Elektroforéza - I (v klasickém provedení)

Transkript

1 Elektroforéza - I (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2 Elektroforéza B.D.Hames, D.Rickwood - Gel electrophoresis of proteins, Practical approach, IRL Press, 1981 Karger B., Snyder L.R., Horvath C. - An Introduction to Separation Sciece, John Wiley New York, 1973 Z. Deyl - Separation methods, Elsevier Science Publishing B.V., 1984 J.Zýka - Nové směry v analytické chemii, svazek 1, SNTL, 1983

3 Elektromigrační metody Elektromigrační separační metody jsou založeny na rozdílné pohyblivosti nabitých částic v stejnosměrném elektrickém poli Pohyb nabitých částic závisí na velikosti náboje, velikosti a tvaru molekul, na prostředí a síle elektrického pole. Velikost náboje ovlivňuje stupeň ionizace, iontová síla a ph prostředí. Základní principy Zásadní pojem je elektroforetická pohyblivost µ nabitého analytu Je definována jako rychlost částice v při jednotkovém potenciálovém spádu E, kde E je intenzita elektrického pole (napětí/vzdálenost, [V m -1 ]): µ = v E Pohyblivost částic je ovlivňována řadou faktorů, nejvýznamnější jsou: a) Fyzikálně chemické vlastnosti samotných částic jejich celkový náboj, velikost, tvar, disociovatelnost povrchových skupin, schopnost adsorpce iontů a polárních molekul, tvorba komplexů. Většinu těchto faktorů ovlivňuje prostředí, tj. ph, použité elektrolyty, iontová síla.

4 b) Vlastnosti prostředí elektrolyty používané v elektromigračních metodách jsou zpravidla tlumivé roztoky o dané koncentraci, iontové síle, vodivosti, ph, teplotě, viskozitě a permitivitě. Pohyblivost nabitých částic je dále ovlivňována i přítomnými neelektrolyty. Roztok elektrolytu klade při průchodu proudu určitý odpor, jeho velikost závisí na druhu, koncentraci elektrolytu a na konstrukci elektroforetického zařízení. Průchodem proudu se vyvíjí Jouleovo teplo a může dojít ke změnám vlastostí systému a dělených látek. c) Vlastnosti nosiče pohyblivost iontů je obvykle menší při použití nosiče ve srovnání s volnou elektroforézou. Migraci ovlivňují další faktory, elektroendoosmóza, prostorové vlivy nosiče, adsorpce atd. Velikost elektroendoosmózy závisí na druhu nosiče, potenciálovém spádu, iontové síle elektrolytu a ph. Nosičem bývá chromatografický papír, sorbenty, gely atd. d) Vlastnosti elektrického pole síla, homogenita, stabilita, změny ph vlivem elektrolytických dějů na elektrodách a Jouleovo teplo ovlivňují rychlost migrace a ostrost dělení.

5 Elekroforéza se dělí na volnou elektroforézu a elektroforézu na nosičích Užití nosičů má ve srovnání s volnou elektroforézou tu výhodu, že umožňuje snížení negativního vlivu zahřívání systému průchodem proudu na separaci a zmenšuje rozmývání zón, ke kterému dochází vlivem difúze Podle experimentálního uspořádání lze elektroforetické metody rozdělit následujícím způsobem: Elektroforéza s pohyblivým rozhraním Zónová elektroforéza Izoelektrická fokusace Izotachoforéza

6 Elektroforéza s pohyblivým rozhraním Směs separovaných složek (smíchaná se základním elektrolytem) je rozptýlena v tak veliké části separační kolony/prostoru, že při dané délce kolony nedojde k úplné separaci složek směsi Prvá zóna obsahuje nejpohyblivější složku vzorku, pak následuje směsná zóna dvou nejrychlejších složek, atd., na konci je čistá nejpomalejší složka Hranice mezi zónami jsou hlavně určeny koncentracemi a efektivními mobilitami složek vzorku a volbou anodického a katodického pufru Hranice na obou stranách mohou být zónově elektroforické nebo izotachoforetické podle elektroforetické mobility anodického a katodického pufru a složek vzorku Metoda je užívána jen omezeně, např. pro testování čistoty substancí Hranice zón jsou detekovány fotometrickým a vodivostním detektorem Dělení probíhá většinou v úzké trubici

