3) Fyziologie rostlinných hormonů auxinů: receptory a signální dráhy

Transkript

1 SFR ) Fyziologie rostlinných hormonů auxinů: receptory a signální dráhy a) Auxinový receptor TIR1 b) Auxinový receptor ABP1 c) Kooperace receptorů TIR1 a ABP1 Estelle M et al. (2011) Auxin Signaling: From Synthesis to Systems Biology; Cold Spring Harbor Laboratory Martin Fellner Laboratoř růstových regulátorů PřF UP v Olomouci a ÚEB AVČR

2 2 Ve 30. letech byl izolován auxin a bylo ukázáno, že stimuluje růst.. Úhel zakřivení je úměrný množství auxinu v bloku Akumulace auxinu ze špiček koleoptile do agarových bloků...a ukázal, že materiál akumulovaný v agarových blocích je látka, která stimuluje růst. Indole-3-acetic acid, IAA Tento experiment ukazující stimulaci růstu auxinem byl použit jako základ pro purifikaci auxinu. Redrawn from Went, F.W. (1935) Auxin, the plant growth-hormone. Bot. Rev. 1:

3 Auxiny důležité rostlinné hormony zapojené v širokém spektru růstových a vývojových procesů: 3 embryogeneze prodlužování stonku apikální dominance foto- a gravitropismus tvorba laterálních kořenů Buněčná úroveň: buněčné dělení expanze buněk diferenciace buněk

4 4 a) Auxinový receptor TIR1 Intracelulární receptor TIR1 (Transport Inhibitor Response 1) u Arabidopsis Kepinski and Leyser 2005 Dharmasiri et al Auxin se váže v jádře přímo k TIR1 Jádro TIR1 1) První intracelulární auxinový receptor 2) Receptor zprostředkující transkripční reakce k auxinu TIR1 A A

5 5 tir1-1 mutant u Arabidopsis: wt tir1 tir1-1 rezistentní k inhibitoru polárního transportu auxinu (NPA) tir1-1 redukovaná tvorba laterálních kořenů - 2,4-D TIR1 obsahuje sérii leucinů a motif zvaný F-box F-box proteiny jsou zapojeny v procesech zprostředkovaných ubiquitinací + 2,4-D Reakce k auxinu závisí na modifikacích proteinů procesem ubiquitinace. TIR1 funguje v ubiquitinační konjugační dráze, která směřuje proteiny k proteolytické degradaci.

6 F-box zprostředkuje transkripční reakce k auxinu 6 TIR1 TIR1 A A TIR1 A Degradace substrátu Jádro Vazba auxinu k TIR1 umožňuje vazbu substrátového proteinu ( = represoru transkripce auxinem-indukovaných genů). To vede k degradaci substrátového proteinu a tak k uvolnění exprese auxinem-indukovaných genů. Auxin funguje jako lepidlo umožňující spojení TIR1 se substrátem A TIR1

7 7 Ubiquitinace - nezbytný regulační mechanizmus v rostlinných i živočišných buňkách Ub Ubiquitin Jádro Ub UbUb E1 Ubiquitin-activující enzym 26S Proteazom E1 E2 F-box Ubiquitin-conjugující enzym F-box E3 ubiquitin-ligázy Cílový protein A F-box ASK1 Ub Ub CUL1 Ub E2 RBX1 E1 Ub Ub Ubiquitin Cílový protein je poly-ubiquitinován a směřován do 26S proteazomu, kde je degradován.

8 8 COP1 funguje jako E3 ubiquitin ligáza enzym zajišťující v buňce degradaci proteinů (proteolýzu) Proteolýza zprostředkovaná proteazomem vyžaduje protein ubiquitin. Ubiquitinace běžný mechanizmus degradace proteinů v organizmech ubiquitin protein ubiquitin protein E3 ubiquitin ligáza 26S proteazom UPDATE 2012 Lau OS, Deng XW (2012) TIPS 17: Nejnovější informace o funkci COP1 v rostlinách

9 9 Co je substrátovým proteinem? Proteiny typu Aux/IAA nukleární proteiny, které potlačují auxinové reakce. Arabidopsis identifikováno 29 typů proteinů. Aux/IAA I II III IV Fúzní Aux/IAA-GUS protein ukazuje jadernou akumulaci

10 10 Proteiny Aux/IAA jsou proteiny s velmi krátkou životností Aux/IAA mají regulační funkci Aux/IAA jsou destabilizovány za přítomnosti auxinu. PS-IAA6 Proteiny Aux/IAA mají proteindestabilizující doménu.

