Proteinkinázy typu AGC a jejich role při regulaci transportu auxinu

Transkript

1 Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze Katedra experimentální biologie rostlin Proteinkinázy typu AGC a jejich role při regulaci transportu auxinu The role of AGC protein kinases in the regulation of auxin transport Marie Martincová Diplomová práce Praha 2011

2

3 Vedoucí diplomové práce: RNDr. Jan Petrášek, Ph.D. Finanční podpora vypracování diplomové práce: Grantová agentura Akademie věd České republiky, projekt KJB , , řešitel Jan Petrášek Grantová agentura České republiky, projekt P305/11/2476, , řešitel Jan Petrášek Operační program Praha Konkurenceschopnost Projekt CZ.2.16/3.1.00/21159, 2009, řešitel David Honys Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy, Centrum základního výzkumu LC06034, , řešitel Eva Zažímalová Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením školitele a s použitím citované literatury. Souhlasím s jejím zapůjčováním ke studijním účelům. V Praze dne Marie Martincová

4

5 Poděkování patří mému školiteli za jeho cenné rady, trpělivost a odborné vedení při vypracování mé diplomové práce. Dále děkuji všem členům Laboratoře hormonálních regulací u rostlin, ÚEB AV ČR, v.v.i., Praha za vytvoření příjemného pracovního prostředí a možnost konzultace, a především pak Mgr. Markétě Pařezové za její rady a pomoc během mé práce v laboratoři. Mé poděkování patří i Dr. Remko Offringovi (Institute of Biology Leiden, Department of Molecular and Developmental Genetics, Leiden, Nizozemsko) a Dr. Jiřímu Frimlovi (Univerzita Ghent, Belgie) za laskavé poskytnutí genových konstruktů. V neposlední řadě děkuji také mé rodině za morální i materiální podporu a povzbuzování při psaní této práce.

6

7 Obsah Obsah... 7 Seznam použitých zkratek... 9 Abstrakt a klíčová slova Abstract and Keywords Úvod Literární přehled Mechanizmus působení auxinu Mezibuněčný transport auxinu Chemiosmotická teorie a přenos auxinu přes plazmatickou membránu Proteiny AUX1/LAX Proteiny PGP/ABCB Proteiny PIN Funkce proteinů PIN Transkripční a translační regulace proteinů PIN Regulace buněčné lokalizace proteinů PIN Regulace proteinů PIN jejich specifickou degradací Regulace proteinů PIN inhibitory polárního transportu auxinu Regulace proteinů PIN specifickou fosforylací a defosforylací Proteinkinázy AGC Proteinkinázy AGC u živočichů Rostlinné proteinkinázy AGC Role proteinkináz AGC při regulaci transportu auxinu Role proteinfosfatázy PP2A v regulaci transportu auxinu Role PDK1 při regulaci aktivity proteinkináz AGCVIII Regulace aktivity proteinkináz AGCVIII pomocí iontů a Ca 2+ vazebných proteinů BTB proteiny při regulaci proteinkináz AGCVIII a transportu auxinu Fototropiny jako další zástupci proteinkináz AGCVIII a jejich možná funkce v regulaci transportu auxinu Cíle diplomové práce Materiál a metody Materiál Rostlinný materiál, bakteriální kmeny a kultivační média Použité kity Seznam použitých přístrojů Seznam použitých chemikálí Metody Práce s rostlinným materiálem Použité genové konstrukty a transgenní buněčné linie Stabilní transformace buněk tabákové linie BY Tranzientní transformace buněk BY-2 biolistickou metodou Izolace DNA a RNA Amplifikace plazmidů v Escherichia coli PCR, RT-PCR a DNA elektroforéza Konfokální mikroskopie a FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching Měření aktivního transportu auxinu z buněk

8 5 Výsledky Aktivita proteinkinázy PID stimuluje celkový transport auxinu z buněk Aktivita proteinkinázy PID ovlivňuje umisťování přenašečů PIN Studium buněčné lokalizace proteinkinázy PID Identifikace tabákových homologů AGC kináz Diskuze Souhrn Seznam citované literatury

9 Seznam použitých zkratek 2,4-D 4-Cl-IAA ABC transporter ABCB transporter ABP1 ADP AGC kinases AGCVIII AGC3 ARF ARFs Asp ATP AUX/IAA AUX1/LAX AuxRE BFA BTB doména BY-2 camp cdna cgmp D6PK DMSO DNA DTP EDTA ER EST FMN FRAP GDP GEF GFP Gly GNOM GTP IAA IBA kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina 4-chlor-indolyl-3-octová ATP-Binding Cassette transporter, membránový přenašeč ATP-Binding Cassette transporter, přenašeč ABC podtypu B AUXIN BINDING PROTEIN1, vazebný protein pro auxin adenosin difosfát camp-dependent protein kinases A (PKA), cgmp-dependent protein kinases G (PKG), and phospholipid-dependent protein kinases C (PKC), rodina proteinkináz obsahující PKA, PKG a PKC podskupina proteinkináz rodiny AGC podskupina AGCVIII kináz, do které patří i proteinkinázy PID, WAG1 a WAG2 ADP-ribozylační faktor AUXIN RESPONSE FACTORs, transkripční faktory vážící se na promotory auxinem indukovaných genů kyselina asparagová adenosin trifosfát AUXIN/INDOL-3-ACETIC ACID, transkripčních represory vázající se na ARFs AUXIN-RESISTANT1/LIKE AUX1, přenašeč auxinu z buněk Auxin-Responsive Element brefeldin A, inhibitor exocytózy Bric-a-brac, Tramtrack, Broad-Complex domain, protein-protein interakční motiv nazvaný podle transkripčních faktorů z banánové mušky a nalézající se v mnoha eukaryotických proteinech Bright Yellow 2, kultivar tabákové buněčné linie cyklický adenosin monofosfát complementary DNA cyklický guanosin monofosfát proteinkináza D6, z rodiny AGCVIII dimetyl sulfoxid deoxyribonukleová kyselina deoxyribonukleotid trifosfát kyselina ethylendiamintetraoctová endoplazmatické retikulum Expressed Sequence Tag flavin mononukleotid Fluorescence Recovery After Photobleaching guanosin difosfát GDP/GTP výměnný faktor zelený fluorescenční protein glycin GEF pro malé G proteiny typu ARF účastnící se pučení váčků a výběru jejich obsahu guanosin trifosfát kyselina indolyl-3-octová kyselina indolyl-3-máselná 9

10 KDEL ER retenční signál LB médium Luria-Bertani médium LOV doména Light, Oxygen, or Voltagesensing doména vážící chromofor FMN MAB4 MAB4/ENP/NPY1 (MACCHI-BOU4/ENHANCER OF PINOID/NAKED PINS IN YUC MUTANTS1), patří mezi BTB proteiny MES kyselina 2-(N-morfolino)etanosulfonová MG-132 inhibitor proteazomu MOP MODULATOR OF PIN, protein účastnící se post-transkripční regulace proteinů PIN MS médium Murashige a Skoog médium NAA kyselina naftalen-1-octová NBP NPA-vázající protein NPA kyselina 1-naftylftalamová, inhibitor polárního transportu auxinu NPH3 NON-HYPOCOTYL RESPONSE 3, patří mezi BTB proteiny NRT1.1 nitrátový transporter, přenašeč auxinu do buněk P fosfát PAA kyselina fenyloctová PAK camp-dependentní protein kináza PBA kyselina 2-(1-pyrenoyl)benzoová PBP1 PID-BINDING PROTEIN1, protein interagující s kinázou PID a s Ca 2+ PBP2 PID BINDING PROTEIN2, patří mezi BTB proteiny PCR Polymerase Chain Reaction PDK1 3-fosfoinositid-dependentní proteinkináza 1 PGP fosfoglykoprotein, přenašeč auxinu Phe fenylalanin PHOT fototropin, receptor modrého světla, proteinkináza z rodiny AGCVIII PID PINOID, proteinkináza z rodiny AGCVIII PIF PDK1-interacting fragment, doména na proteinkináze AGC sloužící k interakci s PDK1 PIN PINFORMED, přenašeč auxinu z buňky pka disociační konstanta PKB protein kináza B PKC protein kináza C PKG cgmp-dependentní protein kináza PP2A protein fosfatáza 2A PVC prevakuolární kompartmenty rcn1 roots curl in NPA 1, mutant nesoucí inzerci T-DNA v genu kódujícím regulační podjednotku A proteinu PP2A RFP červený fluorescenční protein RNA ribonukleová kyselina RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction SCF TIR1 komplex ubiquitinační ligázy SNX1 SORTING NEXIN1, součást komplexu retromer TAM tamoxifen TF transkripční faktor TCH3 TOUCH3, protein podobný kalmodulinu, interaguje s proteinem PID a s Ca 2+ TIBA kyselina 2,3,5-trijodbenzoová, inhibitor polárního transportu auxinu TIR1 TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE1, auxinový receptor 10

11 TPL TRH1 TRIS TWD1 Tyr A23 Tyr A51 VPS29 WAG WT TOPLESS, represor transkripce auxinem indukovaných genů TINY ROOT HAIR1, přenašeč auxinu do buněk tris(hydroxymetyl)aminometan TWISTED DWARF1, protein interagující s PGP Tyrfostin A23, inhibitor endocytózy Tyrfostin A51, nefunkční analog Tyr A23 VACUOLAR PROTEIN SORTING29, součást komplexu retromer WAVY ROOT GROWTH, proteinkináza z rodiny AGCVIII wild type 11

12 12

13 Abstrakt a klíčová slova Podskupina rostlinné kinázové rodiny AGC (AGCVIII) obsahuje několik kináz účastnících se regulace transportu auxinu. Jsou to proteinkinázy PID, WAG1, WAG2 a D6. Všechny tyto kinázy mohou fosforylovat proteiny PIN, přenašeče auxinu z buňky. Asymetrická polární lokalizace přenašečů PIN v buňkách umožňuje směrovaný transport auxinu pletivem. Regulací jejich exprese, aktivity či lokalizace lze tedy ovlivnit, jaké množství auxinu bude transportováno a jakým směrem. Tato práce je zaměřena především na bližší porozumění regulace transportu auxinu pomocí protein kinázy PID. Na buněčné suspenzi tabákové linie BY-2 stabilně a transientně transformované genem PID z Arabidopsis thaliana byly sledovány parametry akumulace radioaktivně značeného auxinu a současně lokalizace proteinů PIN a PID. Bylo zjištěno, že aktivita PID vedoucí zřejmě k fosforylaci přenašečů PIN nezpůsobuje zvýšení jejich aktivity, ale přesto ovlivní pozitivně transport auxinu z buněk tím, že zvyšuje množství proteinů PIN na plazmatické membráně. Výsledky naznačují, že fosforylované přenašeče PIN jsou pravděpodobně ve větší míře dopravovány z endozomálních kompartmentů do plazmatické membrány. Pomocí současné tranzientní exprese kinázy PID mutované v ATP vazebném místě a PIN1-RFP bylo ukázáno, že fosforylační aktivita kinázy PID je důležitá pro správné umisťování proteinů PIN do plazmatické membrány. Lokalizace samotné kinázy PID byla studována in vivo pomocí PID- GFP. Byla lokalizována především v kortikální cytoplazmě v těsné asociaci s plazmatickou membránou a v cytoplazmatických provazcích. Mutace v ATP vazebném místě kinázy PID nemá vliv na její lokalizaci v buňce. Využití cytoskeletálních drog neprokázalo žádnou interakce kinázy PID s cytoskeletem. Na základě homologie se sekvencemi protein kináz PID, WAG1 a WAG2 z Arabidopsis thaliana byly v tabákových databázích exprimovaných genů nalezeny příslušné homology a jejich exprese prokázána v buněčné suspenzi tabákových buněk BY-2 pomocí RT-PCR. Získané výsledky naznačují, že fosforylace PIN prostřednictvím PID ovlivňuje především jejich vnitrobuněčnou lokalizaci a že tato aktivita PID může ovlivnit celkovou bilanci transportu auxinu přes plazmatickou membránu. Klíčová slova: polární transport auxinu, PINFORMED, PINOID, fosforylace, auxin 13

14 14

15 Abstract and Keywords There are several members of the subfamily of plant AGC kinases (AGCVIII) suggested to play a role in the regulation of auxin transport, protein kinases PID, WAG1, WAG2 and D6. They all have been shown to perform regulatory phosphorylation of PIN auxin efflux carriers. It is the asymmetrical subcellular localization of PIN proteins that enables the auxin molecules to be transported through a tissue in a polar manner. Regulation of their expression, localization or activity can therefore affect the quantity and directionality of auxin transport. This thesis is focused on better understanding of the PID-mediated regulation of auxin transport. The auxin accumulation as well as the localization of PIN and PID proteins has been studied using stable and transient expression of Arabidopsis thaliana PID in tobacco cell line BY-2. As shown here, the activity of PID does not enhance the activity of PINs, but still it has a positive effect on auxin efflux by increasing the amount of PIN proteins on the plasma membrane. Results presented here suggest that PID-mediated phosphorylation of PIN proteins most likely promotes their exocytosis from endosomal compartments towards the plasma membrane. Using transient co-expression of PID kinase mutated in its ATP-binding site and PIN1-RFP it was shown that functional PID kinase is necessary for the correct plasma membrane localization of PIN proteins. The localization of protein kinase PID was studied using PID-GFP. It was shown that it is localized predominantly in the cortical cytoplasm in close association with the plasma membrane and in the cytoplasmic strands. The mutation in its ATP-binding site has no effect on its subcellular localization. No interaction of PID kinase with cytoskeleton was found as studied using cytoskeletal drugs. Based on the protein sequence homology with Arabidopsis thaliana protein kinases PID, WAG1 and WAG2, tobacco homologs were found in the translated database of expressed sequence tags. Their expression in BY-2 cells has been confirmed using RT-PCR. Altogether, results of this thesis suggest that the PID-mediated phosphorylation of PIN proteins affects their intracellular localization and that this PID-mediated activity might influence the overall balance of auxin transport across plasma membrane. Keywords: polar auxin transport, PINFORMED, PINOID, phosphorylation, auxin 15

