Mendelova univerzita v Brně. Agronomická fakulta. Ústav chemie a technologie potravin

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a technologie potravin Využití NIR spektroskopie při kontrole jakosti kondenzovaného mléka Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Táňa Luţová Vypracovala: Bc. Ivana Štulpová Brno 2011

2

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci na téma Vyuţití NIR spektroskopie při kontrole jakosti kondenzovaného mléka vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v seznamu pouţité literatury. Diplomová práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům pouze se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. Dne Podpis studenta

4 PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych poděkovat Ing. Táni Luţové za pomoc při vypracování diplomové práce, za její odborné rady a konzultace, které mi poskytla.

5 ABSTRAKT Diplomová se zabývá vyuţitím NIR spektroskopie ke kontrole jakosti slazeného kondenzovaného mléka. Jakost vzorků byla hodnocena na základě stanovení titrační kyselosti, ph a obsahu sušiny. Blízká infračervená spektroskopie je nedestruktivní analytická metoda, která se po řadu let široce uplatňuje v potravinářském a krmivářském průmyslu a obecně v průmyslu zpracování rostlinných a ţivočišných produktů. V teoretické části práce je uvedena historie vzniku této metody, princip, technika měření spekter, aplikační rozsah, ale i praktické vyuţití blízké infračervené spektroskopie. Zajímavou částí práce je téţ popis spektroskopického softwaru TQ Analyst. Následující část práce je věnována problematice zahuštěných mléčných výrobků. Jsou zde zmiňovány poţadavky na jakost mléka pro výrobu kondenzovaných mlék, technologie výroby a vady těchto výrobků. Praktická část popisuje měření vzorků, jak pomocí referenčních metod, tak spektrometrem Nicolet FT NIR Antaris ve spektrálním rozsahu cm -1. Ke statistickému vyhodnocení byl pouţit párový T-test. Z výsledků vyplývá, ţe NIR spektroskopie je vhodnou metodou pro hodnocení jakosti kondenzovaného mléka. Klíčová slova: NIR spektroskopie, slazené kondenzované mléko, spektroskopický software TQ Analyst, metoda částečných nejmenších čtverců

6 ABSTRACT This thesis focuses on the utilization of NIR spectroscopy for a quality control of sweetened condensed milk. The quality of the samples was evaluated on the basis of titrable acidity, ph and solids content. Near infrared spectroscopy is non-destructive analytical method which has been applied in food and feed industry and generally in plant and animal products processing for many years. In the theoretical part of this study, the history and the development of this method, principles, spectrum measuring technique, extent of application but also the practical utilization of infrared spectroscopy are introduced. The description of spectroscopic software TQ Analyst is also a very interesting part of this thesis. The following part of the study concentrates on the questions of concentrated milk products. Furthermore, the requirements regarding the quality of milk for condensed milk production, production techniques and the flaws of these techniques are pointed out. The practical part of this study investigates the measuring of the samples by means of reference method as well as spectrometer Nicolet FT NIR Antaris in the spectrum extent cm -1. Paired T-test was used for statistical evaluation. The results imply that NIR spectroscopy is a suitable method for assessing the quality of condensed milk. Key words: NIR spectroscopy, sweetened condensed milk, spectroscopic software TQ Analyst, partial least squares

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Infračervená spektroskopie Blízká infračervená spektroskopie Historie Nástin teorie NIR spektroskopie Princip Technika měření NIR spekter Chemometrické metody pro NIR spektroskopii Aplikační rozsah NIR spektroskopie Programové vybavení FT NIR Antaris Software pro měření vzorků Software pro tvorbu kalibračních modelů TQ Analyst Kvantitativní analýza Aplikace NIR spektroskopie v průmyslu a jiných odvětvích Aplikace NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu Tekuté mléko Zahuštěné a sušené mléko Sýry a tvarohy Ostatní mlékárenské výrobky Zahuštěné mléčné výrobky Poţadavky na jakost mléka Hodnocení mikrobiální jakosti mléka a mléčných výrobků Technologie výroby zahuštěného slazeného mléka Vady slazeného kondenzovaného mléka... 39

8 Vady mikrobiálního původu Vady fyzikálně chemického původu Sortiment zahuštěných mléčných výrobků Zahuštěná mléka neslazená Zahuštěná mléka slazená MATERIÁL A METODIKA Referenční metody (dle ČSN ) Stanovení sušiny Stanovení obsahu tuku - Acidobutyrometrická (Gerberova) metoda Stanovení titrační kyselosti Stanovení ph Spektrometrické stanovení VÝSLEDKY A DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK... 64

9 ÚVOD 1 ÚVOD Zvyšující se poptávka po zlepšení kvality výrobků a racionalizaci výroby v chemickém, petrochemickém, farmaceutickém, kosmetickém a potravinářském odvětví i zemědělských provozech vedla k postupnému nahrazování časově náročných konzervativních analytických technik (GC, HPLC, NMR, MS) více specifickými a k ţivotnímu prostředí šetrnějšími analytickými metodami. V důsledku toho dochází k rozvoji optických metod, ať uţ se jedná o blízkou, střední či Ramanovu spektroskopii. V posledních letech se tyto techniky objevují společně s vyuţitím vláknové optiky či on-line sondy (SIESLER, 2002). Spektroskopie v NIR oblasti nachází v potravinářském průmyslu a zemědělství významné vyuţití. Tato metoda je pouţívána především pro stanovení hlavních sloţek, tj. sušiny, bílkovin, tuku a sacharidů. Aplikace NIR spektroskopie je však mnohem širší a zahrnuje i stanovení senzorických a fyzikálně-chemických parametrů (hustota, bod tuhnutí, ph, velikost částic). Úspěšnost při vyuţití NIR spektroskopie závisí nejen na kvalitě přístroje a jeho konstrukci, ale také na referenční metodě, standardní přípravě vzorku, jeho homogenitě a v neposlední řadě na kalibrační metodě (DRAČKOVÁ, 2005). Zdraví lidské populace je ovlivňováno kvalitou potravin, která je v přímé souvislosti s jakostí surovin a pouţitou technologií výroby. Je velice důleţité, aby potraviny byly zdravotně nezávadné a odpovídaly deklarovanému sloţení (TRILČOVÁ, 2005). Zahuštěné mléčné výrobky se vyznačují vyšším obsahem sušiny a relativně dlouhou dobou trvanlivosti. Ochrana před neţádoucí činností mikroorganismů je zajištěna buď vytvořením hypertonického prostředí přídavkem cukru, nebo sterilací finálního produktu (SIMEONOVOVÁ et al., 2003). 9

10 CÍL PRÁCE 2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo prostudovat dostupnou literaturu o vyuţití NIR spektroskopie v mlékárenství, o kontrole jakosti mléčných výrobků, především pak kondenzovaného mléka. Na toto téma byla vypracována literární rešerše. Dále bylo náplní práce stanovit jakostní parametry, tj. titrační kyselost, ph a obsah tuku a sušiny u vzorků slazeného kondenzovaného mléka za pouţití referenčních metod a spektrometru Nicolet FT Antaris. 10

11 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Infračervená spektroskopie Podstatou infračervené spektroskopie je interakce infračerveného záření se studovanou hmotou, kdy v případě pohlcení fotonu studovanou hmotou mluvíme o absorpční infračervené spektroskopii a v případě vyzáření fotonu o emisní infračervené spektroskopii. Infračerveným zářením rozumíme elektromagnetické záření v rozsahu vlnočtů aţ 20 cm -1 a vlnových délek 800 nm aţ 0,5 mm. Nejpouţívanější jednotkou v infračervené spektroskopii je vlnočet, který je svázán s vlnovou délkou vztahem v = 1/λ a s frekvencí v = ν/c. Infračervené záření tedy navazuje na záření viditelné na jedné straně a na záření mikrovlnné na straně druhé. Podle vţité konvence dělíme infračervenou spektroskopii z praktických důvodů podle vlnových délek záření na dalekou (FIR z angl. far infrared), střední (MIR z angl. middle infrared) a blízkou (NIR z angl. near infrared) (KANIA, 2007). Rozsah vlnových délek jednotlivých oblastí infračervené spektroskopie je následující: - daleká infračervená spektroskopie ( cm -1 ) - střední infračervená spektroskopie ( cm -1 ) - blízká infračervená spektroskopie ( cm -1 ) (KLUČÁKOVÁ, 2004) Energie fotonů infračerveného záření (1 60 kj/mol) nepostačuje pro excitaci elektronů v molekulových orbitalech, ale je dostatečná ke změně vibračního či rotačního stavu molekuly. Získané hodnoty vibračních energií souvisí s pevností chemických vazeb a také s molekulovou geometrií a hmotnostmi jader, tedy s molekulovou strukturou. Tyto skutečnosti předurčují infračervenou spektroskopii jako vynikající experimentální techniku, která vedle kvantitativní a kvalitativní analýzy hraje důleţitou roli při výzkumu molekulové dynamiky, chemických vlastností molekul, vlivu prostředí na studované molekuly a mnoho jiných oblastí (KANIA, 2007). 11

