Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici. Diplomová práce Sledování průběhu malolaktické fermentace

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Diplomová práce Sledování průběhu malolaktické fermentace Vedoucí diplomové práce: Ing. Kamil Prokeš Vypracovala: Bc. Lucie Štětkářová Lednice 2014

2 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci Sledování průběhu malolaktické fermentace vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Lednici dne:... Podpis studenta

3 Poděkování Ráda bych poděkovala Ing. Kamilu Prokešovi za odborné vedení a pomoc při zpracování praktické části a výsledků diplomové práce. Také bych chtěla poděkovat Ing. Mojmíru Baroňovi, Ph.D. za pomoc při literární části po stylistické stránce.

4 Obsah 1. ÚVOD CÍL DIPLOMOVÉ PRÁCE LITERÁRNÍ ČÁST Bakterie Stavba bakteriální buňky Rozmnožování bakterií Růst bakterií Bakterie v moštech a vínech Mléčné bakterie Druhy mléčných bakterií Ekologie mléčných bakterií Fyziologie mléčných bakterií Fenotypové a fylogenetické vztahy Růst a množení mléčných bakterií Choroby vína způsobené mléčnými bakteriemi Malolaktická fermentace Inokulace Načasování malolaktické fermentace v procesu vinifikace Faktory ovlivňující malolaktickou fermentaci Vliv malolaktické fermentace na faktory kvality vína Působení MLF na organoleptické vlastnosti vína Hygienická kvalita vína Malolaktická fermentace v bílých vínech PRAKTICKÁ ČÁST Pracovní postup Materiál a metody Materiál Metody VÝSLEDKY Změny obsahu kyselin u odrůdy Sauvignon při použiti bakterií SB u odrůdy Sauvignon při použití citrátnegativních bakterií MaloStar

5 u odrůdy Cerason při použiti bakterií SB u odrůdy Cerason při použití citrátnegativních bakterií MaloStar u odrůdy Marlen při použiti bakterií SB u odrůdy Marlen při použití citrátnegativních bakterií MaloStar Změny obsahu kyseliny citronové u obou druhů bakterií u odrůdy Sauvignon u odrůdy Cerason u odrůdy Marlen Senzorická analýza bodový systém hodnocení hodnocení struktury a mohutnosti aromatický profil vín Statistická analýza Kyselina citronová Senzorická analýza DISKUZE ZÁVĚR SOUHRN RESUME SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Seznam obrázků Obr. 1 Růstová křivka bakterií Obr. 2 Lactobacillus pod mikroskopem Obr. 3 Pediococcus cerevisae pod mikroskopem Obr. 4 Oenococcus oeni pod mikroskopem Obr. 5 Heterofermentativní cesta kvašení Obr. 6 Homofermetativní cesta kvašení Obr. 7 Růst mléčných bakterií během alkoholové a malolaktické fermentace Obr. 8 Kapalinová chromatografie HPLC Obr. 9 Analyzátor vína ALPHA Obr. 10 Analyzátor vína ALPHA

6 Seznam tabulek Tab. 1 Analýza vína před a po MLF Tab. 2 Změny obsahu kyselin u odrůdy Sauvignon při použití bakterií SB Tab. 3 Změny obsahu kyselin u odrůdy Sauvignon při použití cítrátnegativních bakterií MaloStar Tab. 4 Změny obsahu kyselin u odrůdy Cerason při použití bakterií SB Tab. 5 Změny obsahu kyselin u odrůdy Cerason při použití citrátnegativních bakterií MaloStar Tab. 6 Změny obsahu kyselin u odrůdy Marlen při použití bakterií SB Tab. 7 Změny obsahu kyselin u odrůdy Marlen při použití citrátnegativních bakterií MaloStar Tab. 8 Změny obsahu kyseliny citronové u obou druhů bakterií u odrůdy Sauvignon Tab. 9 Změny obsahu kyseliny citronové u obou druhů bakterií u odrůdy Cerason Tab. 10 Změny obsahu kyseliny citronové u obou druhů bakterií u odrůdy Marlen Tab bodový systém hodnocení vín po MLF Tab. 12 Hodnocení struktury a mohutnosti tichých vín po MLF Tab. 13 T-test pro kyselinu citronovou u obou kmenů Tab. 14 T-test pro kyselinu citronovou u kmenu SB Tab. 15 T-test pro kyselinu citronovou u kmenu MaloStar Tab. 16 Porovnání použití obou kmenů ve vínech T-testem v 100bodovém systému hodnocení vín a v rozdílu kyselin ve vínech před a po MLF Tab. 17 Korelace 100bodového hodnocení a rozdílu kyselin před a po MLF u obou kmenů bakterií Tab. 18 Korelace mezi 100bodovým systémem hodnocení vín a konečným obsahem kyselin Seznam grafů Graf 1 Změny obsahu kyselin u odrůdy Sauvignon při použití bakterií SB Graf 2 Změny obsahu kyselin u odrůdy Sauvignon při použití citrátnegativních bakterií MaloStar Graf 3 Změny obsahu kyselin u odrůdy Cerason při použití bakterií SB Graf 4 Změny obsahu kyselin u odrůdy Cerason při použití citrátnegativních bakterií MaloStar Graf 5 Změny obsahu kyselin u odrůdy Marlen při použití bakterií SB

7 Graf 6 Změny obsahu kyselin u odrůdy Marlen při použití citrátnegativních bakterií MaloStar Graf 7 Změny obsahu kyseliny citronové u obou druhů bakterií u odrůdy Sauvignon Graf 8 Změny obsahu kyseliny citronové u obou druhů bakterií u odrůdy Cerason Graf 9 Změny obsahu kyseliny citronové u obou druhů bakterií u odrůdy Marlen Graf 10 Paprskový graf struktury a mohutnosti vín Graf 11 Aromatický profil bílého vína při použití komerčního kmenu Graf 12 Aromatický profil bílého vína při použití citrátnegativního kmenu Graf 13 Aromatický profil rosé vína při použití komerčního kmenu Graf 14 Aromatický profil rosé vína při použití citrátnegativního kmenu Graf 15 Aromatický profil červeného vína při použití komerčního kmenu Graf 16 Aromatický profil červeného vína při použití citrátnegativního kmenu Graf 17 Krabicový graf obsahu kyseliny citronové u obou kmenů bakterií před a po malolaktické fermentaci Graf 18 Krabicový graf obsahu kyseliny citronové u kmenu SB 3 před a po malolaktické fermentaci Graf 19 Krabicový graf obsahu kyseliny citronové u kmenu MaloStar před a po malolaktické fermentaci Graf 20 Krabicový graf 100bodové hodnocení vín po malolaktické fermentaci při použití obou kmenů baterií Graf 21 Krabicový graf rozdílu kyselin ve vínech před a po malolaktické fermentaci při použití obou kmenů bakterií

8 1. ÚVOD Malolaktická fermentace (MLF) neboli jablečno-mléčné kvašení je proces, při kterém se kyselina jablečná přeměňuje na kyselinu mléčnou. Uskutečňuje se pomocí bakterií mléčného kvašení. Existují různé druhy mléčných bakterií pozitivní (Oenococcus oeni) a negativní (Lactobacillus, Pediococcus). Jelikož chceme docílit pozitivního vlivu malolaktické fermentace na víno, vždy se snažíme vytvořit optimální podmínky pro růst bakterií Oenococcus oeni, protože negativní mléčné bakterie mohou způsobovat choroby vína. Každá bakterie potřebuje pro svůj růst a množení jiné optimální podmínky. Mezi takové podmínky patří teplota, hodnota ph, obsah alkoholu a obsah SO2. Malolaktická fermentace působí na víno tím, že snižuje kyselost, zlepšuje mikrobiální stabilitu a senzorické vlastnosti vína. Malolaktickou fermentace můžeme provádět před alkoholovou fermentací, během alkoholové fermentace a po alkoholové fermentaci. Vždy záleží na situaci a typu vína. V této práci je popsána malolaktická fermentace, její typy, jaké faktory na ni působí, jaké vlastností vína ovlivňuje. Také jsou popsány mléčné bakterie, jejich fyziologie, ekologie, růst i množení. Uvedeny jsou i nejčastější choroby způsobené mléčnými bakteriemi. Tato práce obsahuje praktickou část zaměřenou na sledování průběhu malolaktické fermentace. Byla sledována přeměna kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou v bílém, růžovém a červeném víně za působení dvou typů bakterií

9 2. CÍL DIPLOMOVÉ PRÁCE Cílem literární části diplomové práce bylo popsat mléčné bakterie, jejich množení, růst, ekologii a fyziologii. Dále bylo cílem popsat proces malolaktické fermentace, její druhy, faktory, které MLF ovlivňují a vlastnosti vína, které MLF ovlivňuje. Cílem praktické části diplomové práce bylo sledování průběhu malolaktické fermentace v bílém, růžovém a červeném víně. Malolaktická fermentace byla pozorována za působení dvou kmenů bakterií komerční kmen a citrátnegativní kmen

10 3. LITERÁRNÍ ČÁST 3.1. Bakterie Bakterie jsou jednobuněčné prokaryotické mikroorganismy, které nemají morfologicky diferencované jádro oddělené jadernou membránou od cytoplazmy. Jaderný aparát (nukleoid) je tvořený molekulou deoxyribonukleové kyseliny (DNA), která současně představuje chromozóm bakteriální buňky. Velikost buněk je velmi rozmanitá, od desetin až po několik desítek µm. Bakteriální buňky se vyskytují ve dvou základních tvarech. První tvar je kulovitý, sférický až oválný a tyto bakterie nazýváme koky. Paličkovité (tyčinkovité) bakterie mají tyčinkovitý až vláknitý tvar, rozdílně zahnutý až spirálovitý. (KOVÁČ a kol., 1990) Stavba bakteriální buňky Buňka bakterie se jednoduchostí své struktury výrazně liší od buňky eukaryotických organismů, např. kvasinek. Vnitřní obsah buňky se skládá s buněčné šťávy (cytoplazmy), což je v podstatě vodní roztok enzymů, vnitřních produktů metabolismu, zásobních látek a různých anorganických iontů a jaderného aparátu. Obě tyto složky tvoří protoplazmu. V cytoplazmě jsou uloženy i ribozomy, které jsou potřebné na syntézu bílkovin. Po obvodě cytoplazmy se nachází cytoplazmatická membrána, z níž do cytoplazmy vybíhají vychlípeniny mezozómy. Nad cytoplazmatickou membránou je buněčná stěna, která dává bakteriím tvar a mechanickou odolnost. Kromě toho mohou mít některé bakterie na povrchu ještě mikropouzdro, pouzdro nebo slizovou vrstvu. Některé bakterie mají na povrchu bičíky a fimbrie, které slouží jako pohybové orgány buňky. (KOVÁČ a kol., 1990) Rozmnožování bakterií Dlouho se rozmnožování bakterií považovalo za nepohlavní dělením nebo prostřednictvím spor. Dnes však už je prokázána existence párových typů, které mohou konjugovat (kopulovat). Bakterie vín spory netvoří, rozmnožují se výlučně příčným dělením. Po prodloužení se buňky rozdělí příčnou stěnou na dvě části. Proces dělení začíná rozdělením jaderného aparátu. Po něm se vytvoří příčná dělící stěna a mateřská buňka se rozdělí na dvě stejné dceřiné buňky. Dělení bakterií probíhá za příznivých podmínek velmi rychle, může proběhnout za minut. Teplota velmi ovlivňuje růst bakterií a jejich životní činnost probíhá je v určitém rozpětí teplot