16 16

17 1 Úvod Rostliny se liší od živočichů jednou velmi podstatnou skutečností. Nemohou se pohybovat, a tedy ani uniknout před špatnými životními podmínkami či predátory. Vyvinuly se u nich proto různé mechanizmy, kterými přizpůsobují své tělo a metabolizmus měnícím se okolním podmínkám. Rostliny jsou velice plastické, udržují si skupiny nediferencovaných a stále se obnovujících buněk v tzv. meristémech, jsou schopné výborně regenerovat pletiva, a dokonce vytvářet celé orgány de novo. Reagují též změnou směru růstu na vnější podněty, jako je nedostatek světla či růstová bariéra. A jak je v rostlinách zajištěn přenos signálu od nějakého vnějšího podnětu ke specifické vývojové odpovědi? Podobně jako u živočichů k tomu slouží hormony, jednoduché endogenní signální molekuly, které koordinují vývojové i fyziologické procesy. Rostlinné hormony (fytohormony) mají ve svém působení několik společných i odlišných rysů v porovnání s živočišnými hormony. Jsou účinné již ve velmi malých koncentracích a někdy jsou syntetizovány v jiných částech těla, než kde budou působit. Ale syntéza fytohormonů není většinou koncentrována do specializovaných tkání jako u živočichů a každá rostlinná buňka je schopná si určitý hormon vyrobit sama (shrnuto v Davies, 1995; Vanneste a Friml; 2009). Regulační mechanizmy ovlivňující biosyntézu, metabolizmus i transport fytohormonů jsou velmi složité. Musí odpovídat na rozličné signály z vnějšku a na jejich základě modulovat vývoj rostliny a jejích orgánů tak, aby se co nejlépe přizpůsobila měnícím se podmínkám prostředí. Auxin (kyselina indolyl-3-octová, IAA) představuje jeden z důležitých fytohormonů zodpovědných za růstové odpovědi na vnější signály. Je důležitý při dělení a elongaci buněk probíhající během mnoha procesů embryonálního i postembryonálního vývoje rostlin (shrnuto ve Woodward a Bartel, 2005; Tanaka a kol., 2006; Teale a kol., 2006; Fleming, 2006). Účinnost auxinu je zprostředkována jeho koncentračními rozdíly mezi jednotlivými buňkami či pletivy. Vznikající koncentrační gradienty jsou podkladem jeho morfogenního účinku. Rozdíly v koncentraci auxinu jsou tvořeny díky rozdílné lokální biosyntéze tohoto fytohormonu (Stepanova a kol., 2008; Tao a kol., 2008), ale také díky unikátní schopnosti auxinu být transportován z buňky do buňky polárně (shrnuto v Gao a kol., 2008; Vanneste a Friml, 2009). Samotná polarita transportu auxinu je zajištěna asymetrickým rozmístěním auxinových přenašečů v plazmatické membráně, a to zejména přenašečů auxinu ven z buňky (shrnuto v Petrášek a Friml, 2009). Mezi hlavní dosud popsané přenašeče auxinu ven z buňky patří transmembránové proteiny z rodiny PINFORMED (PIN; Gälweiler a kol., 1998; Petrášek a kol., 2006) a také 17

18 fosfoglykoproteiny (PGP), rostlinné ortology savčích ABC-transportérů (Dudler a Hertig, 1992; Terasaka a kol., 2005). Ty jsou ovšem až na výjimky (Geisler a kol., 2005) lokalizované v membráně symetricky, což naznačuje jejich roli spíše v podpoře transportu auxinu, jehož směrovost je udávána proteiny PIN. Za polární transport auxinu jsou tedy zodpovědné především proteiny PIN. Jejich aktivita, a tím i transport auxinu, je regulována na mnoha úrovních. Ty zahrnují regulaci jejich transkripce, ovlivnění proteosyntézy a maturace proteinů, transport přenašečů do membrány a jejich lokalizaci v buňce. Může být také přímo ovlivněna funkce již maturovaných proteinů prostřednictvím kompetitivní a nekompetitivní inhibice, fosforylace, defosforylace a řízené degradace (shrnuto v Titapiwatanakun a Murphy, 2009). Ve své diplomové práci jsem se zaměřila především na regulaci přenašečů PIN jejich specifickou fosforylací prostřednictvím serin/threoninových kináz z podrodiny AGCVIII (Benjamins a kol., 2001; Friml a kol., 2004; Robert a Offringa, 2008). Reverzibilní fosforylace proteinů je jednou z nejčastějších regulací funkce proteinů u eukaryot. Může regulovat aktivitu proteinů, jejich lokalizaci v buňce, stabilitu i schopnost interakce s dalšími proteiny. Rostlinné kinázy podrodiny AGCVIII patří do rodiny AGC kináz (Bögre a kol., 2003; shrnuto v Zhang a McCormick, 2009), které dostaly své jméno na základě homologie se savčími AGC kinázami. Ty zahrnují camp-dependentní protein kinázy (PKA), cgmpdependentní protein kinázy (PKG) a různé typy protein kináz C (PKC), protein kináz B (PKB) a 3-fosfoinositid-dependentní protein kinázu 1 (PDK1) (Zhang a McCormick, 2009). Mezi rostlinné kinázy z podrodiny AGCVIII patří několik proteinů ovlivňujících transport auxinu. Jsou to především protein kináza PID (Bennett a kol., 1995), WAG1 a WAG2 (Santner a Watson, 2006), nově objevené kinázy D6PK (Zourelidou a kol., 2009), ale také fototropiny, receptory modrého světla (shrnuto v Galván-Ampudia a Offringa, 2007). V rámci této diplomové práce jsem se především zabývala tím, jak kináza PID ovlivňuje umisťování přenašečů PIN do membrány, jak ovlivňuje rychlost endocytózy proteinů PIN při jejich cyklování mezi plazmatickou membránou a vnitrobuněčnými endozomálními kompartmenty (Geldner a kol., 2003) a kde do tohoto procesu zasahuje. Dále jsem se zajímala o to, jestli je vlastní umisťování proteinů PIN závislé na přítomnosti funkční kinázy PID nebo ne a zdali v lokalizaci samotné kinázy PID hraje nějakou roli cytoskelet. 18

19 2 Literární přehled 2.1 Mechanizmus působení auxinu V rostlinách můžeme nalézt několik přirozeně se vyskytujících auxinů. Nejvíce zastoupeným přirozeným auxinem se zdaleka nejvýznamnějším účinkem je kyselina indolyl- 3-octová (IAA). Dále byly u rostlin popsány 3 další endogenní auxiny. kyselina 4-chlorindolyl-3-octová (4-Cl-IAA), kyselina fenyloctová (PAA) a kyselina indolyl-3-máselná (IBA). V laboratořích i v zemědělství se dále používají syntetické auxiny, mezi které patří například kyselina naftalen-1-octová (NAA) či kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D) (Woodward a Bartel, 2005). Rostlina reaguje na změny hladiny auxinu v buňkách. Ty slouží ke zprostředkování nejrůznějších vnějších i vnitřních podnětů, ale mohou být i signálem k diferenciaci buňky. Při vývoji rostliny proto dochází k různým změnám v distribuci auxinu a ke vzniku lokálních auxinových maxim a gradientů. Již při vývoji embrya dochází k ustanovení auxinového maxima v hypofýze, jež je prekurzorem kořenového meristému (Weijers a kol., 2006). I v postembyonálním vývoji hraje nestejné rozložení auxinu svou roli (shrnuto v Tanaka a kol., 2006). Uplatňuje se při zakládání postranních orgánů jak kořenového, tak stonkového původu. Jeho zvýšená akumulace byla naměřena v místech zakládání nových kořenových, listových i květních orgánů. Auxinové maximum se tvoří v buňkách pericyklu, ze kterých se bude iniciovat zakládání postranních kořenů, a také v primordiích listů (Carraro a kol., 2006). Při růstu nově vznikajícího orgánu se pak vytvoří gradient auxinu s maximem ve vrcholu tohoto orgánu. Lokální akumulace auxinu dále slouží k vytvoření cévního pletiva, které bude nově vzniklý orgán spojovat s cévním pletivem rostliny (Mattsson a kol., 2003). Auxin sám přispívá ke vzniku svého maxima v určitém místě tím, že působí na transkripci určitých genů. Vyvolává v buňkách velmi rychlou expresi (v řádu minut) transkripčních regulátorů rodiny AUXIN/INDOL-3-ACETIC ACID (AUX/IAA; Abel a Theologis, 1996; Liscum a Reed, 2002). Tyto faktory mají schopnost represe transkripce určitých genů, ale také dimerizace s jinými AUX/IAA proteiny či s takzvanými AUXIN RESPONSE FACTORs (ARFs). Mohou také interagovat s proteinem TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1 (TIR1), který je součástí komplexu ubiquitinační ligázy SCF TIR1. Ten označuje cílové proteiny včetně AUX/IAA ubiquitinem, což vede k jejich následné degradaci v proteazomu. Auxin se zde chová jako signální molekula a váže se na receptorový protein TIR1 (Dharmasiri a kol., 2005). Tím se zvyšuje interakce mezi TIR1 a AUX/IAA a 19

20 dochází k řízené degradaci transkripčních regulátorů AUX/IAA v proteazomu (Gray a kol., 2001). Geny, jejichž exprese je regulována auxinem, většinou obsahují v promotorové oblasti regulační sekvenci, tzv. Auxin-Responsive Element (AuxRE, Ulmasov a kol., 1995). Na tu se váží ARF proteiny, často v interakci s jinými ARF proteiny nebo s AUX/IAA proteiny, inhibujícími transkripci (shrnuto ve Woodward a Bartel, 2005). Nedávno byl objeven protein TOPLESS (TPL, Szemenyei a kol., 2008), který také interaguje s proteiny AUX/IAA a funguje jako korepresor (Chapman a Estelle 2009; Santner a Estelle, 2010). Auxinem indukovaná exprese genů pro AUX/IAA je vlastně důmyslnou negativní zpětnou regulací (obr. 1). Auxin se váže na jaderný receptor TIR1, což má za následek okamžitou ubiquitinaci proteinů AUX/IAA a jejich degradaci v proteazomu. Tím dojde k uvolnění korepresorů z bezprostřední blízkosti ARF proteinů (Chapman a Estelle 2009) a následně k zesílení transkripce genu AUX/IAA zprostředkované nasednutím ARF proteinů na AuxRE v promotorové oblasti genu AUX/IAA. Tím dojde k opětovné akumulaci represorů AUX/IAA v buňce a k vypnutí auxinového signálu. Tento systém tedy umožňuje velice rychlou a reverzibilní signalizaci (Gray a kol., 2001). Obr. 1: Mechanizmus účinku auxinu. Při nízké hladině IAA represory transkripce AUX/IAA ve spolupráci s korepresory (CoRep) brání přepisování auxinem indukovaných genů. Po navázání IAA na receptor TIR1, který je součástí komplexu ubiquitinační ligázy SCF TIR1, dojde k označení proteinů AUX/IAA ubiquitinem a jejich následné degradaci v proteazomu. Poté je odpoután i korepresor z blízkosti ARF proteinů, inhibice je odblokována a transkripční faktory ARF mohou aktivovat expresi auxinem indukovaných genů. Převzato z Chapman a Estelle (2009). 20

21 2.2 Mezibuněčný transport auxinu Chemiosmotická teorie a přenos auxinu přes plazmatickou membránu Jak již bylo řečeno, účinek auxinu je zprostředkován koncentračními rozdíly mezi jednotlivými buňkami či pletivy, vznikají zde auxinová maxima a koncentrační gradienty, která jsou mimo jiné ustanovena díky unikátní schopnosti auxinu být na mezibuněčné úrovni transportován polárně (shrnuto v Tanaka a kol., 2006; Gao a kol., 2008). Pro vysvětlení mezibuněčného transportu auxinu byla navržena tzv. chemiosmotická hypotéza (Rubery a Sheldrake, 1974). Díky protonovým pumpám lokalizovaným na plazmatické membráně je na ní vytvářen protonový gradient. Ten způsobuje, že ph v mezibuněčném prostoru je o něco nižší než uvnitř buněk (přibližně 5,5 ku 7). IAA jakožto slabá kyselina s disociační konstantou pka rovnou 4,7 v nízkém ph apoplastu jen částečně disociuje. Nedisociované molekuly auxinu (IAA) jsou nepolární a hydrofóbní, mohou tedy přecházet přes plazmatickou membránu na základě koncentračního gradientu prostou pasivní difůzí bez dodání energie, zatímco polární disociované molekuly auxinu mohou být do buněk transportovány jedině aktivně pomocí specifického přenašeče. V neutrálním ph cytozolu je většina auxinu disociována, nemůže tedy pasivně procházet plazmatickou membránou ven z buněk. Jedinou možností, jak se může dostat ven, je aktivní transport pomocí přenašeče. Právě export auxinu je tedy tím kritickým krokem, který rozhoduje o tom, kolik auxinu se bude transportovat a jakým směrem, což záleží především na množství a lokalizaci vynašečů auxinu. Ty mohou být na plazmatické membráně umístěny asymetricky čímž je způsoben polarizovaný transport auxinu (shrnuto v Zažímalová a kol., 2007; Petrášek a Friml, 2009). K mezibuněčnému transportu auxinu slouží specifické přenašeče, z nichž některé mohou být na membráně lokalizovány polárně a sloužit tak ke směrování transportu auxinu určitým směrem (obr. 2). Hlavními dosud popsanými přenašeči jsou proteiny z rodiny AUX1/LAX, proteiny PIN a v neposlední řadě i proteiny PGP (shrnuto v Zažímalová a kol., 2010). Nedávno byl identifikován další protein transportující auxin do buněk, NRTl.l. Tento protein je lokalizován na plazmatické membráně a slouží také jako nitrátový transportér. Zatímco nitrát může inhibovat přenos auxinu do buněk, auxin takovýto efekt na příjem nitrátu přenašečem NRTl.l nemá (Krouk a kol., 2010). Uvažuje se o zapojení i jiných transportních proteinů, jako je TINY ROOT HAIR1 (TRH1), sloužící k přenosu draslíkových kationtů v kořeni (Vicente-Agullo a kol., 2004). 21

22 2.2.2 Proteiny AUX1/LAX K transportu disociovaných molekul auxinu do buňky slouží specifické přenašeče z rodiny AUXIN-RESISTANT1/LIKE AUX (AUX1/LAX, Bennett a kol., 1996), mezi které patří protein AUX1 a jeho homology LAX1, LAX2 a LAX3 (Parry a kol., 2001). Tyto přenašeče se podobají aminokyselinovým permeázám a transportují IAA (strukturně podobnou tryptofanu) do buněk symportem s protony. Tyto přenašeče se účastní mnoha postembryonálních vývojových procesů, jako je odpověď na gravitropní signály, fylotaxe a zakládání postraních kořenů (Marchant a kol., 1999; Parry a kol., 2001; Bainbridge a kol., 2008), ale také například organizace radikuly v embryonálním stádiu rostliny (Ugartechea- Chirino a kol., 2010). Mutant aux1 má postižen gravitorpizmus kořene (Marchant a kol., 1999). Přenašeč AUX1 je lokalizován na plazmatické membráně, v membráně Golgiho aparátu a v endozomech a jeho množství na membráně je regulováno cyklováním mezi plazmatickou membránou a endozomálními kompartmenty (Swarup a kol., 2004; Kleine- Vehn a kol., 2006). Obr. 2: Buněčný transport auxinu. Schéma znázorňuje buněčnou lokalizaci proteinů přenášejících auxin přes membránu. Převzato ze Zažímalová a kol. (2010). Proteiny AUX1 mohou být na membráně lokalizovány i asymetricky a přispívat tím k polárnímu transportu auxinu. Účastní se například směrování proudu auxinu z floému do kořenové špičky. V buňkách protofloému jsou přenašeče AUX1 lokalizovány jen na horní 22