7

8 Zónová elektroforéza Jednotlivé látky vzorku jednorázově nanesené do určitého místa separačního média (např. kolony) putují po vložení elektrického pole na systém podle své efektivní pohyblivosti různou rychlostí k příslušné elektrodě, současně se dělí kationty i anionty Látky vzorku se rozdělují a vytvářejí v základním elektrolytu samostatné zóny Během separace šířka zón roste a maximální koncentrace látek v nich klesá Dvojice látek o velmi blízké efektivní pohyblivosti se plně nerozdělí ani po velmi dlouhé době Jelikož je nutno zóny stabilizovat, používají se často nosiče

9 1. Papírová elektroforéza Jedna z prvních elektromigračních technik, první práce v roce 1950 Není ideální pro separace bílkovin a nukleových kyselin a dalších velkých molekul, spíše se užívá pro dělení nízkomolekulárních látek Dnes na ústupu ve srovnání s dalšími technikami Přístroje jsou konstruovány pro nízké nebo vysoké napětí, s horizontálním nebo vertikálním uspořádáním

10 Přístroje s nízkým napětím 1. Horizontální uspořádání Dvě elektrody v elektrolytu, odděleny diafragmou od separačního prostoru Systém je uzavřen pro zamezení odpařování pufrů Pruh papíru je horizontálně umístěn mezi skleněnými nebo nylonovými tyčemi, konce papíru jsou stejnoměrně ponořeny do elektrolytu, který je v obou nádobách ve stejné výšce k potlačení sifonového efektu

11 2. Vertikální uspořádání Papír je zformován do tvaru inverzního písmene V Podpůrná konstrukce je zhotovena ze skla nebo umělé hmoty odolné k pufrům Zařízení je uzavřeno k omezení odpařování

12 V obou uspořádáních: Potenciálový gradient je menší než 20 V/cm Není třeba dodatečné chlazení Elektrody obvykle platinové, případně Ag, grafit, Pd atd., podle pracovního elektrolytu Vzorek je aplikován ve formě skvrny nebo proužku Po elektroforéze je papír vyjmut, vysušen při 100 C v sušárně

13 Přístroje s vysokým napětím Potenciálový gradient 20 až 200 V/cm Výhody: Krátké doby analýz Lepší rozlišení Řada separací je nedosažitelná při nízkém napětí Nezbytné je intenzivní chlazení systému, používají se dva systémy chlazení

14 a) První systém chlazení: Proužek filtračního papíru je ponořen do nemísitelné nevodivé kapaliny (CCl 4, chlorbenzen, heptan, apod.), která je chlazena chladící smyčkou b) Druhý systém chlazení: Filtrační papír je vložen mezi dvě chlazené kovové (hliníkové) desky Chlazení je prováděno vodou Filtrační papír je izolován od chladících desek polyethylenovými destičkami

15 Dvourozměrné separace Technika má několik modifikací: 1. Dvourozměrná elektroforéza ve dvou po sobě následujících krocích ve vzájemně kolmých směrech 2. Elektroforéza v jednom směru kombinovaná s následnou chromatografií v kolmém směru 3. Separace v jednom kroku za současného působení dvou sil vzájemně kolmých 1. Dvourozměrná elektroforéza by neposkytovala lepší rozlišení pokud by nebyla provedena po prvním kroku jistá chemická reakce měnící náboj určitých složek směsi. Látky modifikované reakcí pak nejsou po následujícím druhém kroku (druhé elektroforéze) na diagonále. Příklad Peptidy-redukce disulfidických vazeb, enzymatická změna některých aminokyselin 2. Elektroforéza v kombinaci s chromatografií v kolmém směru byla užita pro fingerprinting proteinů, zejména pro odlišení dvou podobných proteinů

16

17 3. Např. Kontinuální elektroforéza Curtain electrophoresis Filtrační papír je umístěn vertikálně a shora je přiváděn elektrolyt Kolmo na směr toku je vloženo napětí Vzorek je kontinuálně vnášen ve formě malé skvrny na horní část papíru Složky jsou separovány kontinuálně, vytvářejí angulární profil Metoda je dnes častěji prováděna na základě vytvoření filmu pufru bez nosiče (papíru) mezi paralelními deskami, tok je stabilizován viskozitou pufru. Použití je především spojeno s dělením buněk, mitochondrií, mikrozomů a dalších biologicky významných partikulárních částic Metoda má preparativní význam

