HCl a poté 6 ml dichlormethanu. Vzniklý roztok byl 45 minut ultrazvukován. Na závěr byly obě fáze separovány pomocí dělicí nálevky a podrobeny stanovení rtuti. Protože vodná fáze obsahovala krystalky KOH, byl roztok před nástřikem filtrován (FP 30/0,2 CA S; 0,2 μm), aby se zabránilo poškození kolony. FIAgram Hg +II ve vodné nebo dichlormethanové fázi v porovnání se základním vzorkem je uveden na Obr. 5. Obr. 5 FIAgram Hg +II po extrakci roztokem KOH v methanolu, okyselení HCl a vytřepáním do CH2Cl2 (červeně), zbylé vodné fáze (modře) a základního vzorku (zeleně). vzorek: 200 ppb dané specie + 2 ml 25% (v/v) KOH v methanolu + 1,5 ml HCl + 6 ml CH2Cl2 + mf; základní vzorek: 200 ppb dané specie + mf; mf: cetoh= 40 % (v/v), c2me= 0,1 % (v/v), cp= 20 mmol l 1 ; Vd= 100 µl, var= 85 ml min 1, vmf= 0,5 ml l 1, l=1 m, tk= 40 C, td= 100 C Po této extrakci docházelo nejen ke značnému snížení signálu oproti základním vzorkům, ale navíc i k potlačení signálu uprostřed zóny analytu až téměř na základní linii. K ověření, zda stanovení není rušeno vysokou koncentrací Cl, byla extrakce zopakována a k okyselení roztoku byla namísto HCl

32 použita H2SO4. FIAgram je uveden na Obr. 6. Ačkoli byl signál vlivem činidla značně snížen, nedošlo k rozštěpení zóny analytu. Pokles signálu uprostřed zóny analytu po první extrakci lze tedy vysvětlit jako interferenci Cl. Vlivem naředění byla na krajích zóny analytu koncentrace Cl nižší, tedy i rušivý vliv zde byl slabší, a proto byl pozorován nárůst signálu. Naopak vyšší koncentrace Cl uprostřed zóny analytu potlačovala signál téměř až na základní linii. Ačkoliv se lze okyselením roztoku pomocí H2SO4 vyhnout interferencím, je tento postup až příliš časově a materiálově náročný. Také extrakční účinnost není uspokojivá, a proto byla i tato extrakční metoda vyhodnocena jako nevhodná. Obr. 6 FIAgram Hg +II po extrakci KOH (v methanolu), okyselení H2SO4 s následným vytřepáním do CH2Cl2 (červeně), zbylá vodná fáze (modře), základní vzorek (zeleně) vzorek: 200 ppb dané specie + 2 ml 25% (v/v) KOH v methanolu + 1,5 ml H2SO4 + 6 ml CH2Cl2 + mf; základní vzorek: 200 ppb dané specie + mf; mf: cetoh= 40 % (v/v), c2me= 0,1 % (v/v), cp= 20 mmol l 1 ; Vd= 100 µl, var= 85 ml min 1, vmf= 0,5 ml l 1, l=1 m, tk= 40 C, td= 100 C Vliv koncentrace HCl na stanovení Z výše uvedených důvodů byl zkoumán vliv koncentrace Cl na analýzu. Graf závislosti velikosti signálu jednotlivých specií na koncentraci HCl je uveden

33 na Obr. 7. Absorbance i plocha píku se zvětšují s rostoucí koncentrací kyseliny až do 0,05 mol l 1. Při přesáhnutí této hranice dochází ke snížení signálu a jeho rozštěpení. Obr. 7 Závislost absorbance jednotlivých specií na koncentraci kyseliny chlorovodíkové vzorek: 200 ppb dané specie + HCl o dané koncentraci+ mf; mf: cetoh= 40 % (v/v), c2me= 0,1 % (v/v), cp= 20 mmol l 1 ; Vd= 100 µl, var= 85 ml min 1, vmf= 0,5 ml l 1, l=1 m, tk= 40 C, td= 100 C Byl také změřen vliv 0,05 mol l 1 HCl na separaci směsi vybraných specií. Kyselina byla postupně přidána do vzorku, do mobilní fáze a do vzorku i mobilní fáze (Obr. 8). Přídavek HCl pouze do mobilní fáze zvýšil signál Hg +II a MeHg +, kdežto signál EtHg + byl nižší oproti základním vzorkům a mohlo tedy dojít

