Materiály pro tkáňové inženýrství

Transkript

1 Materiály pro tkáňové inženýrství (Materiály II) Katedra netkaných textilií Fakulta textilní Technická univerzita v Liberci Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky

2 Nanokompozitní materiály Nanokompozity jsou materiály složené ze dvou nebo více různých složek, z nich alespoň jedna se v materiálu vyskytuje ve formě částic o velikostech jednotek až desítek nanometrů. Většinou se jedná o nanočástice aktivní látky (tj. látky se zajímavými magnetickými, elektrickými a jinými vlastnostmi) rovnoměrně rozptýlené v inertní matrici. V našem případě se budeme bavit o nano/mikro částicích inkorporovaných do/mezi nanovlákna. Nano/mikro částice je možné do/mezi vlákna inkorporovat následujícími způsoby 1) Koaxiálním zvlákňováním jako materiál jádra 2) Zvlákňování z polymerní disperze 3) Elektrickým naprašováním 4) Elektrickým sprejováním (nanokapsle, enkapsulace) 5) (Ne)kovalentní vázání na povrch vrstvy

3 Koaxiální zvlákňování Koaxiální zvlákňování je metoda výroby nanovláken typu jádro/plášť. Tato metoda umožňuje zvlákňování materiálů, které jsou běžným způsobem nezvláknitelné. Oba materiály musí být vzájemně nemísitelné. Z toho důvodu je důležité vybrat vhodný plášťový materiál. Výhodou této metody je větší množství materiálu uvnitř vláken oproti zvlákňování z disperze. Nevýhodou je poměrně složitý proces dávkování obou látek. Použití Cílená doprava léčiv s řízeným uvolňováním Inteligentní scaffoldy obsahující podpůrné látky (růstové faktory, lipozomy a pod)

4 Jehlové zvlákňování 10% PCL - plášť, 9% PVA- jádro

5 Zvlákňování z polymerní disperze Druhou možností výroby nanokompozitních materiálů je inkorporace nano/mikro částic do polymerního roztoku a následné elektrostatické zvlákňování. Výhodou této metody je možnost inkorporace částic desítek/jednotek nanometrů do nanovláken. Je možné inkorporovat jak prokariotní tak eukariotní buněčné kultury. Nevýhodou této metody je omezené množství materiálu (1-3%), které lze dispergovat, neboť se vzrůstajícím množstvím částic roste viskozita, která zabraňuje následnému zvlákňování. Další nevýhodou je, že částice mají snahu aglomerovat. Je proto nutná dostatečná dispergace částic například metodou ultrazvuku.

6 Koloidní částice polyanilínu (Vesmír 2011) Kvasinka inkorporovaná v nanovláknu PVA Nanoželezo inkorporované nanovlákenech z polyuretanu

7 Nanokompozitni materialy, hydroxylapatit, aktivni uhli, antibakterialni uprava, 3D vrstvy Nanovlákenné materiály s inkorporovanými částicemi v mezivlákenném prostoru Částice nejsou uvnitř vláken, ale v prostoru mezi vlákny. To umožňuje značné zvýšení množství inkorporovaného materiálu. Částice nejsou překryté vrstvou polymeru což může být výhodou i nevýhodou. Omezení je ve velikosti inkorporovaných částic

8

9 - Electrospraying Electrospraying is an old method for production of nano/micro droplets Depending on used polymer and solvent, it is possible to create submicron droplets with narrow distribution. Possibility of incorporation of liquit agents using coaxial electrospraying. Several parameters are responsible for production of small droplets with narrow distribution of its sizes.

10 Polyvinylpyrrolidone (PVP) PVP is water soluble, biocompatible and biodegradable polymer practically used in pharmaceutical industry. Ethanol or other polar solvents can be used as well for elecrtrospraying. Ethanol has low surface tension and low molar enthalpy of vaporization comparing to the water. It is not toxic and environmentally friendly solvent.