18

19 2. Elektroforéza na membránách na bázi celulózy, acetátu celulózy a nitrocelulózy Výhodou těchto nosičů je nižší adsorpce analytů, a tím menší chvostování ve srovnání s elektroforézou na filtračních papírech Přístrojové uspořádání je obdobné jako pro papírovou elektroforézu 3. Tenkovrstvá elektroforéza Granulovaný materiál je nanesen na desku, kde vytvoří uniforně silnou vrstvu Používá se prášková celulóza, granulovaný škrob, alumina, silikagel, polyvinyl chlorid a další syntetické polymery, skleněná vlákna atd. Metoda vhodná pro preparativní dělení, po elektroforéze se obarví úzký pruh a pak se blok rozdělí a jednotlivé složky získají např. filtrací

20 4. Elektroforéza na gelech 4.1 Elektroforéza na škrobovém gelu První užití elektroforetického děje současně s uplatněním sítového efektu V současnosti většinou nahrazena elektroforézou na polyakrylamidových gelech 4.2 Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu Tyto gely nejen omezují difúzi, ale mohou se podílet na separaci interakcí s analyty Na polyakrylamidové gely lze pohlížet jako na porézní média, ve kterých je velikost pórů srovnatelná s velikostmi dělených látek (často proteinů a jiných makromolekul) Dělení je pak uplatněním sítového efektu závislé nejen na nábojové hustotě analytu (tj. poměru náboj/hmotnost), ale i na velikosti molekul Tj. dva proteiny odlišné relativní molekulové hmotnosti se stejnou nábojovou hustotou budou pravděpodobně nepříliš dobře odděleny papírovou elektroforézou, ale mohou být dobře děleny na polyakrylamidovém gelu díky sítovému efektu, jenž zpomaluje pohyb většího proteinu vzhledem k proteinu menšímu

21 Polyakrylamidový gel je chemicky inertní, stabilní v širokém rozmezí ph (3 až 10), teploty a iontové síly Velikost pórů gelu je nastavitelná v širokém rozmezí (na rozdíl od škrobových gelů) Hustota a stupeň zesítění jsou podstatné pro výsledné vlastnosti Chemická struktura: gel se připravuje polymerací akrylamidu v přítomnosti bifunkčního síťovadla N,N -methylen bisakrylamidu. Jako polymerační iniciátor se uplatňuje persíran ammoný nebo riboflavin (iniciace světlem), pro katalýzu polymerace se užívá N,N,N,N -tetramethylethylendiamin Efektivní velikost pórů: nejčastěji používané koncentrace jsou v rozmezí 5-20% (limitně 3-30%) akrylamidu s 3-5% síťovadla. Dělit lze peptidy a bílkoviny v rozmezí od Da do ~ Da

22

23 Formát gelu: Tyčinka (rod) nebo deska (slab) Tyčinky: rozměry ~ x 5 mm Desky: rozměry ~ mm délka, mm šířka, 1-3 mm tloušťka Výhody tyčinkového formátu ve srovnání s deskovým formátem: Větší kapacita gelu Lze snadněji testovat mnoho různých separačních podmínek najednou, např. hledání nejvhodnějšího ph atd. Dvoudimenzionální dělení, první dimenze na tyčince Výhody deskového formátu ve srovnání s tyčinkovým formátem: Více vzorků (~ 25) lze dělit najednou vedle sebe, příprava gelu je jednodušší Společně se vzorky je možno separovat i standardy za totožných podmínek Teplo je snadněji odváděno Obdélníkový tvar gelu umožňuje snadné denzitometrické vyhodnocování

