MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2011 HANA SCHINDLEROVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Ověřování parentit u skotu Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Stehlík Vypracovala: Hana Schindlerová Brno

3 Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Ověřování parentit u skotu vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uloţena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně dne... Podpis.. 3

4 Poděkování Ráda bych poděkovala panu Ing. Liborovi Stehlíkovi za rady a pomoc při zpracování mé bakalářské práce. Také bych ráda poděkovala za podporu mým rodičům a sestře Štěpánce. 4

5 Abstrakt Ve své práci se zabývám problematikou zjišťování parentit u skotu. Častým problémem je stále neprůkaznost původu skotu s následkem sníţení genetického zisku. Toto jsou bezesporu faktory, které ovlivňují plemennou hodnotu býka, a to jak ve smyslu nadhodnocování či podhodnocování. Rodičovství je moţné ověřovat několika způsoby. Pomocí polymorfismu krevních systémů počínaje, minisatelitů, mikrosatelitů a metodou SNP konče. Moderní genetickou metodou dnešní doby je bezesporu vyuţití mikrosatelitů. V České republice provádí určování parentit tři akreditované laboratoře (laboratoř Agrogenomiky při Mendlově univerzitě v Brně, Genservice v Brně a laboratoř v Hradišťsku pod Medníkem), jejichţ práce podléhá Plemenářskému zákonu č. 154/2000 Sb. Klíčová slova: DNA, rodičovství, mikrosatelity Abstract The bachelor thesis is focused on the parentity verification testing.. A frequent problem is still inconclusive bovine origin, resulting in a reduction of genetic gain. These are undoubtedly factors that affect the value of the herd bull, and both in terms of overestimation or underestimation. Parenting can be verified in several ways.the verifications of parentity can be done through the blood, minisatelite, microsatelite and SNP s polymorphism. Nowadays, the modern genetics methods are based on microsatelite analysis. Totally three different and independent accredited laboratories are presented in the Czech Republic Laboratory of Agrogenomics at Mendel University in Brno, Brno Genservice and Laboratory of Immunogenetis in Hradišťko pod Medníkem. All of mentioned laboratories meet the criteria of 154/2000 Sb. Key words: DNA, microsatellites, parentity 5

6 Obsah 1 ÚVOD CÍL PRÁCE DNA ANALÝZY UŢÍVANÉ PRO OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ Historie Izolace DNA z krve Klasická proteinázová metoda Izolace DNA z chlupu Postup odběru chlupů u skotu Zpracování vzorků PCR Princip metody Fragmentační analýza SATELITNÍ DNA Uţívání minisatelitní DNA Uţívání mikrosatelitů Uţívání SNP Výhody SNP oproti mikrosatelitům ZÁKONNÉ PODKLADY K OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ U SKOTU VLASTNÍ PRÁCE Ověřování parentit u otců plemene holštýn Porovnávaní býci Výskyt alel v celé populaci Výpočet frekvence pro celou populaci: Ověřování parentity (5 býků) POUŢITÁ TERMINOLOGIE ZÁVĚR SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY

7 1 ÚVOD Ověřování rodičovství (parentity) patří v současné době k běţně uţívaným genetickým testům. Tento test je zaloţen na testování DNA. Jde o DNA rodiče a potomka. Analyzují se jednotlivé mikrosatelity. Dřívější metody vyuţívaly krevních skupin a polymorfismu bílkovin. Potomek dostává do své genetické výbavy jednu kopii od otce a jednu od matky, proto musí DNA potomka obsahovat mikrosatelity obou rodičů. Pokud ne, nejedná se o rodičovství. Správné určení rodičovství má vliv na odhad plemenné hodnoty a také na úspěšnost šlechtitelského programu. Chyby v identifikaci, chybný záznam nebo záměna telat, hraje velmi důleţitou ekonomickou roli (Roy et al., 1995). V ČR se ověřováním původu a genetického typu zabývá Laboratoř agrogenomiky Mendlovy univerzity v Brně, Laboratoř imunogenetiky Českomoravské společnosti chovatelů, a.s. Hradišťsko pod Medníkem (pouze hospodářská zvířata a psi) a zkušební laboratoř molekulární genetiky a cytogenetiky GENSERVICE, s.r.o., Brno (akreditace ČIA pro určování paternity a individuální identifikace zvířat) (Bryndová, 2009). 7

8 2 CÍL PRÁCE Cílem předloţené bakalářské práce byly následující úkoly: - zjistit současný stav v ověřování parentit v ČR včetně legislativy - seznámit se s postupem určování genetických typů a ověřování původu skotu v laboratořích genomiky - z podkladů laboratorních testů mikrosatelitů DNA analyzovat rozdíly v alelách a genotypech MS u skotu - provést analýzy mikrosatelitů stanovených u rodičů a jejich potomků, ověřit původy a vyhledat příslušné otce 8

9 3 DNA ANALÝZY UŽÍVANÉ PRO OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ V dnešní době nastal velký rozvoj v různých odvětví vědy, zejména v molekulární genetice. 3.1 Historie Uţ dříve lidé poznali, ţe pokud spolu kříţí samce a samici s dobrými vlastnostmi, které poţadovali, například růst, zmasilost, ţivotaschopnost, dostanou potomky podobných vlastností, proto zde došlo k potřebě ověřovat, zda jsou rodiče skuteční. Na počátku 20. století byly objeveny krevní skupiny. Krevní skupinou se rozumí geneticky determinovaná vlastnost červené krvinky charakterizovaná přítomností specifických antigenů (Kutěj,Šamaj 2006). LANDSTEINER, byl prvním objevitelem, který v roce 1901 objevil individuální rozdíly u lidských erytrocytů. Skoro ve stejnou dobu probíhal ale i výzkum antigenních individuálních rozdílů u ţivočichů: EHRLICH a MORGENROTH u koz, TODD a WHITE u skotu, LANGER a MILLER u slepic. Později se ukázalo, ţe tato výlučnost antigenů jednoho jedince je dána existencí omezených počtů antigenních faktorů, které vzájemným kombinováním zajišťují odlišení jedinců stejného druhu. Dochází ale k překrývání některých antigenních faktorů, z nichţ některé jsou společné celé řadě jedinců (Kníţe, Šiler et al., 1978). DNA lze v dnešní době zjistit z krve, chlupové cibulky, tkáně, mléka a sperma. 3.2 Izolace DNA z krve Jednou z moţností jak získat DNA je izolace z krve Klasická proteinázová metoda 1. K 50µl krve v 1,5 ml eppendorfově zkumavce přidat 500µl TE pufru, centrifugovat při otáčkách za 1 minutu. Opakovat minimálně 3 tak, aby vzorek nebyl červeně zabarven. 2. Odstraněním supernatanu je získán sediment obsahující leukocyty. 9