23 straně buněk, zatímco na spodní straně jsou umístěny přenašeče auxinu ven z buňky (Swarup a kol., 2001) Proteiny PGP/ABCB Transportu auxinu se účastní také fosfoglykoproteiny (PGP), jež jsou rostlinnými ortology savčích ABC-transportérů typu B (ATP-binding cassette transporters type B, ABCB) sloužící podobně jako další ABC transportéry k zajištění rezistence vůči některým toxickým látkám a lékům (Noh a kol., 2001). Patří mezi primární přenašeče a transportují látky přes membránu za spotřeby ATP. Mutace v genech pro ABCB proteiny mají za následek fenotyp typický pro rostliny s poškozeným transportem auxinu (Noh a kol., 2001). Přenašeče ABCB mohou být v buňkách lokalizovány jak symetricky, tak i polarizovaně, například v endodermis a kůře elongační zóny kořene, účastní se tedy i polárního transportu auxinu (Geisler a kol., 2005). Účastní se také obou směrů transportu auxinu, jak do buňky (ABCB4), tak z buňky (ABCB1) (Terasaka a kol., 2005; Geisler a kol., 2005). Pokud jsou ABCB4 a ABCB1 lokalizovány v buňkách polárně, jsou umístěny na opačných koncích buněk (Geisler a kol., 2006). Regulace přenašečů ABCB není dosud příliš prozkoumaná. Existuje pozitivní korelace mezi mírou transportu auxinu a fosforylací ABCB proteinů (shrnuto v Geisler a kol., 2006). Přenašeče ABCB jsou také citlivé k flavonoidům, přirozeně se vyskytujícím regulátorům transportu auxinu z buněk. ABCB1 i ABCB4 váží flavonoidy i kyselinu 1-naftylftalamovou (NPA) a jsou jimi inhibovány. Biogeneze přenašečů ABCB je regulována v ER pomocí imunofilinu TWISTED DWARF1 (TWD1) (Geisler a kol., 2003; Bouchard a kol., 2006; Wu a kol., 2010). V mutantech twd1 jsou ABCB1, ABCB4 i ABCB19 lokalizovány pouze v ER. Protein TWD1 pravděpodobně interaguje s proteiny ABCB již na ER a účastní se jejich maturace potřebné pro jejich transport do plazmatické membrány Proteiny PIN Funkce proteinů PIN Při studiu mutantů Arabidopsis thaliana byl objeven další protein, který by mohl být přenašečem auxinu ven z buňky. Mutanty pin-formed vykazují fenotyp podobný rostlinám pěstovaným za přítomnosti inhibitorů polárního transportu auxinu (Okada a kol., 1991). Mají narušenou tvorbu květních primordií, postranních orgánů, fylotaxi, vývoj děloh, 23

24 gravitropizmus a další procesy spojené s transportem auxinu (Luschnig a kol., 1998; Benková a kol., 2003; Friml a kol., 2003; Reinhardt a kol., 2003;). Protein PIN1 je dlouhý 622 aminokyselin a má 8-12 transmembránových domén obklopujících centrální hydrofilní oblast. Podobnou strukturu má i mnoho jiných proteinů, které se účastní různých transmembránových transportních procesů. Proteiny PIN patří do skupiny sekundárních přenašečů, které přenášejí chemické látky přes membránu na úkor energie elektrochemického gradientu na membráně (Gälweiler a kol., 1998). V Arabidopsis je kódováno 8 různých PIN proteinů, které lze zhruba rozdělit do dvou skupin podle délky jejich centrální hydrofilní domény. Mají také rozdílné funkce a lokalizaci v buňce (shrnuto v Petrášek a Friml 2009; Zažímalová a kol., 2010). Proteiny PIN z první skupiny jsou lokalizovány především asymetricky na plazmatické membráně a slouží ke směrovanému transportu auxinu z buňky (Petrášek a kol., 2006). Patří sem proteiny PIN1, PIN2, PIN3, PIN4 a PIN7 účastnící se růstových odpovědí na vnější podněty, směrovaného transportu auxinu z růstového vrcholu do špičky kořene a reorientaci jeho proudu zpět skrz epidermis kořene, ustanovení kořenového meristému, organogeneze i formování apikálněbazální osy embrya (Okada a kol., 1991; Müller a kol., 1998; Luschnig a kol., 1998; Friml a kol., 2002a; Friml a kol., 2002b; Friml a kol., 2003). Do druhé skupiny patří proteiny PIN5, PIN6 a PIN8, které jsou lokalizovány v membráně endoplazmatického retikula. Jak bylo ukázáno u PIN5, mohou zprostředkovávat transport auxinu mezi cytosolem a ER a tím regulovat množství auxinu dostupné pro buněčné děje, ale i pro mezibuněčný transport (Mravec a kol., 2009). Exprese jednotlivých proteinů PIN je tkáňově specifická a různé PIN proteiny se také účastní různých vývojových procesů. Funkce těchto přenašečů se ale částečně překrývají, proto rostliny nesoucí mutaci v jednotlivých proteinech PIN nevykazují takové poškození, jaké by se předpokládalo. Mutace jednoho z PIN genů může být funkčně kompenzována ektopickou expresí jiného proteinu PIN. Tato částečná záměnnost je pro rostliny velmi důležitá a přispívá k jejich vysoké plasticitě (Vieten a kol., 2005). Proteiny PIN se nevyskytují v plazmatické membráně samostatně, ale tvoří komplex s dalšími proteiny. Jedním z nich je NPA-vázající protein (NBP; Butler a kol., 1998). Jak vyplývá z názvu, je tento protein místem inhibičního působení NPA a je také pravděpodobně tou částí komplexu, která je zodpovědná za vazbu s aktinovým cytoskeletem. Po inkubaci buněk s cytochalasinem D, cytoskeletální drogou způsobující fragmentaci aktinového cytoskeletu, dochází ke snížení míry transportu auxinu. NPA-vázající protein, a s ním i celý 24

25 komplex přenašeče auxinu, je tedy pravděpodobně držen na membráně ve správné poloze pomocí aktinového cytoskeletu (shrnuto v Muday, 2000). Bylo také zjištěno, že i proteiny ABCB interagují s přenašeči PIN na plazmatické membráně. PIN1 kolokalizuje s ABCB19 v mikrodoménách bohatých na sterol, které jsou podobné lipidovým raftům. V mutantech abcb19 se PIN1 v těchto doménách nevyskytuje, ABCB19 tedy pravděpodobně stabilizuje komplex přenašeče PIN1 v membráně (Bandyopadhyay a kol., 2007; Titapiwatanakun a kol., 2009). Proteiny PIN a ABCB se nejspíše účastní koordinovaných, ale vzájemně nezávislých transportních procesů. Zatímco přenašeče PIN jsou vzhledem ke své schopnosti polarizovaného umísťování určující pro směrovost transportu auxinu, přenašeče ABCB, jejichž dynamika je podstatně nižší, tok auxinu spíše podporují v pletivech, kde je např. velká produkce auxinu a současně velká potřeba jeho odvádění. Proteiny ABCB tak modulují hladinu auxinu v buňkách a tím určují, jaký objem auxinu bude dostupný pro jeho polarizovaný transport pomocí proteinů PIN (Blakeslee a kol., 2007; Mravec a kol., 2008). Proteiny PIN jsou důležité pro distribuci auxinu v rostlině a ustanovení různých koncentračních gradientů a maxim auxinu v tkáních při mnoha vývojových procesech. Jejich funkce je proto velice citlivě regulována na mnoha úrovních. Může být ovlivněna transkripce těchto přenašečů, jejich aktivita, transport do membrány a lokalizace v buňce. Množství proteinů PIN je regulováno také specifickou degradací Transkripční a translační regulace proteinů PIN Bylo dokázáno, že geny kódující proteiny PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, PIN6 a PIN7 patří mezi ty, jejichž exprese je indukována po působení auxinu (Vieten a kol., 2005; Paponov a kol., 2008). Regulace genové exprese je zprostředkována AUX/IAA-závislou dráhou. Auxin se po vniku do buňky váže na receptor TIR1, dojde k ubiquitinaci a následné degradaci represorů AUX/IAA v proteazomu a k uvolnění transkripčních faktorů ARF z jejich inhibice. Ty mohou poté aktivovat transkripci proteinů PIN. Tento mechanizmus představuje důmyslnou pozitivní zpětnou regulaci transportu auxinu. Post-transkripční regulace proteinů PIN nejsou zatím příliš prostudovány. Doposud byly nalezeny dva geny, MODULATOR OF PIN2 (MOP2) a MOP3 (Malenica a kol., 2007), které nemají vliv na expresi proteinů PIN ani na jejich lokalizaci v buňce. Pokud ale v rostlině chybí, dochází k významnému snížení množství proteinů PIN v buňkách i k ovlivnění jejich 25

26 aktivity, což naznačuje možné zapojení proteinů MOP2 a MOP3 v post-transkripční regulaci proteinů PIN Regulace buněčné lokalizace proteinů PIN Jak bylo nejprve ukázáno pomocí brefeldinu A (BFA), inhibitoru váčkového transportu směrem k plazmatické membráně, proteiny PIN neustále cyklují mezi plazmatickou membránou a endozomálními kompartmenty (Geldner a kol., 2001). Regulací tohoto procesu lze ovlivnit množství přenašečů PIN na membráně dostupných pro přenos auxinu, lze tedy ovlivnit objem toku auxinu z buněk. Bylo také zjištěno, že nově syntetizované proteiny PIN jsou lokalizovány v plazmatické membráně nejprve asymetricky a teprve procesem cyklování dochází k jejich polarizaci (Dhonukshe a kol., 2008a). Transportu směrem k plazmatické membráně se účastní protein GNOM, GDP/GTP výměnný faktor (GEF-GDP/GTP exchange factor) pro malé G proteiny typu ARF (ADP-ribosylační faktor; Geldner a kol., 2003). Je nezbytný pro pučení váčků a výběr jejich obsahu, reguluje transport váčků a řídí tak správnou lokalizaci proteinů PIN1 do membrány (Steinmann a kol., 1999). Protein GNOM je citlivý k BFA, po jeho aplikaci dochází k reverzibilnímu nahloučení proteinů do endozomálních kompartmentů, tzv. BFA kompartmentů (Geldner a kol., 2001). Rostlinné buňky využívají více mechanizmů při směrování proteinů PIN do předem definovaných oblastí plazmatické membrány. Bylo ukázáno, že PIN1 ve stélé či PIN2 v mladých buňkách kůry kořene umístěné na bazální straně buněk (směrem ke špičce kořene) se po aplikaci BFA stáhnou do BFA kompartmentů, zatímco PIN proteiny lokalizované na apikální straně buněk, jako je například PIN2 v buňkách epidermis kořene, zůstávají na membráně (Kleine-Vehn a kol., 2008a). Cílení jednotlivých přenašečů PIN do membrány je tedy zprostředkováno nejméně dvěma odlišnými systémy využívajícími různé ARF-GEF proteiny. Transportu do bazální membrány se účastní BFA-senzitivní ARF-GEF, nejspíše GNOM, transport na apikální stranu je zajištěn mechanizmem necitlivým k BFA (obr. 3). Výběr transportní cesty a příslušných ARF-GEF je buněčně specifický. Obě tyto transportní cesty jsou ale propojené, protože po delším působení BFA dochází k vymizení BFA kompartmentů a k transportu endozomů na apikální stranu buňky (Dhonukshe a kol., 2008a; Kleine-Vehn a kol., 2008a). 26

27 Obr. 3: Cyklování proteinů PIN. Schéma znázorňuje 2 různé cesty cílení jednotlivých proteinů PIN do membrány a jejich cyklování. Transportu do bazální membrány se účastní BFA-senzitivní ARF-GEF, nejspíše GNOM, transport na apikální stranu je zajištěn mechanizmem necitlivým k BFA. Převzato z Friml a kol. (2010). Cyklování membránových váčků lze zhruba dělit na dva základní procesy. Endocytózu, neboli pohyb vezikulů z plazmatické membrány do endozomálních kompartmentů, a exocytózu, tj. transport váčků směrem k plazmatické membráně. Endocytóza je přitom zřejmě regulována samotným auxinem (Paciorek a kol., 2005). Auxin inhibuje endocytózu proteinů PIN, což vede k jejich zvýšenému výskytu na membráně. Auxin tím sám zvyšuje svůj transport ven z buněk, což je důležitá negativní zpětná regulace jeho vnitrobuněčné hladiny. Při endocytóze vznikají klatrinové váčky, do kterých jsou proteiny PIN směrovány pomocí klatrinového adaptorového komplexu (Dhonukshe a kol., 2007). Bylo zjištěno, že inhibice endocytózy auxinem je zprostředkována vazbou auxinu na AUXIN BINDING PROTEIN1 (ABP1) (Robert a kol., 2010), který funguje jako jeho receptor (Löbler a Klambt, 1985). Přestože protein ABP1 obsahuje retenční sekvenci KDEL pro zachycení v lumenu ER, je v omezené míře sekretován i do mimobuněčného prostoru, kde působí (Henderson a kol., 1997; Shimomura a kol., 1999). ABP1 bez navázaného auxinu má pozitivní vliv na klatrinem zprostředkovanou endocytózu. Vazba auxinu na ABP1 tento pozitivní vliv inhibuje, po jeho působení dochází k rychlému vymizení klatrinu asociovaného 27

28 s membránou, nedojde k pučení klatrinových váčků a k endocytóze proteinů PIN. Tento efekt auxinu není specifický jen pro cyklování přenašečů PIN, ale platí pro endocytózu obecně (Robert a kol., 2010). Významů cyklování proteinů PIN může být více. Pomocí tohoto procesu je docílena správná lokalizace těchto přenašečů v buňce (Dhonukshe a kol., 2008a), lze jím regulovat množství přenašečů na membráně a může sloužit i k jejich rychlé relokalizaci a tím ke změně transportu auxinu. Je také možné, že tímto způsobem dochází k akumulaci auxinu v endozomálních váčcích a takto nahromaděný auxin je pak možno směrovat do jiných částí buňky (shrnuto v Zažímalová a kol., 2007). Důležitou strukturou účastnící se transportu váčků je cytoskelet, tvořící dynamickou kostru buňky. Drží jednotlivé organely i proteiny signálních drah na svém místě a určuje tvar buňky. Pro transport membránových váčků v interfázové buňce slouží především aktinový cytoskelet, zatímco rolí mikrotubulů je řízení pohybu celulóza syntázového komplexu, řídí tedy ukládání celulozových mikrofibril a tím i směr růstu buněk (Paredez a kol., 2006). Pokusy s cytoskeletálními drogami bylo zjištěno, že především aktin je důležitý pro transport proteinů PIN do membrány. Po aplikaci latrunculinu B, látky způsobující depolymeraci aktinových filament, je silně ovlivněna apikální lokalizace proteinu PIN2 v epidermis kořene, zatímco jeho lokalizace v mladých buňkách kortexu, kde je PIN2 umístěn na bazální straně buněk, tolik poškozena není. Po aplikaci oryzalinu, který způsobuje depolymeraci mikrotubulů, je naopak negativně ovlivněna polární lokalizace na bazální straně buňky, jako například u proteinu PIN1 ve stélé (Kleine-Vehn a kol., 2008b). Tento efekt ale může být jen vedlejším důsledkem depolymerace kortikálních mikrotubulů a následných změn ve struktuře buněčné stěny a tvaru buněk Regulace funkce proteinů PIN jejich specifickou degradací Množství proteinů PIN na membráně, a tedy i vnitrobuněčná hladina auxinu, může být též regulováno specifickou degradací přenašečů PIN. Tento proces byl popsán pro účast PIN2 při zprostředkování gravitropické odpovědi kořene. Změnou hladiny auxinu na spodní a svrchní straně kořene je zajištěna rychlá gravitropická reakce, PIN2 je degradován v horní části kořene, naopak ve spodní části k této degradaci nedochází (Sieberer a kol., 2000; Abas a kol., 2006). K degradaci PIN2 dochází v lytických vakuolách, kam jsou směrovány proteiny PIN přes prevakuolární kompartmenty (PVC) pomocí specifických proteinů ARF-GEF, procesu degradace se účastní i proteazóm (Abas a kol., 2006). K cílení membránových 28