11 Podle optimální teploty růstu se bakterie dělí na: a) Psychrofilní teplota do 20 C b) Mezofilní teplota C c) Termofilní teplota nad 40 C (KOVÁČ a kol., 1990) Růst bakterií Růst bakterií je rozdělen do několika fází: Lag fáze o Adaptace buněk o Buňky zvětšují objem, aktivace enzymového systému Fáze zrychlené růstu o Enzymové reakce dosahují mezních konstantních rychlostí ustálený stav o Nárůst protoplasmy, příprava buněk na množení Exponenciální fáze o Rychlost množení je konstantní o Počet buněk roste geometrickou řadou o Nejkratší generační doba buněk o Buňky: živé, stejné velikosti, nárůst biomasy o Množení závisí na prostředí složení a koncentrace živin, teplota, ph Fáze zpomaleného růstu o Vyčerpávání živin, toxické metabolity o Bakterie se nemnoží tak rychle jako v exponenciální fázi (rychlost se snižuje) o Populace dosáhla maximálního počtu Stacionární fáze o Úbytek živin o Metabolické produkty o Hladovění, intoxikace inhibice růstu o Živé buňky a malé množství mrtvých o Maximální populace o Zastavuje se nárůst živých buněk, množení minimální

12 Fáze postupného odumírání o Buňky se nemnoží odumírají o Nárůst mrtvých buněk o Postupné snížení počtu buněk (BÁBÍKOVÁ, 2012) Obr. 1 Růstová křivka bakterií ( rs002/section002/page001.html) Bakterie v moštech a vínech V moštech a vínech se vyskytuje jen omezený počet druhů bakterií, protože většina bakterií není schopna metabolizovat v prostředí s nízkým ph, tj. v kyselých prostředích jako jsou mošty a vína. Ve víně je navíc i toxický vliv alkoholu, případně SO2. Z technologického hlediska se bakterie dělí na užitečné, kterými se víno zlepší (malolaktická fermentace), a škodlivé, které mají vliv na nežádoucí mikrobiální změny ve vínech. Všechny bakterie vín se považují za heterotrofní organismy. To znamená, že jako energetický a stavební zdroj využívají již vytvořenou organickou hmotu, hlavně cukry, organické kyseliny apod. Podle nároků na kyslík se rozdělují na striktně aerobní, které vyžadují kyslík a striktně anaerobní, pro které je kyslík jedem. Fakultativní anaeroby mohou žít za přítomnosti i nepřítomnosti kyslíku. Podle produktů kvašení je rozdělujeme na homofermentativní, které produkují jen kyselinu mléčnou a CO2 a heterofermentativní, které

13 kromě kyseliny mléčné jako hlavního produktu, produkují ještě etanol, kyselinu octovou, CO2, glycerol apod. Při přímém pozorování bakterií pod mikroskopem je problém je rozpoznat, protože jejich buňky mají rozměr okolo 1 µm a vykazují intenzivní pohyb. Proto se fixují a barví, tzv. Gramovým barvením. Gram pozitivní bakterie se zbarví do fialova, zatímco gramnegativní se odbarví etanolem a dobarví dodatečně. Bakterie vyskytující se ve víně jsou na rozdíl od ostatních druhů přizpůsobené nižšímu ph a dobře se vyvíjejí při hodnotách ph mezi 3 až 4. Nejdůležitější bakterie ve vínech jsou octové a mléčné bakterie. (KOVÁČ a kol., 1990) 3.2. Mléčné bakterie Mléčné bakterie jsou anaerobní gram pozitivní mikroorganismy kulovitého nebo tyčinkovitého tvaru, které netvoří spory. Pozitivní vlastností mléčných bakterií je biologické odbourávání kyselin malolaktická fermentace. Z negativních vlastností je třeba připomenout možnost rozkladu kyseliny vinné (zvrhnutí vína), manitové a mléčné kvašení (odbourávání cukrů). Přírodním stanovištěm mléčných bakterií jsou dozrávající bobule révy, ze kterých se dostávají do moštu. Výskyt a zastoupení v mikroflóře kvasících moštů je poměrně nepravidelné, proto nebývá ani bakteriální odbourání kyselin v jednotlivých ročnících stejně intenzivní. Kromě toho jsou mléčné bakterie velmi náročné na složení živné půdy. Ve víně se vyskytují prakticky jen v přítomnosti kvasinek, které se už rozkládají (autolyzují) a poskytují jim výživné látky. Činnost mléčných bakterií značně inhibuje SO2. (KOVÁČ a kol., 1990) Druhy mléčných bakterií Lactobacillus Lactobacillus je jedním z nejvýznamnějších rodů v mikrobiologii potravin a výživy, vzhledem k jejich roli v potravinách, výrobě a konzervace, stejně jako pro jejich probiotické vlastnosti. Přispívají k aromatu fermentovaných potravin tak, že produkují diacetyl, H2S a aminy. Hrají roli v produkci i v kvašení potravin (zelí, siláž, mléčné výrobky a maso stejně jako produkty rybolovu) a nápojů (pivo, víno, džusy) (HAMMES a kol., 1991 v KÖNIG a kol., 2009). Lactobacillus představuje velmi rozmanitou skupinu gram pozitivních, mikroaerofilních bakterií. Buňky jsou stacionární a objevuje se ve formě dlouhých nebo krátkých tyčinek

14 (KANDLER a WEISS, 1986 v MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) uspořádaných v párech nebo řetízcích. Tyto bakterie jsou fakultativně anaerobní a vyžadují médium bohaté na zkvasitelné cukry. Jsou rozděleny do dvou skupin podle jejich vztahu k metabolismu hexóz: - Přísně heterofermentativní (L. brevis, L. hilgardii) - Fakultativně heterofermentativní (L. casei, L. plantarum) Existuje i třetí skupina představující přísně homofermentativní bakterie, ale tato skupina nebyla ve víně nalezena. (MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) Lactobacillus obsahují enzymy oxidázu a peroxidázu k provedení oxidace s O2 finálním elektronovým akceptorem. Homofermentativní kvašení cukrů probíhá jako Emdben- Meyerhofova cesta (EMS) a heterofermentativní kvašení jako fosfoketolázová cesta. Pyruvát může být během kvašení převeden na laktát, ale i na jiné produkty, např. diacetyl, kyselinu octovou, etanol a CO2. Za přítomnosti kyslíku lze laktát převést na pyruvát a následně na kyselinu octovou a CO2 nebo acetát. (SCHÜTZ a RADLER, 1984) Homofermentativní druhy mají aldózu, heterofermentativní fosfoketolázu. Fakultativní homofermentativní druhy mají indukovanou fosfoketolázu. U heterofermentativních druhů lze jako substrát použít také pentózy. (KÖNIG a kol., 2009) Kombinace fyziologických, biochemických a molekulárních testů jsou vyžadovány pro jednoznačnou identifikaci druhů Lactobacillu. 115 platně publikovaných druhů rodu Lactobacillus lze přiřadit do devíti skupin (HAMMES a kol., 1991 v KÖNIG a kol., 2009). Asi 16 poddruhů bylo nalezeno v moštu a víně. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) Několik druhů Lactobacillus bylo izolováno z hroznů a vín po celém světě. (MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) Obr. 2 Lactobacillus pod mikroskopem: A L. brevis, B L. casei (JACKSON, 2008)

15 Pediococcus Pediococcus se vyskytuje na rostlinách, ovoci a fermentovaných potravinách. Je nepatogenní pro rostliny a živočichy Buňky těchto bakterií jsou stacionární a mají kulovitý tvar. Tvoří páry, tetrády nebo velké shluky. Tyto bakterie jsou fakultativně anaerobní a vyžadují médium obsahující zkvasitelný cukr pro jejich rozvoj. Optimální teplota je C a ph 6. Jsou homofermentativní, což znamená, že všechny glukózy metabolizují na kyselinu mléčnou a nefermentují heteropolymer. Glukózu kvasí Embden-Meyerhofovou cestou. Ze sacharidů používá hexózy, pentózy, disacharidy, polysacharidy i škrob. Pyruvát dokáže převést na diacetyl. (KÖNIG a kol., 2009) Ze schválených druhů Pediococcus (GARVIE, 1986 v MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) byly pouze čtyři izolovány z vína: P. damnosus, P. parvulus, P. inopinatus a P. pentosaceus. (DAVIS a kol., 1986) P. pentosaceus a P. parvulus jsou nejběžnější druhy ve víně. (MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) Druhy jsou rozlišeny podle rozsahu kvašení cukrů, hydrolýzy argininu, růstu na různých hodnotách ph a konfiguraci vytvořené kyseliny mléčné. (AXELSSON, 2004 v KÖNIG a kol., 2009) Obr. 3 Pediococcus cerevisae pod mikroskopem (JACKSON, 2008) Oenococcus Byly popsány a snadno rozlišeny dva druhy: O. oeni a O. kitahareae. (EDNO a OKADA, 2006) O. kitahareae kyselinu jablečnou nekarboxyluje na kyselinu mléčnou a CO2-15 -