10 3. Inkubovat 2-10 hodin ve 100µl lyzačního pufru s proteinázou K při 54 C (Knoll, Vykoukalová 2002). Výnos DNA můţe být zvýšen aţ o 15 %, pokud se postup opakuje se stejným 200ml vzorkem obsahujícím eluát. Pokud je výnos DNA niţší (méně neţ 3mg) objem elučního pufru se sníţí na 100 µl, abychom dosáhli vyšší koncentrace DNA v eluátu. Pokud je DNA méně neţ 1mg, můţeme sníţit objem elučního pufru aţ na 50µl. Celkový výnos DNA se sníţí o % (Finnzymes). Z praktického hlediska je tento postup náročnější na odběr materiálu. Například odběr u volně se pasoucích stád. 3.3 Izolace DNA z chlupu Abychom izolovali DNA a přesně určili genetický typ, je zapotřebí chlupových cibulek. V následující kapitole je popsán odběr chlupů u skotu a zpracování vzorků Postup odběru chlupů u skotu - snaţit se chlupy vytrhávat z neznečištěných míst - kořen ocasu, slabiny, kohoutek - nestříhat, ale vytrhávat srst proti směru růstu - zkontrolovat, zda srst obsahuje chlupové cibulky - umístit do přiloţeného papírového sáčku - nadepsat číslo zvířete (popř. poslední 4 čísla) - vyplnit přiloţenou objednávku (Stehlík 2010). 10

11 3.3.2 Zpracování vzorků 1) Vzorky tkáně nařezat skalpelem a semlít na jemný prášek. Prášek by měl být co nejjemnější pro optimální lyzi. 2) Přidá se 200µl pufru T1, směs by měla být homogenní. Nutné pouţívat ochranné rukavice. 3) Přidat 200µl proteinázy K do směsi, promíchat a inkubovat minimálně 1-2hodiny při 56 C (pokud se tkáň rozkládá špatně, prodlouţíme inkubaci přes noc). Délka inkubace je závislá na tom, jak je vzorek homogenizovaný. Během inkubace směs obracet. Měla by být průhledná. Pufr T1 denaturuje proteiny, proteináza K štěpí denaturované bílkoviny na menší fragmenty. 4) Přidat 20µl Rase A a inkubuje se dalších 5 minut při 37 C. Zbytkové fragmenty RNA budou odstraněny během dalšího postupu. Přidat 200µl pufru T2, inkubovat 10 minut při 70 C. 5) Směs nechat vychladnout 1 minutu, pak přidat 200µl 100 % ethanolu. Musíme zabránit vysráţení DNA (promíchat). I přes promíchání můţe k vysráţení dojít, proto se musíme přesvědčit, ţe DNA přeneseme spolu s kapalinou do kolon. 6) Centrifugace 1 minutu. 7) Přidat 500 pufru T3. Ten zajistí nízký obsah solí v eluátu. 8) Odstřeďovat 1 minutu při otáčkách za minutu, tím se odstředí reziduát T3 pufru. Zbytek ethanolu by mohl mít vliv na enzymatické reakce (Taq DNA polymeráza). Vloţit do čisté zkumavky, inkubovat 5 minut při pokojové teplotě, poté vloţit do odstředivky na 2 minuty (JETQUICK). 3.4 PCR Polymerázová řetězová reakce, která slouţí k získání dostatečného mnoţství DNA pro další analýzy. Metoda byla poprvé popsána v roce 1985 (Saiki et al.,1987). 11

12 PCR můţe být pouţita jen tehdy, kdyţ je známá nukleotidová sekvence ohraničující analyzovaný gen nebo sekvenci DNA (Snustad, Simmons 2009) Princip metody PCR je zaloţena na extenzi primerů a geometrické amplifikaci (namnoţení) molekul DNA za cyklického opakování tří kroků lišících se pouze teplotními podmínkami (Knoll, Vykoukalová 2002). Při této amplifikaci je vhodné mít dva primery, kaţdý na jeden řetězec dvoušroubovice. Primery ohraničují cílovou sekvenci z kaţdé strany, aby byla moţná selektivní amplifikace. Primery jsou syntetizovány jako oligonukleotidy a jsou přidávány do reakce v nadbytku, takţe kaţdý z primerů je zpravidla schopen být k dispozici po kaţdém denaturačním kroku. Další podmínkou je dostupnost termostabilní DNA polymerázy. To je čištěný enzym termofilní bakterie Thermus aquaticus a podle svého producenta se nazývá Taq. Kromě primerů a Taq polymerázy je nutné, aby kaţdá PCR reakce obsahovala pufr a 4 dntps, tj. volné nukleotidy, které jsou nutné při komplementárním doplňování rozpletených DNA řetězců (Řehout et al., 2005). PCR umoţňuje současnou syntézu obou komplementárních vláken extenzí (prodluţováním) dvou primerů (jednořetězcových oligonukleotidů) připojených ke komplementárním řetězcům na protilehlých koncích templátu. Umístění obou primerů tak ohraničuje amplifikovaný úsek DNA. Kaţdý cyklus PCR zahrnuje teplotní denaturaci DNA, připojení primerů (annealing) a syntézu DNA (elongace). V kaţdém cyklu se mnoţství DNA zdvojnásobí a tím se zdvojnásobí mnoţství templátu pro následující cyklus. V důsledku toho dochází k exponenciální amplifikaci, tj. z kaţdé molekuly původního templátu bude vytvořeno 2 n kopií, kde n je počet cyklů. Například po 30 cyklech by mělo dojít zhruba k násobnému namnoţení DNA. V praxi je však amplifikace limitována koncentrací substrátů a aktivitou enzymu. Obecně násobné amplifikace můţe být dosaţeno v 30 aţ 50 cyklech. Účinnost amplifikace je odhadována mezi 60 a 85 %, ale můţe být sníţena přítomností většího mnoţství templátu. Zvyšuje se totiţ pravděpodobnost hybridizace templátu s komplementárním řetězcem DNA, místo s primerem. Na účinnost amplifikace má také vliv nespecifická hybridizace primerů s jinými sekvencemi na cílové DNA. Za optimálních podmínek 12

