Analýza biologicky aktivních látek kapalinovou chromatografií

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové DISERTAČNÍ PRÁCE Analýza biologicky aktivních látek kapalinovou chromatografií Školitel: Prof. RNDr. Jiří Klimeš, CSc. Hradec Králové Mgr. Pavla Pilařová

2

3 Prohlášení Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně (pod vedením svého školitele). Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Práce vznikla za podpory Specifického vysokoškolského výzkumu SVV Pavla Pilařová

4

5 Poděkování Ráda bych poděkovala svému školiteli Prof. RNDr. Jiřímu Klimešovi CSc. za odborné vedení, pomoc a podporu během celého postgraduálního studia. Dále bych chtěla poděkovat především PharmDr. Petru Kastnerovi PhD. za jeho cenné rady, zkušenosti a veškerou pomoc během doktorského studia. Poděkování též patří všem pracovníkům Katedry farmaceutické chemie a kontroly léčiv za vstřícnost, pochopení a vytvoření příjemného pracovního prostředí. V neposlední řadě velké poděkování své rodině za jejich morální podporu a trpělivost během mého postgraduálního studia.

6

7 Obsah Seznam zkratek..9 1 Úvod Cíl práce Teoretická část Kapalinová chromatografie Historie chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) Stacionární fáze Mobilní fáze HPLC ve farmaceutické analýze Tenkovrstvá chromatografie Příprava vzorků k analýze Biologický materiál Izolace látek z biologického materiálu Léčivé přípravky Derivatizace Validace analytických metod Charakterizace látek Amfetaminové deriváty Ostatní látky Experimentální část TLC analýza vybraných amfetaminů v moči Stanovení 4-hydroxymethamfetaminu, 4-hydroxy-amfetaminu, amfetaminu a methamfetaminu pomocí HPLC s fluorescenční detekcí Vývoj a validace rychlé UPLC metody stanovení acikloviru, jeho nečistot a konzervačních látek v topickém přípravku

8 4.4 Vývoj a validace rychlé UPLC metody pro stanovení risperidonu a jeho nečistot v účinné látce a tabletách Vývoj a validace stabilitu indikující metody pro stanovení natriumpikosulfátu, jeho nečistot a konzervačních látek ve farmaceutických přípravcích Přílohy Publikované práce v odborných časopiech Práce zaslané do odborných časopisů Přehled plakátových sdělení Závěr Literatura Abstrakt

9 Seznam zkratek ACI ACN AP APs BSA CAD CD CE CNS CRL ČL DAD DMSO Dns-Cl EDTA ELSD EtOH FMOC-Cl GC HPLC HPTLC ICH ID LC LC-MS LLE LOD LOQ LSD M MA MeOH MDA MDEA MDMA Mr NMR aciklovir acetonitril amfetamin amfetaminové deriváty bovinní sérový albumin aerosolový detektor nabitých částic cirkulární dichroismus kapilární elektroforéza centrální nervová soustava chemická referenční látka Český lékopis diode array detector dimethylsulfoxid dansylchlorid N,N-ethylendiamintetraoctová kyselina evaporative light scattering detector ethanol 9-Fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid plynová chromatografie vysokoúčinná kapalinová chromatografie vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie International Coference on Harmonisation vnitřní průměr kapalinová chromatografie kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí extrakce rozpouštědly limit detekce limit kvantifikace diethylamid kyseliny lysergové mol methamfetamin methanol 3,4-metylenedioxyamfetamin 3,4-methylenedioxyethylamfetamin 3,4-methylenedioxymethamfetamin molekulová hmotnost nukleární magnetická rezonance 9

10 NP NQS ODS p-ohap p-ohma Ph. Eur. RP SFE SME SPE SPIE SPME SST SVP THF TLC UFLC UHPLC, UPLC USP UV UV-VIS normální fáze 1,2-naphtoquinon-4 sulfonát sodný silikagelová C18 stacionární fáze para-hydroxyamfetamin para-hydroxymethamfetamin Evropský lékopis reverzní fáze extrakce nadkritickým plynem mikroextrakce rozpouštědlem extrakce na pevných fázích imunoextrakce na pevných fázích mikroextrakce na pevných fázích test způsobilosti správná výrobní praxe tetrahydrofuran tenkovrstvá chromatografie ultra-rychlá kapalinová chromatografie ultra-účinná kapalinová chromatografie americký lékopis utrafialové záření ultrafialová-viditelná oblast 10