16 za přítomnosti zkvasitelných cukrů. Buňky nerostou při ph nižším než 4,5 a obsahu etanolu 10 %. O. oeni může růst při ph 3,0 a obsahu etanolu 10 %. (KÖNIG a kol., 2009) Oenococcus je popisován jako gram pozitivní kok vyskytující se v párech či řetízcích. Je fakultativně anaerobní, roste v teplotním rozmezí C. Vyžaduje bohaté médium hroznové šťávy. Je to heterofermentativní bakterie glukózu kvasí v kyselinu mléčnou, oxid uhličitý, kyselinu octovou a etanol. (MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) Obr. 4 Oenococcus oeni pod mikroskopem (JACKSON, 2008) Ekologie mléčných bakterií Obecně se mléčné bakterie vyskytují na stanovištích s bohatou zásobou výživy. Objevují se na rozkládajících se rostlinách a ovoci, mléčných výrobcích, fermentovaném masu a rybách, řepě, kaši, zelí, nakládané zelenině, siláži, v nápojích, vodě, šťávách, odpadních vodách a v dutinách člověka a zvířat. Jsou součástí zdravé mikroflóry střev. Kromě zubního kazu jsou laktobacily považovány za nepatogeny. (KÖNIG a kol., 2009) Lactobacillus plantarum by mohla být spojena s endokarditidou, sepsí a abscesy. Některé druhy jsou používány jako kvasné kultury pro kvašení potravin. Vzhledem k překyselení zabraňují růstu patogenních mikroorganismů (HAMMES a kol., 1991 v KÖNIG a kol., 2009) a kažení potravin. Některé bakterie jsou známé jako probiotika, které jsou potenciálně přínosné bakteriálním buňkám střevní mikroflóry člověka a jiných živočichů (TANNOCK, 2005)

17 Bakterie mléčného kvašení lze nalézt také na hroznech, v moštu, víně a pivu. Nepoškozené hrozny obsahují < 103 CFU.g -1 a počáteční titr je nízký. (LAFON- LAFOURCADE a kol., 1983) Kyselé prostředí (ph: 3,0 3,5) moštu poskytuje vhodné stanoviště jen pro pár mikrobiálních skupin. Zatímco mnoho mikrobů je inhibována koncentrací etanolu nad 4 %, tolerantní druhy k etanolu dokáží přežít v mladém víně. Kromě kvasinek mohou při vyšších koncentracích etanolu růst některé druhy Lactobacillus (např. L. hilgardii) a Oenococcus oeni. (KÖNIG a kol., 2009) Fyziologie mléčných bakterií Sacharidy se používají jako zdroj uhlíku a energie při kvašení homo- nebo heterofermentativní. Cukry nebo oligosacharidy jsou přeneseny enzymem fosfotransferázou nebo permeázou. Homofermentace hexos pokračuje přes EMS, zatímco heterofermentace se provádí přes fosfoketolázu na kyselinu mléčnou, acetát, etanol a CO2. Pentózy jsou fermentované fosfoketolázou na kyselinu mléčnou, kyselinu octovou etanol a CO2. Některé Lactobacillus mohou fermentovat pentózy homofermentativně. (RODAS a kol., 2006; RAIBAUD a kol., 1973) Některé kmeny mohou produkovat acetát a etanol za striktně anaerobních podmínek (HAMMES a VOGEL, 1995 v KÖNIG a kol., 2009) EMS je používána Lactobacillus a Pediococcus, zatímco Oenococcus používá fosfoketolázu (Pentózofosfátový cyklus). Změny ve složení konečného produktu mohou být ovlivněny faktory životního prostředí. V anaerobních podmínkách mohou L. casei pyruvát metabolizovat na acetát a etanol. Konečnými produkty jsou kyselina mléčná, acetát a etanol. Za aerobních podmínek může L. plantarum převést pyruvát na CO2 a acetyl. (SEDEWITZ a kol., 1984) Některé mléčné bakterie používají vysoké intracelulární koncentrace manganu (30-35 mm) na ochranu proti superoxidaci. (ARCHIBALD, 1986) THEOBALD a kol. (2005) našel stimulaci růstu O. oeni v koncentracích manganu 68 mm nebo 34 mm v růstovém médiu. U L. plantarum pěstovaném na mannitolu, funguje oxaloctan jako akceptor elektronů vedoucí k tvorbě kyseliny jantarové. (CHEN a MCFEETERS, 1986) Fruktóza může být kvašena přes fosfoketolázu a fungovat jako akceptor elektronů na výnos mannitolu od L. brevis. (ELTZ a VANDEMARK, 1960) Kyselina jablečná slouží jak energetický zdroj L. casei k získávání acetátu, etanolu a CO2. Biosyntéza aminokyselin u Lactobacillus je omezená. Některé mají peptidázy a mohou hydrolyzovat proteiny. (KÖNIG a kol., 2009)

18 Fenotypové a fylogenetické vztahy Klasifikace mléčných bakterií je z velké části založena na morfologii, způsobu fermentace glukózy, růstu při různých teplotách, produkci kyseliny mléčné, schopnosti růstu při vysokých koncentracích solí a kyselin, alkalické nebo etanolové toleranci. Dále je to dle složení mastných kyselin a složení buněčné stěny, chování vůči kyslíku, hydrolýzy argininu, požadavku na růstový faktor atd. (AXELSSON, 2004 v KÖNIG a kol., 2009) Rody a druhy Lactobacillus ve víně musí být rozlišeny fenotypovými znaky. Rozdělení založené na fyziologických funkcích rozděluje Lactobacillus na striktně homofermentativní, fakultativně heterofermentativní a striktně heterofermentativní. (KÖNIG a kol., 2009) Fylogenetické vztahy byly odhaleny sekvencováním rrna. Podle analýzy 16S rdna byly mléčné bakterie rozděleny do tří skupin. Skupina I obsahuje striktně homofermentativní a fakultativně heterofermentativní druhy. Skupina II obsahuje více než 30 druhů Lactobacillus a 5 druhů Pediococcus. Patří zde L. casei, L. brevis, L. buchneri a L. fermentum. Skupina III obsahuje rod Weissella, Leuconostocs a Oenococcus oeni. (COLLINS a kol., 1990, 1991, 1993) Obr. 6 Homofermetativní cesta kvašení ( Obr. 5 Heterofermentativní cesta kvašení (

19 Růst a množení mléčných bakterií Během malolaktické fermentace prochází mléčné bakterie několika fázemi. V prvních dnech kvašení jsou bakterie přítomny ve velmi variabilním množství nejčastěji UFC.ml -1. Rozsah populace závisí na klimatických podmínkách v posledních dnech zrání. Při příznivých podmínkách pro hrozny je tento rozsah nižší a může být obtížné na bobulích izolovat jedinou bakteriální kolonii. Avšak během různých procesů výroby vína do sklizně po naplnění nádob může dojít ke kontaminaci velice rychle, pravděpodobně zařízením. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) V prvních dnech alkoholové fermentace se množí bakterie i kvasinky. Kvasinky se lépe přizpůsobí prostředí hroznového moštu, rychle se namnoží. Během této doby se bakterie množí, ale jejich růst je stále omezený, maximální počet populace je UFC.ml -1. Do značné míry jejich chování závisí na ph moštu a množství SO2. Za normálních okolností dávka SO2 50 mg.l -1 a ph 3,2-3,4 nebrání jejich růstu, ale omezuje je to. Při aktivní fázi alkoholové fermentace a při vyčerpání cukrů se bakterie rychle vrací na počet UFC.ml -1. Toto závisí i na podmínkách prostředí. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) Po alkoholové fermentaci zůstávají bakterie v latentní fázi různou dobu, která může trvat i několik měsíců, kdy ph, etanol a teplota zůstávají na nízkých hodnotách. Obvykle tato fáze trvá pouze pár dní, v některých případech k ní nedojde vůbec. Po této fázi nastupuje ihned fáze množení. Nejprve kvasinky, pak mléčné bakterie. Takto vypadají ideální podmínky, kde jsou zkvašeny veškeré cukry dřív, než jsou napadeny bakteriemi. V opačném případě se bakterie aktivně množí na konci alkoholové fermentace a kvasí cukry heterofermentativní cestou a tím zvyšují obsah těkavých kyselin ve víně. (RIBÉREAU- GAYON a kol., 2006) Růstová fáze trvá několik dní a populace dosahuje 107 UFC.ml -1 i více. Trvání závisí na složení média. Následná stacionární fáze se rovněž liší. Bakterie poté přechází do fáze odumírání. Jak je kyselina jablečná zcela transformována, tak se k odstranění bakterií používá síření. Fáze malolaktické fermentace začíná, když celkový počet populace přesahuje 107 UFC.ml -1. To pokračuje a je dokončena ve stacionární fázi nebo na začátku fáze odumírání. Ve velmi příznivých podmínkách a s nízkou koncentrací kyseliny jablečné je malolaktická fermentace ukončena ještě před fází růstu. Optimální počet populace v těchto případech převyšuje 108 UFC.ml -1. Když se vytvoří dostatečné množství biomasy, je kyselina jablečná degradována. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006)

20 Bakterie mléčného kvašení jsou vždy přítomny, ale jejich aktivita záleží na různých podmínkách, zejména na teplotě. Transformace 2 g.l -1 kyseliny jablečné může trvat déle než 4 g.l -1, pokud je úroveň populace nižší. Není-li víno sířeno po malolaktické fermentaci, bakterie mohou nadále přežívat i několik měsíců. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) CARRE (1982) zaznamenal malý pokles mléčných bakterií ve víně ze 107 UFC.ml -1 na 105 UFC.ml -1 po šesti měsících při teplotě 19 C, ph 3,9 a obsahu etanolu 11,25 %. Obr. 7 Růst mléčných bakterií během alkoholové a malolaktické fermentace (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) Choroby vína způsobené mléčnými bakteriemi Vláčkovatění Tato choroba se ve víně projevuje mírným zákalem, bublinkami CO2 a víno je viskózní a sliznaté. Vůně je nečistá, bylinná, octová a chuť zvětralá, nečistá, sliznatá, někdy je zastřen odrůdový charakter. Příčinou této choroby jsou bakterie Pediococcus a Lactobacillus. Přetvářejí kyselinu jablečnou a cukr na polysacharidy zvyšující viskozitu. Rozvíjejí se především při vysokých hodnotách ph (nad 3,5) a při ležení vína na kvasnicích. Takové víno by mělo být co nejdříve stočeno. Při silném slizovatění se při stáčení využívá sprchování vína. Následovat by mělo silné síření a dvojí filtrace přes vložkové filtry a následně sterilní filtrace. Jelikož je obsah kyselin v takovém víně nízký, scelováním s vínem s vyšším obsahem kyselin se zlepší chuťový dojem vína. (STEIDL, 2002)