11 11 Aux/IAA I II III IV Krátká aminokyselinová sekvence nazývaná degron nutná pro auxinem-indukovanou nestabilitu proteinu Aux/IAA Změna v jedné aminokyselině v doméně degron vede k větší stabilitě proteinu Aux/IAA => rezistence k auxinu

12 12 Prostřednictvím domény degron se Aux/IAA váže k TIR1 I II III IV QVVGWPPVRSYRK Wild-type degron I II III IV QVVGWPLVRSYRK Mutant degron Mutace v doméně degron brání proteinu Aux/IAA ve vazbě k TIR1 a tím brání v degradaci Aux/IAA => mutantní protein Aux/IAA je stabilnější.

13 13 Transkripční faktory ARF (Auxin Response Factors) proteiny s krátkou životností; váží se k DNA sekvenci nazývanou AuxRE (Auxin Response Element). ARF stimulují expresi auxinemindukovných genů. Arabidopsis 23 ARFs ARF DNAbinding domain Activation / repression domain III IV Aux/IAA I II III IV ARF homodimer ARF Aux/IAA heterodimer

14 14 Proteiny Aux/IAA blokují transkripční faktory ARF A TIR1 ARF Transkripční výsledek (aktivace či potlačení) závisí na koncentraci auxinu, a tím na finální koncentraci transkripčních faktorů ARF a Aux/IAA v buňce a k jejich vzájemné afinitě a afinitě k vazebnému místu na DNA. [Auxin] [Aux/IAA] Transkripční výsledek ARF Vazba ARF k AuxREs AuxRE TGTCTC Auxin responsivní gen Aktivace genové exprese Potlačení genové exprese

15 15 TIR1- zprostředkovaná signalizace auxinu Ub UbUb 26S Proteasome A TIR1 auxin F-box podjednotka E3-ubiquitin ligázy; auxinový receptor represor transkripce auxinem-indukovaných genů A TIR1 ASK1 Ub Ub CUL1 Ub E2 RBX1 E1 Ub E1 Ub ARF transkripční faktor (aktivátor exprese genů) Auxinem-indukované geny obsahují AuxRE = auxin responsivní element Podobné mechanizmy pro F-box proteiny: TIR1 A TIR1 A A TIR1 A A A A A A COP1 CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOG. 1 COI CORONATINE INSENSITVE 1 ARF AuxRE Auxin inducible gene de-repression ARF AuxRE e.g. AUX/IAA, SAUR, GH3, etc. ZTL ZEITLUPE, etc. [Auxin] Plant development

16 16 Rozmanitost auxinových reakcí koreluje s rozmanitostí signálních proteinů. Auxin Aux/IAA ARF Transkripční výsledek 2010 American Society of Plant Biologists Počet potenciálních interakcí mezi ARFs a Aux/IAA proteiny je veliký. Tím vzniká vysoký potenciál (schopnost) přesně kontrolovat expresi auxinemindukovaných genů v mnoha kombinacích.

17 17 Rozmanitost auxinových reakcí je dále zvyšována různou afinitou receptorů TIR1 a substrátových proteinů Aux/IAA k auxinu. 6 typů receptorů typu TIR1: TIR1, AFB1, AFB2, AFB3, AFB4 a AFB5 29 typů proteinových substrátů Aux/IAA Receptory TIR1/AFBs mají různou afinitu k substrátům Aux/IAA, a to v závislosti na koncentraci auxinu. Při různé koncentraci auxinů se tak k různým receptorům TIR1/AFBs připojují různé substráty Aux/IAA. Některé substráty Aux/IAA vyžadují vysokou koncentraci auxinů k tomu, aby se připojili k receptoru TIR1/AFBs. TIR1/ AFBs A Koncentrace auxinů Komplex TIR1/AFBs-Aux/IAA se nazývá co-receptorový systém. Afinita Aux/IAA k auxinu je určující pro celkovou afinitu systému. 6 typů 29 typů