13 však mohou být detekovány PCR amplifikacemi i geonomové sekvence o jedné kopii a viry (KNOLL, Vykoukalová 2002). Pomocí přístroje zvaný termální cykler se střídá teplota reakce ve třech základních krocích. V kaţdém cyklu se mnoţství DNA zdvojnásobí, tj. po 30 cyklech bude teoreticky 2 30 nově nesyntetizovaných molekul DNA. Protoţe se při PCR pracuje s velmi malým mnoţstvím, je reakce poměrně citlivá. Je tedy nutné dbát na přísnou hygienu a čistotu práce, aby nedošlo ke kontaminaci (např. leţí-li otevřené zkumavky delší dobu v laboratoři, či pracujeme-li bez rukavic). Proto je nejlepší připravovat reakci ve sterilním boxu. Dále je nutný vţdy přesný popis pouţívaných zkumavek a kvalita kontroly, zejména tehdy, jsou-li analýzy prováděny v humánní medicíně nebo pro soudní účely (Řehout et al., 2005). 3.5 Fragmentační analýza Namnoţení mikrosatelitní DNA probíhá pomocí metody PCR a je moţné pomnoţit všechny mikrosatelity v jedné zkumavce (multiplex PCR ). Fragmenty DNA mikrosatelitů jsou potom podrobeny kapilární elektroforéze (fragmentární analýza) na genetickém analyzátoru (sekvenátoru), kde jsou jednotlivé DNA fragmenty separovány na základě své velikosti. Detekce se provádí automaticky pomocí fluorescence. Kit firmy Finnzymes Diagnostics na stanovení DNA polymorfismu u skotu (Bovine GenotypoesTM Panel 3.1) slouţí k amplifikaci 18 dinukleotidových markerů. Testovaný kit nabízí vysoce kvalitní a dobře vybalancovanou intenzitu výstupního signálu. Výhodou je poměrně vysoká stabilita multiplexní PCR reakce, nízké detekční limity pro geonomovou DNA a v neposlední řadě komfort v podobě master mixů primerů(finnzymes). Uchování DNA Kvalitně a šetrně izolovanou DNA lze dlouhodobě uchovávat zamraţenou v ethanolu, v lyofilizovaném stavu a nejčastěji ve vodném roztoku (případně pufru). Pro 13

14 potřeby PCR se uchovává DNA ve vodě při -20 C, dlouhodobě aţ při -70 C. Rozmrazování negativně ovlivňuje kvalitu DNA, proto u vzácných vzorků je vhodné uloţit alikvotní vzorek. Pufr TE zvyšuje délku skladovatelnosti DNA, ale vzhledem k obsahu EDTA, který inhibuje PCR se nedoporučuje (KNOLL, Vykoukalová 2002). 14

15 4 SATELITNÍ DNA V posledních letech je velmi intenzivně sledován výskyt satelitů. Satelitní DNA je obecné označení pro výskyt mnoha relativně krátkých sekvencí v geonomu ve formě tzv. tandemových repetic, tzn. za sebou leţících opakujících se jednotek DNA. Podle své délky se zařazují do několika tříd: - maxisatelity celková délka repetitivní DNA je 5 x 10 5 párů bází. Na chromozomu jsou často lokalizovány v blízkosti centromery. - minisatelity krátké hypervariabilní sekvence DNA, uspořádané rovněţ jako tandemové repetice, jsou tvořeny sekvencemi párů bází. - mikrosatelity jsou tvořeny 2-6 bázemi (Řehout et al., 2000). 4.1 Užívání minisatelitní DNA Minisatelity, označované také jako VNTR (variable number tandem repeat). Minisatelity jsou seřazeny tandemově a mohou mít opakujících se párů bází (bp). Jedinci se pak liší v počtech opakování a restrikčních místech (Dvořák et al., 2002). Sem patří i vzácně se vyskytující dalece nebo inzerce v intronové části způsobené např. transpozomy (KNOLL, Vykoukalová 2002). Pro potřeby laboratorního testování je nutné si uvědomit, ţe jsou minisatelity velmi dlouhé. Proto není moţné je amplifikovat pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce). K detekci minisatelitní DNA je nutné pouţít značenou sondu a restrikční enzymy, které štěpí tuto DNA. Minisatelity jsou hypervariabilní, proto lze po provedení elektroforézy získat na gelu hustý ţebřík DNA, jehoţ pruhy jsou individuálně specifické. V praxi se však tyto postupy k určování rodičovství u hospodářských zvířat nepouţívají (Dvořák et al., 2002). 4.2 Užívání mikrosatelitů Mikrosatelity (syn. STR short tandem repeats), jsou krátké tandemové repetice sloţené z mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidových motivů. Vyskytují se ve všech eukaryotních genomech. 15

16 Významnou vlastností je vysoký stupeň polymorfizmu způsobený variabilním počtem tandemových repetic (obvykle 10-30). Nejčastěji se vyskytující repeticí u savců je motiv (AC) n (Knoll, Vykoukalová 2002), ty se vyskytují na tisících různých lokusech v genomu ţivočichů (Dvořák et. al., 2002). Polymorfismus mikrosatelitů je moţné rychle a spolehlivě zjistit pomocí PCR. Díky těmto vlastnostem jsou mikrosatelity dobrými markery pro vazbové mapování genů a studium diverzity včetně ověřování rodičovství (Knoll, Vykoukalová 2002). Mnoţství opakování daných bází (např. GA, CTA) je v desítkách, někdy i stovkách a označují se (TGA) n. Jiné příklady jsou GA 6, CTA 215. Blok, ve kterém se opakují mikrosatelitní elementy se nazývá mikrosatelitní jednotka. Ty se pak v genu vyskytují v různém počtu kopií (Dvořák et. al., 2002). V současné době jsou mikrosatelity nejčastěji pouţívaným typem markeru. Jejich genotypizace je prováděna rutinně tak, ţe se v PCR amplifikuje příslušný úsek DNA, který nese daný mikrosatelit a jenţ je identifikován sekvencí bází v primeru. Fragmenty se liší délkou, která je dána počtem opakování mikrosatelitního motivu. Délka je určována elektroforeticky, většinou na automatickém sekvenátoru (Řehout et al., 2005). Příklad tří různých alel mikrosatelitů lišících se délkou DNA (Knoll, Vykoukalová 2002). Mikrosatelit (GC) n 5ʹATCGGTATTGCGCGCGCGCGCGCGCTACGTT 3ʹ n=8 5ʹ ATCGGTATTGCGCGCGCGCTACGTT 3ʹ n=5 5ʹ ATCGGTATTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTACGTT 3ʹ n=11 16