11 1 ÚVOD 11

12 12

13 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie za dobu své existence doznala velkého rozmachu a lze se s ní setkat v mnoha oborech. Jde o efektivní a neustále se rozvíjející metodu, kdy volbou instrumentace, separačních podmínek a detekce lze dosáhnout vysokých citlivostí a rychlosti analýzy. Předností HPLC je její schopnost separace, identifikace a současně kvantifikace širokého spektra látek o různých koncentracích během jedné analýzy. Pomocí HPLC můžeme kromě identifikace léčiv hodnotit jeho obsah a čistotu, sledovat stabilitu a vznikající rozkladné produkty a mimo to i monitorovat léčiva a jejich metabolity v tělních tekutinách. Během posledního desetiletí došlo ve všech oblastech kapalinové chromatografie k velkému rozvoji. Jeden inovační směr se zaměřil na vývoj přístrojů umožňujících práci za mnohem vyšších tlaků než běžná HPLC, jedná se o Ultra high performance liquid chromatography (UHPLC). Pro UHPLC je charakteristická kratší doba analýzy, k získání výsledků stačí minimální množství testovaných vzorků a díky rychlejšímu rozdělování látek nedochází k velké spotřebě rozpouštědel. Tato hlediska přispívají k úspoře času, financí a v neposlední řadě i ochraně životního prostředí. Kapalinová chromatografie jako separační metoda je metodou volby v hodnocení léčivých přípravků, které jsou směsí účinných a pomocných látek, a zároveň je využívána v rámci sledování jejich stability. Metody vyvinuté pro hodnocení a monitorování kvality léčiv musí být především přesné a správné, což je zaručeno jejich validací. Kromě vysokoúčinné kapalinové chromatografie má stále své místo v analýze látek i chromatografie na tenké vrstvě. Například v toxikologickém screeningu je určena k záchytu a identifikaci velkého množství léčiv a drog jako neznámých nox ve vzorcích biologického materiálu. Její výhoda tkví ve spojení screeningu a identifikace v jednom pracovním postupu, metoda je kvalitativní a slouží k diagnostice akutních intoxikací, pro kontrolní vyšetření. Relativně nižší citlivost TLC není v toxikologickém screeningu, kde toxiny v biologickém materiálu dosahují zpravidla vyšších hladin na překážku. 13

14 14

15 2 CÍL PRÁCE 15

16 16

17 Dizertační práce se zabývá kapalinovou chromatografií a skládá ze dvou částí. Část I se týkala analýzy drog odvozených strukturou od amfetaminu v moči. V prvním případě bylo cílem studie nalezení vhodného izolačního postupu a vypracování jednoduché a rychlé TLC metodiky pro analýzu amfetaminů z modelové moče. Dosažené výsledky byly porovnány z hlediska citlivosti detekce s přímou aplikací amfetaminů v moči na chromatografickou desku a s detekčními papírky. V následující studii bylo hlavním cílem vyvinout a validovat relativně jednoduchou a rychlou HPLC metodu s fluorescenční detekcí pro kvalitativní i kvantitativní hodnocení methamfetaminu a jeho metabolitů v moči. Byla optimalizována derivatizace vzorků dansylchloridem a podmínky separace derivátů za použití vnitřního standardu. Byl také nalezen vhodný izolační postup pro izolaci těchto látek z moči. Metoda byla validována z hlediska validačních parametrů: linearita, přesnost (opakovatelnost), správnost, robustnost a selektivita. Část II se zaměřuje na hodnocení léčivých přípravků pomocí HPLC Cílem první studie bylo vyvinutí nové, rychlé a citlivé metody stanovení acikloviru a jeho tří příbuzných látek společně s konzervačními přísadami v topickém přípravku. Všechny látky byly hodnoceny pomocí UHPLC s UV detekcí za použití gradientové eluce a vyšší teploty. V další práci byla také vyvíjena nová UHPLC metoda pro hodnocení risperidonu a jeho čtyř příbuzných látek v tabletách a porovnání s konvenční HPLC metodou v USP. Analýza tablet byla realizována při 40 C gradientovou elucí a UV detekcí při 260 nm. Téma poslední práce bylo hodnocení natrium-pikosulfátu, jeho rozkladných produktů a konzervačních látek v kapkách. Byly vyvinuty dvě isokratické HPLC metody na různých stacionárních fázích v závislosti na použité konzervační látce v léčivém přípravku. Obě metody byly validovány s uspokojujícím výsledkem. Při stanovení příbuzných látek bylo validací dokázáno, že kromě klasického hodnocení s vnějším standardem lze využít pohodlnější metodu normalizace. 17