18 18 Auxinem indukované geny Primární (rané) geny přímo aktivované TIR1/AFBs-Aux/IAA signalizací Sekundární (pozdní) geny kódují proteiny, které nejsou přímo zapojeny v indukci primární auxinové reakce Primární (rané) geny - indukce: minuty až hodiny; 3 funkce Transkripce rané geny kódují proteiny regulující expresi pozdních genů Signalizace rané geny jsou zapojeny v intercelulární komunikaci nebo signalizace mezi buňkami Konjugace/katabolismus auxinů rané geny kódují proteiny zapojené v eliminaci IAA buď konjugací nebo degradací

19 19 Primární geny pro růst a vývoj AUX/IAA exprese stimulovaná auxinem během 6 60 minut; vzniklý protein žije asi 7 minut. SAUR exprese stimulovaná auxinem během 2 5 minut; exprese nevyžaduje syntézu nových proteinů; geny neobsahují introny, kódují velmi podobné peptidy neznámé funkce. Indukují expanzi buněk (SAUR19) Indukují dělení buněk (SAUR76) Koordinují dělení a expanzi buněk (SAUR41) UPDATE GH3 exprese stimulovaná auxinem během 5 minut; geny fungují v IAA konjugaci; exprese GH3 odráží množství endogenního auxinu => syntetický promotor DR5. Sekundární (pozdní) geny Exprese stimulovaná auxinem během 2 4 hodin; často indukovány i stresem

20 Signální dráha receptoru TIR1 důležitá, ale ne jediná, dráha pro funkci auxinu 20 Homology TIR1: AFB1, AFB2, AFB3, AFB4, AFB5 stejná funkce jako TIR1 Avšak: 1) Čtyřnásobný mutant stále funkční rostlina Receptory TIR1 a AFB nejsou nepostradatelné Col-0 tir1 afb1 afb2 afb3 2) Dharmasiri et al. 2005b Auxin indukuje prodlužování buněk s lag fází 8-15 min => rychlá reakce vylučující zapojení TIR1, tedy transkripci genů či syntézu proteinů Auxin funguje prostřednictvím signální dráhy s jiným receptorem Receptor ABP1 Steffens and Lüthen 2000

21 21 b) Auxinový receptor ABP1 Hertel R et al. (1972) 1972 identifikace ABP1 (Auxin-Binding Protein 1) v izolovaných membránách z buněk kukuřičné koleoptile; vazba radioaktivního auxinu v membráně 1985 izolace proteinu ABP1 z kukuřice; velikost 22 kd Lobler M an Klämbt DA (1985) Konec 80. let klonování ABP1 a struktura ABP1 Auxin-binding doména Pravděpodobná auxin-binding doména N Box a Box b Box c KDEL C Auxin se váže k plazmamembránové frakci? ALE Protein ABP1 nemá transmembránovou doménu Navržen model Docking proteinu

22 22 Transport ABP1 z endoplazmatického retikula do apoplastu Tromas A et al. (2010) Většina ABP1 je lokalizována v endoplazmatickém retikuku (ER). Malá část ABP1 je pomocí vezikul sekretovába zatím neznámým mechanizmem do apoplastu a přichycena na plazmatickou membránu (Plm). Sekrece ABP1 byla dokázána v různých typech buněčných kultur. ABP1 se pravidelně nalézá i v kultivačním médiu. Brefeldin - inhibitor vesikulárního transportu - inhibuje sekreci ABP1 do kultivačního media.

23 Jaké jsou důkazy pro to, že ABP1 je extracelularní auxinový receptor? 23 Elektrofyziologické experimenty na protoplastech IAA ABP1 Anti-ABP1 antibody ABP1 Control Docking protein Docking protein +NAA +NAA +anti-abp Hyperpolarizace membrány Hyperpolarizace membrány je blokována Barbier-Brygoo H et al. (1989) Technika patch-clamp: Auxinem-indukované zvýšení ATP-závislého proudu může být blokována protilátkami proti ABP1

24 Elektrofyziologické reakce velmi rychlé (minuty) 24 ALE Růstové reakce jsou pomalejší Potřeba citlivého experimentálního systému k odhalení funkce ABP1 v kontrole růstu Auxinem-indukované zvětšování protoplastů 12 min 6 h Keller C and Van Volkenburgh E (1996) IAA