29 přenašečů PIN k degradaci je důležitá také signalizace pomocí fosfatidylinositol-3-kinázy a také aktinový cytoskelet. Regulace degradace se účastní i proteinový komplex retromer, jehož dva komponenty, proteiny SORTING NEXIN1 (SNX1) a VACUOLAR PROTEIN SORTING29 (VPS29) slouží k recyklaci přenašečů PIN z PVC pravděpodobně do trans- Golgiho komplexu a tím vlastně brání jejich degradaci (Kleine-Vehn a kol., 2008c) Regulace aktivity proteinů PIN prostřednictvím inhibitorů polárního transportu auxinu Inhibitory polárního transportu auxinu jsou látky, které ovlivňují aktivitu i lokalizaci přenašečů auxinu. Po jejich působení je transport auxinu ven z buněk snížen a následně se více hromadí v buňkách (Katekar a Geissler, 1980). Mezi tyto inhibitory patří například kyselina 2,3,5-trijodbenzoová (TIBA) či kyselina 2-(1-pyrenoyl)benzoová (PBA), které pravděpodobně stabilizují aktinový cytoskelet a tím ovlivňují transporty váčků i cyklování přenašečů auxinu (Dhonukshe a kol., 2008b). Nejčastěji studovaným inhibitorem polárního transportu auxinu je kyselina 1-naftylftalamová (NPA) náležící mezi tzv. fytotropiny. Mezi proteiny inhibované NPA patří i přenašeče ABCB (Geisler a kol., 2005), kde NPA narušuje jejich vazbu s imunofilinem TWD1 (Bailly a kol., 2008). Přirozeně vyskytujícími se obdobami fytotropinů jsou flavonoidy, sekundární metabolity rostlin (Jacobs a Rubery, 1988). Zvýšená hladina flavonoidů narušuje polární transport auxinu, rostliny jsou zakrslé, zatímco u rostlin s poškozenou biosyntézou flavonoidů dochází ke zvýšenému transportu auxinu ven z buněk (Murphy a kol., 2000). Flavonoidy jsou tedy pravděpodobně přirozenými inhibitory transportu auxinu z buněk (shrnuto v Buer a kol., 2010). Není zatím známo, jestli flavonoidy přímo regulují aktivitu přenašečů PIN, nebo nějakým způsobem ovlivňují jejich lokalizaci či transport do membrány nebo dokonce obojí (Peer a Murphy, 2007; Buer a Djordjevic, 2009). Nedávno bylo zjištěno, že flavonoidy mohou dokonce i aktivovat a měnit směr transportu auxinu ovlivněním vnitrobuněčného transportu komplexu jeho přenašečů, působí tedy pravděpodobně trochu jiným mechanizmem než NPA (Santelia a kol., 2008) Regulace aktivity proteinů PIN specifickou fosforylací a defosforylací Reverzibilní fosforylace proteinů je jednou z nejčastějších regulací funkce proteinů u eukaryot. Je zajištěna enzymatickým aparátem proteinkináz a proteinfosfatáz. Může regulovat 29

30 aktivitu proteinů, jejich lokalizaci v buňce, stabilitu i schopnost interakce s dalšími proteiny. Fosforylace proteinů PIN je zprostředkována proteinkinázami z rodiny AGC, zatímco defosforylaci pravděpodobně zajišťuje proteinfosfatáza PP2A (shrnuto v Galván-Ampudia a Offringa, 2007, Michniewitz a kol., 2007). Role fosforylace a defosforylace je podrobně popsána dále (kap. 2.3). 2.3 Proteinkinázy AGC Proteinkinázy AGC u živočichů Rostlinné kinázy rodiny AGC byly pojmenovány na základě své homologie s živočišnými kinázami typu AGC (zahrnují camp-dependentní protein kinázy [PKA], cgmp-dependentní protein kinázy [PKG] a různé typy protein kináz C [PKC], protein kináz B [PKB] a 3-fosfoinositid-dependentní protein kinázu 1 [PDK1]; Bögre a kol., 2003). U živočichů slouží v dráze přenosu signálu od navázání růstových regulátorů a hormonů na receptor, až ke zprostředkování jejich funkce například změnou aktivity efektorových proteinů či ovlivněním genové exprese. Navázáním signální molekuly na receptor je aktivována dráha generující druhého posla, který může měnit aktivitu řady molekul, mezi nimi i různých proteinkináz AGC. Proteinkinázy A, B i C jsou aktivovány fosforylací jejich aktivační smyčky pomocí PDK1 (shrnuto v Newton, 2003; Mora a kol., 2004). Samotná PDK1 má schopnost autofosforylace své aktivační smyčky a tedy samoaktivace (Wick a kol., 2003). Proteinkinázy AGC mají v organizmu více různých funkcí, jimi zprostředkovaná fosforylace má za následek ovlivnění aktivity mnoha regulačních proteinů, které dále řídí procesy, jako jsou regulace diferenciace buněk, jejich dělení, přenos látek přes membránu nebo inhibice apoptózy (shrnuto v Mora a kol., 2004). Homologie rostlinných proteinkináz AGC naznačuje jejich zapojení v přenosu signálu a regulaci obdobných procesů Rostlinné proteinkinázy AGC V rostlinách bylo nalezeno několik serin/threoninových proteinkináz účastnících se transportu auxinu. Všechny patří do proteinkinázové rodiny AGC, podskupiny AGCVIII. Celkem je v rostlinách kódováno 23 kináz z této podskupiny a patří sem vedle zatím nejlépe prostudované proteinkinázy PINOID (PID) i proteinkinázy WAVY ROOT GROWTH1 30

31 (WAG1), WAG2, kinázy D6, a také fototropiny (PHOT1 a PHOT2), receptory modrého světla (Bögre a kol., 2003; Galván-Ampudia a Offringa, 2007; Zourelidou a kol., 2009). Proteinkinázy podskupiny AGCVIII pravděpodobně pocházejí ze společného předka. Dnes je můžeme rozdělit do čtyř skupin podle funkce, jakou v rostlinách zastávají. Kinázy AGC1 hrají roli v buněčné organizaci a regulaci transportu auxinu, kinázy AGC2 se účastní odpovědi na stres, kinázy AGC3 regulují polární transport auxinu a kinázy AGC4 zprostředkovávají fototropní odpověď (Galván-Ampudia a Offringa, 2007). Všechny proteinkinázy AGCVIII mají podobnou aminokyselinovou sekvenci jako jiné serin/threoninové proteinkinázy a jejich katalytická doména obsahuje všech 11 subdomén typických pro katalytickou doménu ostatních proteinkináz (Hanks a kol., 1988). Tuto proteinkinázovou rodinu charakterizuje především záměna glycinu na 225. pozici v aminokyselinovém řetězci za aspartát. Záměnou této jedné aminokyseliny dochází ke změně konzervovaného motivu DFG (Asp-Phe-Gly) v subdoméně VII za triplet DFD (Asp-Phe-Asp) (Christensen a kol., 2000, shrnuto v Galván-Ampudia a Offringa, 2007) Role proteinkináz AGC při regulaci transportu auxinu Nejlépe popsanou proteinkinázou AGC z hlediska její role v mezibuněčném transportu auxinu je proteinkináza PINOID (PID). Mutanty pid mají podobný fenotyp jako rostliny mutantní v genu pro PIN1 (Bennet a kol., 1995, Christensen a kol., 2000). Je narušena fylotaxie a zakládání děloh. Květenství je skoro holé, jen s malým počtem květů s vysokým stupněm poškození. Naopak nadprodukce proteinů PID vede k agravitropickému růstu kořene i hypokotylu a někdy až k úplnému kolapsu meristému primárního kořene v důsledku vyčerpání auxinu (Benjamins a kol., 2001). Gen PID patří mezi auxinem indukovanou skupinu genů (Benjamins a kol., 2001). Jeho promotorové oblasti obsahují sekvence AuxRE. Protein PID je asociován s plazmatickou membránou pomocí interakce s membránovými proteiny, byla prokázána kolokalizace s přenašeči PIN (Michniewicz a kol., 2007). S proteinkinázou PID kolokalizují u membrány i další proteinkinázy AGC, WAG1, WAG2 a D6 (Galván-Ampudia a Offringa, 2007). Všechny tyto kinázy mohou fosforylovat přenašeče PIN. Doposud nebylo zjištěno, kde přesně kinázy D6 PIN fosforylují, ale cílem fosforylace ostatních tří kináz je centrální hydrofilní smyčka proteinu PIN, kde byl nalezen vysoce konzervovaný serin/threoninový motiv. Toto Ser/Thr fosforylační místo je společné všem proteinům PIN lokalizovaným na plazmatické membráně, zatímco PIN proteiny vyskytující 31

32 se na endoplazmatickém retikulu (Mravec a kol., 2009) tento motiv neobsahují (Zourelidou a kol., 2009; Dhonukshe a kol., 2010; Huang a kol., 2010; Zhang a kol., 2010). Bylo prokázáno, že proteinkináza PID má vliv na lokalizaci auxinových přenašečů PIN v buňce (Friml a kol., 2004). Nízká hladina proteinů PID v podpokožkových buňkách primárního kořene Arabidopsis, a tím pádem malá míra fosforylace přenašečů PIN1, PIN2 a PIN4, vede k jejich lokalizaci na bazální straně buněk. Nadprodukce proteinkinázy PID, a tím pádem větší míra fosforylace přenašečů, způsobuje přesun proteinů PIN2 a PIN4 na apikální stranu buňky. To má za následek kolaps kořenového meristému u takových rostlin (Friml a kol., 2004). Pokud však jsou v buňkách proteiny PIN lokalizovány nepolárně, jako například PIN1 a PIN3 v buňkách kořenových vlásků, nedochází po inhibici kinázy PID staurosporinem k jejich přemístění na jinou stranu buňky, ale k jejich shlukování, kináza PID tedy nejspíše napomáhá proteinům PIN v lokalizaci do správných částí membrány. Po nadprodukci kinázy PID pak dochází k inhibici růstu kořenových vlásků, což může být dáno větším množstvím přenašečů PIN v membráně a tedy zvýšenou mírou transportu auxinu z buněk a vyčerpáním auxinu, ale i zvýšenou aktivitou přenašečů PIN díky fosforylaci zprostředkované proteinkinázou PID (Lee a Cho, 2006). Jak již bylo zmíněno výše, lokalizace proteinů PIN a jejich množství v plazmatické membráně je regulováno jejich dynamickým cyklováním mezi membránou a endozomálními kompartmenty (Geldner a kol., 2001). Zatímco exocytóza váčků s přenašeči PIN do membrány na bazální straně buňky je závislá na proteinu GNOM a je tedy citlivá k BFA, cílení membránových váčků na apikální stranu buňky se účastní jiný ARF-GEF protein, necitlivý k BFA (Geldner a kol., 2003; Kleine-Vehn a kol., 2008a). Je pravděpodobné, že protein kináza PID určuje lokalizaci proteinů PIN v buňce právě zasažením do procesu jeho cyklování. Bylo prokázáno, že proteinkináza PID, ale i proteinkinázy WAG1 a WAG2 fosforylují PIN na jeho centrální hydrofilní smyčce a tím určují jeho cílení do apikální části membrány. Žádný účinek na relokalizaci proteinů PIN nebyl prokázán pro kinázy D6 (Friml a kol., 2004; Michniewitz a kol., 2007; Dhonukshe a kol., 2010; Zhang a kol., 2010). Protože byla zjištěna jen malá míra kolokalizace proteinů PIN s kinázou PID v endozómech (Kleine- Vehn a kol., 2009), je pravděpodobné, že k fosforylaci proteinů PIN dochází na plazmatické membráně. Byl navržen model (Dhonukshe a kol., 2010), podle kterého kinázy PID, WAG1 a WAG2 fosforylují primárně nepolárně lokalizovaný, nově syntetizovaný PIN přímo na plazmatické membráně, čímž je spuštěna jeho endocytóza a následný na proteinu GNOM nezávislý transport těchto váčků na apikální stranu buňky, zatímco nefosforylované proteiny 32

33 PIN jsou určeny k recyklaci na bazální stranu buňky pomocí GNOM. Sukumar a kol. (2009) zjistili, že apikální lokalizace přenašečů PIN2 v pokožkových buňkách kořene zůstává neporušena i v mutantech pid. Zajištění správné lokalizace proteinů PIN v buňce se tedy pravděpodobně účastní ještě jiné proteinkinázy, je také možné, že se funkce jednotlivých AGC kináz doplňují a při mutaci jedné z nich může dojít k funkční náhradě jinou homologní kinázou. To potvrzuje i postupně se zhoršující poškození zakládání děloh v embryogenezi ve fenotypu jednoduchých, dvojitých až trojitých mutantů pin wag1 wag2 (Dhonukshe a kol., 2010). Jak bylo v nedávné době ukázáno, exprese kinázy PID může být regulována světlem a tato světlem regulovaná exprese PID může hrát roli ve specifické redistribuci PIN3 nutné pro fototropní odpověď rostlin Arabidopsis (Ding a kol., 2011) Role proteinfosfatázy PP2A v regulaci transportu auxinu Bylo zjištěno, že proteinfosfatáza PP2A působí antagonisticky k proteinu PID. PID a PP2A působí zřejmě jako kinázo-fosfatázový pár (Michniewicz a kol., 2007). Tato fosfatáza byla nalezena díky mutantu rcn1 (roots curl in NPA 1), jehož kořeny se chovají atypicky v přítomnosti inhibitoru transportu auxinu NPA. Mutant rcn1 nese inzerci T-DNA v genu kódujícím regulační podjednotku A proteinu PP2A (Garbers a kol., 1996). V Arabidopsis je kódováno velké množství různých izoforem fosfatázy PP2A, jejichž exprese může být tkáňově specifická. Nepodílejí se pouze na regulaci transportu auxinu, ale ovlivňují i mnoho dalších procesů od buněčného dělení, až po regulaci aktivity enzymů účastnících se metabolických drah (shrnuto v DeLong a kol., 2002; Zhou a kol., 2004). Mutantní rostliny rcn1 mají podobný fenotyp jako rostliny s nadprodukovanou kinázou PID. Jsou často agravitropické a může u nich docházet i ke kolapsu kořenového meristému v důsledku vyčerpání auxinu. Stejně jako u rostlin nadrodukujících PID dochází i u rcn1 mutantů k přesunu proteinů PIN z bazální na apikální stranu u buněk kortexu kořene. Proteinkináza PID i fosfatáza PP2A jsou asociované s membránou, kde kolokalizují s proteiny PIN (Michniewicz a kol., 2007). Zatímco fosforylace proteinů PIN pomocí kinázy PID vede k jejich cílení na apikální stranu buňky, nefosforylované proteiny PIN putují na bazální membránu (obr. 4). V rostlinách, které nadprodukují kinázu PID, nedochází po působení BFA k internalizaci proteinů PIN do BFA kompartmentů v takové míře jako u kontrolních rostlin. Převážně fosforylované proteiny PIN jsou směrovány dráhou nezávislou na GNOM na apikální stranu buněk. Stejný efekt můžeme pozorovat u rostlin mutantních v PP2A (Kleine-Vehn a kol., 33