18 18

19 3 TEORETICKÁ ČÁST 19

20 20

21 3.1 KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE Kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography, LC)je analytická separační metoda, která je založena na různé distribuci jednotlivých složek vzorku mezi dvě fáze, které jsou nemísitelné. První fáze se vyznačuje schopností zadržovat v různém rozsahu jednotlivé složky směsi, nazývá se stacionární fáze a je, na rozdíl od fáze druhé, nepohyblivá. Druhá fáze je tedy pohyblivá a slouží k vymývání zadržovaných složek ze stacionární fáze, nazývá se proto fáze mobilní. Jak už napovídá název metody, mobilní fází je kapalina. Vlivem různé afinity jednotlivých částí vzorku ke stacionární fázi dochází k jejich separaci, složky s malou afinitou se oddělují ze stacionární fáze do fáze mobilní dříve než složky, které se k nepohyblivé fázi vážou pevněji. Výhodou chromatografických metod je získávání jak kvalitativních, tak kvantitativních výsledků měření Historie chromatografie Počátky chromatografie sahají na začátek 20. století, kdy ruský botanik Michail Semjonovič Cvět 1903 publikoval práci, kde oddělil jednotlivé složky chlorofylu po extrakci do petroletheru, pomocí skleněné kolony naplněné křemelinou. Jelikož pracoval především s barevnými látkami a rostlinnými barvivy, Cvět tuto metodu pojmenoval chromatografie (z řeckého chromos = barva, graphein = psaní). Metoda byla znovu aplikována až roku 1931 Kuhnem, Wentersteinem a Lederem při dělení polyenových barviv. Martin a Synge dostali za objev resp. zavedení rozdělovací chromatografie typu kapalina-kapalina roku 1952 Nobelovu cenu, což vedlo vývoji v oblasti plynové a tenkovrstvé chromatografie. 1,4-6 Největšího rozvoje se LC dočkala až v 70. letech minulého století, kdy byla vyvinuta díky poznatkům v oboru plynové chromatografie metoda vysokoúčinné LC umožňující práci za vysokých tlaků (30-40 MPa). Kirkland s Halászlem urychlili dělení látek pomocí kolon naplněných malými částicemi, byly použity náplně kolon z odolnějšího materiálu (porózní oxid křemičitý) zároveň se zabývali automatizací celého systému. 6 Velikost částic v kolonách se tehdy 21

22 pohybovala mezi 5-10 µm. O dvacet let později byla velikost částic 3-5 µm. 7 Zmenšování částic bylo zavedeno z důvodu vyšší účinnosti separace. Trendem se stávají kolony s co nejmenšími částicemi (1-2 µm), to však vede ke značnému nárůstu tlaku do tak vysokých hodnot, za kterých už běžný HPLC systém nemůže pracovat. Tento fakt vyžadoval vznik nových přístrojů, jako jsou UFLC nebo UHPLC systémy, které využívají kolony s náplní částic o velikosti do 2 µm a jsou schopny pracovat i za vyšších tlaků. 8 Přehled vývoje velikosti částic uvádí Tab 1. Tab1. Vývoj velikosti částic kolonové náplně 9 Rok Velikost částic (µm) , , ,7 Přestože je provedení chromatografické separace poměrně jednoduché, mechanismus samotného dělení jednotlivých složek je komplikovaný jev, na který je třeba pohlížet komplexně. Existuje mnoho hledisek pro dělení chromatografických metod. Způsob separace rozdělovací fyzikální rozpouštění ve fázi adsorpční fyzikální adsorpce ve fázi chemická reakcev objemu/na povrchu fáze (acidobazická rovnováha, tvorba komplexů, tvorba iontových párů, výměna iontů, srážení) bioafinitní asociace stérické bránění 22