34 k přeměně specie. HCl pouze ve vzorku nebo vzorku i mobilní fázi mírně zvyšovala signál a zužovala píky. Nicméně z důvodu relativně vysoké ceny velmi čisté HCl byla kyselina v dalších experimentech přidávána pouze ke vzorku. Obr. 8 Chromatogramy přídavku 0,05 HCl mol l 1 do vzorku (červeně), mobilní fáze (žlutě), nebo do vzorku i mobilní fáze (modře) ke směsi specií rtuti. vzorek: směs 200 ppb každé specie (+ 0,05 mol l -1 HCl); základní vzorek: 200 ppb dané specie + mf; mf: cetoh= 40 % (v/v), c2me= 0,1 % (v/v), cp= 20 mmol l 1, (0,05 mol l 1 HCl); Vd= 100 µl, var= 85 ml min 1, vmf= 0,5 ml l 1, l=1 m, tk= 40 C, td= 100 C Extrakce CuSO4, KBr a vytřepání do dichlormethanu Extrakční činidlo vzniklo smícháním roztoků CuSO4 a KBr v poměru 1:3. První byl připraven z 6,25 g CuSO4 rozpuštěných v destilované vodě, druhý ze 4,5 g KBr a 1,25 ml H2SO4 v destilované vodě. Nicméně při smíchání činidla s mobilní fází se tvořily drobné modré a žluté krystalky, jejichž množství s přibývajícím objemem mobilní fáze rostlo. Krystalky by mohly poškodit kolonu, a proto žádné další experimenty s tímto činidlem nebyly provedeny.

35 Extrakce za zvýšené teploty L-cysteinem Standardy specií rtuti o koncentraci 300 ppb byly spolu s 5 ml 0,2% (m/v) roztoku L-cysteinu vařeny 2 hodiny při teplotě C a vychladlé roztoky pak byly analyzovány. Obr. 9 ukazuje naměřené závislosti a opět nabízí porovnání se základními vzorky. Po extrakci se plochy píků vzorku oproti základnímu vzorku podstatně zmenšily. Pravděpodobně dochází k tvorbě příliš silné vazby L-cysteinu se rtutí, kterou není možno UV-zářením rozpojit, a proto není L-cystein vhodným extrakčním činidlem pro speciační analýzu ve spojení s RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS. Obr. 9 FIAgramy standardů jednotlivých specií po extrakci L-cysteinem za zvýšené teploty (červeně) ve srovnání s jejich základními vzorky (zeleně). vzorek: 200 ppb dané specie + 5 ml 0,2% (m/v) L-cystein + mf; základní vzorek: 200 ppb dané specie + mf; mf: cetoh= 40 % (v/v), c2me= 0,1 % (v/v), cp= 20 mmol l 1 ; Vd= 100 µl, var= 85 ml min 1, vmf= 0,5 ml l 1, l=1 m, tk= 40 C, td= 100 C Extrakce za zvýšené teploty 2-merkaptoethanolem Postup přípravy vzorků byl stejný jako v předchozím případě, pouze namístol-cysteinu byl přidán 0,2% (v/v) roztok 2-merkaptoethanolu. Hodnoty naměřené po extrakci byly opět nižší oproti základním vzorkům, a to zejména u methylrtuti (Obr. 10). Jak již bylo popsáno v teoretické části, pokud je 2-merkaptoethanol použit jako extrakční a komplexotvorné činidlo zároveň,

36 ovlivňuje extrakční i separační proces. Mgr. Ondřej Linhart zjistil, že při koncentracích vyšších než 0,1 % (v/v) 2-merkaptoethanolu dochází ke snížení signálu. 2 V diskutovaném experimentu byl použit 0,2% (v/v) pro extrakci a 0,1% (v/v) 2-merkaptoethanol v mobilní fázi, tudíž výsledná koncentrace byla příliš vysoká. 2-merkaptoethanol by mohl sloužit jako extrakční činidlo ve spojení s RP-HPLC-UV-CVG-QTAAS, pokud by byl použit ve velmi nízkých koncentracích, avšak ty by pravděpodobně nedostačovaly na vyluhování všech specií rtuti z reálného vzorku rybí tkáně. Obr. 10 FIAgramy standardů každé specie po extrakci 2-merkaptoethanolem (červeně) porovnané s jejich základními vzorky (zeleně) vzorek: 200 ppb dané specie + 5 ml 0,2% (v/v) 2ME + mf; základní vzorek: 200 ppb dané specie + mf; mf: cetoh= 40 % (v/v), c2me= 0,1 % (v/v), cp= 20 mmol l 1 ; Vd= 100 µl, var= 85 ml min 1, vmf= 0,5 ml l 1, l=1 m, tk= 40 C, td= 100 C Extrakce za zvýšené teploty pyrrolidindithiokarbamátem sodným Ke standardům jednotlivých specií o koncentraci 200 ppb bylo přidáno 5 ml 0,2% (m/v) roztoku pyrrolidindithiokarbamátu sodného. Další postup přípravy vzorků byl stejný jako u extrakce L-cysteinem. Ačkoli naměřené hodnoty byly v případě MeHg + a EtHg + vyšší než pro základní vzorky, signál Hg +II byl snížen a u PhHg + byl potlačen téměř až na základní linii. Pyrrolidindithiokarbamát sodný by mohl s touto specií tvořit pevný komplex, který, stejně jako u L-cysteinu, není