24 Disociující a nedisociující systémy pufrů Většina studií užívající zónovou elektroforézu bílkovin na polyakrylamidových gelech užívá pufry vedoucí k disociaci všech proteinů na jednotlivé podjednotky Nejčastěji je používán detergent SDS (dodecylsulfát sodný) Vzorek je denaturován teplotou 100 C v přítomnosti SDS a thiolového reagentu k redukci disulfidických můstků Při uvedených podmínkách většina polypeptidů váže SDS v konstantném hmotnostním poměru 1,4 g na 1 g polypeptidu Vnitřní náboj polypeptidu je nepodstatný ve srovnání s negativním nábojem SDS navázaným na polypeptid SDS-polypeptidové komplexy mají stejnou nábojovou hustotu a postupují v polyakrylamidovém gelu vhodné velikosti pórů výhradně podle molekulových hmotností SDS-PAGE Zónová elektroforéza nativních proteinů s použitím nedisociujících purfů je vhodná tehdy, když je cílem zachovat interakce podjednotek, přirozenou konformaci a biologickou aktivitu

25 Kontinuální a diskontinuální systém pufrů Kontinuální pufry Zonová elektroforéza za užití stejného pufru ve vzorku, elektrodovém prostoru a v gelu (někdy v různých koncentracích) při stejném ph je označována jako elektroforéza s kontinuálním pufrem Vzorek je dávkován přímo na gel, ve kterém dochází k dělení Póry gelu jsou vhodné velikosti, aby došlo k dělení podle velikosti Diskontinuální pufry Zonová elektroforéza za užití různých iontů a různého ph v elektrodových pufrech a v gelech se nazývá elektroforéza s diskontinuálním systémem pufrů Vzorek je nanášen do stacking zaostřujícího gelu zpolymerovaného ve vrchní části nízkoporézního dělícího gelu Nejpodstatnější výhoda diskontinuálního uspořádání je možnost dávkovat velké objemy relativně zředěných bílkovin při zachování vysokého rozlišení Důvodem tohoto faktu je skutečnost, že při postupu bílkovin zaostřovacím gelem vytvoří bílkoviny velmi úzké zóny na začátku dělicího gelu

26

27 Objasnění zaostření zóny vzorku Ornstein a Davis Slabá kyselina, glycin, je za ph blízkého pk a hodnotě jen částečně disociována. Jen část molekul bude záporně nabita. Pokud x vyjadřuje frakci disociovaných, záporně nabitých molekul, pak efektivní pohyblivost částečně nabité látky je rovna součinu µ*x, kde µ je pohyblivost nabité částice. Rychlost migrace částečně nabité látky je pak rovna součinu E*µ*x, kde E je intenzita elektrického pole. Iont s nižší pohyblivostí se tedy může pohybovat stejnou rychlostí jako iont s vyšší pohyblivostí, za podmínky, že součiny E*µ*x jsou totožné. V Ornstein a Davis systému obsahuje vzorek a zaostřovací gel Tris- HCl pufr, zatímco horní elektrodový prostor obsahuje Tris-glycin pufr. Při ph vzorku a zaostřovacího gelu ph=6,7 je glycin málo disociován a efektivní pohyblivost je malá. Chloridové ionty mají podstatně větší pohyblivost při tomto ph a proteiny mají pohyblivost mezi pohyblivostmi glycinu a Cl - za daných podmínek. V okamžiku, kdy je vloženo napětí, migrují chloridové ionty od glycinu nechávaje za sebou zónu s nízkou vodivostí. Protože je vodivost nepřímo úměrná intenzitě elektrického pole, získá tato zadní zóna větší gradient napětí, který urychluje glycin a ten proto dostihuje chloridy. Je dosaženo stabilního stavu, kdy tyto nabité látky vytváří velmi úzké rozhraní a pohybují se stejnou rychlostí. Jak se toto rozhraní pohybuje skrz vzorek a zaostřující gel, gradient nízkého napětí postupuje před pohyblivým rozhraním a gradient vysokého napětí postupuje za pohyblivým rozhraním.