11 Electrospraying (PVP) Ethylalkohol- částice Ethylalkohol- vlákna Průměr částic resp. vláken [nm] Koncentrace [hm. %]

12 PVP with different molecular weights 40 ths m.w. 1% 3% 5% 360 ths m.w. 1% 3% 5% 1300 ths m.w. 1% 3% 5%

13 Inkorporaion of FITC-Dextran into PVP capsules

14 Combination of spraying and spinning

15 Polyvinylalcohol (PVA) Another polymer which can be used for drug delivery systems is polyvinyl alcohol. PVA is simle water soluble biocompatible and biodegradable polymer. It can be easily chemically modified due to its OH groups. Problem for PVA is its difficult solubility in alcohols. Maximally about 30 40% of ethanol can be added to water. More ethanol cause coagulation of PVA. Some other solvents like DMSO, DMAC or DMF can be used, But it is not very good choice for medical applications To find a good solvent for PVA is a key for future applications

16 DRAWING POSTUP: A. Nanesení kapky polymerního roztoku na podkladový materiál Pohyb mikropipety, jehly nebo drátku směrem k okraji kapky B. Kontakt mikropipety s povrchem kapky polymeru C. Tažení vlákna z kapky polymeru určitou rychlostí, v závislosti na typu použitého polymeru - po nanesení kapky na podklad dochází k pomalému odpařování rozpouštědla a po několika minutách se kontaktní linie kapky stává více koncentrovaná - bez předchozího vypaření se kapalinový tok většinou rozpadá - výsledný průměr vlákna velmi závisí na přesném složení materiálu, rychlosti dloužení a rychlosti vypařování (případně chlazení)

17 Interakce buněk s polymery Adheze a rozprostření buněk Migrace buněk důležité pro regeneraci tkáně Tvorba agregátů mezibuněčné interakce Specifické funkce buněk např. tvorba extracelulární matrix (chondrocyty, osteoblasty, fibroblasty)

18 Rapid prototyping - 3D tisk Rapid prototyping neboli rychlá výroba prototypů je technika vztahující se ke skupině technologí, které používají počítačem podporovaný design (CAD systémy) k vytvoření trojrozměrných objektů. Prototyp neboli model je navržen pomocí počítače, dále jsou data převedena to tiskárny pro trojrozměrný tisk, která tiskne navržený model. Toto je výhodné, pokud je navrhován a vytvářen tvarově komplikovaný objekt. Největší výhodou je značná úspora času a finančních prostředků potřebných ke komplexnímu vývoji nového typu scaffoldu. 18

19 Netextilní výroba scaffoldů Rapid prototyping - 3D tisk Rychlá výroba prototypů + CAD počítačem podporovaný design. Model scaffoldu navržen počítačem a následně využita 3D tiskárna pro vytvoření vlastního scaffoldu místo inkoustu polymerní roztok nebo tavenina. 19

20 3D-Bioprinting 0DhBLEhdzk Once a tissue design is established, the first step is to develop the bioprocess protocols required to generate the multi-cellular building blocks also called bio-ink from the cells that will be used to build the target tissue. The bio-ink building blocks are then dispensed from a bioprinter, using a layer-by-layer approach that is scaled for the target output. Bio-inert hydrogel components may be utilized as supports, as tissues are built up vertically to achieve three-dimensionality, or as fillers to create channels or void spaces within tissues to mimic features of native tissue. The bioprinting process can be tailored to produce tissues in a variety of formats, from micro-scale tissues contained in standard multi-well tissue culture plates, to larger structures suitable for placement onto bioreactors for biomechanical conditioning prior to use.