12 LITERÁRNÍ PŘEHLED Obr. 1: Elektromagnetické spektrum (KANIA, 2007) 3.2 Blízká infračervená spektroskopie Historie Objev NIR energie se připisuje Williamu Herschelovi, který v roce 1800 publikoval zprávu o záření za viditelnou oblastí červeného spektra. Aţ do začátku 2. světové války se oblast NIR pro spektroskopii nepovaţovala za uţitečnou, neboť NIR pásy se překrývají a bylo je obtíţné interpretovat. Zájem o NIR vzrostl v padesátých letech minulého století na základě zjištění, ţe vodíkové (X-H) stretching vibrace jsou odpovědné za téměř všechny absorpční pásy v NIR oblasti. To vedlo v letech šedesátých k vývoji metody monitorování obsahu vody v různých materiálech. Zjištění, ţe zrniny vykazují v oblasti NIR specifické absorpční pásy, vedlo K. H. Norrise v roce 1968 k převratnému návrhu, pouţít NIR spektrometr s filtry 1 680, 1 940, 2 100, 2 180, a nm ke stanovení obsahu bílkovin, vody v zrnu obilovin, resp. bílkovin, oleje a vody v sójových bobech. V sedmdesátých letech Norris se spolupracovníky ukázali na přístroji Cary 14 se skenujícím monochromátorem, ţe v pícninách lze stanovovat parametry kvality, včetně stravitelnosti (bilančně stanovovanou na skopcích) a přijmu píce. Jiţ v roce 1978 Shenk s kolegy umístili NIR přistroj na dodávkový automobil tak, aby se mohl pouţít v terénu, přímo na amerických farmách a při obchodu se senem. 12

13 LITERÁRNÍ PŘEHLED Od roku 1983 byly dodávány komerční filtrové přístroje se softwarem pro analýzy pícnin a krmiv. Pro další rozvoj techniky NIR měl mimořádný význam technický pokrok ve vývoji přístrojů a téţ optických vláken, dovolující delokalizaci měření (pomocí optické sondy) v pevných a kapalných materiálech. Záření se vede optickými vlákny ze zdroje do vzorku a odtud zpět na detektor, kde se snímají NIR spektra vzorku. Vedle toho měl pro další rozvoj techniky NIR velký význam pokrok v počítačích a vývoj nových matematických metod dovolujících globální zpracování obrovských datových souborů (MÍKA et al., 2008) Nástin teorie NIR spektroskopie Blízká infračervená spektroskopie (NIR near infrared spectroscopy) je nedestruktivní analytická metoda, která se po řadu let široce uplatňuje v potravinářském a krmivářském průmyslu a obecně v průmyslu zpracování rostlinných a ţivočišných produktů. Její hlavní předností je schopnost určit obsah řady látek, především základních ţivin, v čase od několika sekund do cca 1 minuty (BIEN, 2006). Z hlediska kvalitativní informace je moţné srovnávat měřená spektra čistých látek s knihovnami spekter, a tak provádět identifikaci látek. K dispozici jsou například knihovny spekter polymerů či farmaceuticky důleţitých chemikálií. Často se NIR spektra třídí a klasifikují s vyuţitím chemometrických metod. Významnou měrou se NIR spektra vyuţívají pro kvantitativní analýzu, a to i sloţitých vzorků v řadě odvětví jako je například petrochemie, farmaceutický, papírenský či potravinářský průmysl. V mnoha případech je moţné stanovit více sloţek vedle sebe, aniţ je nutné dělit sloţité směsi, a to přímo ve výrobním procesu. NIR spektrometrie se proto zařazuje mezi tzv. procesní analytické metody, kdy se klade důraz na rychlost samotné analýzy včetně moţnosti kontinuální on-line analýzy ve výrobním procesu (na výrobní lince) nikoli na její přesnost. Takto lze například zároveň stanovit obsah tuků, bílkovin, laktózy a močoviny v mléce a mléčných výrobcích (v různých stádiích jejich zpracování), či obsah etanolu a sacharidů v alkoholických nápojích (například během probíhajících kvasných procesů). NIR spektrometrie se v poslední době uplatňuje i při analýzách ţivotního prostředí či v medicinální chemii. Samotné měření nevyţaduje obvykle ţádnou speciální úpravu vzorku. Minimalizuje se tak spotřeba chemikálií, jednorázově pouţitelných analytických setů, a tím i generování ţivotní prostředí 13

14 LITERÁRNÍ PŘEHLED zatěţujících odpadů. Lze měřit vzorky ve skleněných i některých dalších transparentních obalech. Voda v některých částech NIR oblasti významně absorbuje, přesto však lze analyzovat i relativně zředěné vodné roztoky. Mnohem pracnější a časově výrazně náročnější neţ samotné měření spekter je následné zpracování a vyhodnocování naměřených dat (MATĚJKA, 2008). NIR spektroskopické metody nejsou zdaleka uzavřeny ve svém vývoji a očekává se ještě další rozvoj. Současnost jsou především aplikace. Těm je podřízena konstrukce přístrojů a jejich technické parametry (BIEN, 2006) Princip Princip metody spočívá v měření odraţeného, popř. prošlého záření vzorkem v oblasti vlnových délek od cca nm (blízká infračervená oblast). Část energie tohoto elektromagnetického záření je pohlcována absorbéry, coţ jsou dvouatomové vazby C-H, N-H, O-H, S-H, které jsou obsaţeny v charakteristických skupinách látek, jako např. bílkoviny, tuky, sacharidy apod. Příčinou absorpce světla je změna rotačně-vibračních stavů těchto vazeb. Jejich počet je úměrný koncentraci řady komplexních látek v analyzovaném materiálu a je proto moţné tyto závislosti analyticky vyuţít (BIEN, 2006). Absorpce záření v NIR oblasti je obvykle způsobena energetickými přechody mezi vibračními hladinami molekul, a to přechody kombinačními a svrchními tóny (overtony), nikoli přechody fundamentálními, které hrají dominantní roli ve střední infračervené oblasti MIR (MATĚJKA, 2008). Svrchní tóny a kombinační přechody způsobují rozšíření absorpčních pásů v NIR spektru. Spektrum je také ovlivněno okolím měřené vazby, tak je moţné stanovit např. chlorid sodný, který sám není v NIR aktivní, ale působí na polohu absorpce vody. Z výše uvedeného vyplívá, ţe identifikace absorpčních pásů v NIR spektru je poměrně obtíţná, proto se NIR spektroskopie nevyuţívá k identifikaci látek na základě přiřazení absorpčních pásů jednotlivým funkčním skupinám, jak je obvyklé ve střední oblasti. NIR spektroskopie je z těchto důvodů vhodná především ke kvantitativní analýze, která je zaloţena na celo-spektrálních metodách (ČURDA et al., 2002). 14

15 LITERÁRNÍ PŘEHLED Technika měření NIR spekter NIR spektra lze měřit jako zeslabení zářivého toku po průchodu záření vzorkem (transmisní měření) nebo po odrazu záření (reflexní techniky). V rámci reflexních technik se nejčastěji uplatňuje princip difúzní reflektance, kdy se dopadající záření odráţí od povrchu jednotlivých malých částic práškového vzorku. Tento přístup se často pouţívá při analýzách ve farmaceutickém průmyslu či při analýze průmyslově vyráběných práškových krmiv pro zemědělskou výrobu. Transmisní měření se vyuţívá především v případě kapalin, kašovitých vzorků a polymerních folií. Kapalné vzorky je moţné měřit v kyvetách ze speciálního skla (INFRASIL, SUPRASIL), které vykazuje vysokou propustnost v celé NIR oblasti. Tloušťka optické vrstvy u těchto kyvet je obvykle od 1 mm do cca 10 mm a jejich volba se optimalizuje v závislosti na koncentraci analytu v roztoku a optických vlastnostech rozpouštědla. Vedle uvedených postupů, kdy je vzorek umístěn v drţáku přístroje, se často NIR spektra měří s vyuţitím vláknové optiky s různými typy sond, které mohou být umístěny například přímo v chemickém či biotechnologickém výrobním reaktoru (MATĚJKA, 2008). Přístrojová technika pro NIR spektroskopii se vyvíjela od filtrových přístrojů přes stále poměrně rozšířené disperzní spektrometry, které jsou však postupně nahrazovány přístroji s Fourierovou transformací (FT). FT NIR spektrometr má ve srovnání s disperzním spektrometrem řadu výhod, především vyšší rychlost snímání spekter, lepší poměr signálu k šumu, vysokou vlnočtovou přesnost, velkou rozlišovací schopnost a konstantní rozlišení v celém rozsahu spektra. Nověji se také objevují přístroje s DAD (diode-array detector). Obr. 2: Fyzikální jevy transmitance a reflektance (NOVOTNÁ, 2009) 15