28 Každá bílkovina před pohyblivým rozhraním v oblasti gradientu nízkého napětí je předbíhána chloridový ionty, protože chloridové ionty mají vyšší pohyblivost než bílkoviny. Za pohyblivým rozhraním, v oblasti vysokého gradientu napětí mají bílkoviny vyšší pohyblivost než glycin, a proto migrují rychleji. V důsledku těchto jevů se bílkoviny koncentrují v úzké zóně silné několik mikrometrů v pořadí klesající pohyblivosti. Poslední bílkovina je následována glycinem. Koncentrace proteinu na pohyblivém rozhraní závisí pouze na koncentraci Tris-HCl pufru ve vzorku a zaostřovacím gelu. Síla vrstvy vzorku po zakoncentrování je závislá na celkovém množství proteinu aplikovanéno na gel. Zaostřovací gel je tvořen velkými póry a nedochází na něm k sítovému efektu. Jakmile pohyblivé rozhraní dosáhne rozhraní mezi zaostřovacím gelem a dělícím gelem, hodnota ph značně stoupne a glycin je výrazně disociován. Tím dojde k nárůstu efektivní pohyblivosti glycinu, glycin předběhne bílkoviny a začne migrovat těsně za chloridovými ionty. Současně velikost pórů dělicího gelu významně klesne a začne docházet k zpomalování proteinů sítovým efektem. Oba efekty vedou k vytvoření samostatných zón proteinů, které postupují na základě vnitřního náboje a molekulové hmotnosti. Vzhledem k dosahování vysokého rozlišení v případě diskontinuálních pufrů, SDS-diskontinuální systém je obvykle užíván pro dělení směsí proteinů za disociujících podmínek.

29

30 Volba ph Polyakrylamidový gel je stabilní v rozmezí ph 3 až 10 Pro SDS-PAGE SDS-polypeptidových komplexů platí, že jsou negativně nabity v širokém rozmezí ph. Hodnota ph kontinuálního SDS-fosfátového pufru proto není kritická. Pro diskontinuální SDS-fosfátový pufr je ph důležité jen k vytvoření zaostřené zóny vzorku (viz dříve). Pokud jsou děleny nativní proteiny v nedisociujících pufrech, je hodnota ph podstatná. ph ovlivňuje náboj, stabilitu a aktivitu proteinu. Musí být tedy voleno ph, které splňuje požadavky na stabilitu a aktivitu proteinu. Ve vymezené oblasti ph se dále volí kompromis mezi dvěma protichůdnými kriterii. Čím dále je ph od izoelektrického bodu (pi), tím větší je náboj proteinu a tím kratší doba elektroforézy a menší rozmytí zón, ale na druhou stranu, čím je ph blíže pi, tím je větší předpoklad zlepšeného dělení proteinů.

31 Volba koncentrace gelu Koncentrace gelu hraje velmi podstatnou úlohu pro dělení Nevhodná koncentrace gelu může vést k úplné exkluzi proteinů (nemohou vstoupit do hustého gelu) nebo naopak k migraci proteinů s čelem (neuplatní se sítový efekt). Při hledání vhodné koncentrace gelu se prakticky postupuje dvěma alternativními způsoby: 1. Analýza při 7,5% akrylamidu, pak gely v rozpětí 5% - 15%. 2. Pro SDS-PAGE je doporučováno užít vzrůstající koncentrační gradient akrylamidu ve směru migrace proteinů. Gradient má především dvě výhody: Dělí proteiny s širším rozmezím molekulových hmotností Gradient velikosti pórů zaostřuje získané zóny Při hledání optimálních podmínek pro dělení dvou proteinů se používají tzv. Fergusonovy závislosti Závislosti log R f versus %T, kde je R f relativní mobilita a %T je koncentrace gelu (celková procenta monomeru, tzn. gramy akrylamidu a bisakrylamidu/100 ml) migrační vzdálenost proteinu R f = migrační vzdálenost barviva (barvivo - bromfenolová modř)

32

33 Každá Fergusonova závislost je charakterizována sklonem K R a úsekem Y 0 K R Fergusonovy závislosti je měřítkem retardace proteinu gelem, K R je retardační koeficient, který má vztah k velikosti molekuly. Úsek Y 0 je měřítkem mobility proteinu při volné elektroforéze. Podle Rodbarda se rozlišují čtyři skupiny separačních problémů v souvislosti s Fergusonovými závislostmi: Případ A Proteiny mají identickou nábojovou hustotu a vykazují identickou mobilitu ve volném roztoku. V polyakrylamidovém gelu se pohybují výhradně podle velikosti. Platí pro většinu SDSdenaturovaných proteinů. Případ B Protein s větší mobilitou ve volném roztoku má zároveň menší molekulovou hmotnost. Efekty jsou synergické. Zvýšení separace je dosaženo zvýšením %T. Případ C Větší protein má větší mobilitu ve volném roztoku. Efekty jsou antagonistické. Toto chování bývá pozorováno u nedisociačních systémů. Případ D Proteiny mají stejnou velikost ale odlišnou mobilitu ve volném roztoku. Změna koncentrace akrylamidového gelu nemá vliv na relativní rozdělení proteinů. Pro dělení je vhodnější elektrofokusace nebo izotachoforéza.