34 2009). PID a PP2A tedy pravděpodobně mohou fungovat jako kinázo-fosfatázový pár a přímo fosforylovat a defosforylovat proteiny PIN, je ale také možné, že PP2A defosforyluje kinázu PID a tím snižuje její schopnost fosforylovat PIN (Michniewicz a kol., 2007). Obr. 4: Regulace lokalizace proteinů PIN v buňce jejich specifickou fosforylací a defosforylací. Fosforylační stav proteinů PIN má vliv na jejich umísťování. Zatímco fosforylované přenašeče PIN jsou transportovány cestou nezávislou na GNOM (Dhonukshe a kol., 2010) do apikální membrány, nefosforylované proteiny PIN putují na bazální stranu buňky cestou závislou na GNOM. Schéma upraveno z Petrášek a Friml (2009) Role PDK1 při regulaci aktivity proteinkináz AGCVIII Jak již bylo zmíněno, mnoho živočišných AGC kináz podléhá regulaci kinázou PDK1. Ta je aktivuje fosforylací specifického threoninu v jejich aktivační smyčce (shrnuto v Mora a kol., 2004). K funkční interakci mezi kinázami je nutná přítomnost domény PIF (PDK1- interacting fragment) na kináze AGC (Biondi a kol., 2004). Nedávno byl objeven ještě jeden vysoce konzervovaný motiv, tzv. Ade motiv, sloužící k interakci s PDK1. Ten pravděpodobně umožňuje ještě preciznější regulaci jejich aktivity (Romano a kol., 2009). Ačkoli je Ade motiv vysoce konzervován mezi živočichy, u rostlinných proteinkináz AGC ho nenajdeme, zatímco doménu PIF obsahuje většina kináz AGCVIII u Arabidopsis thaliana (Zhang a McCormick, 2009). Najdeme ji i u kinázy PID. WAG 1 a WAG2 ji ale nemají a nemají ani 34

35 aktivační smyčku. Přesto mohou PDK1 vázat, ale nedochází už k jejich fosforylaci (Zegzouti a kol., 2006a). V in vitro pokusech bylo zjištěno, že interakce mezi PDK1 a PID vede k rychlému zvýšení množství fosforylovaných kináz PID. PDK1 aktivuje PID tím, že ji fosforyluje na jednom či více serinech v její aktivační smyčce, čímž dochází k podpoře její autofosforylační aktivity, a tím i její schopnosti fosforylovat substrát (Zegzouti a kol., 2006b). PDK1 je důležitým regulátorem aktivity AGC kináz v živočišných buňkách, její role v řízení podobných procesů u rostlin ale zatím nebyla přesvědčivě dokázána. Ačkoli PDK1 zvýšila autofosforylační i transfosforylační schopnosti některých AGC kináz in vitro, chybí přesvědčivé důkazy o jejím působení na aktivaci kináz AGC in vivo. PDK1 se pravděpodobně účastní regulace aktivity jen některých z nich a i u těch působí ještě spolu s dalšími regulátory, například s vápníkovými kationty a různými regulačními proteiny (shrnuto v Zhang a McCormick, 2009) Regulace aktivity proteinkináz AGCVIII pomocí iontů a Ca 2+ vazebných proteinů Dalšími molekulami, které by mohly ovlivňovat aktivitu rostlinných proteinkináz AGCVIII, jsou signální molekuly a druzí posli. camp, cgmp, Ca 2+ a fosfolipidy regulují aktivitu živočišných kináz, jejich lokalizaci v buňce i substrátovou specifitu většinou vazbou na specifickou doménu kinázy AGC. Zatímco regulace rostlinných proteinkináz AGC pomocí camp a cgmp doposud nebyla příliš studována, o signalizaci zprostředkované vápníkovými kationty je toho známo více. Ca 2+ se v buňce podílí na regulaci mnoha různých procesů od růstu buněk a odpovědi na stres až po zprostředkování hormonální signalizace (Sanders a kol., 1999). Kinázy podrodiny AGCVIII sami neobsahují domény vázající Ca 2+, ty byly ale nalezeny u některých proteinů, které s nimi interagují. Proteinkináza PID interaguje se dvěma proteiny vázajícími vápník. Jsou to TOUCH3 (TCH3), protein podobný kalmodulinu, a PID- BINDING PROTEIN 1 (PBP1). Proteiny TCH3 ani PBP1 nejsou kinázou PID fosforylovány, fungují tedy asi v dráze přenosu signálu před kinázou PID. Vážou Ca 2+ jako druhého posla a regulují aktivitu protein kinázy PID (Benjamins a kol., 2003). Protein PBP1 se v malé míře váže na PID i v nepřítomnosti Ca 2+. Po navázání Ca 2+ se tato interakce zesiluje a vede ke zvýšení autofosforylační schopnosti protein kinázy PID. PBP1 tedy pravděpodobně funguje jako pozitivní regulátor její aktivity. Naopak interakce TCH3 s kinázou PID je závislá na navázání Ca 2+ na TCH3. Díky příbuznosti TCH3 s 35

36 kalmodulinem lze pozorovat při použití inhibitoru kalmodulinu (tetracain) zvýšení aktivity PID. TCH3 je tedy nejspíše negativním regulátorem aktivity kinázy PID (Benjamins a kol., 2003). Obr. 5: Regulace aktivity kinázy PID pomocí iontů a Ca 2+ vazebných proteinů. Vazba PBP1 a Mg 2+ na kinázu PID, stejně jako její fosforylace zprostředkovaná kinázou PDK1, zvyšuje autofosforylační i transfosforylační aktivitu kinázy PID (A). Naopak interakce s proteinem TCH3 a navázání Ca 2+ negativně ovlivňuje schopnost kinázy PID fosforylovat substrát. Také samotné kationty Ca 2+ a Mg 2+ mohou fungovat jako regulátory aktivity kinázy PID. Zatímco PID je podobně jako jiné kinázy aktivní při navázaném Mg 2+, který zvyšuje její autofosforylační schopnost a tím i míru fosforylace substrátu, vazba vápenatých kationtů její aktivitu ovlivňuje negativně. Ca 2+ soutěží o stejné vazebné místo, do kterého se váže Mg 2+, který je pro funkci PID nezbytný (Zegzouti a kol., 2006b). Kationty vápníku jsou tak asi schopné negativně ovlivňovat aktivitu kinázy PID jak její přímou inhibicí navázáním do místa pro Mg 2+, tak nepřímo přes inhibici zprostředkovanou interakcí mezi PID a proteinem TCH3 vázajícím vápník (obr. 5) BTB proteiny při regulaci proteinkináz AGCVIII a transportu auxinu V poměrně nedávné době byla zjištěna účast BTB (Bric-a-brac, Tramtrack, Broad- Complex) proteinů v regulaci polárního transportu auxinu (Treml a kol., 2005; Furutani a kol., 2007; Cheng a kol., 2007). Tyto proteiny jsou charakteristické tím, že obsahují mnoho domén pro interakci s jinými proteiny. Slouží tedy v buňce jako jakési lešení ke složení 36

37 transkripčních komplexů a proteinů signálních kaskád. Poprvé byly pospány u Drosophila melanogaster, vyskytují se ale i u většiny eukaryot včetně rostlin a podílí se na regulaci mnoha buněčných procesů. V Arabidopsis je kódováno 80 různých BTB proteinů, z nichž 32 patří do rodiny BTB-NPH3 (NON-HYPOCOTYL RESPONSE 3), proteinové rodiny specifické pro rostliny. (Gingerich a kol., 2005; Stogios a kol., 2005). Pomocí studia mutantů byly nalezeny 2 BTB proteiny, které jsou pravděpodobně součástí stejné signalizační dráhy jako kináza PID. Prvním z nich je PID BINDING PROTEIN2 (PBP2), jehož možnou funkcí je zprostředkování interakce mezi kinázou PID a cytoskeletem (Galvan-Ampudia a kol., 2005). Druhý popsaný protein byl postupně označen jako MACCHI-BOU4/ENHANCER OF PINOID/NAKED PINS IN YUC MUTANTS1 (MAB4/ENP/NPY1; Treml a kol. 2005; Furutani a kol. 2007; Cheng a kol. 2007, 2008). Jeho funkce a přesný mechanizmus působení zatím nebyl plně objasněn, ale protože mutace v tomto proteinu má za následek fenotyp podobný pin1 mutantní rostlině, účastní se zřejmě regulace transportu auxinu. V normálně se vyvíjejícím embryu je PIN1 lokalizován na apikální straně plazmatické membrány jak v protodermálních buňkách embrya, tak v L1 vrstvě apikálního meristému stonku a slouží k transportu auxinu z místa biosyntézy do míst apikálního meristému, kde jeho zvýšená akumulace spustí organogenezi (Reinhardt a kol. 2003). Bylo ukázáno, že MAB4 nejspíše spolupracuje s kinázou PID na určení správné lokalizace proteinu PIN1 na membráně. Jednotlivé mutanty mab4 a pid mají jen slabě poškozený vývoj děloh v embryogenezi, zatímco double mutant silně, často se dokonce dělohy nevyvíjí vůbec (Treml a kol. 2005). Furutani a kol. (2007) ukázali, že mutanty mab4 mají výrazně snížené množství proteinu PIN1 na membráně protodermálních buněk embrya. U double mutantů mab4 pid dochází ke kompletní relokalizaci proteinu PIN1 z apikální na bazální stranu protodermálních buněk, následkem čehož nedojde k vytvoření auxinového maxima nutného k iniciaci vzniku děloh (Treml a kol. 2005). Protein MAB4 tedy působí společně s kinázou PID, nejspíše jako jedna ze součástí její signalizační dráhy. Může regulovat transkripci proteinu PID, interagovat s ním, ale je také možné, že je jím fosforylován. (Robert a kol. 2008). Další 4 homology MAB4, proteiny MEL 1-4 byly nedávno ukázány jako důležité při udržování membránové lokalizace PIN2 (Furutani a kol., 2011). 37

38 2.3.8 Fototropiny jako další zástupci proteinkináz AGCVIII a jejich možná funkce v regulaci transportu auxinu Do proteinkinázové podrodiny AGCVIII patří také dva proteiny PHOT1 a PHOT2 (fototropiny), hrající úlohu v přenosu světelného signálu (shrnuto v Celaya a kol., 2005). Jsou to receptory modrého světla a po přijetí světelného signálu spouštějí fototropní odpověď rostliny. Napomáhají optimalizaci fotosyntézy tím, že řídí relokalizaci chloroplastů, podílejí se na otvírání průduchů, a také inhibují růst hypokotylu v modrém světle. Fototropiny mají jak C-terminální doménu s kinázovou aktivitou, tak N-terminální doménu sloužící jako fotoreceptor. Tato receptorová doména dále obsahuje 2 tzv. LOV (light, oxygen, or voltagesensing) domény vážící chromofor flavin mononukleotid (FMN). Ve tmě je PHOT asociovaný s membránou a obě LOV s navázaným FMN reprimují kinázovou doménu. Po přijetí fotonu dochází ke strukturní změně LOV domén a uvolnění kinázové domény z represe. Ta se poté autofosforyluje a spustí dráhu signální transdukce, v rámci které dojde i k otevření Ca 2+ kanálů na plazmatické membráně a vylití Ca 2+ z apoplastu do buněk (Baum a kol., 1999; shrnuto v Celaya a kol., 2005; Harada a Shimazaki, 2007). Zatím nebyla plně objasněna role Ca 2+ při fototropní odpovědi, je ovšem možné, že tato signalizace spuštěná PHOT iniciuje relokalizaci proteinů PIN tím, že moduluje aktivitu AGCVIII kináz pomocí proteinů TCH3 a PBP1, proteinů, jejichž aktivita je regulována právě vápníkem (shrnuto v Robert a kol., 2008). Ding a kol. (2011) zjistili, že exprese proteinkinázy PID je inhibována modrým světlem, a že tato světlem regulovaná exprese kinázy PID hraje pravděpodobně roli v redistribuci proteinů PIN3 v endodermálních buňkách hypokotylu během fototropní odpovědi rostlin (obr. 6). Ve tmě je kináza PID exprimována ve větší míře, přenašeče PIN3 jsou převážně ve fosforylovaném stavu a v buňce jsou lokalizovány nepolárně. Po osvícení hypokotylu je transkripce kinázy PID inhibována, což vede k relokalizaci přenašečů PIN3 na vnitřní stranu buňky. Vyšší hladina auxinu, a tedy rychlejší růst zastíněné strany hypokotylu, pak vede k jeho ohnutí za zdrojem světla. 38

39 Obr. 6: Relokalizace přenašečů PIN3 při fototropní reakci hypokotylu na jednostranné světlo (žluté šipky). Na zastíněné straně hypokotylu jsou kinázou PID fosforylované přenašeče PIN3 (červené válečky) lokalizovány symetricky v plazmatické membráně celé buňky. Na osvícené straně hypokotylu je transkripce proteinkinázy PID inhibována, což vede k relokalizaci přenašečů PIN3 na vnitřní stranu endodermálních buněk. Vyšší hladina auxinu na zastíněné straně pak způsobí rychlejší růst této strany a ohnutí hypokotylu ke zdroji světla. Modrý gradient pozadí znázorňuje hladinu auxinu a modré šipky směr jeho transportu. GN je GNOM účastnící se cyklování proteinu PIN3. Převzato z Ding a kol. (2011). 39

40 40

41 3 Cíle diplomové práce Ve své diplomové práci jsem se zaměřila především na studium funkce proteinkinázy PID, zkoumala jsem její vliv na aktivitu i lokalizaci přenašeče PIN a zjišťovala jsem, jak se ovlivnění funkce samotné kinázy PID a tím i přenašeče PIN projeví na mezibuněčném transportu auxinu. Experimentálním materiálem byla buněčná linie tabáku BY-2 transformovaná příslušnými genovými konstrukty. Cíle diplomové práce v bodech: 1) Zjistit, jak je ovlivněn transport auxinu protein kinázou PID u tabákových buněk BY-2 2) Zjistit vliv kinázy PID na umisťování proteinů PIN do membrány 3) Určit buněčnou lokalizaci kinázy PID a zjistit, zda v jejím umisťování hraje nějakou roli cytoskelet 4) Najít tabákové homology vybraných AGCVIII kináz 41

42 42

43 4 Materiál a metody 4.1 Materiál Rostlinný materiál, bakteriální kmeny a kultivační média K experimentům byla použita buněčná linie tabáku BY-2 Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2 (Nagata a kol., 1992). Jedná se o nezelené, rychle se dělící buňky udržované většinou ve formě buněčné suspenze. Dnes slouží jako modelový systém pro vyšší rostliny, protože jednotlivé buňky jsou velmi homogenní, na podněty reagují podobně, a proto se na nich snadněji studují některé buněčné procesy jako je buněčné dělení, transport hormonů či transport membránových váčků. Buňky BY-2 byly kultivovány v MS (Murashige a Skoog) médiu (Murashige a Skoog, 1962, dle Nagata a kol., 1992) obsahujícím 4,33 g/l MS Basal Salt Mixture, 1 mg/l thiamin, 0,2 mg/l 2,4-D, 200 mg/l KH 2 PO 4, 100 mg/l myo-inositol a 30 g/l sacharózy, ph 5,8. Pevné MS médium bylo připraveno přidáním 6 g/l agaru. Pro množení DNA a transformaci buněk BY-2 byly použity buňky Escherichia Coli (E. Coli) kmen DH5α (Invitrogen, USA) a Agrobacterium tumefaciens kmen GV2260. Bakterie byly kultivovány v LB (Luria Bertani) médiu obsahujícím 5 g/l Select yeast extract, 10 g/l pepton, 10 g/l NaCl, ph 7. Pevné LB médium bylo připraveno přidáním 15 g/l agaru Použité kity Pro izolaci rostlinné RNA byl využit RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Německo), pro izolaci rostlinné DNA NucleoSpin Plant II (Macherey-Nagel, Německo). Izolace plazmidové DNA z Escherichia coli a Agrobacterium tumefaciens byla prováděna pomocí Qiaprep Miniprep Kit (Qiagen, Německo). Pro RT-PCR byl použit One Step RT PCR Kit (Qiagen, Německo) Seznam použitých přístrojů Autokláv stolní (Chirana, ČR) Aparatura pro elektroforézu, OWL EasycastTM B1 (Owl Separation Systems, USA) Centrifuga, Mini Spin plus (Eppendorf, Německo) Digitální váhy (Schoeller Pharma Prague, ČR) Elektroporace bakterií, E. Coli Pulser (BIO-RAD, USA) Flowbox, Trigon-plus, Holten Lamin-Air (Thermo, USA) Fluorescenční mikroskop, Nicon Eclipse E600 (Nicon, Japonsko) 43