17 Tab. č. 1 Panel mikrosatelitů (ISAG 2003). Lokus Chromozom Opakování Velikost (bp) TGLA di BM di TGLA53 16 di ETH10 5 di SPS di SPS di RM067 4 di TGLA di TGLA di INRA23 3 di BM di ETH3 19 di ETH225 9 di BM di CSRM60 10 di MGTG4B 4 di CSSM66 14 di ILSTS006 7 di genotypů mikrosatelitů, které zahrnují všech 12 lokusů, doporučené ISAG pro rutinní používání pro určování rodičovství u skotu (ISAG 2003). 4.3 Užívání SNP V geonomu ţivočichů se nachází mimo minisatelitů a mikrosatelitů i další variabilita, která vzniká bodovými mutacemi. Mutace mohou vznikat záměnou báze DNA za jinou, ztrátou jedné báze (delece), přehozením po sobě následujících bází (inverze) či vloţením další báze do sekvence (inzerce) a došlo ke vzniku jednonukleotidového polymorfismu SNP (Dvořák et al., 2002). Jak uvádí Werner et al., (2004) SNP byly podrobeny následujícím výběrovým kritériím: 17

18 - četnost menších alel musí být větší neţ 0,1 u dvou ze tří zkoumaných plemen - markery by neměly úzce souviset Frekvence alel byly odhadnuty na základě analýzy sekvenování DNA nebo genotypizace jednotlivých vzorků DNA. Vybrané SNP lokusy byly radiačně mapovány nebo mapovány pomocí fluorescenční in-situ hybridizace a testovány na mutace. Tato metoda umoţňuje určit rodičovství na 99,9 % (Werner et al., 2004). 4.4 Výhody SNP oproti mikrosatelitům Pro porovnání SNP a mikrosatelitů jsou zde uvedeny výhody metody SNP: 1) niţší mutační rychlost 2) více vyuţívaný v laboratorní praxi 3) vhodnost pro standardní zobrazení výsledků genotypizace DNA 4) vhodnost pro různé genotypy a vysoký potenciál pro automatizaci 5) naopak nevýhodou SNP je to, ţe má niţší obsah informací ve srovnání s vysoce polymorfními mikrosatelity. Tuto nevýhodu lze ale kompenzovat vyšším počtem markerů (Werner et al., 2004). 18

19 5 ZÁKONNÉ PODKLADY K OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ U SKOTU V České republice se určování rodičovství řídí zákonem č. 154/2000 Sb. o šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat a o změně některých souvisejících zákonů (plemenářský zákon). Účelem tohoto zákona je stanovit podmínky a pravidla pro šlechtění a plemenitbu vyjmenovaných hospodářských zvířat, pro ochranu, uchovávání a vyuţívání genetických zdrojů zvířat, pro označování označovaných zvířat a pro evidenci evidovaných zvířat, chovaných na území České republiky tak, aby tato činnost byla za podpory ze státních prostředků nástrojem pro zvelebování populací těchto zvířat a zachování jejich genetické rozmanitosti. 14 Genetické zdroje Pro účely tohoto zákona se dále rozumí a) genetickým zdrojem zvířete jedinec, sperma, vajíčko, embryo, popřípadě ostatní genetický materiál autochtonního nebo lokálně adaptovaného druhu, plemene nebo populace zvířete, nacházející se na území České republiky, mající význam pro výţivu a zemědělství, pro uchování biologické a genetické rozmanitosti světového přírodního bohatství a pro umoţnění jeho vyuţívání pro potřeby současných i budoucích generací, zařazené do Národního programu konzervace a vyuţívání genetických zdrojů zvířat významných pro výţivu a zemědělství, b) určenou osobou příspěvková organizace zřízená ministerstvem pro realizaci Národního programu, pro provozování genobanky a pro koordinaci opatření s tím souvisejících, jejíţ identifikační údaje jsou uveřejněny ve Věstníku Ministerstva zemědělství, c) genobankou soubor zařízení slouţících ke konzervaci a vyuţívání genetických zdrojů zvířat provozovaný určenou osobou, d) vzorkem genetického zdroje zvířete odebraný reprodukční materiál zvířete, zejména sperma, vaječné buňky, embrya, případně další tkáně, umoţňující přenos a regeneraci genetického zdroje zvířete při zachování jeho genetického základu, 19

20 e) uváděním do oběhu plemenného zvířete, spermatu, embrya, vaječné buňky, násadových vajec drůbeţe a plemenného materiálu ryb a včel, jejich nákup nebo prodej, nabízení k prodeji a kaţdý jiný způsob převodu za úplatu nebo bezúplatně jiným osobám. Šlechtitelská činnost a šlechtitelská opatření spočívají: a) ve stanovení šlechtitelských programů pro dosaţení chovných cílů, b) ve zjišťování a evidování původu, vlastností a znaků vyjmenovaných hospodářských zvířat, c) v provádění kontroly uţitkovosti, výkonnostních zkoušek, výkonnostních testů, kontroly dědičnosti, posuzování vlastností, znaků a zdraví vyjmenovaných hospodářských zvířat, d) ve kvalifikovaném odhadu plemenné hodnoty vyjmenovaných hospodářských zvířat, e) ve vedení plemenných knih nebo plemenářských evidencí, f) v ověřování a osvědčování původu nebo stanovování genetického typu plemenných zvířat, g) v hodnocení vyjmenovaných hospodářských zvířat a jejich cílevědomé selekci a připařování v souladu se šlechtitelskými programy a cíli, h) v ochraně dědičných vlastností a znaků určité populace (genofondu) a udrţování genetických zdrojů, i) ve vystavování dokladů o původu, výkonnosti a hodnotě plemenných zvířat, j) ve zveřejňování dosaţených plemenných hodnot zvířat, výsledků šlechtění a plemenářské činnosti Ověřování a osvědčování původu a stanovování genetického typu plemenných zvířat (1) Původ plemenných zvířat ověřují a jejich genetické typy stanovují oprávněné osoby. (2) Oprávněná osoba je povinna a) doloţit způsobilost k ověřování a osvědčování původů a stanovování genetických typů plemenných zvířat osvědčením o akreditaci, b) doloţit účast v mezinárodních srovnávacích testech, pokud se tyto testy provádějí, a trvale splňovat jejich kritéria, 20