21 Myšina Vzhled vína je matný, vůně oxidativní i lehce octová, chuť škrablavá připomínající myší moč. Myšina se často vyskytuje u vín s pomalým kvašením i v ovocných vínech. Příčinou jsou bakterie Lactobacillus brevis a Lactobacillus cellobiosus. Někdy jsou příčinou kvasinky či nedostatek kyselin. Proti myšině pomáhá přídavek SO2 či jeho zvýšení na 70 mg.l -1. Při vyšší intenzitě je potřeba sířit více. Často se myšina vytratí při ležení vína a je několik týdnů sířeno mg.l 1 SO2. Pak ale musí být řezáno s vínem s nižším obsahem SO2. Účinné je i přidání aktivního uhlí (10-20 g.hl -1 ) nebo čerstvými vinnými kvasnicemi (5 l.hl -1 ). (STEIDL, 2002) Mléčné a manitolové kvašení Tato choroba způsobuje ve víně nepříjemnou škrablavou chuť a vůni, která připomíná kyselé zelí. Obyčejně se víno nevyčistí a vznikne zákal. Vyskytuje se především ve vínech s nízkým obsahem kyselin a zbytkovým cukrem, které jsou kvašené při vysokých teplotách. Příčinou choroby jsou bakterie mléčného kvašení. Zkvašují cukr na kyselinu mléčnou, kyselinu octovou, přičemž se z fruktózy tvoří šestimocný alkohol sladké chuti, tzv. manitol. Manitolové kvašení způsobují hlavně mléčné bakterie Lactobacillus. Této chorobě se preventivně předchází tím, že se mošty z nahnilých hroznů odkalí a zasíří vyšší dávkou SO2. (KOVÁČ a kol., 1990) Hořknutí vína Ve víně probíhá rozklad glycerolu při reakci s fenolickými látkami a za vzniku kyseliny mléčné. Titrovatelné kyseliny se zvyšují až o 0,8 g.l -1 a ph může klesnout až o 0,3. (KUMŠTA, 2012) Objevuje se téměř výlučně v červených vínech. Způsobují ji bakterie druhu Lactobacillus. Ochrana spočívá v prevenci. (KOVÁČ a kol., 1990) Zvrhnutí vína Choroba vyskytující se v červených vínech. Způsobuje ji bakterie Lactobacillus plantarum, která rozkládá kyselinu vinnou a vinný kámen na kyselinu octovou a CO2. Napadá i glycerin, který rozkládá na kyselinu octovou, kyselinu mléčnou a CO

22 Ochrana spočívá hlavně ve správné úpravě moštu před kvašením a dostatečném síření. (KOVÁČ a kol., 1990) 3.3. Malolaktická fermentace Malolaktická fermentace (MLF) ve víně je enzymatická přeměna kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou. Tento proces obvykle následuje po alkoholové fermentaci, ale mohou probíhat i souběžně. MLF probíhá za přítomnosti mléčných bakterií. Provádí ji především druh Oenococcus oeni, který snáší nízké ph a vysoký obsah alkoholu i vysoký obsah SO2. K MLF mohou přispívat i další druhy mléčných bakterií, a to Lactobacillus a Pediococcus, které snášejí vyšší ph ve víně. (DAVIS a kol., 1986) Nejdůležitější výhodou MLF je odkyselení vína v chladném podnebí, mléčné bakterie přispívají k aromatu vína a zlepšení mikrobiální stability. (LONVAUD-FUNEL, 1999; MORENO-ARRIBAS a POLO, 2005) Nekontrolovaná MLF může víno také znehodnotit. V chuti se objevují kyselina octová, těkavé fenoly a myšina nebo se tvoří etyl-karbamát a biogenní aminy, které mohou být nebezpečné pro lidský organismus. (MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) Kyselina jablečná Kyselina jablečná tvoří asi polovinu celkového obsahu kyselin v hroznech a ve víně. Její koncentrace v plodech se v průběhu zrání snižuje, zejména během letního období. To může vést k produkci vína náchylného k mikrobiální kontaminaci. Naopak za příznivých podmínek, koncentrace kyseliny jablečné zůstává vysoká a dává výslednému vínu kyselou chuť. Proto je obsah kyseliny jablečné jedním z hlavním ukazatelů při určování termínu sklizně. (JACKSON, 2008) Kyselina mléčná Malé množství kyseliny mléčné je produkováno kvasinkami během kvašení, ale kyselina mléčná jako složka ve víně pochází z metabolických činností bakterií. Nejčastěji se na tvorbě podílejí mléčné bakterie. Produkují enzym, který dekarboxyluje kyselinu jablečnou na kyselinu mléčnou. Tento proces se nazývá jablečno-mléčné kvašení neboli malolaktická fermentace. Hlavní výhodou malolaktické fermentace je přeměna tvrdší chuti kyseliny jablečné na hladší chuť kyseliny mléčné. Převaha kyseliny L-mléčné je obvykle ukazatel malolaktické fermentace. V kontrastu kvasinek a některých bakterií lze při jejich metabolismu

23 syntetizovat stejné množství forem (D i L) kyseliny mléčné i kyseliny jablečné. (JACKSON, 2008) Inokulace Malolaktická fermentace není vždy iniciována spontánně. V optimálních podmínkách se ve vinařství po alkoholové i malolaktické fermentaci často vyskytuje určité množství kvasinek i bakterií. Ve víně se mohou dále některé kmeny bakterií stále množit. Pokud máme víno, kde malolaktická fermentace probíhá obtížně, smícháme jeho dvě třetiny s jednou třetinou vína, kde už nám malolaktická fermentace proběhla. Takto můžeme víno naočkovat bakteriemi, které se namnožily po skončení MLF. Kvašení je tedy dokončeno během několika týdnů. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) Naočkování mícháním vína však může být odmítnuto vzhledem ke kvalitě hroznů. Definitivní míchání se obecně provádí několik týdnů po ukončení MLF, při ochutnávání je umožněno přesnější stanovení jakosti vína. Teplota musí být stále udržována, což může být nákladné. Spontánní bakterie nemusí mít nutně vyšší kvalitu než komerční, což znamená, že očkování vybranými kmeny bakterií je někdy výhodnější. Obecně platí, že nejvhodnější kmen bakterií pro MLF je Oenococcus oeni. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) Komerční bakterie jsou původně pěstovány v prostředí podporující jejich růst. Ve víně jsou pro ně méně příznivé podmínky pro růst, proto se snažíme podmínky upravit, aby se bakterie mohly množit a provést MLF. Spontánní bakterie z hroznů se však mohou lépe přizpůsobit měnícím se podmínkám prostředí, a proto zajišťují MLF snadněji než komerční kmeny. Potíže při použití komerčních kmenů vedly k vývoji technik popsaných níže. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) a) inokulace moštu před alkoholovou fermentací V tradičním vinařství se spontánní bakterie z hroznů začínají množit před zahájením alkoholové fermentace. Z těchto bakterií je prováděn progresivní výběr při alkoholové fermentaci, který má za následek snížení populace, která je však dobře přizpůsobena podmínkám životního prostředí. Toto snížení populace schopné provádět MLF lze zvýšit médiem s Oenococcus oeni před zahájením alkoholové fermentace. Aby se předešlo potlačení kvasinek bakteriemi, doporučuje se současné naočkování bakteriemi a kvasinkami. Očkování 1 g.hl -1 odpovídá množství buněk na mililitr. Bakterie lze do moštu přidat předem bez přípravy

24 Při této metodě mohou v praxi nastat tři situace: 1. Při poklesu růstu bakterií dochází ke konci alkoholové fermentace; MLF je současně zahájena a provedena rychle. Toto je ideální stav. 2. Pokles růstu vede k jejich úplnému odumření. Kinetika MLF není lepší, očkování nemá žádný účinek. 3. Protichůdné jevy mezi kvasinkami a bakteriemi vedou k zablokování alkoholové fermentace a předčasnému růstu mléčných bakterií v prostředí obsahující cukr. Vznikají těkavé kyseliny. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) Je téměř nemožné stanovit ideální podmínky pro každé víno, co se týče složení (obsah alkoholu, ph ). Tyto podmínky jsou ovlivněny výběrem homofermentativního kmenu bakterií a kvasinek a koncentrací inokulace. Přidání média Oenococcus oeni před alkoholovým kvašením se nedoporučuje. Riziko pomalé a váznoucí alkoholové fermentace je vysoké. Tato metoda se stále pravidelně používá v některých vinařstvích. (RIBÉREAU- GAYON a kol., 2006) V poslední době se k očkování před alkoholovou fermentací používá jako startér Lactobacillus plantarum, který využívá množící se buňky. (PRAHL a kol., 1988) b) Inokulace pomocí nemnožících se mléčných bakterií LAFON-LAFOURCADE (1970) sledoval, jak je obtížné zajistit růst mléčných bakterií ve víně a možnost odbourávání kyseliny jablečné pomocí biomasy dostatečně bohaté na jablečnomléčný enzym tak, aby fermentace mohla probíhat i bez buněčného násobení. Když studoval vývoj populace naočkované bakterie ve víně, pozoroval v prvních hodinách náhlý pokles počtu životaschopných buněk. Poté se pokles zpomalil. Po několika dnech může dojít k růstu bakterií, ale tento růst je příliš nejistý, aby se užíval jako technika pro zahájení malolaktické fermentace. Přesto během poklesu populace, bakterie vytvářejí enzym, který vyvolává částečné odbourávání kyseliny jablečné. V tomto případě bakterie jednají jako enzymatická podpora. Navzdory snahám o vytvoření příznivých podmínek pro naočkování biomasy Oenococcus oeni není schopen odbourat veškerou kyselinu jablečnou. Celkové odbourání lze získat pouze naočkováním 1-5 g.l -1, které se v praxi nepoužívá. Po vymizení populace se malolaktická fermentace zastavuje. Aktivitu bakterií v komerčních přípravcích snižuje i konzervace při nízkých teplotách. Kinetiku fermentace je možno zlepšit opravou buněk či enzymatickými přípravky na pevné bázi. Výsledná ochrana s ohledem na médium by mohla zvýšit průměrnou délku enzymatické aktivity. V současné době se tento výzkum v praxi neaplikuje. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006)