44 Gene gun, PDS 1000/He Biolistic Particle Delivery System (BIO-RAD, USA) Kamera, G:box (Syngene, UK) Komůrka pro počítání buněk Fuchs Rosenthal (Brand, Německo) Mikrokultivační komůrka pro mikroskopování (Lab-Tec, USA) Konfokální mikroskop, Zeiss LSM 5 DUO (Zeiss, Německo) Míchací plotna, RCT basic (IKA, Německo) Orbitální inkubátor, Multi-Shaker PSU 20 (Biosan, Lotyšsko) PCR cyklér, Authorized Thermal Cycler (Eppendorf, Německo) ph/ise metr, Orion 710A (Thermo, USA) Předvážky, Basic (Sartorius AG, Německo) Scintilační počítač, Packard Tri-Carb 2900TR (Packard Instrument, USA) Spektrofotometr, Biomate 3 (Thermo, USA) Světelný mikroskop, Axiovert 40C (Zeiss, Německo) Termobloček, TB1 Thermoblock (Biometra, Německo) Termostat, Biological Thermostat BT 120 (Laboratorní Přístroje, ČR) Vortex, GVLab (Gilson, USA) Zdroj pro elektroforézu, Standart Power Pack P25 (Biometra, Německo) Seznam použitých chemikálií 10x Taq pufr (Fermentas, Litva) 2-mercaptoetanol (Sigma, USA) [ 3 H]NAA (American Radiolabeled Chemicals, USA) 5U/µl Taq polymeráza (Fermentas, Litva) 6x DNA loading Dye (Fermentas, Litva) Acetosyringon (Sigma, USA) Agar (Sigma, USA) Agaróza (Serva, Německo) Brefeldin A (Sigma, USA) Claforan (Lek Pharmaceulticals, Slovinsko) Dihydrogenfosforečnan draselný (P-LAB, ČR) DMSO (Sigma, USA) dntp mix (Fermentas, Litva) EDTA (Serva, Německo) Etanol (P-LAB, ČR) GeneRuler TM 1 kb Plus DNA Ladder (Fermentas, Litva) GeneRuler DNA Ladder Mix, ,000 bp (Fermentas, Litva) Glycerol (Duchefa, Nizozemí) Hydroxid draselný (Lach:Ner, ČR) Hygromycin (MP Biomedicals, Francie) Chlorid hořečnatý (Fermentas, Litva) Chlorid sodný (Lach:Ner, ČR) Chlorid vápenatý (Sigma, USA) Kanamycin (MP Biomedicals, Francie) Kyselina 1-naftylftalamová (OlChemIm, ČR) Kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová (Sigma, USA) Kyselina octová (Sigma, USA) Latrunculin B (Sigma, USA) MES (Duchefa, Nizozemí) MG-132 (Sigma, USA) 44

45 MS Basal Salt Mixture (Sigma, USA) Myo-inositol (Duchefa, Nizozemí) Oryzalin (Sigma, USA) Pepton (Duchefa, Nizozemí) Sacharóza (Lach:Ner, ČR) Scintilační roztok (MP Biomedicals, Francie) Select yeast extract (Duchefa, Nizozemí) Síran vápenatý dihydrát (Lachema, ČR) Spermidine (Sigma, USA) SybrSafe (Invitrogen, USA) Tamoxifen (Sigma, USA) Tekutý dusík (Linde Gas, ČR) Thiamin (Sigma, USA) Tris (Duchefa, Nizozemsko) 4.2. Metody Práce s rostlinným materiálem K experimentům byla použita buněčná linie tabáku BY-2. Byla udržována v živném médiu MS. Kultura byla pěstována sterilně ve tmě při teplotě C buď ve formě kalusu na pevném agarovém médiu, nebo jako suspenzní kultura v tekutém médiu. Vyčerpání kyslíku z média je zde zabráněno neustálým třepáním suspenzní kultury na orbitálním inkubátoru. Kultivační interval kalusu byl 30 dní, suspenzní kultura byla pasážována po 7 dnech. K pokusům byly používány suspenze aktivně se dělících buněk, druhý až třetí den po jejich nasazení do čerstvého média. Transgenní kalusy a suspenzní kultury byly udržovány v médiu obsahujícím navíc některé z antibiotik v odpovídající koncentraci (kanamycin 100 μg/ml média, hygromycin 40 μg/ml média, claforan 300 μg/ml média) Použité genové konstrukty a transgenní buněčné linie Byly použity genové konstrukty vytvořené a laskavě poskytnuté laboratoří Dr. Remko Offringy (Institute of Biology Leiden, Department of Molecular and Developmental Genetics, Leiden, Nizozemsko), 35S::PID-GFP (pgreen, kanamycin rezistence bakterie i rostliny), 35S::mPID-GFP (pgreen, kanamycin rezistence bakterie i rostliny), a pintam-pid (pintam3, kanamycin rezistence bakterie, hygromycin rostliny). Dále byl použit genový konstrukt 35S::PIN1-RFP (pbinplus, Dr. Jiří Friml, Univerzita Ghent, Belgie) s kanamycinovou rezistencí v bakteriích i rostlinách. 45

46 V laboratoři školitele již byly k dispozici buněčné linie tabáku BY-2 stabilně exprimující PIN1::PIN1:GFP, linie PIN1-GFP (Petrášek a Zažímalová, 2006) Stabilní transformace buněk tabákové linie BY-2 Pro vytvoření dvojitě transformované linie BY-2 PIN1-PID nesoucí stabilně geny PIN1::PIN1:GFP a pintam-pid byl do linie PIN1-GFP (Petrášek a Zažímalová, 2006) přitransformován pintam-pid (tamoxifenem indukovatelný promotor). Použit byl postup dle An (1985). 100 ml třídenní buněčné suspenze PIN1 bylo zfiltrováno a resuspendováno ve stejném objemu čerstvého MS média. Pro narušení plazmatické membrány buněk byl přidán acetosyringon o výsledné koncentraci 20 µm a suspenze byla 20x protažena 10 ml špičkou. Takto připravená suspenze byla poté rozdělena po 4 ml do Petriho misek a inkubována 3 dny při 27 C s třemi různými koncentracemi půldenní kultury Agrobacterium tumefaciens kmene GV2260 (20, 40 a 60 µl kultury), nesoucím pintam-pid. Suspenze PIN1 bez Agrobacteria byla použita jako kontrola. Inkubované buněčné suspenze byly třikrát promyty 50 ml 3% roztoku sacharózy obsahujícího 500 µg/ml claforanu a opatrně naneseny v tenké vrstvě na misky s pevným BY-2 MS médiem s příslušnými selekčními antibiotiky (100 µg/ml média kanamycin, 40µg/ml média hygromycin). Misky byly inkubovány ve tmě při 27 C. Po asi 3-4 týdnech se objevily první kolonie, z nichž byly vytvořeny buněčné suspenze přenesením části kalusu do asi 2 ml tekutého MS média. Přítomnost vneseného genu byla prokázána pomocí RT-PCR po indukci 5 µm tamoxifenem (Obr. 7). Vzniklý dvojitý transformant byl označen PIN1-PID. Exprese proteinkinázy PID byla v této linii aktivována 1 µm tamoxifenem po dobu 48 hodin. 10 mm zásobní roztok tamoxifenu byl připraven v DMSO. Do kontrolních buněk bylo přidáno odpovídající množství čistého DMSO. 46

47 Obr. 7: Elektroforetogram RT-PCR produktů s primery (tab. 1) specifickými pro PID. RT-PCR byla provedena s použitím celkové RNA izolované z buněčné suspenze linie PIN1- PID 48 h po aktivaci 5 µm tamoxifenem a z kontrolních buněk, ke kterým bylo přidáno stejné množství DMSO (provedla Pařezová M.) Tranzientní transformace buněk BY-2 biolistickou metodou Byl použit protokol pro tranzientní transformaci buněk BY-2 uvedený v Mravec a kol. (2009). 4-5 ml dvoudenní buněčné suspenze BY-2 bylo za použití vakuové pumpy zfiltrováno přes celulózový filtr téměř do sucha. Filtr byl spolu s buňkami přenesen na Petriho misku (průměr 5cm) s pevným BY-2 MS médiem. 6 µl zlatých partikulí (průměr 1,6 μm, koncentrace 55 μg/μl) v glycerolu bylo smícháno s 1 µl plazmidové DNA (optimální koncentrace 1 μg/μl), 6 µl 2,5 M CaCl 2 a 2,5 µl 0,1 M spermidinem. Takto připravená směs byla 3 minuty vortexována, stočena, a poté byla promyta postupně 70% a 100% etanolem. Připravené projektily s navázanou DNA byly v malém objemu 100% etanolu přeneseny na nosnou membránu a ponechány k zaschnutí. Bylo použito zařízení pro bombardování buněk PDS 1000/He Biolistic Particle Delivery System (BioRad). Pro dosažení dostatečné razance nutné k průniku mikroprojektilů s navázanou DNA do buněk byla použita héliová bomba. Střela byla vedena přes pojistnou membránu (průrazový tlak 1100 psi) na nosnou membránu s mikroprojektily, přes rozptylové sítko a nakonec do buněk na Petriho misce, umístěné ve vzdálenosti 6 cm od projektilů. Při vzrůstu tlaku nad hranici 1100 psi byla pojistná membrána protržena, mikroprojektily odtrženy z nosiče a rozptýleny přes sítko do buněk. Misky s transformovanými buňkami byly po nastřelení udržovány ve tmě při stálé teplotě 24 C. Preparáty byly pozorovány po 4-24 hodinách. 47

48 4.2.5 Izolace DNA a RNA Pro izolaci DNA z buněčné suspenze tabáku byla suspenze za použití vakuové pumpy zfiltrována téměř do sucha a buňky hluboce zamraženy v tekutém dusíku. 100 mg takto zamražených buněk bylo poté rozmělněno v třecí misce na jemný homogenát a tento přenesen do vymražené eppendorfky. Pro izolaci DNA byl použit kit NucleoSpin Plant II. Pro izolaci RNA z buněčné suspenze tabáku byla použita dvoudenní exponenciální buněčná kultura. Za použití vakuové pumpy byla zfiltrována téměř do sucha a buňky hluboce zamraženy v tekutém dusíku. 100 mg takto zamražených buněk bylo poté rozmělněno v třecí misce na jemný homogenní prášek a přeneseno do vymražené eppendorfky. Pro izolaci RNA byl použit RNeasy Plant Mini Kit. Koncentrace a čistota získané RNA byla stanovena měřením absorbance při 260 a 280 nm na spektrofotometru. Plazmidová DNA byla izolována z bakteriální buněčné kultury pomocí kitu Qiaprep Miniprep Amplifikace plazmidů v Escherichia coli Pro účely pomnožení DNA byla využita bakteriální kultura Escherichia coli. Izolace plazmidové DNA z Agrobacterium tumefaciens byla provedena pomocí kitu Qiaprep Miniprep. 1 µl takto izolované a 100x naředěné DNA byl přidán k 50 µl Escherichia coli v elektroporační kyvetě. Elektroporace byla provedena při napětí 2,5 V. Suspenze byla poté převedena do čerstvého LB média a inkubována 30 min při 37 C, následně byla centrifugována (5 minut při 5000 rpm) a znovu resuspendována v 200 µl média. Takto připravená suspenze byla rovnoměrně rozetřena na misku s pevným LB médiem s příslušnými selekčními antibiotiky a inkubována v termostatu při 37 C. Po asi 24 hodinách byly narostlé kolonie setřeny párátkem a to bylo vloženo do baňky s 5 ml tekutého LB média. Suspenze buněk Escherichia coli byla dále kultivována při 37 C po dobu asi 16 hodin a poté byla pomocí kitu Qiaprep Miniprep izolována amplifikovaná plazmidová DNA PCR, RT-PCR a elektroforéza DNA Pro detekci genů v DNA izolované z buněk BY-2 byla využita PCR (Polymerase Chain Reaction). Celková DNA byla získána izolací z buněčné suspenze. Pro detekci genů byly využity specifické primery (Tab. 1). 48

49 Název Sekvence Velikost produktu NtPID NtWAG1 NtWAG2 NtAktin AtPID fwd rev fwd rev fwd rev fwd rev fwd rev 5'-GGTGGTGATTTGCATTCCCT-3' 5'-CGGAGGTGAAGTTGACGATT-3' 5'-CCTGCCAACACTCTATGC-3' 5'-GAGTCCACCAGTCAACAGCA-3' 5'-TGCGACCTATGCGTGAT-3' 5'-AGCCCTATTCTTTCGCCATT-3' 5'-CTATTCTCCGCTTTGGACTTGGCA-3' 5'-AGGACCTCAGGACAACGGAAACG-3' 5'-TCCTTTCTCTCAAACCTCACCGATCC-3' 5'-CGTAGAGAAACACTCCAAAGGCCCAC-3' Teplota nasednutí primeru 266 bp 60,5 C 598 bp 56,9 C 306 bp 56,9 C 290 bp 55 C 830 bp 57 C Tab. 1: Specifické primery využité k amplifikaci genů při PCR a RT-PCR. Tabulka uvádí název, sekvenci primerů, očekávanou velikost produktů a teplotu pro nasednutí primerů. Optimální teploty pro nasednutí primerů (annealing) byly stanoveny experimentálně s použitím teplotního gradientu. Reakční směs pro PCR obsahovala: 10x Taq pufr 2,5 µl 25 mm MgCl 2 1,5 µl 10 mm mix dntp 0,5 µl 0,1 mm primer rev. 0,5 µl 0,1 mm primer fwd. 0,5 µl Templátová DNA 4 µl 5 U/µl Taq polymeráza 0,125 µl Reakční směs byla doplněna do 25 µl vodou a eppendorfky umístěny do cykléru. PCR probíhala v následujících podmínkách: čas teplota počet cyklů 1. počáteční denaturace 3 min 95 C 1 2. denaturace 1 min 95 C annealing 1 min dle primeru 35 polymerace 1 min 72 C 3. finální polymerace 10 min 72 C 1 Pro detekci exprimovaných genů v genomu Nicotiana tabaccum byla využita RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction). Celková RNA byla získána izolací z buněčné suspenze. Pro detekci genů byly využity specifické primery (Tab. 1). 49