21 Hydrogel Hydrogely jsou zesíťované (stabilizované vůči rozpuštění ve vodě) hydrofilní polymery, které reprezentují velmi důležitou skupinu biomateriálů pro biotechnologické a medicínské použití. Hydrogely bobtnají díky své hydrofilitě při kontaktu s vodou, kterou absorbují ve velkém množství. Nedojde však k jejich rozkladu či rozpuštění díky zesíťování dané struktury (Nguyen 2002). To jim dává vlastnosti podobné měkkým tkáním. Ačkoliv jsou hydrogely zdánlivě neporézní materiály, díky pronikání vody do daného polymerního materiálu mohou do struktury hydrogelu proniknout i buňky a další důležité látky pro tvorbu konečného implantátu. Polymery, které přirozeně tvoří hydrogely jsou například algináty, modifikovaný polyethylen oxid, kyselina hyaluronová, fibrin atd. 21

22 Netextilní výroba scaffoldů Výroba hydrogelů Alginátové hydrogely různých tvarů.

23 Hydrogely Vznik makromolekulárních látek: 1)Postupnými reakcemi nízkomolekulárních látek (polyadice, polykondenzace) 2)Polymerační řetězová reakce, síťovací polymerace 3)Spojování reaktivních konců nízkomolekulárních polymerů (10 3 g/mol) 4)Zavedením příčných vazeb do vysokomolekulárních polymerů Síťování polymerů: fyzikální nebo chemické Stupeň zesíťování nám určuje počet zesíťovaných míst na primární hmotnostně průměrné makromolekule. Relativní míru stupně zesíťování nám udává síťovací index: γ = n M w Kde n je látkové množství zesíťovaných jednotek a M w střední molární hmotnost.

24 Hydrogely -V první fázi vzrůstají rozměry molekul a polydisperzita systému. - Při určitém stupni reakce dospěje systém do bodu gelace, ve kterém <M w > vzroste nade všechny meze a v systému se objeví první stopy nekonečné struktury: gelu. - Po překročení bodu gelace se systém skládá ze dvou částí: nekonečné struktury, gelu a z molekul konečné velikosti solu. Obě části jsou od sebe oddělitelné extrakcí. Gel je nerozpustný v rozpouštědle, pouze bobtná. -V dalším průběhu reakce obsah solu klesá a jeho molární hmotnost i polydisperzita se zmenšují. -V gelu vznikají tzv. elasticky aktivní řetězce sítě, které při deformaci nesou napětí a určují pružnost gelu a jeho rovnovážný stupeň nabobtnání.

25 Bod gelace je charakterizován vznikem nekonečně velké makromolekuly <M w >. Schema struktury vzniklé síťováním mono-disperzního polymeru v předgelačním stádiu. První stopy gelu se objeví tehdy, když alespoň jeden útvar v systému dosáhne nekonečných (makroskopických) rozměrů. Systém je v bodě gelace tehdy, existuje-li můstek od molekuly A k B a od ní cesta přes další příčnou vazbu k další primární makromolekule a tak dále až do nekonečna. Pravděpodobnost že daná jednotka je zesíťovaná určuje stupeň zesíťování.

26 Flory definoval bod gelace jako konverzi funkčních skupin (p), při které koeficient větvení dosáhne kritické hodnoty. Koeficient větvení α uvažoval jako pravděpodobnost, že se funkční skupina na jedné větvící jednotce spojí s funkční skupinou na jiné větvící jednotce prostřednictvím lineárního řetězce libovolné délky. kde r je stechiometrický poměr reagujících funkčních skupin, β je poměr počtu funkčních skupin v přítomných molekulách větvícího monomeru a celkového počtu stejného typu funkčních skupin ve všech molekulách na počátku reakce. 26

27 Hydrogely Po překročení bodu gelace se systém rozdělí na sol/gel. Hmotnostní zlomek zesíťovaných jednotek v solu je obecně menší než v gelu. Těsně za bodem gelace je koncentrace zesíťovaných jednotek v gelu právě dvakrát větší než v solu či celém systému. V gelu se tedy příčné vazby tvoří přednostně. Teprve při velkém stupni zesíťování, kdy už je obsah solu malý se počet zesíťovaných jednotek solu blíží nule. Polymerní gel vzniká samovolným bobtnáním polymerní sítě ve vhodném rozpouštědle. V případě, že rozpouštědlem je voda, vzniká polymerní hydrogel. Míšení polymerních řetězců s molekulami rozpouštědla musí být energeticky výhodné. Volná energie bobtnajícího systému klesá až dosáhne svého minima, které odpovídá rovnovážnému stupni nabobtnání V případě, že se polymerní síť určena k přípravě hydrogelu skládá ze složek lišící se značně svou afinitou k vodě (hydrofilicitou), zachování topologie sítě během jejího bobtnání ve vodě může vést k fázové separaci složek v měřítku nanometrů tj. tvorbě nanofázově separovaných hydrogelů.