16 LITERÁRNÍ PŘEHLED Chemometrické metody pro NIR spektroskopii Pro stanovovanou sloţku musí být provedena kalibrace příslušného NIR spektrometru pomocí vhodného souboru kalibračních standardů (nejméně 30 vzorků) o známém sloţení, které je určeno nezávislou analytickou metodou. Kalibrační vzorky by měly charakterizovat v maximální míře vlastnosti analyzovaných vzorků a měly by pokrývat celý koncentrační rozsah. Úzké koncentrační rozpětí kalibračních vzorků lze řešit úpravou modelových vzorků (ČURDA et al., 2002). Kalibrace je nutná k docílení konzistence měření. Obvykle je její součástí zjišťování závislosti mezi odezvou přístroje a jednou nebo více referenčními (vztaţnými) hodnotami. Jakmile je tato závislost určena, slouţí k predikci (předpovědi, určení) hodnoty (např. koncentrace) z odezvy přístroje (DOHNAL, 2007). Před kalibrací je obvykle nutná úprava spektrálních dat. Typická NIR spektra jsou charakterizována lineárním rostoucím trendem od kratších k delším vlnovým délkám, coţ je způsobeno rozptylem, který závisí na velikosti pevných částic vzorku a vlnové délce dopadajícího záření. K častým úpravám také patří vícenásobná korekce rozptylu (MSC multiplicative scatter correction) a posun základní linie spekter (baseline shift). Vliv velikosti částic redukuje SNV (standard normal variate), která upravuje kaţdé spektrum tak, aby v souboru byla směrodatná odchylka proměnných v kaţdém bodě rovna 1. Detrend odstraňuje lineární a kvadratické zakřivené kaţdého spektra. Často bývají metodiky SNV a detrend pouţívány při úpravě spekter současně (ESBENSEN, 2000). Tvorba kalibračního modelu vyţaduje pouţití počítače vybaveného chemometrickým softwarem. Principem kalibrace je získání závislosti mezi spektrální informací a sloţením vzorku (ČURDA et al., 2002). Jako základní algoritmus pro tvorbu kalibračního modelu byla dříve vyuţívána vícenásobná lineární regrese (MLR multiple linear regression ). Dnes se v rámci rozvoje chemometrického softwaru nejvíce uplatňují dvě regresní metody, a to regrese hlavních komponent (PCR principal component regression ) a metoda částečných nejmenších čtverců (PLS partial least squares ). Při pouţití těchto regresních metod se v rámci kalibračního modelu vyuţívají nikoli hodnoty absorbance v maximech vybraných pásů, ale většinou se vyhodnocují širší spektrální úseky či dokonce celá NIR spektra. Cílem je tedy nalézt vztah mezi vícedimenzionální spektrální informací 16

17 LITERÁRNÍ PŘEHLED a sloţením vzorků. V některých případech, kdy jsou absorpční pásy velmi široké, se pro kalibrační modely spektra předem upravují, např. výpočtem derivačních záznamů (především 1. a 2. derivace původního spekter). Podmínky měření všech spekter i způsoby jejich úprav a zpracování musí být zachovány od kalibračních, přes validační aţ po neznámé zkoumané vzorky (MATĚJKA, 2008). Při PLS jsou novými proměnnými PLS faktory, které jsou lineárními kombinacemi původních absorbancí. Jsou počítány tak, aby byla maximalizována kovariance mezi PLS faktory a koncentrací analytu. Důleţitým diagnostickým nástrojem pro vývoj kalibračního modelu je závislost PRESS (predicted residual sum of squares) na počtu PC nebo PLS faktorů pouţitých ke kalibraci. Optimální počet PLS faktorů se volí v minimu funkce PRESS. Vysoký počet PLS faktorů sniţuje schopnost predikce, protoţe PRESS zahrnuje i spektrální šum. Při tvorbě kalibračních modelů se vyuţívá i nelineární regrese. Takové zpracování dat umoţňuje metoda umělých neuronových sítí (ANN artificial neural network), která je sice náročná, protoţe vyţaduje veliký kalibrační soubor (500 a více vzorků), ale odchylka stanovení by měla být niţší. K posouzení spolehlivosti získaného kalibračního modelu slouţí validace. Jednou z moţností je validace pomocí nezávislého souboru vzorků o známém sloţení, které nebyly zahrnuty v kalibračním souboru. S referenčními hodnotami sloţek zjištěnými nezávislými metodami se porovnávají koncentrace sloţek předpověděné prostřednictvím kalibračních modelů (ČURDA et al., 2002). Většina druhů softwarů obsahuje postup zvaný vnitřní křížová validace (internal cross-valiation), jimţ se kalibrační soubor opakovaně segmentuje na skupiny. Jedna skupina se ponechává pro validaci, zbylé pro kalibraci. Tento postup se opakuje, dokud všechny skupiny nebudou pro validaci pouţity alespoň jednou (MÍKA et al., 2008). Kvalitu kalibračního modelu lze posoudit podle směrodatné odchylky kalibrace (SEC standard error of calibration) definované vztahem: SEC 1 N 1 N y NIR x i i 1 2 Obr. 3: Vztah pro výpočet směrodatné odchylky kalibrace (ČURDA, 2002) kde y NIR je hodnota předpověděná z NIR spektra, x i referenční laboratorní hodnota i-tého kalibračního vzorku, N je počet kalibračních vzorků. 17

18 LITERÁRNÍ PŘEHLED Při validaci se pouţívá směrodatná odchylka predikce SEP (standard error of prediction). Je kladen důraz na minimální SEP, protoţe se jedná o odchylku, která je očekávána v budoucích předpovědích. SEP spolehlivé kalibrace není obvykle o mnoho větší neţ SEC. Pro porovnání spolehlivosti kalibrace pro různé sloţky lze vypočítat kalibrační variační koeficient CCV (calibration coefficient of variation), který vyjadřuje SEC v procentech průměrné laboratorní hodnoty. Analogicky lze vypočítat na základě SEP predikční variační koeficient. Výhodou CCV ve srovnání se SEC je nezávislost na pouţitých jednotkách. Dobrá kalibrace má hodnotu CCV pod 5 % a CCV do 10 % je ještě přijatelný. Referenční a predikované hodnoty by v ideálním případě měly vykazovat lineární závislost jdoucí počátkem a se směrnicí rovnou 1. Kvalitu modelu lze proto posoudit na základě korelačního koeficientu R, testováním koeficientů lineární závislosti, dále lze vyuţít T-test, resp. Z-test (ČURDA et al., 2002). Korelační koeficient se můţe pohybovat v intervalu od 1 (dokonalá negativní závislost) do +1 (dokonalá pozitivní závislost). Nula znamená ţádnou závislost. Korelační koeficient je mírou pouze lineární závislosti mezi dvěma sadami dat. Podobně jako u T-testu, je statistická významnost hodnoty R závislá na mnoţství dat n (DOHNAL, 2007). Dalšími metodami, jejichţ pouţití má význam především při identifikaci a kvalifikaci neznámého vzorku, je analýza hlavních komponent (PCA principal component analysis) a shluková analýza (cluster analysis). Tyto postupy slouţí k posouzení míry shody neznámého vzorku se standardem nebo jeho zařazení do charakterově nejbliţší třídy (ČURDA et al., 2002) Aplikační rozsah NIR spektroskopie K základním parametrům, které jsou měřeny pomocí NIR spektrometru, patří: 1) Vlhkost stanovení vody bylo jednou z prvních aplikací. Vyuţívá se intenzivní absorpce vazby O-H v molekule vody. Stanovení se provádí běţně jak u sypkých, tak u pastovitých a kapalných vzorků, 2) Bílkoviny stanovení obsahu bílkovin je umoţňováno absorpcí vazby N-H přítomné v peptidické vazbě a dovoluje stanovení nejen celkového obsahu 18

19 LITERÁRNÍ PŘEHLED bílkovin, ale např. i jednotlivých aminokyselin v určitých matricích nebo jejich vlastností, jako je teplem poškozený protein, lepek nebo frakce bílkovin, 3) Tuky, oleje u stanovení tuků je vyuţíváno charakteristických absorpčních pásů způsobovaných vazbou C-H přítomnou v jejich molekulách. Mimo celkového obsahu tuků je moţné sledovat i jejich kvalitu (jodové číslo apod.), 4) Polysacharidy charakteristické skupiny a jejich vazby (C-H, O-H) umoţňují stanovení vlákniny v různých modifikacích, škrobu a jednoduchých cukrů (sacharóza, glukóza, laktóza), 5) Popel obsah popela se metodou NIR určuje nepřímo, neboť je v řadě matric v korelaci k celkové organické hmotě (BIEN, 2006). 3.3 Programové vybavení FT NIR Antaris Software pro měření vzorků Result Integration Slouţí nejen k měření spekter, ale také k tvorbě workflows pro rutinní práci s FT NIR spektrometrem Antaris. Result Operation Na rozdíl od Result Integration je určen pouze k měření spekter. Výhodou je velmi snadná manipulace. Omnic Tento spektroskopický software umoţňuje práci s daty a spektrální analýzu. Macros Basic Ve spojení s programem Omnic a TQ Analyst je moţné tento program vyuţít k automatizaci měření spekter, k jejich úpravě a manipulaci s nimi, kvantitativní 19