50 Reakční směs pro RT-PCR obsahovala: 5x One Step RT-PCR pufr 2,5 µl 10 mm mix dntp 0,5 µl 0,1 mm primer rev. 0,5 µl 0,1 mm primer fwd. 0,5 µl Templátová RNA 2,5 µl RT-PCR enzymový mix 0,125 µl Reakční směs byla doplněna do 25 µl RNA-čistou vodou a eppendorfky umístěny do cykléru. RT-PCR probíhala za následujících podmínek: čas teplota počet cyklů 1. reverzní transkripce 30 min 50 C 1 2. PCR aktivace 15 min 95 C 1 3. denaturace 1 min 94 C annealing 1 min dle primeru 35 polymerace 1 min 72 C 4. finální polymerace 10 min 72 C 1 Přitomnost PCR produktů byla ověřena pomocí gelové elektroforézy na 1 % agarózovém gelu s využitím SybrSafe pro vizualizaci DNA. Pro zjištění molekulové hmotnosti DNA fragmentů bylo využito 5 μl GeneRuler TM 1 kb Plus DNA Ladder nebo GeneRuler DNA Ladder Mix, ,000 bp. Vzhledem k velikosti dělených fragmentů DNA byl k jejich rozdělování zvolen 1% (w/v) agarózový gel. Směs agarózy a 1x TAE pufru (Tris, 0,5 M EDTA ph=8, kyselina octová) byla vařena až do úplného rozpuštění agarózy, po zchlazení suspenze byl přidán SybrSafe (0,1 µl/ml suspenze). Takto připravená směs byla nalita do formy na gel do výšky asi 0,5 cm. Po ztuhnutí byl gel přenesen do aparatury pro agarózovou elektroforézu a zalit 1x TAE pufrem. Do jamek v gelu byly naneseny vzorky DNA smíchané s 6x DNA Loading Dye a standard o známé velikosti DNA fragmentů. Aparatura byla poté zakryta a nastaveno napětí 90 V. Elektroforéza probíhala asi 45 minut, poté byl gel vyjmut a pozorováno rozdělení DNA fragmentů v UV světle. Pomocí kamery byl zhotoven elektroforetogram. 50

51 4.2.8 Konfokální mikroskopie a FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Pro mikroskopická pozorování byl použit laserový konfokální mikroskop Zeiss LSM 5 DUO. Pro excitaci GFP (maximální excitace 488 nm, maximální emise 509 nm) byl zvolen argonový laser Argon/2. Pro excitaci mrfp1 (maximální excitace 584 nm, maximální emise 607 nm) byl použit diodový laser DPSS U vzroků se dvěma fluorochromy byl každý kanál snímán odděleně k potlačení možných přesahů signálu. Preparát z tranzientně transformovaných buněk vytvořen rozmícháním transformovaných buněk v kapce destilované vody a přikryt krycím sklíčkem. Pozorování probíhalo v živých buňkách, bez fixace. Pro hledání transformovaných buněk byl využit motorizovaný stolek s pamětí pro uložení pozic jednotlivých buněk. Metoda FRAP byla prováděna na laserovém konfokálním mikroskopu Zeiss LSM 5 DUO. Aby bylo zabráněno pohybu buněk v průběhu měření, byla použita mikrokultivační komůrka pro mikroskopování, do které byl nakápnut asi 1 ml buněčné suspenze. Komůrka byla poté uzavřena, a po asi 5 minutách, kdy buňky sedimentují na dno, byl zahájen experiment. Pomocí argonového laseru Argon/2 o vlnové délce 488 nm byla vysvícena fluorescence GFP v malé oblasti transverzální membrány v řetízku dělících se buněk. Po následující dobu asi 400 s byla tato oblast každých přibližně 20 s snímána a byla měřena intenzita fluorescence v tomto místě. Současně byla měřena intenzita fluorescence kontroly, jiné oblasti transverzální membrány stejné buňky, podle které byla poté určena míra vysvícení chromoforů daná delší expozicí laseru. Z naměřených dat byla stanovena míra znovuobnovení fluorescenčního signálu za daný čas po vysvícení laserem u rozdílně ošetřených buněčných linií Měření aktivního transportu auxinu z buněk Míra transportu auxinu z buněk v suspenzi byla stanovena pomocí tzv. akumulačních experimentů. Bylo měřeno, kolik radioaktivně značeného auxinu buňky nahromadí za určitý čas a za určitých podmínek. Byl použit již dříve publikovaný protokol (Delbarre a kol., 1996, upraveno Petrášek a kol., 2003). Akumulace radioaktivně značeného auxinu [ 3 H]NAA byla měřena v 0,5 ml vzorcích buněčné suspenze o hustotě asi 5x10 5 buněk na ml (buněčná denzita byla zjištěna pomocí standardní počítací komůrky Fuchs Rosenthal o objemu 3,2 mm 3, rozměry mikrokomůrky: 4 x 4 x 0,2 mm). Buněčná suspenze byla nejprve zfiltrována, 51

52 resuspendována v ekvilibračním pufru (uptake pufr, obsahuje 86 mg/l 0,5 mm CaSO 4.2H 2 O, 4,3 g/l 20 mm MES, 13,7 g/l 10 mm sacharóza, ph 5,7) a poté po dobu 45 minut ekvilibrována za neustálého třepání na orbitálním inkubátoru. Takto ošetřená suspenze byla znovu zfiltrována, resuspendována v čerstvém uptake pufru a dále ekvilibrována po dobu 1,5 hodiny. Poté byla přidána [ 3 H]NAA v takovém množství, aby bylo dosaženo finální koncentrace roztoku 2 nm. Z této suspenze byly odebírány vzorky o objemu 0,5 ml v intervalu přibližně 5 minut po dobu do 30 minut od přidání [ 3 H]NAA. Akumulace radioaktivně značeného auxinu byla zastavena filtrací vzorků na filtračním papíru (22 mm v průměru). Filtry spolu s buňkami byly přeneseny do scintilačních lahviček a po dobu 30 minut extrahovány v 0,5 ml etanolu. Poté k nim byly přidány 4 ml scintilačního roztoku a pomocí scintilačního počítače bylo určeno množství akumulovaného auxinu v buňkách. Jednotlivá měření byla opravena o možnou povrchovou radioaktivitu odečtením hodnot, které byly naměřeny u vzorků odebraných ihned po přidání [ 3 H]NAA. V jednom časovém intervalu byly odebrány vždy 4 vzorky (4 opakování), naměřené hodnoty byly zprůměrovány a vyjádřeny v pmol [ 3 H]NAA akumulované v 10 6 buněk. 50 µm BFA, 50 µm Tyrfostin A23 a 50 µm Tyrfostin A51 byly přidávány do suspenze vždy po odběru prvního vzorku ze zásobních roztoků (50 mm BFA v ethanolu, 50 mm Tyrfostin A23 v DMSO, 50 mm Tyrfostin A51 v DMSO). Do kontrolní varianty bylo přidáno vždy příslušné množství rozpouštědla. 52

53 5 Výsledky 5.1. Aktivita proteinkinázy PID stimuluje celkový transport auxinu z buněk Role proteinkinázy PID v tranpsortu auxinu z buněk byla studována na buněčné suspenzi BY-2. Byla použita buněčná linie PIN1-PID, která stabilně exprimuje PIN1, zatímco tvorba kinázy PID je indukovatelná tamoxifenem. Neindukovaná linie PIN1-PID byla použita jako kontrola. Aktivita membránových přenašečů auxinu z buňky byla stanovena pomocí akumulace radioaktivně značeného auxinu, kyseliny naftyloctové [ 3 H]NAA. Byla vybrána proto, že do buněk prostupuje především prostou difůzí, její transport do buněk tedy není ovlivněn aktivitou přenašeče. V cytosolu molekuly NAA disociují a mohou být transportovány ven pouze prostřednictvím specifických přenašečů. Míra akumulace radioaktivně značené NAA v buňkách tedy vypovídá o aktivitě vynašečů auxinu či o jejich množství na plazmatické membráně (Petrášek a Zažímalová, 2006). Obr. 8: Vliv nadprodukce kinázy PID na kinetiku akumulace [ 3 H]NAA v buňkách linie PIN1-PID. Po aktivaci exprese kinázy PID 1 µm tamoxifenem dochází ke snížení akumulace [ 3 H]NAA v buňkách. Chybové úsečky představují střední chyby průměru (n = 4). Pro zjištění toho, jaký vliv má kináza PID na aktivitu proteinů PIN byla indukována exprese této kinázy v linii PIN1-PID 1 µm tamoxifenem (TAM) po dobu 48 hodin od nasazení stacionární kultury. Akumulace [ 3 H]NAA v buňkách byla poté měřena po dobu asi 25 minut od přidání [ 3 H]NAA. Bylo zjištěno, že po aktivaci exprese kinázy PID tamoxifenem dochází ke snížení akumulace [ 3 H]NAA v buňkách (obr. 8 a 9). 53

54 Akumulace [ 3 H]NAA (% neindukované kontroly) PIN1-PID kontrola PIN1-PID+TAM Obr. 9: Relativní vyjádření vlivu overexprese kinázy PID na akumulaci [ 3 H]NAA. Po indukci exprese kinázy PID 1 µm tamoxifenem dochází ke snížení akumulace [ 3 H]NAA v buňkách linie PIN1-PID o 52 % oproti kontrole. Použity míry akumulací ve 20. minutě od začátku experimentu. Chybové úsečky vyjadřují průměrné střední chyby průměru stanovených hodnot akumulací [ 3 H]NAA v buňkách aktivované a neaktivované linie PIN1- PID (n = 4). Snížení akumulace auxinu u buněk nadprodukujících PID napovídá, že fosforylace přenašečů PIN zprostředkovaná proteinkinázou PID působí pozitivně na transport auxinu z buněk. Tento efekt může být způsoben zvýšením aktivity přenašečů PIN po jejich fosforylaci, nedá se vyloučit i stimulace dalších přenašečů. Je také možné, že fosforylované proteiny PIN nejsou více aktivní, ale jsou jen ve větším množství transportovány do plazmatické membrány. Pro testování této hypotézy byly provedeny experimenty zjišťující vliv proteinkinázy PID na lokalizaci přenašečů PIN v buňkách BY Aktivita proteinkinázy PID ovlivňuje umisťování přenašečů PIN Ke zjištění vlivu aktivity proteinkinázy PID na buněčnou lokalizaci proteinů PIN byla využita konfokální mikroskopie v kombinaci s transportními experimenty. Nejprve bylo pomocí tranzientní koexprese kinázy PID mutované v ATP vazebném místě a přenašeče PIN1-RFP stanoveno, zda je funkční kináza PID nezbytná pro správné umístění přenašečů PIN v buňkách. Pro tranzientní transformaci buněk linie BY-2 vybranými geny byla využita biolistická metoda transformace. Do buněk byly nastřelovány současně dva plazmidy, první nesoucí 35S::PIN1-RFP a druhý buď 35S::PID-GFP nebo jeho nefunkční 54

55 variantu 35S::mPID-GFP. mpid-gfp kóduje protein kinázu PID s jednobodovou mutací v ATP-vazebném místě. Tato kináza tedy nemůže fosforylovat substrát (Christensen a kol., 2000; Friml a kol., 2004). Pomocí konfokálního mikroskopu byly pozorovány možné změny v lokalizaci proteinů PIN1-RFP po současné expresi s PID-GFP či mpid-gfp po cca 5 hodinách od nastřelení (obr. 11). Pro kontrolu lokalizace samotného PIN1-RFP byly buňky linie BY-2 tranzientně transformovány samotným plazmidem nesoucím 35S::PIN1-RFP. Tyto proteiny se lokalizovaly především symetricky na plazmatickou membránu, v řetízku buněk pak především na transverzální membránu (Obr. 10), v několika případech vznikaly menší shluky kolem jádra a pod plazmatickou membránou. Obr. 10: Buněčná lokalizace přenašeče PIN1. Tranzientní biolistická transformace plazmidem nesoucím 35S::PIN1-RFP (v koncentraci 60 ng/µl). Konfokální optické řezy, objektiv 60x, vodní imerze. Protein PIN1 je lokalizován především na plazmatické membráně. V malé míře tvoří shluky pod membránou a kolem jádra (označeno šipkami). U buněk koexprimujících proteiny PIN1 a PID jsou přenašeče PIN1 lokalizovány především na plazmatické membráně (obr. 11A), stejně jako je tomu u buněk transformovaných jen genem pro protein PIN1 (obr. 10). U buněk produkujících nefunkční kinázu mpid se proteiny PIN1 lokalizují v malé míře do plazmatické membrány, ale tvoří také velké shluky pod membránou a kolem jádra (obr. 11B). Umisťování proteinů PIN je zde 55

56 tedy narušeno. Z tohoto experimentu vyplývá, že funkční kináza PID je velice důležitá pro správné umístění přenašečů PIN do membrány. A B PID-GFP PIN1-RFP mpid-gfp PIN1-RFP PID-GFP; PIN1-RFP mpid-gfp, PIN1-RFP Obr. 11: Ovlivnění lokalizace proteinu PIN1 prostřednictvím kinázy PID. Transientní biolistická transformace plazmidy nesoucími 35S::PIN1-RFP (v koncentraci 60 ng/µl) a 35S::PID-GFP (A) nebo 35S::mPID-GFP (B) (oba v konc. 1,2 µg/µl). Konfokální optické řezy, objektiv 60x, vodní imerze. U buněk exprimujících současně proteiny PIN1 a PID jsou přenašeče PIN1 lokalizovány především na plazmatické membráně (A), zatímco u buněk BY- 2 produkujících nefunkční kinázu mpid dochází k nesprávné lokalizaci proteinů PIN1, tvoří se shluky pod membránou a u buněčného jádra (B). Z předchozích experimentů je zřejmé, že aktivita PID má vliv na buněčnou lokalizaci proteinů PIN a že celkově pozitivně působí na transport auxinu z buněk. Pro rozlišení toho, zda jsou potenciálně fosforylované přenašeče PIN aktivnější v transportu auxinu, nebo se ve větší míře vyskytují v plazmatické membráně, byla využita metoda FRAP. Po dobu 48 hodin byla indukována exprese kinázy PID v buněčné suspenzi PIN1-PID, neindukovaná varianta byla použita jako kontrola. Bylo měřeno, na kolik procent původního stavu se obnoví fluorescence v místě vysvíceném laserem za určitou dobu po vysvícení. Nejprve bylo měřeno obnovení fluorescence po 15 minutách od vysvícení (obr. 12 a 13). 56

57 Obr. 12: Obnovení fluorescenčního signálu PIN1-GFP v plazmatické mebráně 15 minut po vysvícení laserem. Konfokální řezy, objektiv 40x, vodní imerze. Červeně jsou zakroužkovány části plazmatických membrán, které byly vysvíceny laserem o vlnové délce 488 nm. Je vidět obnovení fluorescenčního signálu PIN1-GFP 15 minut po vysvícení u kontrolních buněk PIN1-PID a u varianty aktivované 1 µm tamoxifenem, která nadprodukuje PID. PIN1-PID kontrola PIN1-PID + tamoxifen Intenzita fluorescence (a.u.; 8 bit) Čas (s) Čas (s) Obr. 13:. Průběh FRAP PIN1-GFP během 15 minut. U varianty PIN1-PID aktivované 1 µm tamoxifenem dochází k rychlejšímu obnovení fluorescence na původní hodnotu v místě vysvíceném laserem. Nejvíce je tento rozdíl patrný v prvních asi 6 minutách od vysvícení. Červeně je zobrazena měnící se intenzita fluorescence v místě vysvícení, zeleně pak intenzita fluorescence nevysvěcovaného PIN1-GFP. Protože největší rozdíl v obnovení fluorescenčního signálu mezi oběma variantami byl v prvních asi 6 minutách od vysvícení (obr. 13), byl dále měřen proces obnovování jen po dobu přibližně 6 minut (obr. 14, 15 a 16). Hodnoty intenzity fluorescence jednotlivých měření 57