21 c) ověřovat původ a stanovovat genetický typ plemenného zvířete, poţádá-li o to Česká plemenářská inspekce nebo orgány veterinární správy pro výkon kontrolní činnosti (odstavec 4) nebo uznané chovatelské sdruţení anebo osoba uvedená v odstavci 6, d) vydávat osvědčení o ověření původu a osvědčení o stanovení genetického typu a poskytovat je České plemenářské inspekci nebo orgánům veterinární správy pro výkon kontrolní činnosti (odstavec 4) nebo uznaným chovatelským sdruţením anebo osobě uvedené v odstavci 6, pokud o ně poţádala. (3) Původ musí být ověřen u a) býků před výběrem k plemenitbě, b) hříbat narozených po inseminaci nebo po přenosu embryí, c) hříbat plemene anglický plnokrevník a klusák, d) hejna plemenných ryb zařazených do genetických zdrojů a do plemenitby, e) dovezeného plemenného materiálu včel. (4) Původ zvířat můţe být také namátkově ověřen pro výkon kontrolní činnosti. (5) Genetický typ musí být stanoven u a) býků a hřebců vybraných pro plemenitbu, b) kanců v rozsahu stanoveném ve šlechtitelském programu, c) beranů a kozlů zařazených do inseminace. (6) O ověření původu podle odstavce 3 nebo o stanovení genetického typu podle odstavce 5 je povinen poţádat majitel zvířete. (7) Osvědčení o ověření původu a osvědčení o stanovení genetického typu musí obsahovat identifikační údaje majitele zvířete, identifikační údaje zvířete, identifikační údaje rodičů zvířete a výsledek ověření původu nebo výsledek stanovení genetického typu zvířete. (8) Vyhláška stanoví podrobnosti o údajích osvědčení o ověření původu a osvědčení o stanovení genetického typu. 26 Potvrzení o původu plemenných zvířat, doklad o původu prasat a osvědčení o původu hejna (1) Potvrzení o původu plemenných zvířat je doklad o identitě, původu a výkonnosti plemenných zvířat, dárců spermatu, embryí, vaječných buněk, násadových vajec a plemenného materiálu ryb (dále jen "potvrzení o původu"). 21

22 (2) Potvrzení o původu vydává a údaje v něm uvedené na ţádost chovatele porovnává uznané chovatelské sdruţení, a to podle zápisu plemenného zvířete v plemenné knize nebo v plemenářské evidenci. (3) Doklad o původu prasat pro své smluvní chovy vydává a údaje v něm uvedené porovnává chovatelský podnik prasat, a to podle zápisu zvířete v chovném registru. (4) K produkci násadových vajec je nutné osvědčení o původu hejna. Osvědčení o původu hejna vydává pro tuzemské chovy drůbeţe uznané chovatelské sdruţení, pro chovy drůbeţe přemístěné z jiných členských států Evropské unie nebo dovezené ze třetích zemí oprávněná osoba. (5) Vyhláška stanoví podrobnosti o údajích potvrzení o původu platné i pro přemísťovaná a dováţená zvířata, sperma, embrya, vaječné buňky a plemenný materiál ryb a podrobnosti o údajích osvědčení o původu hejna. 29 Náležitosti osvědčení o ověření původu nebo stanovení genetického typu: (2)Výsledek ověřování původu se vyjadřuje slovy: a) původ souhlasí s uvedenými rodiči, pokud kombinace genetických typů rodičů je kompatibilní s genetickým typem potomka. b) původ nesouhlasí s uvedenými rodiči, pokud kombinace genetických typů rodičů je nekompatibilní s genetickým typem potomka, a to: 1. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí otec 2. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí matka 3. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí oba rodiče 4. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nelze určit, který z rodičů nesouhlasí 22

23 c) původ souhlasí s otcem uvedeným na prvním místě za předpokladu správné matky, pokud bylo udáno více moţných otců a všichni byli vyloučeni aţ na jednoho, který se uvede na prvním místě. d) původ nelze ověřit, pokud není k dispozici genetický typ jednoho nebo obou rodičů(u plemenných ryb rodičovských hejn) a nebo z více udaných moţných otců, nelze vyloučit dva a více otců e) základní testace potvrzení, ţe genetický typ zvířete byl zahrnut do databáze genetických typů vedených oprávněnou osobou s cílem umoţnit ověření původu jeho potomků (Plemenářský zákon). Zákon č.32/2011 SB. Zákon, kterým se mění zákon č.154/2000 Sb., o šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat a o změně některých souvisejících zákonů (plemenářský zákon), ve znění pozdějších předpisů. V 2 odst. 1 písm. b) se za slovo "Bovinae" vkládají slova "s výjimkou volně ţijících ţivočichů 15) "(Plemenářský zákon). 23

24 6 VLASTNÍ PRÁCE Ve své práci jsem ověřovala údaje z genetického analyzátoru ABI PRISM 310, které dodala Laboratoř agrogenomiky. Určovala jsem parentitu u otců plemene holštýn, zjišťovala četnost alel a vypočítávala frekvence alel. 6.1 Ověřování parentit u otců plemene holštýn V České republice je holštýnské plemeno jedním z nejčastějších plemen s trţní produkcí mléka, i kdyţ v roce 2010 došlo k dosti výraznému poklesu počtu krav i chovů dojených plemen skotu. Ukončující se proces převodného kříţení se projevuje poklesem stavů v posledních dvou letech. Holštýnské plemeno dnes zahrnuje celkem 57,2 % krav v kontrole uţitkovosti v ČR (52,5 % černostrakaté a 4,7 % červené holštýnské). Holštýnských krav ubylo 7077 ks, z toho představoval pokles červených holštýnek 1372 ks. Celkový stav holštýnských krav, včetně kříţenců k činil kusů (Svaz chovatelů holštýnského skotu). Holštýnské plemeno patří do skupiny niţších plemen. Černostrakatý skot pochází ze severozápadní Evropy. V těchto oblastech se vyvinulo v průběhu 17. aţ 19. století z různých místních populací a postupně se rozšiřovalo do celého světa. V Evropě bylo nejdříve šlechtěno na exteriérově vyváţený typ středního rámce (131 aţ 132cm v kohoutku) s velmi dobrou mléčnou produkcí, vyšším obsahem mléčných sloţek a dobrým osvalením. Pro zvířata severoamerické provenience se vţilo označení holštýnský skot. Dnes je to nejprošlechtěnější plemeno na mléčnou uţitkovost. Jeho zbarvení je převáţně černostrakaté a ojediněle se vyskytují recesivně zaloţení červenostrakatí jedinci (RED holštýn). K nejprošlechtěnějším populacím patří stáda v Izraeli, Kanadě a USA, kde průměrná uţitkovost dosahuje kg mléka za laktaci. Chov v ČR je zaloţen na genetickém materiálu ze Severní Ameriky, Francie, Holandska, Dánska, Itálie a SRN (svaz chovatelů holštýnského skotu). 24