28 Technologie používané v tkáňovém inženýrství

29 Aplikace Alternativa k transplantacím 1. Vytvoření funkční tkáně mimo tělo pro pozdější implantaci-náhrada poraněné tkáně, např. kožní kryty pro léčbu popálenin 2. Implantace buněčného substrátu, který vyvolá regeneraci tkáně v organismu (využití růstových faktorů), např. podpora regenerace kostní tkáně 3. Vytvoření funkční tkáně za využití kmenových buněk, např. kosti, svalstvo, chrupavka, játra

30 Chrupavka Omezená regenerační kapacita (nízká dostupnost chondrocytů-ukotveny v ECM kloubního povrchu, absence progenitorových buněk, avaskulární tkáň) Izolace autologních chondrocytů/bmsc (bone marrow stromal cells=buňky kostní dřeně) + polymerní 3D scaffold (PLA, PGA, PCL, kolagen) kultivace v bioreaktoru implantace

31 Anatomie kolenní chrupavky Relativně jednoduchá tkáň = žádné nervy, žádné cévy atd. Relatively easy tissue = no nerves, no blood vessels, no other supplemental properties. Existují tři druhy chrupavky podle zastoupení jednotlivých složek (chondrocyty, kolagenní vlákna, extracelulární matrice atd. A/ kloubní chrupavka, B/ Elastická chrupavka, C/ Vazivová chrupavka ploténky

32

33 Kost Využití: osteogenesis imprerfecta (mutace v genu pro kolagen typu I), osteoporoza (řídnutí kostí) Scaffold: mechanická pevnost, ideální velikost pórů, tvrdost, 3D struktura, PCL/HA+β-TCP (kyselina hyaluronová+βtrikalcium fosfát) Izolace mesenchymálních progenitorových buněk z kostní dřeně (MSCs)- diferenciace osteoblasty/osteocytyprodukce mineralizované ECM (hydroxyapatit) a kolagenu After 12 weeks of implantation: Mature bone (B) with bone marrow like tissue (Bm) was deposited directly onto the cement surface (C). Methylene blue and basic fuchsin staining. Acid phosphatase staining revealed osteoclastic, bone remodeling activity.

34 Intervertebral disc Spine fusion device containing a collagen sponge infused with Bone Morphogenetic Protein (BMP). BMP induce native bone to fill the cavity within the device. (in clinical use, Medtronic)

35 Šlachy připojují kosti ke svalům, vazy spojují jednotlivé kosti Pojivová tkáň obsahující fibroblasty, kolagen typu I, GAGs Použití lidských vazivových fibroblastů- ACL (anterior cruciate ligaments) Šlachy a vazy

36 Svaly Využití prekurzorových svalových buněk (MPCs=muscle precursor cells)- Duchenova, Beckerova muskulární dystrofie (genetické choroby vedoucí k postupnému ochabování svalstva) Poranění svalů-nutná aktivace satelitních buněk (klidové myogenní kmenové buňky) myoblasty fúze se svalovými vlákny reparace poškození Kulturistika.net

37 Epidermis schopna regenerace Dermis regenerace pouze v malé míře náhrada tkáně jizvou, která postrádá elasticitu a pevnost škáry Kožní náhrady zakrytí rány, stimulace regenerace dermis Kůže Proces hojení ran: 1.reepitelizace 2.remodelace granulační tkáně 3.tvorba jizvy