58 byly vyjádřeny procentuálně, 100 % představuje hodnota intenzity fluorescence před vysvícením (obr. 14). Následně byl vypočten průměr hodnot všech měření FRAP u varianty nadprodukující PID i kontroly a byla testována statistická průkaznost rozdílu v míře obnovování fluorescenčního signálu po vysvícení laserem mezi těmito dvěma variantami (obr. 15 a 16). Obr. 14: Průběh FRAP během 6 minut po vysvícení PIN1-GFP. Graf ukazuje průběhy FRAP u jednotlivých buněk aktivované linie PIN1-PID (červeně) oproti kontrole (modře). Osa y udává, na kolik procent původního stavu se obnovila fluorescence vysvícené části buněčné přepážky. 100 % jsou hodnoty intenzity fluorescence před vysvícením. Obr. 15: Průměr jednotlivých měření FRAP PIN1-GFP u kontrolní varianty PIN1-PID (modře) a varianty nadprodukující kinázu PID (červeně). Po indukci exprese kinázy PID dochází po 6 minutách k obnovení fluorescence vysvícené části membrány ve vyšší míře než u kontroly. Osa y udává, na kolik procent původního stavu se průměrně obnovila fluorescence vysvícené části membrány. 100 % je intenzita fluorescence před vysvícením. Chybové úsečky vyjadřují střední chybu průměru (n = 14 pro PIN1-PID kontrolu a n = 18 pro PIN1-PID + tamoxifen). 58

59 Obr. 16: Porovnání relativních hodnot FRAP po 6 minutách od vysvícení. U varianty PIN1-PID nadprodukující kinázu PID dochází k průměrně o 12% většímu obnovení fluorescenčního signálu v místě vysvícení oproti kontrole. Osa y udává, na kolik procent původního stavu se průměrně obnovila fluorescence vysvícené části membrány. 100 % je intenzita fluorescence před vysvícením. Průkaznost rozdílu byla prokázána použitím studentského T-testu na 5% pravděpodobnostní hladině (p = 0,001084). Chybové úsečky vyjadřují střední chybu průměru (n = 14 pro PIN1-PID kontrolu a n = 18 pro PIN1-PID + tamoxifen). Dynamika obnovování fluorescence naznačuje, že proteinkináza PID působí pozitivně na transport proteinů PIN1 do membrány. U varianty PIN1-PID nadprodukující kinázu PID dochází po 6 minutách k obnovení fluorescence vysvíceného místa membrány ve větší míře než u kontrolních buněk. Z předchozího experimentu je zřejmé, že protein kináza PID působí pozitivně na výskyt přenašečů PIN v plazmatické membráně. Protože proteiny PIN dynamicky cyklují mezi plazmatickou membránou a endozomálními kompartmenty (Geldner a kol., 2001), je pravděpodobné, že PID určuje lokalizaci proteinů PIN v buňce a podporuje jejich transport do membrány právě zasažením do procesu jejich cyklování. Větší množství přenašečů PIN na membráně může být teoreticky dosaženo buď podporou exocytózy z endozomálních kompartmentů, a nebo inhibicí endocytózy těchto přenašečů. K testování toho, ve kterém kroku kináza PID zasahuje do cyklování proteinů PIN, bylo využito akumulačních experimentů na linii PIN1-PID. U této linie byla po dobu 48 hodin indukována exprese kinázy PID 1 µm tamoxifenem, neovlivněná varianta sloužila jako kontrola. Byla měřena akumulace [ 3 H]NAA u buněčné suspenze PIN1-PID ovlivněné postupně 50 µm brefeldinem A (BFA), inhibitorem exocytózy, 50 µm tyrfostinem A23, inhibitorem endocytózy a 50 µm tyrfostinem A51, nefunkčním analogem tyrfostinu A23 jako kontrolou. 59

60 Akumulace [ 3 H]NAA (% varianty neovlivněné BFA) Obr. 17. Vliv BFA na akumulaci [ 3 H]NAA v buňkách linie PIN1-PID. Kultura nadprodukující kinázu PID má zvýšený transport auxinu z buněk, 50 µm BFA zvrátí tento pozitivní vliv PID. Chybové úsečky vyjadřují střední chyby průměru (n = 4) BFA + BFA PIN1-PID kontrola PIN1-PID+TAM Obr. 18. Vliv BFA na akumulaci [ 3 H]NAA v buňkách linie PIN1-PID, citlivost k BFA po 20 min. akumulace. Dvojice sloupců ukazují, jak se zvýšila akumulace [ 3 H]NAA po aplikaci 50 µm BFA (červené sloupce) oproti variantě bez BFA (modré sloupce). Linie nadprodukující proteinkinázu PID je k BFA citlivější než kontrola. Chybové úsečky vyjadřují průměrné střední chyby průměru stanovených hodnot akumulací [ 3 H]NAA v buňkách aktivované a neaktivované linie PIN1-PID (n = 4). Bylo zjištěno, že po působení BFA dochází k vyrovnání míry akumulace [ 3 H]NAA indukované varianty s kontrolou (obr. 17). Varianta nadprodukující kinázu PID na inhibici BFA reaguje citlivěji než kontrola, akumulace auxinu u indukované varianty se po aplikaci 60

61 BFA zvýšila 5x, zatímco u kontrolní varianty jen 2,3x (obr. 18). Veškerý vliv proteinkinázy PID na transport auxinu z buněk je tedy působením BFA zablokován. Následně byly měřeny akumulace auxinu v buňkách linie PIN1-PID s použitím tyrfostinu A23 (Tyr A23), který jako blokuje endocytózu proteinů PIN závislou na klatrinu (Dhonukshe a kol., 2007) Tyrfostin A51 (Tyr A51) je nefunkčním analogem Tyr A23, jehož působení nemá na akumulace auxinu v buňkách téměř žádný vliv a používá se tedy jako kontrola (obr. 19). Očekávaný účinek Tyr A23 je snížení akumulace auxinu v buňkách jako důsledek toho, že nedochází k endocytóze přenašečů PIN. Na plazmatické membráně jich tedy zůstane více a úměrně větší je také transport auxinu z buněk. Tento efekt Tyr A23 se bohužel nepodařilo prokázat jak u dvojitého transformanta PIN1-PID (obr. 19), tak ani u kontrolních netransformovaných buněk linie BY-2 (obr. 20). V obou případech dochází naopak po aplikaci tyrfostinu A23 k okamžitému nárůstu akumulace auxinu v buňkách. Obr. 19: Vliv Tyrfostinu A23 a A51 na akumulaci [ 3 H]NAA v buňkách linie PIN1-PID. Inhibitor endocytózy tyrfostin A23 způsobuje rychlý nárůst akumulace auxinu v buňkách. Jeho nefunkční analog tyrfostin A51 nemá téměř žádný vliv na akumulaci auxinu. Chybové úsečky vyjadřují střední chyby průměru (n = 4). 61

62 Obr. 20: Vliv tyrfostinu A23 a A51 na akumulaci [3H]NAA ve WT buňkách linie BY-2. Inhibitor endocytózy tyrfostin A23 způsobuje rychlý nárůst akumulace auxinu v buňkách. Tyrfostin A51 nemá téměř žádný vliv na akumulaci auxinu. Chybové úsečky vyjadřují střední chyby průměru (n = 4). Výsledky akumulačních experimentů s BFA naznačují, že fosforylace přenašečů PIN podporuje jejich exocytózu z endozomálních kompartmentů. Protože ale působení Tyr A23 na buňkách BY-2 obecně nezpůsobuje prosté navýšení množství proteinů PIN na membráně a jejich aktivity dané inhibicí jejich endocytózy, není možné z těchto výsledků usoudit, který směr transportu váčků je aktivitou PID ovlivněn přednostně Studium buněčné lokalizace proteinkinázy PID Pro určení buněčné lokalizace kinázy PID byla využita tranzientní transformace buněk BY-2 biolistickou metodou. Do buněk byly vneseny plazmidy nesoucí gen pro PID-GFP nebo jeho nefunkční variantu mpid-gfp a byla porovnána jejich lokalizace. Bylo zjištěno, že oba tyto proteiny jsou umisťovány v oblasti pod plazmatickou membránou, v kortikální cytoplazmě. Signál je dále viditelný v cytoplazmatických provazcích a kolem jádra (obr. 21). Nebyl pozorován žádný rozdíl mezi lokalizací kinázy PID a mpid, mutace v ATP-vazebném místě kinázy mpid tedy nemá vliv na její umisťování v buňce. 62

63 Obr. 21: Lokalizace kinázy PID a mpid v buňkách BY-2. Konfokální řezy (vlevo) a 3D rekonstrukce (vpravo; 12 řezů, šířka kroku 0,9 μm pro PID-GFP a 1 μm pro mpid-gfp), objektiv 60x, vodní imerze. Vnesené plazmidy nesoucí buď 35S::PID-GFP (A) nebo 35S::mPID-GFP (B) (oba v konc. 1,2 µg/µl). Kináza PID i její nefunkční varianta mpid jsou lokalizované v kortikální cytoplazmě, ale také v cytoplazmatických provazcích a kolem jádra. Nebyl pozorován rozdíl mezi lokalizací kinázy PID a mpid. Předchozí pozorování v laboratoři Dr. Remka Offringy (nepublikováno) naznačovalo možnou interakci proteinkinázy PID s cytoskeletem. Pro ověření této případné interakce byly buňky BY-2 tranzientně transformovány plazmidem nesoucím 35S::PID-GFP biolistickou metodou. Pomocí aplikace cytoskeletálních drog bylo zjišťováno, zda cytoskelet hraje nějakou roli v lokalizaci kinázy PID. Část buněk, do kterých byl nastřelen plazmid nesoucí PID-GFP, byla rozmíchána v malém množství tekutého MS média obsahujícího buď oryzalin (20 µm), látku destabilizující mikrotubuly, nebo latrunculin B (500 nm), způsobující fragmentaci aktinových filament, zbylé transformované buňky byly použity jako kontrola. Materiál byl pozorován po 1,5 hodině. Nebyl zjištěn žádný rozdíl v lokalizaci kinázy PID mezi ovlivněnými (obr. 22) a neovlivněnými (obr. 21) buňkami. Proteinkináza PID tak pravděpodobně není v buňkách BY-2 po tranzientní transformaci v interakci s cytoskeletem. 63

64 Obr. 22: Studium úlohy cytoskeletu v umisťování kinázy PID. Konfokální řezy, objektiv 60x, vodní imerze. Vnesený plazmid nesoucí 35S::PID-GFP (v konc. 1,2 µg/µl). Po aplikaci cytoskeletálních drog nebyly nepozorovány žádné změny v lokalizaci kinázy PID oproti neovlivněným buňkám (Obr. 21) Identifikace tabákových homologů AGC kináz Předchozí experimenty byly provedeny na tabákové linii BY-2, která byla stabilně či tranzientně transformována geny z Arabidopsis thaliana. Bylo třeba zjistit, zda se v použitém materiálu vyskytují i endogenní homology proteinkináz PID a WAG, které mohou pravděpodobně také fosforylovat vložený protein PIN1 či být v interakci s endogenními tabákovými proteiny PIN. Cílem tohoto experimentu bylo nalezení alespoň částí sekvencí homologních protein kináz PID, WAG1 a WAG2 v databázích exprimovaných sekvencí z Nicotiana tabacum. Pro hledání byly použity aminokyselinové sekvence těchto kináz z Arabidopsis thaliana a pomocí aplikace TBLASTN na byly nalezeny homologní sekvence v databázi exprimovaných unigenů složených z ESTů (tab. 2, obr. 23 a 24). Pro amplifikaci tabákových sekvencí z DNA a cdna byly navrženy na základě sekvencí unigenů specifické primery (tab. 1). Arabidopsis thaliana Nicotiana tabacum Název a identifikační číslo Velikost kódující sekvence Název a identifikační číslo Velikost unigenu AtPID (AT2G34650) 1317 bp NtPID (SGN-U363341) 960 bp AtWAG1 (AT1G53700) 1431 bp NtWAG1 (SGN-U367045) 1096 bp AtWAG2 (AT3G14370) 1443 bp NtWAG2 (SGN-U369289) 1784 bp Tab. 2: Tabákové unigeny odpovídající homologií genům proteinkináz PID, WAG1 a WAG2 z Arabidopsis thaliana. Tabulka uvádí identifikační čísla, délku unigenů a názvy homologních proteinkináz PID, WAG1 a WAG2 a jejich předloh z Arabidopsis thaliana používané v této práci. 64

65 Obr. 23: Porovnání shody aminokyselinové sekvence proteinkinázy PID z Arabidopsis thaliana (AtPID) a predikované homologní sekvence ze sekvence unigenu SGN-U Nicotiana tabacum (NtPID). Shodné aminokyseliny jsou vyznačeny žlutě a aminokyseliny s podobnými vlastnostmi zeleně Obr. 24: Porovnání shody aminokyselinové sekvence proteinkináz WAG1 a WAG2 z Arabidopsis thaliana (AtWAG1 a AtWAG2) a predikované homologní sekvence ze sekvence unigenů SGN-U a SGN-U u Nicotiana tabacum (NtWAG1 resp NtWAG2). Aminokyseliny shodné u všech sekvencí jsou vyznačeny žlutě, aminokyseliny shodné u dvou či tří sekvencí modře, aminokyseliny s podobnými vlastnostmi zeleně. 65

66 Přítomnost homologů vybraných AGC kináz v buňkách BY-2 byla nejprve zjišťována pomocí PCR na genomické DNA (obr. 25). Jako kontrola správného průběhu reakce byly použity primery specifické k aktinu (tab. 1). Velikost výsledných produktů byla v případě homologů kinázy PID a WAG1 výrazně větší než očekávaná a homolog kinázy WAG2 nebyl nalezen vůbec. Vzhledem k tomu, že použité primery byly navrhovány na základě sekvence unigenů složených z ESTů, bylo nutné otestovat, zda větší velikost produktů PCR reakce nebyla způsobena tím, že došlo i k amplifikaci přes intron. V případě NtWAG2 je pak možné, že byl navržen primer, který byl ve skutečnosti sám přerušen intronem, a nedošlo tedy ke vzniku žádného produktu. Stejná kombinace primerů byla tedy použita pro RT-PCR z exponenciálně se dělících dvoudenních buněk BY-2 (obr. 26). Zde jsou velikosti výsledných produktů plně shodné s očekávanými a byl tak tedy prokázána transkripce homologů kináz PID, WAG1 a WAG2 v dvoudenních buňkách tabáku BY-2. Obr. 25: Elektroforetogram PCR produktů z genomické DNA buněk BY-2. Jednotlivé fragmenty byly amplifikovány pomocí PCR se specifickými primery a následně analyzovány pomocí elektroforézy na agarózovém gelu. Jako kontrola správného průběhu reakce byly použity primery specifické k aktinu. Pozitivní reakce byla získána u NtPID a NtWAG1, NtWAG2 nebyl amplifikován danými primery. 66

67 Obr. 26: Elektroforetogram RT-PCR produktů z celkové RNA dvoudenních buněk BY- 2. Jednotlivé fragmenty byly amplifikovány pomocí RT-PCR se specifickými primery a následně analyzovány pomocí elektroforézy na agarózovém gelu. Jako kontrola správného průběhu reakce byly použity primery specifické k aktinu. Velikosti všech produktů jsou shodné s očekávanými (Tab. 1). 67