25 c) Inokulace komerčním kmenem Oenococcus oeni upravené po reaktivaci Oenococcus oeni je nejvhodnějším kmenem pro MLF ve víně. Podílí se na všech spontánních kvašeních. Přítomnost etanolu má za následek snížení počtu populace po alkoholové fermentaci. Obsah kyseliny jablečné může být částečně snížen, ale buněčné násobení nezbytné pro kompletní MLF se nevyskytuje (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006). LAFON-LAFOURCADE a kol. (1983) ukázal, že pro vyšší přežití bakterií při přídavku do vína je vhodné přidat je do vhodného fyziologického stavu předem. Pro tuto operaci bylo navrženo označení aktivace. Růst populace, který tuto operaci doprovází, je prospěšný vedlejší efekt, ne požadovaný hlavní cíl. Přestože bylo navrženo mnoho různých postupů, tento je nejpoužívanější. Nesířený hroznový mošt se ředí na polovinu své původní koncentrace. Autolyzované komerční kvasinky se předají a ph se upraví na 4,5. Po několika hodinách naočkované bakterie začnou vytvářet 106 buněk na ml při 25 C, které jsou bohaté na enzymy. Tyto buňky jsou ve víně odolnější než ty bez aktivace. Populace se zvýší po 2 hodinách na 106 buněk, po 24 hodinách na 107 buněk a po 6 dnech na 109 buněk na ml. Takto připravené bakterie se po alkoholové fermentaci naočkují do vína (LAFON-LAFOURCADE a kol., 1983). V praxi by reaktivační koncentrace bakterií do vína neměla být vyšší než 1:1000, protože autolýza kvasinek způsobuje vysoké aroma. Pro koncentraci je potřeba buněk na ml v médiu s dobou aktivace hodin. Počáteční komerční přípravky obsahují životaschopných buněk na gram. Inokulace reaktivačním médiem je tedy 10 g.l -1. Tato metoda je účinná, ale vyžaduje znalosti v oblasti mikrobiologie, což omezuje vývoj ve vinařství. Mnoho vinařství preferuje spontánní MLF, i když vyžaduje více času (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006). d) Inokulace komerčním kmenem Oenococcus oeni bez reaktivace Pokusy naočkovat mléčné bakterie přímo do vína po alkoholové fermentaci selhaly. Populace měla potíže přizpůsobit se fyzikálně-chemickým podmínkám vína. Předpokládalo se, že reaktivace poskytuje podmínky charakteristické pro růst bakterií. Bylo by tedy velice obtížné získat komerční přípravky připravené pro použití ve víně. Avšak v roce 1993 byl na trh uveden startér pod názvem Viniflora Oenos, který může být přidán do vína ihned po alkoholové fermentaci. Výsledky pokusu v laboratoři prokázaly, že s ohledem na kontrolu lze bakteriální růst a MLF započít 15 dní předem. Nebyly pozorovány žádné senzorické vady. Účinnost tohoto přípravku byla založena výběru vhodné odolnosti vůči etanolu, ph, SO2 a

26 dalším limitujícím faktorům ve víně. Také závisí na podmínkách konkrétního komerčního přípravku. Tato příprava zahrnuje postupnou adaptaci na omezující podmínky ve víně. Urychlení MLF o několik dní je výhodné, ale nepodstatné (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006). Tab. 1 Analýza vína před a po MLF (RIBÉREAU-GAYON a kol., 1976) Kyseliny Koncentrace (g.l -1 ) Koncentrace (meq.l -1 ) Před Po Před Po Rozdíl Veškeré 4,9 2, Volatilní 0,21 0,28 1,3 5,6 +1,3 Vázané 4,7 3, K. jablečná 3,2 0, K. mléčná 0,12 1,8 1, Načasování malolaktické fermentace v procesu vinifikace a) Spontánní malolaktická fermentace Je klíčovým rozhodnutím, zdali ponechat MLF na přítomné mikroflóře nebo použít čisté kultury mléčných bakterií. U spontánní MLF, stejně jako u spontánního alkoholového kvašení, existuje riziko výskytu nežádoucích mikroorganismů, které víno znehodnotí. (PAVELKOVÁ, 2007 v NĚMEC, 2012) Při sběru hroznů se na slupkách bobulí hroznů nalézá velký počet mikroorganizmů, kvasinek, bakterií a hub, z nichž většina má pro budoucí kvalitu vína nepříznivý vliv. Z přítomných bakterií Lactobacillus, Pediococcus, a Oenococcus je možné pozitivně hodnotit jen poslední jmenované, a to jen tehdy, když se prosadí v konkurenci s nežádoucími bakteriemi dobrý druh či kmen bakterií. Většina spontánních mléčných bakterií vína tvoří těkavé kyseliny a estery, biogenní aminy, diacetyl apod., které občas vyvolávají nežádoucí pachutě a pavůně. Mnohdy je proto věcí náhody, zda MLF zrealizují žádoucí či nežádoucí mléčné bakterie. (MINÁRIK, 2002 v NĚMEC, 2012) Dlouhotrvající MLF má negativní vliv na aroma, protože MLF se mohou zúčastnit i jiné druhy mléčných bakterií, jako Pediococcus a Lactobacillus, což je aktuální hlavně při

27 spontánní MLF, proto je vhodné, aby MLF probíhala v kratším časovém rozpětí. (NĚMEC, 2012) b) Malolaktická fermentace před alkoholovou fermentací Pokud má proběhnout MLF před alkoholovou fermentací, nabízí se možnost zaočkování homofermentativním kmenem Lactobacillus plantarum, který je vhodný aplikovat do vín s nízkou hodnotou ph (až do ph 2,9), ve kterých je žádána jen částečná MLF, s omezeným účinkem na aroma a chuť výsledného produktu. Bakterie ihned po inokulaci do moštu začnou odbourávat kyselinu jablečnou. Kulturou Lactobacillus plantarum se mošt naočkovává hodin před inokulací kvasinkami, tím bakterie zůstávají činné až do obsahu alkoholu kolem 6 %. Populace bakterií tak nikdy nedosáhne fáze růstu, ale setrvává jako odpočívající buňky s vysokým stupněm transformace kyseliny jablečné. Kultura Lactobacillus plantarum nevytváří kyselinu octovou ani jiné malolaktické příchutě. Vína, která jsou odbourána Lactobacillus plantarum, jsou hodnocena jako méně agresivní a s plnějším tělem než kontrolní vzorky. Tato možnost odkyselení je alternativou k Oenococcus oeni nebo k odkyselení chemickému a to obzvláště v bílých vínech s požadavkem na florální nebo ovocný styl. (NYGAARD, 2001 v NĚMEC,2012) c) Malolaktická fermentace během alkoholové fermentace Pokud se má MLF uskutečnit během alkoholové fermentace, existuje varianta s časným naočkováním přídavkem kultury Oenococcus oeni kupříkladu současně s kvasinkami nebo v různých fázích během alkoholové fermentace. Při tomto kroku dochází taktéž k přeměně kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou, při současném zachování ovocného charakteru vína. Společná inokulace kvasinek a bakterií umožňuje bakteriím dobře se adaptovat zvyšujícímu se obsahu alkoholu. Je důležité vědět, že populaci bakterií negativně ovlivňuje přítomnost oxidu siřičitého, který ji může velmi tlumit. Jestliže jsou vytvořeny optimální podmínky, umožní společná inokulace rychlejší průběh MLF, takže vína získávají méně mléčného a jogurtového charakteru a zachovávají si výraznější chuťovou a aromatickou svěžest, což je velmi podstatné u bílých vín. (NYGAARD, 2001; PAVLOUŠEK, 2006 v NĚMEC, 2012) Tento způsob aplikace nese riziko v tom, že v době startu MLF je přítomno ještě značné množství cukru. Rizikem této praxe je bakteriální metabolismus cukrů, který vede k nepřijatelně vysokým hladinám kyselin mléčné a octové. Jiným zdrojem problémů může být

28 antagonismus, který mají určité kmeny kvasinek na růst Oenococcus oeni. Výhodou brzkého zaočkování je dřívější stabilizace vína, neboť se tím docílí rychlejší průběh MLF díky teplu z alkoholového kvašení a nižšímu obsahu alkoholu v době inokulace bakterií. Zaočkování Oenococcus oeni v průběhu pokročilejších fázích alkoholového kvašení (< 20 g.l -1 zbyt. cukru) je méně rizikové a proto je mu často dávána přednost. Jak již bylo zmíněno výše, kvalita provedení MLF má velký vliv na senzorickou kvalitu vína. (NYGAARD, 2001 v NĚMEC, 2012) d) Malolaktická fermentace po alkoholové fermentaci Všeobecně se doporučuje inokulovat Oenococcus oeni do suchého vína, jelikož je to bezpečné a jednoduché. V případě, že aplikujeme bakterie do vína po ukončení alkoholové fermentace, vyhneme se tak nepřiměřené produkci kyseliny octové a kyseliny D-mléčné, které mohou mít negativní vliv na aroma a chuť vína. Přednost inokulace v okamžiku odeznívajícího kvašení je v tom, že se pro MLF využívá zbytkové teplo, a tím je odbourávání o něco rychlejší. Riziko je v tom, že bakterie mohou upřednostnit látkovou výměnu zbytkového cukru a produkovat kyselinu octovou. Mnoho vinařů této metodě dává přednost, ale občas může být obtížné provést MLF ve vínech prokvašených antagonistickými kmeny kvasinek, které vyčerpávají živiny a produkují toxické metabolity, jako je SO2, a které tak vytvářejí pro bakterie nehostinné prostředí. Nízké ph a nízká teplota mohou tyto podmínky ještě více zhoršit. (PAVLOUŠEK, 2006; STEIDL, LEINDL, 2004; NYGAARD, 2001 v NĚMEC, 2012) Faktory ovlivňující malolaktickou fermentaci Podmínky pro růst bakterií ve víně jsou nepříznivé. Konkrétní nedostatky mohou ztěžovat malolaktickou fermentaci. V praxi úprava složení vína nezvýší zkvasitelnost v žádné významné míře kromě zvýšení ph. Každý kmen bakterií má své optimální výživné médium (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006). a) Kyselost (ph) Zvyšuje-li se kyselost, růst bakterií je inhibován. MLF je těžší, ale současně stále čistá. Kyselina jablečná je ve většině degradována. Kyselina mléčná se nejlépe vytváří při ph 4,2 a 4,5. Rychlost MLF se zvyšuje při ph 3,0-4,0. Minimální hodnota ph pro růst bakterií je 2,9, při hodnotě 3,2 je růst bakterií velmi omezen. MLF probíhá při ph 3,3 i vyšším