20 LITERÁRNÍ PŘEHLED a kvalitativní analýze a vytváření výstupních protokolů (Thermo Electron Corporation, 2008) Software pro tvorbu kalibračních modelů TQ Analyst TQ Analyst je důmyslný, snadno pouţitelný program pro vývoj kvantitativních a kvalitativních metod infračervené spektroskopie a analýzu vzorků. Pouţité algoritmy umoţňují výpočet koncentrace komponent nebo klasifikaci neznámých látek za pouţití souboru kalibračních standardů. Za jeho pomoci lze také pouze měřit a zaznamenávat výšku a plochu zvoleného pásu (NICOLET, 2003) Kvantitativní analýza Nejstarší kvantitativní analýzou je stanovení obsahu vody ve vzorcích zrnin, a to díky dvěma výrazným absorpčním pasům pro vodu při a nm (MÍKA et al., 2008). Všechny dostupné techniky pouţívají pro vytvoření kalibračního modelu spektrální a koncentrační informace dosaţitelné v tabulce standardů. Sloţitost modelu je závislá na pouţité technice. Nejlepší je volit nejjednodušší techniku, která je schopna modelovat u analyzovaných vzorků závislost absorbance na koncentraci. Další moţností je vyuţití funkce SUGGEST, která je dostupná téměř na všech vývojových listech. V případě neuspokojivého výsledku kalibrace je moţno pro jiţ zadaná data a parametry vyuţít jinou techniku či zkusit několik technik a zvolit tu, která poskytuje nejpřesnější výsledky. TQ Analyst nabízí pro kvantitativní analýzy následující techniky: - jednoduchý Beerův zákon - CLS (classical least squares) - SMLR (stepwise multiple linear regression) - PLS (partial least squares) - PCR (principle component regression) (NICOLET, 2003) Jednoduchý Beerův zákon Kvantitativní analýza za pouţití transmisních metod je zaloţena na měření poklesu intenzity záření po jeho průchodu vzorkem. Vyuţívá se přitom dvou základních zákonů, 20

21 LITERÁRNÍ PŘEHLED Lambertova a Beerova. Podle Lambertova absorpčního zákona je podíl záření absorbovaného v homogenním prostředí nezávislý na jeho původní intenzitě. Podle Beera je absorpce závislá na koncentraci (KÖSSLER, 1970). Pouţití této metody vyţaduje měření výšky nebo plochy jediného pásu pro kaţdou komponentu, přičemţ kaţdá komponenta musí mít nejméně dvě koncentrační hodnoty. Pro kaţdou komponentu je vytvářena samostatná kalibrační závislost. Výhody metod vyvinutých podle Beerova zákona - jejich matematická podstata je snadno pochopitelná - nevyţadují velké mnoţství standardů Nevýhody metod vyvinutých podle Beerova zákona - nepouţitelné, pokud se pásy nebo oblasti komponent významně překrývají - přesné pouze pro koncentrační rozpětí, pro které je kalibrační závislost lineární Classical Least Squares (CLS) Algoritmus CLS je podobný algoritmu pro výpočet podle Beerova zákona, řeší však alternativu překrývajících se pásů jednotlivých komponent. Kalibrační model můţe být zaloţen na výšce nebo ploše spektrálního pásu, můţe však také pouţít soubor mnoha bodů ve spektrálním rozsahu širším neţ je izolovaný pás. Metoda můţe pouţívat data s překrývajícími se pásy komponent, protoţe kalibrační model vyjadřuje posuzované křivky jako lineární kombinaci absorbancí kaţdé z přispívajících komponent. Výhody CLS metody: - moţnost vyuţití pásů komponent, které se významně překrývají - potřeba menšího mnoţství standardů neţ PLS nebo PCR metoda - přesnější výsledky neţ při pouţití Beerova zákona, protoţe jsou vyuţity všechny datové body v analytickém regionu pouţitém pro výpočet Nevýhody CLS metody: - nemůţe řešit výskyt neočekávaných nečistot ve vzorku - interference pro jednu komponentu mohou ovlivňovat ostatní komponenty 21

22 LITERÁRNÍ PŘEHLED Stepwise Multiple Linear Regression (SMLR) SMLR je metoda, která vyjadřuje koncentraci jako funkci absorbance (na rozdíl od CLS, která postupuje opačně). Kalibrační model SMLR můţe být zaloţen buď na výškách spektrálních pásů, nebo na průměrné výšce v regionu. Pro kaţdou komponentu je voleno více pásů nebo regionů, standardně 3. S kaţdým regionem můţe být asociováno i více komponent. Software automaticky postupně vyhledává regiony pro první komponentu a teprve pak postupuje k další. Vybrané regiony není moţno editovat, lze však vymezit, v jaké oblasti mají být vyhledávány, omezit nebo zvýšit jejich počet a určit minimální šířku a minimální vzdálenost mezi regiony (záloţka Other). Výhody SMLR metody: - kaţdá sloţka je kalibrována nezávisle, coţ dává oproti CLS moţnost získat správný výsledek i při nečekané změně sloţení vzorku (NICOLET, 2003) Partial Least Squares (PLS), Principal Component Regression (PCR) Při pouţití těchto regresních metod se v rámci kalibračního modelu vyuţívají nikoli hodnoty absorbance v maximech vybraných pásů, ale většinou se vyhodnocují širší spektrální úseky či dokonce celá NIR spektra. Cílem je tak nalézt vztah mezi vícedimenzionální spektrální informací (reprezentovanou maticí hodnot absorbancí ve vybraných spektrálních úsecích pro sadu kalibračních vzorků) a sloţením vzorků (reprezentovaným maticí hodnot koncentrací skupiny sledovaných analytů v sadě kalibračních vzorků). V některých případech, kdy jsou absorpční pásy velmi široké, se pro kalibrační modely spektra předem upravují, např. výpočtem derivačních záznamů (především 1. a 2. derivace původního spekter). Podmínky měření všech spekter i způsoby jejich úprav a zpracování musí být zachovány od kalibračních, přes validační aţ po neznámé zkoumané vzorky (MATĚJKA, 2008). Výhody PLS a PCR metodiky: - umoţňuje kalibrace za pouţití pásů nebo regionů komponent, které se silně překrývají - řeší interference neznámých komponent (nečistot) - k výpočtům jsou pouţity všechny datové body v analyzovaném regionu - uţivatel nepotřebuje specifikovat zvláštní oblast pro kaţdou komponentu 22

23 LITERÁRNÍ PŘEHLED Nevýhody PLS a PCR metodiky: - vyţaduje velké mnoţství standardů - pochopení jejího matematického principu je obtíţné (NICOLET, 2003) 3.4 Aplikace NIR spektroskopie v průmyslu a jiných odvětvích ČOPÍKOVÁ et al. (2003) ověřovali moţnost stanovení obsahu tuku, sušiny a jednotlivých druhů cukru, tj. sacharózy a laktózy u čokolády. Na FTIR spektrometru Nicolet 740 byly analyzovány dva soubory vzorků mléčných čokolád. Přístroj byl kalibrován hodnotami obsahu sacharózy, laktózy, tuku a vlhkosti. Obsah cukrů byl stanoven plynovou chromatografií. Na disperzním přístroji NIRSystem byly proměřovány tabulkové a roztavené hořké a mléčné čokolády, které byly zahrnuty do jednoho modelu. U těchto vzorků byl stanoven obsah cukrů kapalinovou chromatografií. Z výsledků měření vyplynulo, ţe stanovení obsahu jednotlivých cukrů a tuku v čokoládách pomocí NIR spektroskopie je moţné. Obsah vlhkosti v čokoládách je nízký a navíc s malým rozptylem, tudíţ u tohoto parametru můţe být pouţití spektroskopie v blízké infračervené oblasti problematické. Záleţí ovšem na typu přístroje. TRILČOVÁ et al. (2005) sledovali kvalitu kakaového prášku pomocí infračervené spektroskopie. Byl zpracován soubor 81 vzorků zakoupených převáţně ve spotřebitelské síti ČR. U všech vzorků byl stanoven obsah tuku dle Soxhleta a vlhkost dle ČSN Dále byla měřena spektra ve střední a blízké infračervené oblasti. Infračervená spektra v blízké oblasti byla měřena spektrometrem NIRSystems ve spektrálním rozsahu 400 aţ nm a vyhodnocena programem NIR3. Vzorky byly měřeny v reţimu reflaktance, při rozlišení 2 a počtu scanů 36. Pro kalibraci byla pouţita modifikovaná metoda částečných nejmenších čtverců (MPLS). Naměřená spektra byla statisticky vyhodnocena programem WINISI II. Z hodnot R pro oba parametry (tuk 0,992; vlhkost 0,997) je patrné, ţe se jedná o velmi silnou závislost mezi hodnotami analyticky stanovenými a hodnotami předpověděnými NIR spektroskopií. Hodnoty CCV (tuk 3,02 %; vlhkost 1,29 %) ukazují na velmi spolehlivý kalibrační model. Infračervená spektra ve střední oblasti byla zaznamenána na přístroji Bruker IFS-55 s ATR-celou a technikou jednoduché reflaktance. Spektra byla měřena v rozsahu nm. Parametry měření byly zvoleny: rozlišení 8, 23