25 25 Časový průběh zvětšování protoplastů a auxinem-indukovaný růst kukuřičné koleoptile Zapojení ABP1 ve zvětšování protoplastů Steffens B and Lüthen H (2000) Auxinový signál pro zvětšování protoplastů je přijímán ABP1 Steffens B et al. (2001)

26 26 Teorie kyselého růstu, protonová pumpa a draslíkové kanály Hager A et al. (1971) Rayle D and Cleland R (1970) Auxin Exkrece H + do apoplastu Snížení ph v apoplastu Aktivace enzymů rozvolňujících buněčnou stěnu apoplast cytozol H H + + H + H + H + IAA ATP H + -ATPáza ADP? ABP1 Docking protein Plazmatická membrána Christian M et al. 2006, upraveno Vazba auxinu k ABP1 Stimulace aktivity H + -ATPázy Hyperpolarizace membrány Acidifikace apoplastu

27 Podmínky platnosti teorie kyselého růstu Kyselé pufry by měly indukovat růst. Kyselé pufry stimulují růst. 2. Auxin by měl zvyšovat rychlost exkrece H + a kinetika exkrece H + by měla korelovat s rychlostí růstu. Auxin stimuluje exkreci H + po min lag fáze = kinetika růstu. 3. Neutrální pufry by měly inhibovat růst indukovaný auxinem. Neutrální pufry inhibují auxinem-indukovaný růst. Fusicoccin stimuluje rychlou exkreci H + a přechodný růst. 4. Látky stimulující exkreci H + by měly stimulovat růst. 5. Buněčná stěna by měla obsahovat faktory, které rozvolňují buněčnou stěnu při nízkém ph. V buněčné stěně se vyskytují expansiny aktivované nízkým ph, které rozvolňují buněčnou stěnu.

28 28 Podmínkou růstu buňky je turgor. Auxin sám nezvyšuje turgorový tlak. Akumulace H + v apoplastu Kompenzace náboje v cytosolu K + kanály transportující K + dovnitř buňky apoplast cytosol ATP H + K+ K + H + -ATPáza ADP H + H + IAA ABP1 Docking protein? H + H + Plazmatická membrána Christian M et al. 2006, upraveno K + kanál K + kanál K + K + K + Akvaporin H 2 O H 2 O Akumulace K + v cytosolu Transport H 2 0 do buňky Turgor RŮST Přítomnost K + : podmínka udržení trvalé acidifikace a trvalého růstu

29 Důkazy zapojení K + kanálů v auxinem-indukovaném růstu 29 - auxinem-indukované prodlužování kukuřičné koleoptile je závislé na koncentraci K + - auxinem-indukované zvětšování protoplastů je závislé na koncentraci K + - TEA (inhibitor K + kanálů) inhibuje auxinem-indukované prodlužování Christian M et al. (2006) - ZMK1 (Zea mays K + channel 1) je exprimován v závislosti na koncentraci auxinu - auxinem-indukovaná exprese ZMK1 koreluje s auxinem-indukovaným růstem - rostliny s knokautovaným ZMK1 jsou embryo letální - rostliny s overexprimovaným ZMK1 jsou supersensitivní k auxinu

30 30 Tromas A et al. (2010) Sauer M and Kleine-Vehn J (2011)

31 UPDATE 2014 Spartz AK et al. (2014) Plant Cell 26: Aktivita H + -ATPázy (protonové pumpy) je stimulována proteiny SAUR19. Mechanizmus: H + -ATPáza je aktivní pouze, když její C-terminální doména je fosforylovaná a navázaná na protein Tím je odblokováno katalyzační místo pumpy pumpa je aktivní. Pokud je protonová pumpa defosforylovaná, tak není aktivní. K této defosforylaci dochází vlivem protein fosfatázy PP2c-D. Pokud je SAUR19 exprimován, tak interaguje s PP2c-D a tím ji inaktivuje. Protonová pumpa pak není defosforylovaná a je tedy aktivní.