29 MLF je nezbytná ve víně vyrobeném z nedostatečně vyzrálých hroznů. Vysokou koncentraci kyseliny jablečné snižuje právě malolaktická fermentace. U velmi vyzrálých hroznů je koncentrace nízká, malolaktická fermentace probíhá snadno a je vyšší riziko vzniku bakteriálního onemocnění. Pokud je hodnota ph příliš nízká, lze pro zahájení MLF víno odkyselit, např. přidáním CaCO3. Úlohou tohoto odkyselení je zvýšení ph bez odstranění nadměrného množství kyseliny vinné (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006). b) Teplota Vliv teploty na MLF je dvojí. Teplota nad 30 C ovlivňuje bakterie. Růst bakterií a zahájení MLF vyžadují určitý rozsah teplot. Vliv teploty na růst bakterií závisí na obsahu alkoholu. Při obsahu alkoholu 0-4 % je optimální teplota 30 C, při obsahu % je to C (HENICK-KLING, 1992). Optimální teplota pro MLF je C. Jiná teplota fermentaci zpomaluje (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006). Nová vína jsou uchovávána při teplotě minimálně 18 C. Teplota je nejjednodušší způsob ovlivnění MLF. Degradace kyseliny jablečné je při 15 C pomalá. Pokud je MLF zahájena při vhodné teplotě, je dokončena, i když teplota klesne na 10 C. Fermentace by měla být provedena při co nejnižší teplotě, například C. Při nižší teplotě je MLF pomalejší, ale omezuje se vznik hnilobotvorných bakterií, zejména vznik těkavých kyselin. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) c) Provzdušnění Každý bakteriální druh má své specifické potřeby. Bakterie mohou být anaerobní i aerobní. Proto na MLF působí také provzdušnění, avšak ne nějak významně. Provzdušnění obecně MLF zrychluje, ale čistý kyslík ji zpožďuje či dokonce blokuje. V praxi je ovšem mírné provzdušnění pro MLF často výhodné. (PEYNAUD, 1981) d) Síření Je známo, že bakterie jsou vysoce citlivé na oxid siřičitý, mnohem více než kvasinky. Na bakterie má vliv volný a vázaný SO2. Během několika měsíců skladování je víno pravidelně sířeno, což zvyšuje celkovou koncentraci SO2 a MLF se stává obtížnou operací. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) Jako obvykle volné formy jsou více inhibiční než vázané formy. (JACKSON, 2008)

30 Síření ovlivňuje MLF zejména ve dvou případech: síření rozdrcených hroznů a síření při lisování. Zvolená koncentrace SO2 závisí na kvalitě hroznů. ph a stav hroznů ovlivňují vázaný SO2. Dalším faktorem je okolní teplota. Určení úrovně síření je obtížné, zůstává však citlivou metodou pro úpravu MLF. Správné síření umožňuje kompletní alkoholovou fermentaci, aniž by se nadměrně fermentace opožďovala. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) e) Etanol Etanol zpomaluje růst bakterií a inhibuje MLF. Mléčné bakterie Lactobacillus jsou k etanolu nejvíce tolerantní. L. trichodes se může ve víně množit až do 20 % obj. etanolu. (VAUGHN, 1955) Některé kmeny Oenococcus oeni se mohou množit až do 15 % obj. etanolu. Tolerance na etanol klesá s rostoucí teplotou a snižující se hodnotou ph. (JACKSON, 2008) Toxicita etanolu pravděpodobně zahrnuje změny polopropustné buněčné membrány. Tyto změny mohou vyvolat zvýšenou pasivitu iontů H a ztrátu buněčných složek. (GRACA DA SILVEIRA a kol., 2002) Snížení koncentrace neutrálních tuků a zvýšení podílu glykolipidů koreluje s vysokým obsahem etanolu. (DESENS a LONVAUD-FUNEL, 1988) Tolerance na etanol také souvisí ze zvýšenou syntézou některých fosfolipidů a začleněním Lactobacillus v plazmalemě. (TEIXEIRA a kol., 2002) Poruchy membrány jsou vyvolány zvýšeným množstvím etanolu, sníženou životaschopností buněk a slabou MLF. 80 % dekarboxylace kyseliny jablečné souvisí se zvýšením etanolu na % obj. (LAFON- LAFOURCADE, 1975) Pokud je MLF žádoucí ve vínech s vysokým obsahem etanolu, volí se kmeny mléčných bakterií, které mají zvýšenou toleranci k etanolu. (JACKSON, 2008) f) Řízení MLF Spontánní malolaktickou fermentaci je obtížné řídit. MLF často trvá měsíce a je potřeba začít za podmínek, které podporují rozvoj MLF. Při takových podmínkám může dojít i k nežádoucí MLF. Proto se používají postupy k podpoře nebo bránění MLF. (JACKSON, 2008) INOKULACE MLF se dá podpořit naočkováním vína kmeny Oenococcus oeni. To souvisí s potřebou vhodných podmínek pro růst bakterií. Jejich kombinace vyvolává rychlý nástup i ukončení MLF. Bez očkování může trvat týdny či měsíce než bakterie dosáhnou dostatečného počtu

31 buněk pro zahájení dekarboxylace kyseliny jablečné. (JACKSON, 2008) INHIBICE Inhibice MLF zahrnuje faktory, které zabraňují jejímu výskytu. Tyto faktory jsou např. skladování vína nad nebo pod 10 C, rané a časté stáčení, vysoká hodnota ph, minimální macerace, zabránění zrání sur-lie, obsah celkového SO2 nad 50 mg.l -1. (JACKSON, 2008) Vliv malolaktické fermentace na faktory kvality vína. Bakteriální malolaktická fermentace odlišnými, ale vzájemně propojenými faktory ovlivňuje kvalitu vína. Snižuje kyselost, ovlivňuje mikrobiální stabilitu a ovlivňuje senzorické vlastnosti vína. (JACKSON, 2008) a) Kyselost Odkyselení a zvýšení ph jsou nejvíce konzistentní účinky MLF. Tento faktor nastane při dosažení bakteriální populace 10 buněk na ml. Snížení kyselosti zvyšuje hladkost a pitelnost červených vín, ale nadměrné snížení vytváří plochost vína. Vhodnost odkyselení závisí především na počátečním ph a obsahu kyselin v hroznech. Obecně platí, že čím vyšší kyselost a nižší ph, tím větší užitek a naopak. Vyšší relativní koncentrace kyseliny vinné a MLF znatelně ovlivňují kyselost a ph vín. (JACKSON, 2008) b) Mikrobiální stabilita Dříve byla zvýšená mikrobiální stabilita považována za hlavní přednost MLF. Tento názor se v posledních letech značně změnil. Myslelo se, že zlepšení mikrobiální stability je výsledkem metabolismu živin po alkoholové fermentaci. Komplexní výživové požadavky mléčných bakterií snižují koncentraci aminokyselin, dusíkatých bází a vitamínů. Přestože mají bakterie po dokončení MLF tendenci snižovat se, aminokyseliny, dusíkaté báze a vitamíny mohou nadále podporovat růst mléčných bakterií i hnilobných organismů. (COSTELLO a kol., 1983) Opačný názor je, že MLF občas mikrobiální stabilitu snižuje. K tomu může dojít, když má víno příliš vysoké ph. Nárůst v ph upřednostňují negativní mléčné bakterie. Jejich schopnost rychlého růstu se zvyšuje při ph 3,5 4,0 a vyšším. (JACKSON, 2008) Stabilizující účinky spojené s MLF jsou významnější po jejím dokončení než v přímém důsledku MLF. Počátek nástupu a ukončení MLF uplatňuje postupy jako je např. síření, skladování v chladu apod. Při opožděném nástupu MLF bez použití standartních metod

32 hrozí riziko napadení octovými bakteriemi, negativními mléčnými bakteriemi a kvasinkami rodu Brettanomyces/Dekkera. Včasné ukončení MLF zabraňuje možnému výskytu negativních organismů po stáčení. (JACKSON, 2008) c) Senzorické vlastnosti Výhody či nevýhody MLF se řeší především u změny chuti vína. Rozmanitost odráží biologické a fyzikálně chemické podmínky MLF. Existuje značná variabilita mezi kmeny mléčných bakterií. (LAURENT a kol., 1994; KRIEGER, 1996) Navíc ph a teplota vína výrazně ovlivňují fyziologii bakterií. (JACKSON, 2008) Diacetyl se běžně hromadí na konci MLF. (RANKINE a kol., 1969) V koncentraci 1 4 mg.l -1 často diacetyl přidá na žádoucí složitosti vůně. Je označován jako máslové či ořechové aroma. Při koncentracích 5-7 mg.l -1 může být máslový charakter výrazný a nežádoucí. Mírné provzdušnění zvyšuje syntézu diacetylu. (JACKSON, 2008) Maximální akumulace koreluje s dokončením metabolismu kyseliny citronové a jablečné. (NIELSEN a RICHELIEU, 1999) Nicméně organoleptické rozdíly vín s e bez MLF často neodpovídají obsahu diacetylu. (MARTINEAU a HENICK-KLING, 1995) Ostatní aromatické látky syntetizované v dostatečné množství ovlivňující víno patří acetaldehyd, kyselina octová, acetoin, 2-butanol, etyl-acetát apod. Velká část kyseliny octové pochází z metabolismu kyseliny citronové při MLF. Je-li kmen značně převýšen producentem kyseliny octové, může zanechat ve víně vysoké množství těkavých kyselin. (JACKSON, 2008) MLF se doporučuje provádět u červených vín. Toto se může vztahovat k tendenci mléčných bakterií metabolizovat sloučeniny odpovědné za nadměrné travnaté aroma. (JACKSON, 2008) d) Produkce aminů Bakterie mléčného kvašení, zejména Pediococcus, produkují aminy prostřednictvím dekarboxylace aminokyselin. Jako primární zdroj produkce histaminu se ukazuje O. oeni. Podíl enzymů zůstáván ve víně aktivní podstatně déle než produkující bakterie. (COTTON a kol., 1998) Syntéza aminů je důležitá pouze při vysokém ph, avšak některé biogenní aminy mohou vyvolat zúžení krevních cév, bolesti hlavy a další přidružené efekty. (RADLER a FÄTH, 1991)