24 LITERÁRNÍ PŘEHLED počet akumulací spektra 128, apodizace trojúhelníková funkce. Naměřená spektra byla vyhodnocena analýzou hlavních komponent (PCA). U některých vzorků se vyskytovaly rozdíly, které byly nejspíše způsobeny sloţením neutrálních cukrů. Spektroskopické techniky ve spojení s multivariační analýzou se jeví jako velice uţitečné při analýze kakaového prášku. LAMMERTYN et al. (1998) hodnotili potenciál blízké infračervené spektroskopie jako nedestruktivní metody pro hodnocení jakostních charakteristik jablek Jonagold. Byl stanovován obsah rozpustné sušiny, ph a dále texturní vlastnosti tuhost a elasticita. Tvorba kalibračního modelu byla provedena pomocí analýzy hlavních komponent (PCA), regrese hlavních komponent (PCR) a metody částečných nejmenších čtverců (PLS). Nejlépe vycházel model pro sušinu, kde byl korelační koeficient R 0,93 a predikční variační koeficient SEP 0,068 %. Dále byly stanoveny hodnoty R 0,90 a SEP 2,49 % pro modul tuhosti, R 0,82 a SEP 0,61 % pro rozpustnou sušinu. Hodnoty pro modul pruţnosti nebyly příliš uspokojivé (R 0,75, SEP 0,26 %). Lze říci, ţe NIR spektroskopie má v této oblasti dobrý potenciál. MLČEK et al. (2009) se zabývali vyuţitím FT NIR spektroskopie ke stanovení základních sloţek hovězího masa v hrubě a jemně mletém stavu. Bylo testováno 40 vzorků čerstvého chlazeného hovězího masa s různým poměrem tuku, bílkovin a vody. Vzorky byly měřeny spektrometrem Nicolet FT NIR Antaris v spektrálním rozsahu aţ cm -1. Spektra byla měřena na integrační sféře v reţimu reflaktance s počtem scanů 80 a rozlišením 8. Ke kalibraci přístroje byly pouţity referenční výsledky z klasických analýz. Kalibrační modely byly tvořeny pomocí PLS algoritmu a ověřeny kříţovou validací. U jemně mletých vzorků bylo dosaţeno lepších výsledků, ale výsledky byly uspokojivé u obou způsobů měření. Korelační koeficient pro tuk byl >0,994, pro bílkoviny >0,926 a pro sušinu >0,984. Párovým T-testem nebyly zjištěny statisticky průkazné rozdíly mezi referenčními a predikovanými hodnotami stanovení. Metoda NIR spektroskopie je na základě výše uvedených výsledků vhodnou náhradou finančně a časově náročné chemické analýzy masa. MUSELÍK et al. (2010) měřili tloušťku obalu tablet blízkou infračervenou spektroskopií. Pro obalování perorálních lékových forem (tablet, tobolek, pelet) existuje celá řada důvodů, tj. estetické (zlepšení vzhledu, maskování nepříjemné chuti a zápachu, snadnější aplikace), identifikační, technologické (zajištění stability přípravku, mechanické odolnosti, oddělení inkompatibilních sloţek, ochrana léčiva 24

25 LITERÁRNÍ PŘEHLED před kyselým prostředím ţaludku) a zejména důvody terapeutické. Tloušťka naneseného obalu byla měřena optickým stereomikroskopem propojeným pomocí videokamery s počítačem. NIR spektra byla měřena v reţimu difúzní reflektance na spektrometru FT NIR Nicolet Antaris vybaveného integrační sférou. Vzorky byly vkládány do drţáku tablet. Měření probíhalo v rozsahu vlnočtů cm -1. Naměřená data byla zpracována počítačovým programem TQ Analyst. Kvalita vyvinutého kalibračního modelu byla ověřena porovnáním referenčních hodnot tloušťky obalu s hodnotami vypočítanými algoritmem PLS, vyjádřením chyby kalibračního modelu, počtem odlehlých standardů a počtem faktorů PLS. Dosaţené výsledky prokázaly, ţe kvantitativní NIR spektroskopie je spolehlivou a rychlou metodou při stanovení tloušťky obalu. Při analýzách není vyţadována ţádná úprava vzorku, doba trvání jedné analýzy je přibliţně 3 minuty na rozdíl od běţných metod, které jsou časově náročnější. QUARESIMA et al. (2003) uvádí, ţe NIR spektroskopie je velmi vhodnou metodou pro sledování činnosti lidských svalů. Hlavní výhodou je, ţe se jedná o metodu neinvazivní. NIR světlo proniká kůţí, tukovou i svalovou tkání a je buď rozptýleno či vstřebáno do tkáně. Tato metoda se stává široce pouţívaným nástrojem pro měření svalové saturace kyslíkem a změn objemu hemoglobinu. Blízká infračervená spektroskopie je méně restriktivní neţ magnetická resonance, je pohodlnější a vhodnější pro rozlišení většího mnoţství svalových skupin. NIR spektroskopie je úspěšně uplatňována ve sportovní medicíně Aplikace NIR spektroskopie v mlékárenském průmyslu Tekuté mléko V analýze zpracovávaného mléka a mléčných výrobků je dominantní střední infračervená oblast s přístroji typu MilkoScan. Přesto je NIR spektroskopie i v této oblasti pouţitelná. Většina prací je nejčastěji věnována základnímu sloţení mléka (sušina, tuk, bílkoviny a laktosa). NIR spektra jsou obvykle snímána v transmitanci. KUKAČKOVÁ et al. (2000) zjišťovali moţnost stanovení celkové sušiny, tuku a bílkovin u 65 vzorků mléka. NIR spektra byla zaznamenána ve dvou vyhotoveních na přístroji NIRSystems s pouţitím optické vláknové sondy. Vzorky, pro stanovení sušiny, byly sušeny do konstantní hmotnosti. Obsah tuku byl stanoven 25

26 LITERÁRNÍ PŘEHLED metodou dle Gerbera a mnoţství bílkovin bylo zjištěno pomocí Kjeldahlovy metody. Kalibrace byla vypočtena na základě MPLS regrese. Byly získány hodnoty korelačního koeficientu R 0,975 a predikčního variačního koeficientu SEP 0,160 % pro mnoţství sušiny, R 0,967 a SEP 0,179 % pro obsah tuku a R 0,965 a SEP 0,049 % pro obsah bílkovin. Z výsledků vyplívá, ţe vyuţití NIR spektroskopie pro rychlou základní analýzu mléka je vhodné. U syrového mléka je snaha o měření vzorků bez homogenizace. Tento postup ověřili např. CHEN et al. (1999) na 154 vzorcích mléka pro stanovení obsahu tuku. Transmitančně naměřená spektra byla zpracována metodou PLS. Získaná kalibrace vykazovala velmi dobré parametry (korelační koeficient kalibrace 0,99 a SEP 0,19 %). Řadu prací, která se zabývá sloţením syrového nehomogenizovaného mléka a obsahem somatických buněk, publikovali TSENKOVA et al. (1999). Zánět mléčné ţlázy, který se projevuje vysokým počtem somatických buněk, ovlivňuje také sloţení mléka. Somatické buňky zvyšují rozptyl světla, protoţe se mění distribuce částic v mléce. Pomocí transmitančních spekter nehomogenizovaného syrového mléka je moţné rozeznat mléko od dojnice se zánětem mléčné ţlázy (mastitidou). Nezávislá validace ukázala, ţe vzorky s vysokým počtem somatických buněk jsou analyzovány s niţší přesností. Podmínky měření sloţek nehomogenizovaného mléka byly dále optimalizovány. Nejlepších výsledků bylo dosaţeno ve spektrální oblasti aţ nm v 1 mm kyvetě po úpravě spekter 1. derivací s vyuţitím PLS metody. Jak uvádí ČURDA et al. (2002) pro analýzu mléka se stále častěji uplatňuje on-line NIR měření. Při kontrole tuku v mléce byl pouţit on-line systém NIRSystems Process Analytics 5 500, který byl napojen na výrobní zařízení a byl sledován průběh výroby. Spektra byla snímána v rozsahu 700 aţ nm vláknovou optikou. K vytvoření kalibračního a validačního modelu bylo pouţito vícenásobné lineární regrese a pro stanovení tuku v mléce byl získán korelační koeficient kalibrace 0,84 a SEP 0,07 %. Velmi úzké koncentrační rozpětí tuku v mléce přispělo k nepřesnostem ve vytvořených kalibracích Zahuštěné a sušené mléko V analytice a kontrole potravinářských surovin a výrobků s nízkým obsahem vody, např. mouka, zrno, olejnatá semena i sušené mléko se ve velkém měřítku vyuţívá 26

27 LITERÁRNÍ PŘEHLED NIR spektroskopie a filtrové přístroje obvykle v reflektančním uspořádání. Filtrové přístroje jsou v této oblasti v současné době rutinně vyuţívány. MARTEL et PAQUIN (1991) sledovali průběh zahušťování mléka. K měření byl vyuţit FT spektrometr Bomem DA3 v transmitanci (kyveta 0,3 mm). Obsah vody byl korelován s absorbancí při cm -1 (1 450 nm). Bylo nutné homogenizovat vzorek vysokým tlakem k omezení rozptylu. BARABÁSSY et TURZA (1995) kalibrovali přístroje NIRSystems a PMC Spectralyzer na základě měření 104 směsí mléčného sušeného prášku, obsahujícího v různém poměru odstředěné mléko, sušenou syrovátku, bílkoviny a laktosu, pro stanovení vlhkosti, tuku, bílkovin, laktosy a popelovin. Vytvořením kombinací sloţek ve směsích bylo rozšířeno koncentrační rozpětí jednotlivých stanovovaných sloţek, a tím byla zvýšena úspěšnost kalibrace. RŮŢIČKOVÁ et ŠUSTOVÁ (2007) stanovovaly obsah vody a titrační kyselost vzorků sušeného mléka, ke kterému byla v různých poměrech přidána syrovátka pro zajištění většího rozsahu referenčních hodnot. U sušených mléčných výrobků se pro stanovení vlhkosti (obsahu vody) pouţila metoda dle ČSN , kdy se obsah vody stanoví sušením při 87±2 C, při které nedochází k porušení organických látek. Pro stanovení titrační kyselosti se postupovalo podle metody Soxhlet-Henkela. Princip spočívá ve spotřebě alkalického odměrného roztoku při neutralizaci zkoušeného vzorku na předepsaný indikátor (fenolftalein). Vzorky sušeného mléka byly následně měřeny v Petriho misce přístrojem FT NIR Antaris firmy ThermoNicolet na integrační sféře v reţimu reflektance při vlnočtech aţ cm -1. Konstantní vrstva sušeného mléka byla vymezena výškou Petriho misky a také vrstvou alobalu. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí PLS algoritmu (metoda částečných minimálních čtverců). Korelační koeficienty kalibrace vlhkosti sušeného mléka dosahují hodnot 0,885 a 0,842, coţ ukazuje na dobrou korelační závislost modelu. Hodnoty SEC a SEP je pohybovaly v rozmezí 0,204 % a 0,237 %. Hodnota CCV byla 6,24 %, coţ přesahuje podmínku spolehlivosti modelu. Naopak hodnota PCV 7,24 % podmínku spolehlivosti modelu splnila. Lze tedy konstatovat, ţe model pro stanovení vlhkosti sušeného mléka je relativně spolehlivý. Kalibrační a validační hodnoty korelačního koeficientu u modelu titrační kyselosti sušeného mléka činí 0,993 a 0,990, coţ ukazuje na velmi pevnou závislost vyhotovené kalibrace. Dle velikosti CCV (0,46 a 0,90 %) 27