25 6.2 Porovnávaní býci Porovnáváni byli potomci pěti býků, kteří jsou uvedeny níţe: - NEB NBY NBY NBY NX TGLA 53 k tomuto lokusu nebyly zadány potřebné údaje, proto jsem s ním nepracovala a dále ho jiţ neuvádím. Plemenný býk NBY 166 Tento plemenný býk měl v mé práci uvedeno 7 potomků. Byli to: CP 26, CP 101, CP 96, GO 25, GO 53, GO 55, GO 48. Jméno: Drake Narozen: Ušní číslo: CZ Otec: NBY 091 Matka: USA Plemenný býk NBY 165 U tohoto plemenného býka jsem napočítala 11 potomků. Byli to: CP 50, CP 59, CP 61, CP 43, CP103, CP 18, GO 19, GO 26, GO 38, GO 42, GO 77 Jméno: Disc Narozen:

26 Ušní číslo: CZ Otec: NBY 91 Matka: USA Plemenný býk NBY 198 Tento plemenný býk měl uvedeno nejvíce potomků, a to 14. Byli to: SE 19, SE 21, SE 22, SE 31, SE 34, SE 35, SE 62, SE 56, SE 64, SE 68, SE 77, SE 84, SE 85, SE 91 Jméno: Mister Dean Narozen: Ušní číslo: neuvedeno Otec: NBY 116 Matka: NLD Plemenný býk NEB 878 Tento plemenný býk měl v mé práci uvedeno 13 potomků. Byli to: SE 1, SE 4, SE 5, SE 12, SE 14, SE 30, Se 32, SE 69, SE 67, SE 76, SE 90, SE 93, SE 98 Plemenný býk NX 929 Tento plemenný býk měl v mé práci uvedeno 7 potomků, stejně jako býk NBY 166. Byli to: GO 13, GO 8, GO 14, GO 49, GO 51, GO 72, GO 69 Jméno: Dušan 26

27 Narozen: Ušní číslo: HU Otec: Matka: USA (Svaz chovatelů holštýnského skotu) Výskyt alel v celé populaci Výskyt alel byl sledován u 109 kusů plemene holštýn. Z toho bylo 5 plemenných býků, 52 matek a 52 potomků. Alely byly pozorovány u níţe uvedených mikrosatelitů. Tab. č. 2 Pozorované alely u plemene holštýn v celé populaci Lokusy Relativní frekvence alel BM ,180,182, 186, 188, 190 BM , 125, 127, 131, 133, 135, 137, 139 ETH 3 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 109 ETH , 215, 217, 219, 221, 223, 225 ETH , 142, 144, 146, 148, 150, 152 INRA , 200, 202, 206, 208, 210, 214, 218 SPS , 252, 254, 256, 258, 260 TGLA , 143, 151, 153, 159, 161, 163, 173,

28 TGLA , 117, 119,121, 123 TGLA , 83, 87, 89, 91, 93, 97, 99, Výpočet frekvence pro celou populaci: Frekvence alel byly vypočítány dle vzorce (Hruban et al., 2000). kde p = relativní četnost alely A q = relativní četnost alely B = relativní četnost homozygotního genotypu AA b = relativní četnost homozygotního genotypu BB h = relativní četnost heterozygotního genotypu AB Ve své práci jsem v celé populaci napočítala 109 jedinců. Tab. č. 3 Vypočtené frekvence pro celou populaci Lokusy BM 1824 Alely ,2442 0,2162 0,2442 0,005 0,2162 0,0742 BM

29 ,005 0,234 0,216 0,055 0,086 0,197 0,101 0,106 ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA ,005 0,48 0,055 0,009 0,005 0,157 0,142 0, ,151 0,005 0,156 0,472 0,037 0,119 0, ,156 0,005 0,118 0,05 0,341 0,28 0, ,005 0,064 0,083 0,216 0,145 0,234 0,248 0, ,505 0,138 0,073 0,124 0,092 0, ,009 0,344 0,134 0,138 0,005 0,055 0,161 0,018 0, ,339 0,385 0,130 0,096 0, ,225 0,046 0,018 0,06 0,188 0,182 0,248 0,005 0,028 Nejvíce alel se nacházelo v lokusech TGLA 122 (alely 139, 143, 151, 153, 159, 161, 163,173, 183) a TGLA 227 (alely 81, 83, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 103) v počtu 9 alel. Nejméně alel se nacházelo v lokusu TGLA 126 v počtu 5 alel. Jsou to: 115, 117,119,121, Ověřování parentity (5 býků) Otec NEB 878 Potomek /61 29

30 Matka /61 Tab. č.4 Ověřování rodičovství potomků u býka NEB 878 Otec NEB 878 Matka /61 Potomek /61 BM BM ETH ETH ETH INRA SPS TGLA TGLA TGLA Sledovaný potomek máv lokusu ETH 10 alely 221 a 223, jeho otec má alely 213 a 219, matka je také heterozygot s alenami 213 a 217, to znamená, ţe ani od otce, ani od matky potomek nedostal ţádnou z uvedených alel. V lokusu ETH 225 je otec homozygot a má alely 148 a 148, matka má alely 144 a 146. Od otce tedy dostal alelu 148, ale od matky nedostal ţádnou. V dalším lokusu INRA 023 má otec alely 210 a 214,potomek má alely 202 a 208, matka je homozygot 208 a 208, předala tedy potomku alelu 208, ale od otce nedostal ţádnou z alel. V lokusu TGLA 122 je otec homozygot a má alely 149 a 149, matka má alely 149 a 163. Potomek má alely 143 a 173 a nedostal tedy alely od ţádného z rodičů. TGLA 126, zde dostal potomek jednu alelu od matky, 115 nebo 117, ale od otce jehoţ lokusy jsou 119 a 121 nedostal nic. TGLA 227 dostal opět potomek alelu od matky, ale od otce nedostal ţádnou. 30

31 Původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí oba rodiče. Otec NEB 878 Potomek /61 Matka /61 Tab. č. 5 Ověřování rodičovství potomků u býka NEB 878 Otec NEB 878 Matka /61 Potomek /61 BM BM ETH ETH ETH INRA SPS TGLA TGLA TGLA V lokusu TGLA jsou všichni jedinci (otec, matka, potomek) homozygoti, kaţdý však s odlišnými alelami, potomek dostal alelu pouze od otce. Původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí matka. Otec NBY 198 Potomek /61 31

32 Matka /61 Tab. č. 6 Ověřování rodičovství u býka NBY 198 Otec NBY 198 Matka /61 Potomek /61 BM BM ETH ETH ETH INRA SPS TGLA TGLA TGLA Otec má v lokusu ETH 225 uvedené alely 140 a 148, z nichţ nepředal potomku ani jednu alelu, pouze matka mu předala alelu 140. V lokusu TGLA 122 dostal heterozygotní potomek alelu pouze od matky, od otce nikoli. Potomek je v lokusu TGLA 127 homozygot, alelu dostal pouze od matky. Původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí otec Otec NBY 166 Potomek /70 Matka /70 32