33 Působení MLF na organoleptické vlastnosti vína Různé studie jsou zaměřeny na biosyntézu sloučenin během MLF a doprovodné organoleptické důsledky. (LAURENT a kol., 1994) MAICAS a kol. (1999) prokázali, že MLF znatelně mění hlavní a vedlejší těkavé sloučeniny, které jsou prospěšné pro chuť vína. POZO- BAYON a kol. (2005) zkoumali změny těkavých sloučenin před a po MLF, kterou prováděly čtyři různé kvasné kultury O. oeni a L. plantarum a našli významné metabolické rozdíly mezi oběma druhy. Vůně a chuť se liší v závislosti na napětí při MLF. MLF zvyšuje ovocné a máslové aroma, ale snižuje rostlinné a travnaté aroma. Vznik a hydrolýza esterů během MLF může vést k nárůstu ovocného aroma a je pravděpodobné působení esterů mléčných bakterii zodpovědných za syntézu a degradaci těchto sloučenin. MLF bývá také spojena s charakteristickou vůní jako je ústní, pražená, vanilková, sladká, dřevnatá, uzená, hořká, medová atd. (HENICK-KLING, 1993 v MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) Snížení rostlinného nebo travnatého aroma může být katabolismem aldehydů a mléčných bakterií. O. oeni mohou katabolizovat acetaldehyd přeměnou na etanol a acetát. (OSBORNE a kol., 2000) Obecně, změna barvy červených vín po MLF odpovídá snížení intenzity adsorpčních antokyanů, zejména methoxylovaných. Pomoci by mohlo zvýšení ph a snížení hladiny volného anhydridu kyseliny siřičité. (SUAREZ LEPE a INIGO-LEAL, 2003) Bylo prokázáno, že vliv použité nádoby se zdá být důležitější než metabolická aktivita bakterií, které jsou zodpovědné za proces. Hydroxyskořicové kyseliny a jejich deriváty byly hlavní sloučeniny upravené MLF. (MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) Vína se skládají z vysoce složité směsi těkavých látek získaných z hroznů, kvasnými procesy a stárnutím. K dnešnímu dni bylo prokázáno jen pár těchto sloučenin v různých koncentracích, které přímo přispívají k aromatu vína. (RAPP, 1988 v LYTRA a kol., 2012; MESTRES a kol., 2000; ORTEGA-HERAS, 2002) Podle FRANCISe a kol. (2005) Vůně není výsledkem žádné jednotné dominantní sloučeniny, která uděluje zvláštní aroma konkrétnímu typu vína, ale že všechna vína vděčí za svůj aromatický charakter velkému množství těkavých látek. Zatímco některé sloučeniny mohou převládat, jiné mají tendenci mizet. I jednoduché binární směsi ukazují, že vnímání kvalitativní a kvantitativní vůně není jednoduché. (LYTRA a kol., 2012) Proces vinifikace zahrnuje různé mikrobiologické procesy, z nichž nejdůležitější je alkoholová fermentace prováděná kvasinkami a malolaktická fermentace prováděná bakteriemi. MLF je zásadním krokem ke zlepšení kvality červených vín. Převedením kyseliny

34 jablečné na kyselinu mléčnou a oxid uhličitý získáme lepší vyvážení vína a zvýšení ph. Navíc MLF výrazně ovlivňuje aromatickou komplexnost vína, produkci aromatických aktivních sloučenin, těkavých látek a chuť prekurzorů. MLF se týká především molekul při metabolismu organických kyselin, zbytkových cukrů a některých aminokyselin. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2000) Hygienická kvalita vína Metabolismus aminokyselin nemá vliv na chuť vína, ale je problematický z toxikologického hlediska, protože zvyšuje koncentraci biogenních aminů a etylkarbamátových prekurzorů ve víně. (MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) a) Etyl-karbamát Etyl-karbamát je schopen vytvořit malé množství citrulinu před degradací z aminokyseliny argininu. Vylučování citrulinu je toxické, protože je to prekurzor tvorby karcinogenního etyl-karbamátu ve víně. (ZIMMERLI a SCHLATTER, 1991) Vznik citrulinu ve vínech s vysokou zbytkovou koncentrací argininu lze snížit provedením MLF čistou kulturou O. oeni. (MIRA DE ORDUNA a kol., 2001) Spontánní MLF je třeba se vyhnout, protože může vést ke vzniku etyl-karbamátových prekurzorů. (LIU a kol., 1994) b) Biogenní aminy Biogenní aminy jsou přírodní sloučeniny, které jsou přítomné v různých typech potravin, např. v sýrech, vínu, pivu a rybách. Požití histaminu a tyraminu může způsobit negativní vliv na nervový a cévní systém. (SILLA, 1996) Putrescin je potencionálně nebezpečný, protože může reagovat s dusitany na karcinogenní nitrosoamin (HALASZ a kol., 1994) Biogenní aminy jsou vytvářeny dekarboxylací aminokyselin specifickými enzymy mikroorganismů, které mohou být přítomny v potravinách. (MORENO-ARRIBAS a POLO, 2009) Biogenní aminy jsou sloučeniny, které vytvářejí především mléčné bakterie, které negativně ovlivňují zdravotní nezávadnost vín. Standartní vinařské procesy mohou výrazně ovlivnit množství biogenních aminů ve víně. Biogenní aminy jsou látky, které se můžou vyskytovat ve fermentovaných potravinách a nápojích, které obsahují jejich prekurzory (volné aminokyseliny). Mohou podporovat růst a metabolismus mikroorganismů a podpořit aktivitu enzymů příslušných kyselin. Víno je

35 médium, ve kterém jsou tyto podmínky potenciálně splněny. Hlavní biogenní aminy spojené s vínem jsou putrescin, histamin, tyramin a kadaverin. Jsou to produkty mikrobiální dekarboxylace ornitinu, histidinu, tyrosinu, lysinu. (SMIT a kol., 2008) Putrescin se může tvořit přes arginin jeho deaminací. (ARENA a MANCA DE NADRA, 2001; MANGANI a kol., 2005) Některé z biogenních aminů, včetně putrescinu, sperminu a spermidinu, vznikají také v metabolismu rostlin a mohou být převedeny z bobule hroznů do moštu a nakonec do vína. (HALÁSZ a kol., 1994) Mnoho jiných biogenních aminů, například fenyletylamin, agmatin, tryptamin, isoamylamin, metylamin a etylamin byly rovněž spojeny s vínem. (GLÓRIA a kol., 1998; MARCOBAL a kol., 2006; SOUFLEROS a kol., 2007; SMIT a kol., 2008) Biogenní aminy jsou tvořeny různými mikroorganismy spojenými s různými fázemi výroby vína a skladování. Znehodnocení biogenních aminů kvasinkami při alkoholové fermentaci je méně významné než laktobacily při malolaktické fermentaci. (GRANCHI a kol., 2005 v SMIT a DU TOIT, 2013; MARCOBAL a kol., 2006) Biogenní aminy ve víně jsou spojeny se všemi rody mléčných bakterií. Jsou přítomny na zdravých hroznech a mohou být přeneseny do vinařského provozu. (WIBOWO a kol., 1985) Tyto mléčné bakterie jsou zodpovědné za spontánní MLF. Oenococcus oeni je převážně zodpovědný za MLF, ale druhy Pediococcus a Lactobacillus, obvykle spojené s vadami vína, mohou přežít a růst během MLF, zejména je-li ph vína nad 3,5. (WIBOWO a kol., 1985; LONVAUD-FUNEL, 1999; DU TOIT a kol., 2011) Po MLF je víno stabilizováno a zraje (tradičně v dubových sudech) několik měsíců až více než jeden rok. Bílá vína a šumivé víno vyráběné metodami tradičního druhotného kvašení (jako méthode champenoise) zrají tradičně v kontaktu s kvašením matolin. Nicméně dnes je běžnější zrání červených vín na kalech a tím zvýšit organoleptické vlastnosti a rovnováhu vína. Uvolňování organických sloučenin kvasinkami a bakteriemi je minimální. (HERNÁNDEZ a kol., 2006; ALCAIDE-HIDALGO a kol., 2007) Malolaktická fermentace v bílých vínech Malolaktická fermentace je vždy navrhována pro červená vína, méně často pak pro bílá vína. Její použití závisí na odrůdě a vinařském regionu. 'Chardonnay' v Burgundsku a 'Chasselas' ve Švýcarsku jsou dva klasické případy bílých odrůd, které zrají na kalech a systematicky procházejí MLF po alkoholové fermentace. Hlavním cílem je odkyselení vína

36 Před MLF je celkový obsah kyselin 7 g.l -1 s odpovídajícím nízkým ph. (RIBÉREAU- GAYON a kol., 2006) Například aby se zabránilo náhodné MLF v láhvi, lze šampaňské podrobit MLF po alkoholové fermentaci v kontrolovaných podmínkách. MLF rovněž přispívá k aromatické komplexnosti vína 'Chardonnay'. Pokud víno 'Chardonnay' neprojde MLF, nelze jej považovat za skvělé víno. MLF nesnižuje odrůdové aroma, právě naopak vyvíjí a stabilizuje některé aromatické a texturní složky, takže víno je plnější. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) Dnes se v mnoha vínech 'Chardonnay' po celém světě provádí MLF pro zlepšení aroma než pro odkyselení a stabilizaci. V těchto případech mošt obsahuje bakterie mléčného kvašení, které jsou schopny MLF. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) U většiny ostatních odrůd, např. 'Sauvignon', 'Semillon', 'Chenin' a alsaských, německých a rakouských odrůd, MLF znatelně snižuje ovocný charakter bílých vín. Jiné metody mohou být použity ke snížení kyselosti, když je tato operace nutná, ale vliv mléčných bakterií na aroma vín vyrobených z těchto odrůd by měl být studován, aby bylo možno vyhnout se MLF ve vínech vyrobených z výše uvedených odrůd. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) Pokud je MLF žádoucí, vína jsou finalizována a udržována na kalech po alkoholové fermentaci bez síření, při teplotě C. Nádoby musí být zcela naplněny a míchání kalů probíhá 1x týdně, aby se zabránilo oxidaci. Správnými vinařskými metodami, například optimálním sířením, se MLF zahájí spontánně po latentní fázi, která může být zkrácena použitím komerčního přípravku. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006) V regionech, kde se systematicky používá MLF však její zahájení nepředstavuje konkrétní problém, protože celé zařízení (zejména sudy) obsahuje velké množství mléčných bakterií a je obtížné se MLF vyhnout. Pokud víno začne před MLF oxidovat, je třeba jen lehce zasířit (2 g.hl -1 ). MLF není ohrožena a aromatický profil vína je zachován. Jakmile je kyselina jablečná zdegradována, vína jsou sířena na 4 5 g.hl -1 a udržována na kalech do plnění. (RIBÉREAU-GAYON a kol., 2006)