28 LITERÁRNÍ PŘEHLED a PCV (0,57 a 1,32 %) lze říci, ţe kalibrační modely pro stanovení titrační kyselosti u sušeného mléka jsou velmi spolehlivé. Zajímavou aplikací NIR spektroskopie je klasifikace sušeného mléka podle tepelného ošetření a posouzení míry denaturace bílkovin. Kalibrace je zaloţena na měření změn vodíkových a disulfidových vazeb, tvorbě H 2 S a distribuce velikostí částic Sýry a tvarohy Značnou perspektivu má NIR spektroskopie při kontrole výroby sýrů a tvarohů, protoţe v této oblasti jí nekonkuruje IR spektroskopie. Přesnost stanovení tuku, bílkovin a sušiny v sýrech NIR reflektanční spektroskopií ve srovnání s referenčními metodami hodnotí RODRÍGUES-OTERO et al. (1995). Pro kalibraci bylo na přístroji NIRSystems 6500 v odrazu proměřeno 92 kalibračních a 25 validačních vzorků sýrů. Kalibrace byla vyhodnocena MPLS regresí, pro některé sloţky byla však pouţita aţ 3. derivace spekter a 8 PLS. Hodnocením senzorických vlastností sýrů pomocí NIR spektroskopie se zabývali SØRENSEN et JEPSEN (1998). Optimální počet PLS faktorů se pohyboval mezi hodnotami 3 8. Přesnost výsledků reflektančního měření byla lepší neţ u transmitance. Korelační koeficient kalibrace obdrţený reflektanční technikou se pohyboval v rozmezí 0,86 0,94 u konzistence a v rozmezí 0,52 0,77 u chuťových vlastností. Práce ukázala, ţe je moţné pomocí NIR spektroskopie určovat senzorické vlastnosti, především konzistenční, které mají uţší vztah k základnímu sloţení. Vedle základního sloţení je u sýrů zajímavé sledovat frakce dusíku. Jejich stanovení NIR spektroskopií nemusí být vţdy úspěšné, jak ukazují např. výsledky zaloţené na měření 107 vzorků sýra Danbo, které byly měřeny jako 2 cm silný plátek v reflektančním modulu spektrometru NIRSystems (WITTRUP et NØRGAARD, 1998). Velmi zajímavou aplikací v sýrařství je sledování procesu sráţení a určení okamţiku zahájení krájení sýřeniny. Na toto téma bylo v poslední době publikováno několik prací. Sondu vláknové optiky lze umístit přímo v sýrařské vaně, kde probíhá enzymová hydrolýza κ-kasienu. Pro měření byl pouţit optický detektor DFA s optickým filtrem v oblasti 950 nm. Závislost absorbance na čase má sigmoidní průběh 28

29 LITERÁRNÍ PŘEHLED a lze ji vyuţít pro určení optimální doby začátku zpracování sraţeniny (PAYNE et al., 1993). Obdobný postup byl pouţit i při monitorování koagulace kozího mléka. Celé reflektanční spektrum (1 100 aţ nm) pro sledování koagulace mléka pepsinem pouţili LAPORTE et al. (1998). Studie ukazuje, ţe NIR reflektance je spolehlivou metodou pro monitorování koagulace mléka. Kromě toho NIR technologie poskytuje lepší odhad koagulačního profilu neţ koagulometr. Sledováním průběhu zrání eidamských sýrů se zabývali KRÁLÍKOVÁ et al. (2007). K analýze byly pouţity vzorky eidamských sýrů o 45 % tučnosti od 4 různých výrobců. Vzorky byly měřeny po dobu 7 měsíců, přičemţ kaţdý měsíc byly analyzovány přístrojem FT NIR Antaris ve spektrálním rozsahu aţ cm -1 v reţimu reflektance. K vyhodnocení spekter byla pouţita metoda diskriminační analýzy. Tato technika rozlišuje spektra podle kvality. Z výsledků je moţné konstatovat, ţe metoda sledování průběhu zrání eidamských sýrů různých výrobců byla úspěšná. Rozdíl mezi jednotlivými vzorky byl patrný jiţ po prvním měsíci zrání. Hodnocení fyzikálně-chemických vlastností sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou pomocí FT NIR popsali DRAČKOVÁ et al. (2007). Vzorky sýrů pocházely z různých prodejen z trţní sítě České republiky. Ve vzorcích byly stanoveny obsahy tuku v sušině, sušiny, tuku, titrační kyselost, obsah NaCl a aktivita vody. Vzorky byly po homogenizaci mletím proměřeny na spektrometru NIR Nicolet Antaris ve spektrálním rozsahu aţ cm -1 se 100 scany. Spektra byla měřena v reţimu reflaktance. Naměřená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst metodou PLS. Stejné vzorky byly pouţity pro kříţovou validaci. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí statistického a grafického softwaru STAT Plus. Pro srovnání hodnot naměřených pomocí FT NIR s hodnotami zjištěnými v laboratoři byl pouţit párový T-test. Výsledky byly posouzeny na základě korelace mezi referenčními a vypočtenými hodnotami z kalibračních rovnic a na základě směrodatných odchylek kalibrace a validace. Nejlepší výsledky byly zjištěny pro obsah sušiny. Pro získání lepších výsledků pro obsah NaCl by bylo vhodné zařadit více vzorků s vyšším obsahem. MOLT et KOHN (1993) ve své práci studovali kvalitu tavených sýrů sledováním obsahu sušiny, tuku, bílkovin a laktosy. Ke snímání spekter byl pouţit disperzní přístroj Infratec 1255 v rozsahu nm. PLS kalibrace a validace poskytla tyto výsledné hodnoty: R = 0,997 a SEP = 0,667 % pro sušinu, R = 0,999 a SEP = 0,712 % pro tuk, 29

30 LITERÁRNÍ PŘEHLED R = 0,996 a SEP = 0,360 % pro bílkoviny a R = 0,985 a SEP = 0,444 % pro laktosu. Důleţitým aspektem této aplikace je zajištění homogenity měřených tavených sýrů Ostatní mlékárenské výrobky ČUDRA et al. (2002) uvádí, ţe on-line NIR analýza je s úspěchem vyuţívána při kontrole obsahu vody v másle. Přístrojem NIRSystems Proces Analytics napojeným na výrobní zařízení byla snímána spektra v rozsahu 700 aţ nm vláknovou optikou. Kalibrační model pro stanovení vody v másle vytvořený vícenásobnou lineární regresí je charakterizován korelačním koeficientem 0,86 a SEP 0,11 %. Nízká hodnota korelačního koeficientu je ovlivněna úzkým koncentračním rozpětím, ve kterém se voda v másle můţe pohybovat. Data jsou však dobře vyuţitelná pro konstrukci regulačních diagramů. POULIOT et al. (1997) se zabývali měřením tepelné denaturace syrovátkových bílkovin a stanovením stupně hydrolýzy syrovátkových bílkovin trypsinem. Spektra byla měřena na přístroji NIRSystems v rozsahu nm vláknovou optikou. PLS kalibrace a validace poskytla velmi uspokojivé výsledky. Zajímavá je aplikace NIR spektroskopie pro stanovení kaseinu a jeho frakcí. DÍAZ-CARILLO et al. (1993) měřili spektra vzorků kozího mléka, které bylo naneseno na filtr ze skelných vláken. Po usušení byl vzorek měřen transmitančně v oblasti nm, filtr bez vzorku slouţil jako reference. Pro kalibraci byla spektra upravena 1. derivací a zpracována metodou PLS. Díky úpravě vzorku byla metoda také úspěšná při stanovení kaseinových frakcí (α s -, β s - a κ-kasein), ačkoli se vyskytují v mléce v nízkých koncentracích. Kromě toho byla vytvořena kalibrace pro celkový kasein, bílkoviny, tuk a laktosu. NIR spektroskopie můţe být nástrojem pro sledování porušení mléka (voda, NaCl, odstředěné sušené mléko). Na přístroji NIRSystems bylo detekováno Clostridium tyrobutyricum při zrání polotvrdých sýrů Danbo (SØRENSEN et JEPSEN, 1997). Spektroskopická měření byla provedena ve vlnovém rozsahu nm v reţimu reflektance. Souběţně s NIR měřením byly plynovou chromatografií sledovány hodnoty volných mastných kyselin, především kyseliny máselné, jejíţ koncentrační přírůstek signalizuje máselné duření sýrů. Kalibrační modely byly vypracovány pomocí regresního PLS modelu a validovány kříţovou validací (R 0,94; SEP 0,02 %). Vysoký počet PLS faktorů (12) je odůvodnitelný velmi nízkou koncentrací kyseliny máselné. Metoda se 30