33 Tab. č. 7 Ověřování rodičovství potomků u býka NBY 166 Otec NBY 166 Matka /70 Potomek /70 BM BM ETH ETH ETH INRA SPS TGLA TGLA TGLA V lokusech BM 21113, ETH 225 a TGLA 122 nedostal potomek od ţádného z rodičů stejnou alelu. V lokusech INRA 023, SPS 115 a TGLA 127 dostal potomek vţdy alelu pouze od matky, od otce nedostal nic, otec nesouhlasí. Původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí oba rodiče Otec NX 929 Potomek /70 Matka /70 Tab. č. 8 Ověřování rodičovství potomků u býka NX

34 Otec NX 929 Matka /70 Potomek /70 BM BM ETH ETH ETH INRA SPS TGLA TGLA TGLA V lokusu BM 1824 je potomek homozygot 188 a 188, otec má alely 178 a 190, matka je také heterozygot, má alely 180 a 182, potomek tedy od ţádného z nich alely nedostal. Otec má v lokusu BM alely 125 a 127, matka předala potomku alelu 135, potomek má alely 135 a 137, tedy od otce ţádnou nedostal. V lokusech ETH 225 a INRA 023 nedostal potomek ţádnou alelu od otce, pouze od matky. Potomek je homozygot v lokusu TGLA 122, otec s alelami 143 a 149 předal potomku alelu 149, matka nepředala ţádnou alelu. Původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí oba rodiče Vypočítané frekvence potomstva po býcích NEB 878, NBY 198, NBY 166, NBY 165, NX 929 Takto jsem prozkoumala všechny lokusy u všech býků. Pokud byl býk heterozygot, vyšly stejné alely, ale pokud byl býk v některém z lokusů homozygot, alely nesouhlasily. 34

35 Tab. č. 9 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NEB 878 BM 1824 BM ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA ,370 0,222 0,240 0,093 0, ,296 0,13 0,037 0,037 0,278 0,111 0, ,389 0,037 0,167 0,222 0, ,204 0,019 0,130 0,500 0,037 0, ,093 0,190 0,056 0,365 0, ,037 0,135 0,093 0,165 0,13 0,24 0, ,648 0,148 0,093 0,092 0, ,222 0,389 0,037 0,019 0,074 0,203 0, ,241 0,185 0,241 0,259 0, ,278 0,074 0,148 0,074 0,111 0,278 0,037 Býk NEB 878 je heterozygot 178/182 v lokusu BM 1824, pokud vyberu dvě nejvyšší frekvence, vyjdou mi po porovnání opět alely 178/182. Z toho je patrné, jakým způsobem docházelo k segregaci alel. Opakování nevyšlo u alel, které byly homozygotní,byly to: 148/148 v lokusu ETH 225, 248/248 v lokusu SPS 115 a 149/149 v lokusu TGLA

36 Tab. č. 10 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 198 BM 1824 BM ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA ,103 0,259 0,103 0,379 0, ,31 0,293 0,017 0,017 0,155 0,052 0, ,569 0,121 0,069 0,086 0, ,121 0,069 0,655 0,017 0, ,241 0,379 0,239 0, ,034 0,086 0,293 0,017 0,276 0, ,345 0,449 0,103 0,052 0,034 0, ,397 0,069 0,069 0,034 0,121 0,190 0,034 0,017 0, ,345 0,534 0,069 0, ,241 0,034 0,260 0,034 0,190 0,017 0,224 U býka NBY 198 byly všechny lokusy heterozygotní, segregace alel byla tedy dobře viditelná. Tab. č. 11 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY

37 BM 1824 BM ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA ,233 1,133 0,333 0,033 0,201 0, ,200 0,233 1,134 0,033 0,067 0,100 0, ,033 0,600 0,100 0,167 0, ,100 0,133 0,333 0,033 0,233 0, ,200 0,167 0,200 0,366 0, ,233 0,067 0,167 0,100 0,133 0,033 0, ,200 0,133 0,267 0, ,467 0,200 0,100 0,100 0,067 0,033 0, ,567 0,167 0,100 0,133 0, ,067 0,267 0,165 0,267 0,067 0,100 0,067 Býk NBY 166 měl převáţnou většinu párů(6 z 11) alel homozygotních, a to: 127/127, 117/117, 150/150, 214/214, 134/143, 91/91, segregace alel byla tedy málo viditelná. Tab. č. 12 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 165 BM ,302 0,196 0,302 0,196 37

38 BM ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA ,239 0,109 0,108 0,196 0,261 0, ,248 0,065 0,088 0,152 0,13 0, ,109 0,152 0,326 0,131 0,217 0, ,087 0,152 0,022 0,478 0, ,086 0,043 0,261 0,152 0,239 0,196 0, ,174 0,022 0,239 0,261 0,022 0, ,043 0,196 0,110 0,196 0,065 0,304 0,043 0, ,391 0,370 0,174 0,065 TGLA ,087 0,109 0,022 0,109 0,304 0,304 0,065 Protoţe byl býk ve všech lokusech heterozygot, daly se ve všech lokusech pop porovnání objevit shodné alely. Tab. č. 13 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NX 929 BM 1824 BM ,234 0,100 0,133 0,223 0, ,033 0,200 0,267 0,167 0,133 0,167 0,033 38

39 ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA ,433 0,133 0,300 0, ,200 0,199 0,467 0,067 0, ,100 0,033 0,134 0,267 0,400 0, ,167 0,200 0,167 0,033 0,233 0, ,700 0,200 0,033 0, ,500 0,233 0,134 0, ,233 0,667 0, ,267 0,167 0,300 0,033 0,233 Býk NX 929 měl pouze jeden lokus homozygotní, byla teda dobře viditelná segregace alel. Při porovnávání alel jsem nalezla dvě alely, které jsou v tabulkách pouze jednou, pro jednoho býka. Je to alela 91, nacházející se pouze u býka NBY 198 a alela 190, která je totoţná pouze pro býka NX