34 Určení molekulové hmotnosti Nativní proteiny Dělení probíhá současně na základě nábojové hustoty a velikosti molekul Ve Fergusovných závislostech je vliv náboje eliminován tak, že K R je měřítkem pouze velikosti molekuly Mezi K R a molekulovou hmotností existuje lineární vztah Použití série proteinů o známé molekulové hmotnosti vede ke zjištění příslušných hodnot K R a ke konstrukci závislosti K R na molekulové hmotnosti V případě nativních proteinů je problémem ta skutečnost, že uvedená jednoduchá závislost platí pouze pokud jsou standardy užité ke kalibraci podobného tvaru, přibližně stejné hydratace a parciálního specifického objemu Denaturované proteiny Elektroforéza v přítomnosti SDS po redukci proteinů (2-merkaptoethanol) je v současnosti preferovanou metodou Detergent SDS eliminuje konformační a nábojové rozdíly mezi proteiny a snižuje vliv hydratace Proteiny migrují jen podle molekulových hmotností

35 Vztah logaritmu molekulových hmotností proteinů na jejich vzdálenosti migrace nebo R f je lineární Molekulová hmotnost daného proteinu se získá pomocí kalibrační křivky Linearita je platná jen v jistém rozmezí molekulových hmotností Lineární závislostí s užitím SDS-diskontinuálního systému pufrů platí v následujících mezích: 15% akrylamid, molekulová hmotnost % akrylamid, molekulová hmotnost % akrylamid, molekulová hmotnost Mnohé glykoproteiny vykazují anomální chování, pravděpodobně se SDS váže jen k proteinové části molekuly, získají se zkreslené-vyšší molekulové hmotnosti Ovšem molekulové hmotnosti obdržené SDS-PAGE metodou poskytují molekulové hmotnosti podjednotek proteinu a ne nativního proteinu, pokud je oligomerní

36

37

38 Koncentračně gradientové gely Polyakrylamidové gely s rostoucí koncentrací akrylamidu, tzn. klesající velikostí porů Použití velmi často jak pro analýzu směsí proteinů tak pro stanovení molekulové hmotnosti metodou SDS-PAGE Gradienty jsou lineární nebo konkávní, limit je ~ 3-30% akrylamidu Při gradientovém dělení protein postupuje až do místa, kde velikost póru zabrání dalšímu pohybu, poloha pásu je pak dále téměř nezávislá na čase, migrace tedy neustane zcela, ale je velmi omezena Možnost měřit molekulové hmotnosti v širokém rozmezí Velmi ostré zóny Nedisociující pufry jsou používány na gradientových gelech při dělení nativních proteinů v menší míře Pro lineárně koncentrační gradienty platí lineární vztah mezi logaritmem molekulových hmotností a logaritmem koncentrací polyakylamidu %T, případně R f

39 Pro gradientové gely existují rozsahy molekulových hmotností, pro které platí lineární závislosti mezi logaritmem molekulových hmotností a log %T: 7-25 %T(C Bis =1%), rel. mol. hm. ~ %T(C Bis =2.6%), rel. mol. hm. ~ %T(C Bis =8.4%), rel. mol. hm. ~ Všechny gradienty mají výrazně širší rozsah molekulových hmotností ve srovnání s negradientovými systémy Glykoproteiny nevykazují žádné anomálie při použití SDS- PAGE s gradientovým gelem

40

41

42

43

44

45

46 Nehledě na výhody gradentového gelu, je třeba zdůraznit, že pokud je třeba dělit dva proteiny s podobnou molekulovou hmotností, dosahuje se lepšího rozlišení na uniformních (negradientových) gelech s optimální porozitou. 4.3 Elektroforéza na agarózovém gelu Póry agarózového gelu jsou velké, většina proteinů se dělí na základě nábojové hustoty, sítový efekt se neuplatňuje Rozlišení je většinou nižší než na polyakrylamidovém gelu Agarózové gely se používají především pro dělení velkých molekul a komplexů, které se nedají separovat na polyakryamidových gelech, tzn. například enzymových komplexů, virů, buněčných komponent, vybraných nukleových kyselin Agarózové gely mají využití v imunoelektroforéze, kde je spojena zónová elektroforéza s imunologickou detekcí a kvantifikací