31 LITERÁRNÍ PŘEHLED ukázala jako velmi vhodná. Vady způsobené bakterií Clostridium tyrobutyricum jsou často pomocí NIR spektroskopie detekovatelné dříve neţ při senzorickém hodnocení či analýze volných mastných kyselin plynovou chromatografií. NIR spektroskopie nachází uplatnění nejen při kontrole výroby, ale také finálních výrobků mlékárenského průmyslu. Filtrové přístroje ustupují a jsou nahrazovány zejména FT NIR spektrometry. Rozšiřování NIR spektroskopie napomáhá vývoj v oblasti chemometrických metod pro vyhodnocení spekter a kalibrace a dostupnost výkonné výpočetní techniky (ČURDA et al., 2002). 3.5 Zahuštěné mléčné výrobky Odpařování je historicky první technologie zaměřená na kapalné látky v potravinářském průmyslu. Výroba zahuštěného mléka a sušených mléčných výrobků začala v 19. století, kdy francouzský vynálezce Nicolas Appert popsal postup pro koncentraci a sušení mléka (TAMIME, 2009). Charakteristickým znakem této skupiny mléčných výrobků, které mají vyšší obsah sušiny, je výrazně prodlouţena trvanlivost, a to buď vytvořením hypertonického prostředí (přídavek cukru), nebo sterilizací finálního výrobku. Jakost a trvanlivost výrobků je závislá především na sloţení a kvalitě pouţívaného mléka a jeho mikrobiologické jakosti. Kromě výrobků pro přímou spotřebu, v malospotřebitelském balení, se vyrábí zahuštěné mléko pro průmyslové zpracování (ŠUSTOVÁ, 2005). Tyto mléčné výrobky mají při zaručení hygieny výroby široké uplatnění ve výţivě lidí i hospodářských zvířat, ale také v dalších odvětvích potravinářského průmyslu. Výrobky lze snadněji a dlouhodoběji skladovat i přepravovat s mnohem niţšími náklady. Poskytují velké moţnosti při vyrovnávání sezónních výkyvů ve výrobě mléka (GAJDŮŠEK, 2000). 31

32 LITERÁRNÍ PŘEHLED Tab. 1: Poţadavky na jakost zahuštěných mléčných výrobků (ŠUSTOVÁ, 2005) Druh výrobku Obsah tuku (%) Mléčná sušina (%) Mléčná tukuprostá s. (%) Zahuštěná smetana více neţ 16,0 včetně 14,0 Zahuštěné plnotučné mléko Zahuštěné mléko polotučné Zahuštěné mléko odtučněné více neţ 8,0 včetně 28,0 4,0 aţ 4,5 24,0 20,0 méně neţ 1,0 včetně 24,0 20, Požadavky na jakost mléka Pro výrobu zahuštěných mléčných výrobků se kladou přísné poţadavky na mléko jak z hlediska smyslových a fyzikálně chemických, tak i mikrobiologických. Mléko musí odpovídat obecně poţadavkům pro nejlepší mléko dle ČSN. Zvláště jakostní mléko je poţadováno u výrobků určených pro kojeneckou a dětskou výţivu. Významným poţadavkem je čerstvost a mikrobiální jakost. Titrační kyselost by neměla překročit 7,8 SH, u kojenecké a dětské výţivy (KDV), ale i kondenzovaných mlék 7,2 SH. Z mikrobiologického hlediska je důleţitý nejen co nejniţší počet mikroorganismů jako celku, ale jsou kladeny i přísnější poţadavky na technologicky škodlivé mikroorganismy a u KDV velmi přísné poţadavky na přítomnost patogenních mikroorganismů. Mléko určené ke zpracování na kondenzované mléko by mělo mít dobrou tepelnou stabilitu. Zhoršení termostability způsobuje zvýšená koncentrace syrovátkových bílkovin (mlezivo, mastitidní mléko), narušená rovnováha bílkovin a minerálních látek (mlezivo, mléko od dojnic s poruchami výţivy a metabolismu), zvýšená titrační kyselost, případně proteolýza bílkovin způsobená mikrobiální činností nebo nativními enzymy (plasmin). Termostabilita však můţe být významně ovlivněna i technologickými postupy, např. zahušťováním (zvyšuje se koncentrace všech sloţek a mění se i vzájemné poměry), homogenizací mléka, přídavky aditivních látek, atd. (GAJDŮŠEK, 2000). 32

33 LITERÁRNÍ PŘEHLED Hodnocení mikrobiální jakosti mléka a mléčných výrobků Mléko a mléčné výrobky představují významnou sloţku stravy. Tyto výrobky jsou povaţovány za plnohodnotnou potravinu, protoţe obsahují bílkoviny, tuky, sacharidy, minerály, vitaminy a vodu. Svým sloţením jsou tedy vhodné i pro růst mikroorganismů. Mléko obsahuje relativně málo baterií, pokud pochází z vemene zdravé dojnice. Po nadojení je ovšem mléko vystaveno sekundární kontaminaci. Hlavními zdroji kontaminace jsou povrch struku a vemene (výkaly, stelivo), dojící zařízení, prostředí stáje, atd. (ANONYM, 2010). Jakost i trvanlivost mléka a mléčných výrobků je proto přímo závislá na mikrobiální čistotě syrového mléka. Zastoupení mikroorganismů v mléce můţe být značně různorodé. Hlavním ukazatelem hygienické kvality mléka je celkový počet mikroorganismů (CPM). Legislativa v České republice se od řídí nařízeními tzv. hygienického balíčku EU. Je to zejména nařízení, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny ţivočišného původu (č. 853/2005). Podle tohoto nařízení nesmí počet CPM v 1 ml syrového kravského mléka převyšovat hodnotu (KADLEC, 2007). Metody identifikace tohoto ukazatele však zachytávají pouze některé, i kdyţ převáţné, skupiny mikroorganismů. Proto jsou kromě CPM sledovány i některé specifické skupiny. Z hlediska zdravotního rizika je poţadována nepřítomnost (resp. jsou stanoveny hraniční hodnoty) patogenních mikroorganismů, tyto však nejsou specifikovány v ČSN. Z hlediska zpracovatelského jsou v ČSN stanoveny také poţadavky na maximální přípustné počty tzv. technicky škodlivých mikroorganismů, které svou přítomností a zejména metabolickou aktivitou mohou zhoršit, resp. zcela znehodnotit mlékárenské výrobky. Jedná se o koliformní bakterie (KB), jejichţ celkový počet smí být maximálně 1000 KTJ/ml, psychrotrofní mikroorganismy (PSM), jejichţ celkový počet nesmí překročit KTJ/ml, termorezistentní mikroorganismy (TRM), u nichţ je stanovena hranice max v 1 ml, resp. sporotvorné anaerobní bakterie (SPAN), které musí být negativní v 0,1 ml. Poţadavky na některou z těchto skupin mikroorganismů jsou uplatňovány podle výrobního zaměření zpracovatelského závodu (GAJDŮŠEK, 2003). Nejvýznamnější zdroje jednotlivých skupin mikroorganismů, které mohou v zemědělské prvovýrobě kontaminovat mléko, jsou uvedeny v tab

34 LITERÁRNÍ PŘEHLED Tab. 2: Typický výskyt mikroorganismů v prvovýrobě (GAJDŮŠEK, 2003) Místo odběru Zdroj pitné vody (studna) Proplachová voda Sanitace dobrá Sanitace špatná Povrch struku a vemene Ošetřující personál (ruce, oblečení, atd.) Podestýlka Mléčná ţláza (mastitidy) Chlazení Filtrační zařízení (filtr) Krmení (nekvalitní siláţ) Skupina mikroorganismů CPM, PSM CPM, PSM SPAN, SPA všechny CPM, SPAN, PAT, TRM, SPA, KB CPM, PAT CPM, SPAN, PAT, TRM, SPA, KB PAT, KB PSM, TRM, SPA KB SPAN (bacily a klostridie) CPM (celkový počet mikroorganismů), KB (koliformní), PAT (patogeny), PSM (psychrotrofní), SPA (sporotvorné aerobní), SPAN (sporotvorné anaerobní), TRM (termorezistentní) Trvanlivost slazeného kondenzovaného mléka je do značné míry výsledkem zvýšení osmotického tlaku (sníţení vodní aktivity) a přídavku cukru. Ke zvýšení osmotického tlaku přispívá zvýšení koncentrace mléčné sušiny odpařováním vody. Avšak některé mikroorganismy, jako např. kvasinky a mikrokoky, mohou být osmotolerantní. V konzervách slazeného kondenzovaného mléka, které jsou hermeticky uzavírány, je velmi nízký obsah vzduchu. Je tedy omezen růst aerobních mikroorganismů. Pouţití přídavku cukru k prodlouţení trvanlivosti slazeného kondenzovaného mléka by nemělo být povaţováno za náhradu pouţití kvalitního mléka. Důkladná sanitace, odpovídající zpracování a skladování je nezbytné (ROBINSON, 2002). 34