37 4. PRAKTICKÁ ČÁST V praktické části byl sledován průběh malolaktické fermentace za použití dvou kmenů mléčných bakterií komerční kmen a citrátnegativní kmen Pracovní postup Pro sledování průběhu malolaktické fermentace byly vybrány tři druhy vína bílé, růžové a červené. Z každého druhu bylo odebráno 10 litrů. Toto množství bylo rozděleno do demižonů o objemu 5 litrů. Každých 5 litrů bylo naočkováno mléčnými bakteriemi. 5 litrů každého vína kmenem O. oeni a dalších 5 litrů citrátnegativním kmenem. Víno bylo po dobu průběhu MLF uchováno v místnosti o teplotě 20 C. Vzorky byly odebírány v pravidelných intervalech a na přístrojích HPLC a ALPHA měřeny kyselina jablečná, mléčná a octová. MLF byla ukončena po 3 týdnech u bílého a růžového vína, u červeného vína po 2 týdnech. Po této době byla vína degustována. Hodnotil se i aromatický profil vín. Po degustaci byla vína stočena do demižonů o objemu 3 litry, zasířena a ponechána v chladu. Po 2 měsících byl ve víně změřen obsah SO2 a víno opět zasířeno Materiál a metody Materiál a) Bílé víno z odrůdy 'Sauvignon Blanc' Bílá moštová odrůda pocházející pravděpodobně z oblasti Bordeaux ve Francii. Má malý až středně velký list, který je pětilaločnatý s výraznými výkroji. Hrozen je malý, válcovitý, hustý. Bobule je malá, oválná, ve zralosti zelenožlutá. Dužnina má výrazné typické aroma. Odrůda má bujnější růst s hustým olistěním. Raší i kvete středně raně, dozrává koncem září až začátkem října. Má nižší odolnosti proti houbovým chorobám a proti mrazu. Cukernatost v moštu se pohybuje mezi NM a obsah kyselin je 9 11,5 g.l -1. Vyžaduje velmi dobré slunné polohy chráněné proti mrazu. Nevhodné půdy jsou suché a podmáčené. Vhodné je vyšší vedení s řezem na dlouhé tažně. Pěstuje se na podnožích SO 4, T 5C a CR

38 Víno je kvalitní, vysoce extraktivní, velmi aromatické, připomínající nádech kopřiv nebo listy černého rybízu, které se ve zralosti mění na vůni angreštového kompotu či bezového květu nebo dokonce broskví a exotického ovoce. (SOTOLÁŘ, 2006) b) Růžové víno z odrůdy 'Cerason' Tato modrá moštová odrůda byla vyšlechtěna v České republice. List je středně velký, trojlaločnatý až celokrajný, mírně puchýřnatý, vespod jemně plstnatý. Hrozen je středně velký, kuželovitě-válcovitý s křidélkem, hustý. Bobule je malá až středně velká, kulatá, tmavomodrá. Dužnina je řídká s plnou chutí. Odrůdy má bujný růst, tvoří silné jednoleté réví, dobře vyzrává. Má husté olistění a mnoho zálistků. Raší i kvete středně raně, dozrává v říjnu. Je poměrně odolná vůči houbovým chorobám. Cukernatost v moštu je NM, obsah kyselin je 8 10,5 g.l -1. Není náročná na stanoviště, ani na půdu a vedení. Vhodnými podnožemi jsou T 5C, SO 4, CR 2 a 125 AA. Víno je kvalitní, plné, připomínající 'Cabernet Sauvignon' svou někdy až travnatou příchutí. (SOTOLÁŘ, 2006) c) Červené víno z odrůdy 'Marlen' Modrá moštová odrůda vyšlechtěná v České republice. List je středně velký, slabě trojlaločnatý, povrch listové čepele hladký, Hrozen má menší až středně velký, válcovitý, u základu třapiny s křidélkem. Bobule je větší, kulatá, tmavomodrá s kabernetovou chutí. Odrůda dozrává v polovině října, potřebuje svahovité umístění s dobrou expozicí ke slunci. Výživné a vlhké půdy podporují bujný růst i sprchávání květenství. Odolnosti proti mrazu i houbových chorobám je dobrá. Za optimální pěstitelský tvar se považuje střední vedení s vodorovným tažněm nebo s tažněm s mírným obloukem. Víno má rubínovou barvu, ve vůni a chuti jsou patrné tóny zelené papriky s jemnými podtóny červeného a lesního ovoce. Chuť je plná, s jemnou tříslovinou. (PAVLOUŠEK, 2011)

39 d) Kmen Oenococcus oeni Lactoenos SB 3 Instant Tento kmen je v používání velmi rozšířen v Bordeaux. Je určen pro vína s prováděnou MLF v sudech typu barrique. Ve spojení s dobrým řízením alkoholové fermentace a výživou kvasinek může být naočkován na začátku kvašení a tak dosaženo rychlé odbourání kyseliny jablečné. Bakterie se rehydratují v nechlorované vodě o teplotě 20 C během 15 minut před dodáním do tanku. Dávkování je vždy uvedeno na obalu příslušného přípravku. (LAFFORT, 2013) e) Kmen citrátnegativní MaloStar Fruit Citrátnegativní kmen, který se používá pro upevnění ovocného typu vín. MaloStar Fruit je nová, citrátnegativní kultura bakterií druhé generace pro MLF pevných, ovocných bílých a červených vín s redukcí diacetylu a acetátu. Ve srovnání s obvyklou kulturou při aktivní fermentaci jsou citrátnegativní kultury rozeznatelné díky chybějící látkové výměně. Díky zvláštní selekci a vysokého počtu buněk MaloStar Fruit se dodá MLF více jistoty. Tato zvláštní selekce negativní na citráty podpoří odrůdový potenciál a komponenty kvasného aroma, které při obvyklé MLF budou pozměněny nebo překryty díky vytvoření diacetylu (máslové tóny). Citrátnegativní znamená, že bakteriální kultura MaloStar Fruit postrádá negativní vlastnost pro rozklad kyseliny citrónové. Proto zůstává kyselina citrónová zachována jako důležitá složka struktury kyselin ve víně. Rovněž také nenastává tvorba kyseliny octové (těkavé kyseliny) z kyseliny citrónové. Zvláštní složení aktivátoru této startovací kultury dodatečně zamezí, díky kyselině pantotenové, možné tvorbě těkavých kyselin z glukózy během MLF. Po ukončení MLF se nemusí čekat na rozklad diacetylu. Může se ihned provést síření. A tím se zabrání rozmnožení divokých mikroorganismů. Dále je MaloStar Fruit vhodný pro souběžné zaočkování. ( Metody a) Kapalinová chromatografie Kapalinová chromatografie je fyzikálně - chemická separační metoda, která využívá dělení látek mezi dvěma fázemi. Jedna je mobilní (pohyblivá) a druhá je stacionární

40 (nepohyblivá). Za základ separace látek kapalinovou chromatografií lze považovat různou afinitu složek vzorku k mobilní a stacionární fázi. Čím větší afinitu k stacionární fázi látka vykazuje, tím více je zbržďován její pohyb chromatografickým systémem. Postupováním vzorku kolonou se vytvářejí rovnovážné stavy na základě různých mezi vzorkem a mobilní fází, vzorkem a stacionární fází a rovněž mezi mobilní a stacionární fází. Mobilní fáze Mobilní fáze vystupuje jako přenašeč vzorku. Vzorek je vstříknut do mobilní fáze přes dávkovací ventil. Chemická interakce mobilní fáze a vzorku s kolonou určuje míru migrace a separace jednotlivých složek obsažených ve vzorku. Mobilní fáze může být změněna za účelem manipulace interakcí vzorku se stacionární fází. Stacionární fáze Za stacionární fázi se považuje náplň kolony, přes kterou protéká mobilní fáze se vzorkem. Chemické interakce stacionární fáze se vzorkem a mobilní fází můžeme rozdělit podle polarity, elektrického náboje a velikosti částic. ( b) Analyzátor vína ALPHA ALPHA analyzátor vína je založen na osvědčeném FT-IR spektrometru od německé firmy Bruker. Analyzátor je robustní, kompaktní, přenosný, snadno ovladatelný a velmi snadno se čistí. K analýze vína nepotřebujete žádný spotřební materiál. Není potřeba žádné přípravy vzorku před analýzou. Optimální a spolehlivé výsledky jsou zajištěny díky použité ATR technice a měřící cele analyzátoru ALPHA. velmi rychlá analýza analýza moštu, moštu během fermentace a hotových vín možnost rozšíření kalibrací možnost použití s autosamplerem intuitivní software PC součástí dodávky Obr. 8 Kapalinová chromatografie HPLC (

41 nejmenší FT-IR analyzátor na světě Měřené parametry pro víno: alkohol kyselina octová (celkové kyseliny) ph hustota kyselina jablečná kyselina mléčná kyselina vinná celkové cukry glukóza fruktóza sacharóza glycerol Měřené parametry pro mošty: Obr. 9 Analyzátor vína ALPHA NM ( celkové kyseliny vina-pomoci-ftir-analyzatoru-bruker- asimilovatelný dusík Alpha) zkvasitelné cukry glukóza fruktóza kyselina vinná kyselina jablečná (včetně L a D isomeru) kyselina citronová ( Obr. 10 Analyzátor vína ALPHA vina-pomoci-ftir-analyzatoru-bruker- Alpha/)