32 32 Přehled reakcí zprostředkovaných ABP1 - velmi rychlé auxinové reakce proud iontů přes plazma membránu Barbier-Brygoo H et al. (1989) - zvětšování buněk Im KH et al. (2000); Chen JG et al. (2006) - dělení buněk Fellner M et al. (1996) - overexprese ABP1 zvětšená velikost listů tabáku Jones AM et al. (1998)

33 33 - knockout ABP1 zastavení vývoje embrya Arabidopsis embryo v globulárním stádiu wt abp1 - kontrola buněčného cyklu fáze G1/S David KM et al. (2007) Chen JG et al. (2001) - inaktivace ABP1 - snížení exprese cyklinů CYCD3 a CYCD6 David KM et al. (2007) - řízená inaktivace ABP1 redukce růstu listů Arabidopsis Braun N et al. (2008)

34 34 Rychlá auxinem-indukovaná inhibice endocytózy proteinů PIN1. Plazma membrána Endozom PIN1 Auxin PIN1 Paciorek T et al. (2005)

35 35 Endocytóza PIN1 je nezávislá na TIR1, ale vyžaduje ABP1. ABP1 stimuluje endocytózu PIN1 proteinů závislou na proteinu clathrinu. Negativní účinek auxinu na internalizaci PIN1 proteinů může být zprostředkován ABP1. Sauer M, Kleine-Vehn J (2011)

36 Lokalizace a uspořádání kortikálních mikrotubulů (MT) je důležité pro utváření tvaru buňky. 36 Kortikální mikrotubuly, které jsou připojeny k vnitřní straně plazmatické membrány, řídí syntézu celulózy. Epidermální zpevňující buňky listů Kortikální mikrotubuly vedou celulóza-syntázový komplex lokalizace a uspořádání komplexu kontroluje expanzi buňky => tvar a růst buňky Epidermální zpevňující buňky listů: Lalokovitá část tvorba F-aktinu ROP2/RIC4 systémem. Prohlubňovitá část tvorba mikrotubulů ROP6/RIC1 systémem. ROP (Rho Of Plants) = = Rho-related GTPáza (hydroláza) F-actin Mikrotubuly Lalokovitá část (výběžek; lobeforming region) Prohlubňovitá část (indenting region ) GTP GDP + Pi Energie Např. translace

37 37 Auxin zvyšuje tvorbu laloků epidermálních zpevňovacích epidermálních buněk listů. Mutant Arabidopsis abp1-5 má odlišné epidermální zpevňovací buňky a auxin nezvyšuje tvorbu laloků. Polarizace PIN1 je pravděpodobně nutná pro vytváření laloků. Sauer M, Kleine-Vehn J (2011)

38 38 Mechanizmus auxinem regulované tvorby tvaru buňky vlivem re-organizace cytoskeletu prostřednictvím Rho-GTPase-závislé dráhy. Nagawa S et al. (2012) PlosONE10: e ) Bylo potvrzeno, že auxin prostřednitvím ABP1 aktivuje ROP2 a ROP6 signalizaci. Yang Z, Lavagi I (2012) (Review)

39 39 c) Kooperace receptorů TIR1 a ABP1 1) TIR1 kontroluje syntézu H + -ATPázy a K + kanálů Christian M et al. (2006) outside H + K+ K + IAA ABP1 inside H + -ATPase Docking protein Plasma membrane ZKM1 ZKM1 ATP ADP Translation IAA TIR1 Transcription IAA TIR1 Translation ARF AuxRE H + -ATPase gene ARF AuxRE K + -channel gene Transcription

40 40 2) TIR1 kontroluje syntézu proteinu PIN1, ABP1 kontroluje jeho polární lokalizaci H + IAA IAA IAA outside ABP1 inside H + -ATPase Docking protein Plasma membrane PIN1 PIN1 ATP ADP IAA TIR1 ARF Transcription Translation PIN1 AuxRE PIN1 gene Endozom

41 41 3) Rychlá aktivace fosfolipázy A Auxin velice rychle (do 2 min) aktivuje fosfolipázu A (ppla) prostřednictvím ROP signalizace. Mastné kyseliny a lizolipidy (LPX) aktivují transkripci. Mastné kyseliny aktivují pomocí calciumdependent kinázy protein PINOID hlavní regulátor PIN proteinů. Scherer GFE et al. (2012)

42 42 4) Duální úloha receptorů ABP1 a TIR1 v kontrole buněčného cyklu David KM et al. (2007)

43 43 Symbolický model potencionální interakce ABP1 a TIR1 Scherer GFE (2011)

44 44

45