35 LITERÁRNÍ PŘEHLED Technologie výroby zahuštěného slazeného mléka Slazená kondenzovaná mléka se vyrábí z plnotučného či odstředěného mléka, ale také z mléka rekombinovaného kondenzovaného, které se skládá z odstředěného sušeného mléka, bezvodého mléčného tuku nebo rostlinného tuku a vody (CHANDAN et al., 2008). Prvním krokem je příjem mléka. Následně by měla proběhnout filtrace, chlazení mléka v deskových chladičích na teplotu 6 aţ 10 C, a poté přemístění mléka do zásobníku. Dále je mléko standardizováno na tučnost 3,35 % aţ 3,45 %. Úprava tuku je ovlivňována beztukovou sušinou mléka. Další částí výroby je rozváření a dávkování cukru. Stanovené mnoţství cukru se rozváří ve vodě na hustý cukerný sirup. Obsah vody v sirupu by neměl přesáhnout 25 %, protoţe přebytečná voda by musela být odpařena v odparce, čímţ by docházelo k delšímu zahušťování a výroba by se stala neekonomickou. Je důleţité, aby byl cukr dobře rozvařen a aby došlo k takovému tepelnému opracování, které zničí veškeré mikroorganismy včetně plísní a kvasinek. Koncentrace cukru ve slazeném kondenzovaném mléce je známá jako cukerný index, který se vyjadřuje v procentech. Hodnota cukerného indexu se pohybuje v rozmezí 63,5 64,5 %. Tento ukazatel chrání výrobek před znehodnocením následkem bakteriologických změn za předpokladu, ţe mléko bylo řádně pasterováno, a ţe se při technologii výroby dodrţela všechna hygienická a sanitační opatření. Cukr je do mléka dávkován přímo do diskontinuálních odparek během zahušťování. Rozvařený, horký cukerný sirup se nasává do odparky přes nerezové síto, na kterém se zadrţí veškeré nečistoty z cukru. Přidávaní cukru je nejvhodnější aţ v druhé části zahušťování, protoţe v této fázi působí přídavek cukru na maximální stabilitu mléka během skladování. Dále probíhá pasterace mléka. Cílem tohoto procesu je minimalizovat zdravotní nebezpečí, vyvolané patogenními mikroorganismy, tepelným zpracováním za minimálních chemických, fyzikálních a organoleptických změn. Podle výšky teploty záhřevu a doby působení rozlišujeme způsoby pasterace: - vysoká pasterace teplota 85 C případně i vyšší, doba záhřevu je 4 aţ 5 s. Je nejúčinnější, a proto se pouţívá k výrobě konzumního mléka. Mléko takto 35

36 LITERÁRNÍ PŘEHLED ošetřené vykazuje zhoršenou sýřitelnost, ničí se přirozené inhibiční látky (lakteniny). - krátkodobá (šetrná) pasterace teplota 71,7 75 C, doba s. U mléka vznikají menší změny fyzikálně chemických vlastností, proto je vhodné k výrobě sýrů. - dlouhodobá (nízká) pasterace teplota C po dobu 30 min. Pouţívá se ojediněle, např. při přípravě směsi k výrobě mraţených smetanových krémů. Chemické vlastnosti mléka se téměř nemění (LUKÁŠOVÁ et al., 2001). Pasterace mléka před zahušťováním je důleţitá pro odstranění všech vegetativních mikroorganismů a části sporulujících, zničení enzymů, zajištění uspokojivého provozu odparky mléko musí přicházet do odparky teplejší, neţ je provozní voda v odparce. Vhodně zvolená teplota pasterace zabraňuje houstnutí mléka během skladování (BALCAR et al., 1978). Na odpařování vody se pouţívají vakuové odparky, nejčastěji trubkové a ve vícestupňovém provedení (obvykle tří aţ čtyřstupňové). Jsou konstruovány tak, ţe předem ohřáté mléko stéká v tenkém filmu za intenzivního varu po vnitřní straně trubek a ohřívací médium je umístěno vně trubek. Vlastní odpařování je prováděno za podtlaku. IFIS (2005) uvádí, ţe odpařování je postupná změna skupenství z kapalného na plynné, které se vyskytuje na povrchu kapaliny. Při niţším tlaku dochází k varu zahušťovaného mléka při niţší teplotě, odpařování je šetrnější a rovněţ je niţší i spotřeba energie. Vznikající vodní (brýdové) páry jsou odsávány, komprimovány a těchto brýdových par se znovu vyuţívá jako topného média. Pouţíváním komprimovaných brýdových par k ohřevu mléka se získá zhruba tolik energie, jako na jednom stupni odparky. Při starším způsobu termokomprese brýdových par (tzv. TVR odparky thermal vapour recompression) jsou komprimované brýdové páry pouţívány jako topné médium v následujícím stupni, takţe mléko se postupně zahušťuje při teplotách od 75 C (v 1. stupni) aţ po 40 aţ 45 C (v posledním stupni) a v jednotlivých stupních se zvyšuje podtlak odpovídající teplotě varu mléka. Moderněji je pouţívána mechanická komprese (tzv. MVR odparky mechanical vapour recompression), kdy se stlačováním brýdových par zvýší jejich teplota o cca 3 aţ 4 C a mohou být opětovně pouţity jako topné médium v prvém členu odparky. Tímto způsobem je moţné odpařovat mléko při stále stejné teplotě (60 aţ 65 C), coţ výrazně 36

37 LITERÁRNÍ PŘEHLED zlepšuje kvalitu zahuštěného mléka. Spotřeba páry je u MVR odparek výrazně niţší, ale oproti TVR odparkám je vyšší spotřeba elektrické energie. Často jsou oba tyto systémy pouţívány v kombinaci (GAJDŮŠEK, 2000). Kondenzované mléko se po zahuštění na odparkách přečerpává do chladičů, kde se mléko jednak ochladí, ale také zde krystalizuje laktóza. Chladiče jsou vybaveny intenzivním míchacím zařízením (BALCAR et al., 1978). Mléko má po zahuštění jiţ tak malý obsah vody, ţe přítomné cukry po vychlazení nemohou zůstat v roztoku. Slazené kondenzované mléko obsahuje g laktózy na 100 g vody. Rozpustnost laktózy při pokojové teplotě je okolo 20 g na 100 g vody, ale ve slazeném kondenzovaném mléce je rozpustnost asi poloviční díky vysoké koncentraci sacharózy. V důsledku toho 75 % laktózy inklinuje ke krystalizaci (WALSTRA, 1999). Laktóza se však musí vyloučit v co nejmenších krystalech (do 10 µm). Pokud se vytvoří větší krystaly laktózy je výrobek moučný nebo písčitý (nad 15 µm). Toho se dosáhne vyvoláním rychlé krystalizace laktózy. Výrobek se rychle vychladí na 30 aţ 35 C (nejvýraznější krystalizace laktózy) a za stálého míchání a postupného dochlazování dochází ke krystalizaci laktózy. Pro zlepšení krystalizace je přidávána v nepatrném mnoţství jemně mletá laktóza. Celková doba chlazení na 20 C je asi 3,5 hodiny. Vychlazené mléko se obvykle ponechává do druhého dne za míchání (k dosaţení homogenity) a pak se asepticky naplní do vysterilovaných obalů. Obr. 4: Krystaly sacharózy ve slazeném kondenzovaném mléce (TAMIME, 2007) 37

38 LITERÁRNÍ PŘEHLED Výrobky jsou dodávány v malospotřebitelském (balené do plechovek nebo tub z hliníkového plechu) nebo ve velkospotřebitelském balení pro další průmyslová zpracování. Výrobky se nesterilují, přítomný cukr v dané koncentraci má dostačující konzervační účinek. Stejně se vyrábějí i další slazené zahuštěné výrobky, např. slazené kondenzované mléko s kakaem s obsahem tuku nad 23 %. Rozvařené kakao s částí sacharózy se přidává do zahuštěného slazeného mléka před chlazením (při zahušťování by docházelo ke ztrátě typického aroma kakaa). Pro výrobu zmrzlin je připravováno zahuštěné mléko, popř. smetana, s přídavkem cukru a vaječné směsi (Fredokrémy). Samostatně se pasterizuje vaječná směs s cukrem při teplotě 74 C, aby nedošlo ke koagulaci bílkovin. Tato směs se pak přidává k zahuštěnému mléku, popř. smetaně, s cukrem. Chlazení a krystalizace jsou obdobné jako u slazeného zahuštěného mléka. Hotové výrobky se skladují při teplotách pod 15 C. Podle způsobu balení bývá trvanlivost 6 aţ 12 měsíců. Zahuštěná slazená smetana (popř. další podobné výrobky s vyšším obsahem tuku) mají kratší dobu trvanlivosti, obvykle 3 měsíce (GAJDŮŠEK, 2000). Obr. 5: Postup výroby slazeného kondenzovaného mléka (BYLUND, 2003) 38