47 4.4 Elektroforéza na kompozitním gelu agaróza-polyakrylamid Užití polyakrylamidových gelů je omezeno velikostí molekul, horní limit je kolem 10 6 rel. molekulové hmotnosti Polyakrylamidové gely s celkovou koncentrací monomerů pod 2.2% nemohou být vůbec připraveny (nedojde ke gelaci polymeru) Gely do 3% jsou obtížně použitelné a téměř viskózní Přídavek agarózy 0.5% zvyšuje mechanickou stabilitu při dělení např. ribozómů, polyribozómů a vybraných virů Kompozitní gely mohou být kalibrovány vhodnými standardy a užity pro určování molekulových hmotností velmi velkých molekul

48 Detekční techniky Detekce s využitím UV záření Monomerní akrylamid má UV absorpční pík na 280 nm, který se snižuje polymerací Polyakrylamidový gel má relativně nízký absorpční koeficient při 270 nm, v gelu tedy nesmí být přítomen monomer Nukleové kyseliny mají vysoké absorpční koeficienty, které nezávisí na složení bází, mohou být snadno detekovány jak v agaru, tak v polyakrylamidovém gelu při 260 nm Proteiny mají při 280 nm podstatně nižší absorpční koeficienty než nukleové kyseliny při 260 nm, kromě toho je absorpční koeficient pro každý protein závislý na jeho složení (na absorpčních koeficientech aminokyselin) Ke skenování gelů se používají speciální densitometry

49 Detekce s využitím fluorescence Lze použít dva přístupy: 1. Separované látky jsou označeny fluorescenční značkou 2. UV absorbující látka je vizualizována jako tmavý pás v matrici, ke které byl přidán fluorescenční chromofor, tj. fluorescenční zhášení Polyakrylamidový gel je sám o sobě fluorescenční materiál, fluorescence se objevuje při excitaci pomocí vlnové délky 280 nm nebo 340 nm, tyto vlnové délky jsou velmi blízké excitačním vlnovým délkám nativních a dansyl chloridem značených proteinů Na druhou stanu polyakrylamidový gel vykazuje největší fluorescenční emisi při 340 nm a nm, to jsou oblasti dostatečně mimo emisní maxima nativních i dansyl chloridem značených proteinů Kromě toho byly vyvinuty postupy přípravy polyakrylamidových gelů vedoucí k nefluoreskujícím gelům

50 Detekce barvením Barvení makromolekul vhodným barvivem je nejpoužívanější metoda detekce v gelové elektroforéze Barvivo musí být pevně vázáno na separovanou makromolekulu, a přitom slabě interagovat se stabilizačním médiem Barvivo může být selektivní, tj. obarvuje pouze danou skupinu makromolekul, nebo může obarvovat několik skupin látek současně Postup detekce je relativně jednoduchý: elektroforeogram je ponořen do barvící látky na jistou dobu, pak je nadbytek barviva nenavázaného na separované látky vymyt. Protože difúze se začne projevovat ihned po proběhnutí elektroforézy, doporučuje se buď vysrážet proteiny na gelu nebo gel vysušit. Lze užít i přídavku fixujícího činidla do barvící lázně. Odbarvování, vymývání nadbytečného, nenavázaného barviva je obvykle nejdéle trvající krok Nejužívanější barviva: Coomassie Brilliant Blue, Amido Black Barvení stříbrem je metoda ultrasenzitivní

51 Detekce měřením radioaktivity Pokud jsou separované látky radioaktivně značeny, lze využít k jejich detekci registrování aktivity Autoradiografie: Suchý gel, acetát celulózy, filtrační papír je překryt filmem citlivým na záření, po jisté době je vyvolán a oblasti radioaktivního materiálu jsou vizualizovány Kromě autoradiografie jsou užívány také citlivější postupy (100 až x), založené na pozičně citlivých počítačích při detekci např. 32 P, 14 C, Dále se užívají kapalinové scintilační počítače - především pro měření měkkých beta zářičů 3 H, 14 C, 35 S