40 7 POUŽITÁ TERMINOLOGIE DNA (deoxyribonukleová kyselina) je nositelkou genetické informace všech organismů (s výjimkou nebuněčných organismů). DNA je pro ţivot nezbytnou látkou, která ve své struktuře kóduje a buňkám zadává jejich program a tím předurčuje vývoj a vlastnosti celého organismu. U eukaryotických organizmů (jako rostliny a ţivočichové) je DNA uloţena vţdy uvnitř buněčného jádra. Gen je základní fyzikální a funkční jednotka dědičnosti obsahující genetickou informaci. Genotyp je soubor všech genů organismu (Bryndová 2009). Alela jedna z různých forem genu nebo sekvence DNA, která můţe existovat na jednom lokusu lišící se v DNA sekvenci a ovlivňující funkčnost jednoho produktu (RNA nebo proteinu). Lokus místo v chromozomech, kde je umístěn určitý gen. Jednotlivé alely genů se nachází na shodných lokusech v homologiích chromozomech (Knoll, Vykoukalová 2009). Parentita určování rodičovství Paternita určování otcovství (Bryndová 2009). Mikrosatelity jsou krátké tandemové repetice sloţené z mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidových motivů. Vyskytují se ve všech eukaryotních geonomech. Významnou vlastností je vysoký stupeň polymorfizmu(proměnlivost určitých úseků genomu) způsobený variabilním počtem tandemových repetic (obvykle 20-30). Nejčastěji se vyskytující repeticí je u savců motiv (AC) n. 40

41 8 ZÁVĚR Přesnost identifikace jedinců, určování genotypů a ověřování parentity signalizují vysokou úroveň molekulární genetiky. Hlavním úkolem zjišťování je nesníţit plemennou hodnotu, která se odráţí i v uţitkových vlastnostech hospodářských zvířat. Nesprávně určený původ má tedy negativní dopad na ekonomiku. Jak je ale patrné z tabulek č.4 aţ č.8, i v dnešní době stále dochází k záměnám matek a otců. Ve své práci jsem porovnávala potomstvo od pěti býků (NEB 878, BM 21113, ETH 3, ETH 10,ETH 225, INRA 023, SPS 115, TGLA 122, TGLA 126 a TGLA 227 ) a pouze v populaci býka NBY 165 nedošlo k záměně rodičů. U býka NEB 615 jsem zjistila dva potomky, kteří nesouhlasili a u ostatních býků po jednom potomkovi. Vzhledem k dnes jiţ velmi vyuţívaného postupu inseminace a důkladnému značení inseminačních dávek, jsem očekávala spíše kladné výsledky, neţ jsem nalezla. Při porovnávání jsem zjistila, ţe nejvíce alel se nacházelo v lokusech TGLA 122 (alely 139, 143, 151, 153, 159, 161, 163,173, 183) a TGLA 227 (alely 81, 83, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 103) v počtu 9 alel. Nejméně alel se nacházelo v lokusu TGLA 126 v počtu 5 alel. Jsou to: 115, 117,119,121, 123. Dále jsem při porovnávání alel nalezla dvě alely, které jsou v tabulkách pouze jednou, pro jednoho býka. Je to alela 91, nacházející se pouze u býka NBY 198 a alela 190, která je totoţná pouze pro býka NX 929. Tato práce je pro mou budoucí praxi jistě přínosem, a to jak z pohledu budoucího zootechnika, tak i z pohledu kupujícího či prodávajícího chovatele. 41

42 9 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY BRYNDOVÁ, Marta. Jak geneticky určit druh dravce?. Zpravodaj Klubu sokolníků ČMMJ. 2009, 46, s ČR. Plemenářský zákon. In Zákony , 3, s DVOŘÁK, Josef, et al. Ověřování parentity u prasat, skotu a koní. [s.l.] : [s.n.], s. HRUBAN, V., MAJZLÍK, I. Obecná genetika. CZU v Praze, 2000, 1. vyd., 316 s. Informace o skotu : Holštýnské. In SCHCHS [online]. [s.l.] : [s.n.], 2006 [cit ]. Dostupné z WWW: < KNÍŢE., ŠILER R.: Genetika zvířat. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 1978, s KNOLL, Aleš; VYKOUKALOVÁ, Zuzana. Molekulární genetika zvířat Brno : [s.n.], Laboratorní protokoly vybraných metodik, s Kutěj V., Šamaj M.: Krevní skupiny [online]. FN Olomouc, Olomouc, 2006(cit ). Parentage testing and individual identifikacion using short tandem repeat loci : introduction. In Bovine genotypes. [s.l.] : [s.n.], s Dostupné na Ron M., Domochovsky R., Golik M., Seroussi E., Ezra E., Shturman C., Weller J.I.: Analysis of vaginal swabs for paternity trstiny and marker-assisted selection in cattle. Journal of Dairy Science, 2003, vol. 86, s

43 ŘEHOUT, Václav, et al. Genetika I.. České Budějovice : [s.n.], s. ŘEHOUT, Václav, et al. Genetika II. České Budějovice : [s.n.], s. SNUSTAD, D.Peter; SIMMONS, Michael J. Genetika. Brno : [s.n.], s. STEHLÍK, Libor. Brněnská genetika pro masný skot. Zpravodaj českého svazu chovatelů masného skotu. 2010, XVII, 3, s ŠUBRT, Jan; HROUZ, Jiří. Obecná zootechnika. Brno : [s.n.], s. URBAN, Tomáš, et al. Genetika(návody do cvičení). [s.l.] : [s.n.], s. WERNER, F., et al. Detection and characterization of SNPs useful for identiti control and parentage testing in major European dairy breeds. International Society for Animal Genetics. 2004, 35, s

44 SEZNAM TABULEK Tab. č. 1 Panel mikrosatelitů Tab. č. 2 Pozorované alely u plemene holštýn v celé populaci Tab. č. 3 Vypočtené frekvence pro celou populaci Tab. č.4 Ověřování rodičovství potomků u býka NEB 878 Tab. č. 5 Ověřování rodičovství potomků u býka NEB 878 Tab. č. 6 Ověřování rodičovství u býka NBY 198 Tab. č. 7 Ověřování rodičovství potomků u býka NBY 166 Tab. č. 8 Ověřování rodičovství potomků u býka NX 929 Tab. č. 9 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NEB 878 Tab. č. 10 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 198 Tab. č. 11 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 166 Tab. č. 12 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 165 Tab. č. 13 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NX

45 PŘÍLOHY Seznam příloh: Příloha č. 1 Výpis ověřovaných býků plemene holštýn Příloha č. 2 Popis býka NX 929 DUSAN Příloha č. 3 Popis býka NBY 166 DRAKE Příloha č. 4 Popis býka NBY 165 DISC54 Příloha č. 5 Popis býka NBY 198 MISTER DEAN 45

46 Příloha č. 1 Výpis ověřovaných býků plemene holštýn Regist/číslo BM 1824 BM ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA 227 O NEB P / M 47881/ P / M 47846/ P / M 57681/ P / M / P / M / P / M / P / M / P / M / P /

47 M / P / M / P / M / P / M / P 12774/ M / O NBY P / M 51664/ P / M / P / M / P / M / P / M /