38 Severe burns Diabetic skin ulcers INTEGRA - acellular scaffold to provide an environment for healing using the patient s own cells. Cook OASIS Wound Matrix - a thin extracellular matrix- based material, derived from the submucosal layer of pig small intestine, known to release natural factors as the material degrades

39 Apligraf (Graftskin) Spodní vrstva tvořena kolagenem a lidskými fibroblasty (kožní buňky), které produkují ECM Horní vrstva tvořena lidskými keratinocyty, které dávají vzniknout epidermis Neobsahuje cévy, vlasové folikuly, melanocyty, potní žlázy Léčba diabetických vředů

40

41 Močový měchýř Autologous urothelium a buňky hladkého svalstva rozšířené ex vivo a osázené na biodegradabilní kolagen nebo kolagen-plga kompozit byly implantovány na sedm pediatrických pacientů kteří potřebovali cystoplastycitu (Atala et al., 2006).

42 Játra Nedostatek dárců Transplantace hepatocytů na polymerním nosiči (PVA, PLA, PGA, PLGA) Liver assist system-enkapsulované hepatocyty sloužící k mimotělní podpoře při selhání jater Dr. Simionescu, Clemson University

43 Pankreas (slinivka břišní) V ČR diabetiků, celosvětově přes (7-10% dm I.typu), prevalence vzrůstá Léčba insulinem nevyhovující (insulin vyplavován fyziologicky po příjmu glukosy) Léčba pomocí transplantace pankreatu, Langerhansových ostrůvků nebo β buněk produkujících insulin Nedostatek lidských dárců využití prasečích/hovězích tkání (produkují insulin homologní s lidským) Enkapsulace ostrůvků zamezení imunologické rejekce

44 2001 Terese Winslow, Lydla Kibluk

45

46 Cévy Limitováno možný vznikem trombů, chronického zánětu, rejekcí nebo špatnými mechanickými vlastnostmi Endoteliální buňky, buňky hladkého svalstva (zajišťují vasoaktivitu cév a mechanickou pevnost při působení tlaku v oběhovém systému), cytokiny a růstové faktory, biodegradabilní polymery První pokusy s PET (Dacron) a PTFEpasivní transport krve, minimální interakce s krví a tkáněmi Možnost pokrytí povrchu proteiny, antikoagulanty, antibiotiky Reakce krve po kontaktu s materiálem Usazování plasmatických proteinů a destiček Infiltrace neutrofily a monocyty Migrace a proliferace endoteliálních a svalových buněk

47 Srdeční chlopně Umělé srdeční chlopně-nebezpečí trombembolismu (celoživotně podávání antikoagulancií) Bioprotézy (např. transplantace prasečí chlopně): nevýhody-kalcifikace, změny struktury výhody-netrombogenní, neinfekční, delší životnost, přežívání buněk možnost růstu, regenerace, remodelace (využití především u dětských pacientů)

48 Artificial Heart Valves Mechanical (A, B) Caged Ball Hinged Leaflets Stented Bovine Pericardium Biological (C-F) Glutaraldehyde-fixed Animal Tissues Stentless Porcine Valve Stented Porcine Valve Stentless Porcine Valve From: Simionescu D, Artificial Heart Valves, Wiley Encyclopedia of Biomedical Engineering, (A, C, F) Copyright Edwards Lifesciences, Inc and (B, D, E) St. Jude Medical, Inc All rights reserved.

49 Beating Heart Created In Laboratory Potkaní decelularizované srdce (vrchní tři obrázky), a během osazování buňkami (spodní dva obrázky). Doris Taylor, Ph.D., Center for Cardiovascular Repair, Medtronic Bakken

50 Nervový systém Využití neuronálních kmenových buněk (NSCs=neronal stem cells) k léčbě CNS (poranění míchy a mozku) Diferenciace ve 3 typy nervových buněk: neurony (vlastní nervové buňky), astrocyty a oligodendrocyty (podpůrné buňky nervové tkáně) Autor: Sestra