23 Způsob uspořádání kolonová (sloupcová) plošná (papírová, tenká vrstva) Způsob vyvíjení Eluční Vytěsňovací Frontální Dle skupenství mobilní a stacionární fáze Kapalina-pevná látka Kapalina-kapalina Kapalina-plyn Plyn-pevná látka Dle skupenství mobilní fáze Kapalinová chromatografie Plynová chromatografie Superkritická fluidní chromatografie Jak je zřejmé, díky všem výše uvedeným separačním mechanismům je možné nalézt účinný a selektivní chromatografický systém k dělení směsí prakticky všech organických látek. Z hlediska způsobu vyvíjení má v analytické praxi význam převážně eluční chromatografie. HPLC (High performance liquid chromatography) je významnou a často využívanou separační analytickou metodou. Pro analýzu těkavých látek má velký význam plynová chromatografie (Gas Chromatography). V toxikologickém screeningu se uplatňuje také tenkovrstvá chromatografie (Thin layer chromatography) 10,11 23

24 3.1.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Postupem času se vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) stala nedílnou součástí analytických laboratoří. Její význam a důležitost je zřejmý z množství publikací, kde je využita pro další výzkum. Za využití separačních mechanismů, již zmíněných výše, lze nalézt účinný a selektivní chromatografický systém k dělení složek směsi mezi stacionární fází v koloně a mobilní fází, která prochází systémem za vysokého tlaku. Separovaná směs látek je po nástřiku unášena mobilní fází na kolonu, kde dochází k opakovanému ustavování rovnováhy mezi stacionární a mobilní fází. V závislosti na druhu sorbentu v koloně dochází k dělení složek směsi viz Obr. 1. Dělení jednotlivých složek směsi je ovlivněno dále způsobem eluce: pokud se zásadně neliší eluční parametry analyzovaných látek, používá se isokratická eluce (konstantní složení mobilní fáze), pokud ano, využívá se gradientová eluce (měnící se složení mobilní fáze). 13 Obr. 1: Průběh chromatografického procesu 12 Jednotlivé látky jsou detekovány v cele detektoru a jejich přítomnost se projeví jako pík na chromatografickém záznamu. Z HPLC záznamu lze získat detailní informace o identitě, čistotě a obsahu analyzované látky. Retence na koloně resp. retenční čas je identifikační charakteristikou látek a pro kvantifikaci je určující charakteristikou výška píku nebo plocha píku pod křivkou. Kvantifikace se provádí několika způsoby: 24

25 Metoda vnějšího standardu kromě analyzovaného roztoku se za stejných podmínek hodnotí roztok standardu stanovované látky (např. CRL) nebo soubor roztoků o přesně definovaných koncentracích (kalibrační křivka) a porovnáním ploch nebo výšek píků vzorku a standardu se provede kvantifikace Metoda vnitřního standardu k analyzovanému roztoku se přidá roztok látky odlišné od analytu, vnitřní standard nesmí reagovat s analytem a má být eluován v jeho blízkosti. Z poměru ploch nebo výšek píků separovaných látek a vnitřního standardu se vypočítá obsah. Metoda je přesnější a není zatížena chybou dvojího nástřiku. Metoda normalizace procentuální obsah jedné nebo více složek směsi se vypočítá z plochy nebo ploch jako procento z celkové plochy všech píků na chromatogramu. Nezahrnují se píky rozpouštědel, přidaných činidel a píky pod limitem zanedbatelnosti. Metody se využívá k určování relativních množství nečistot a degradačních produktů v substancích a léčivých přípravcích. 2,13,14 Instrumentace HPLC sestava může mít řadu obměn, ale v podstatě musí být zachováno řazení základních prvků za sebou. Kapalinový chromatograf se skládá z částí, které zajišťují transport mobilní fáze (zásobníky mobilní fáze, odplyňovač, vysokotlaké čerpadlo, systémy pro tvorbu gradientu v mobilní fázi), dávkování vzorku (manuální či automatické), separaci látek (chromatografická kolona), detekci látek, systém pro sběr a vyhodnocování dat (počítač, případně starší verze zapisovač, integrátor). Počítač může přímo ovládat pracovní parametry chromatografu (složení mobilní fáze, průtok mobilní fáze, nastavení detektoru apod.) viz Obr

26 Obr.2: Schéma kapalinového chromatografu 15 Kapalinové chromatografy jsou v současné době koncipovány jako víceúčelové systémy ve formě stavebnice a lze si z jednotlivých modulů sestavit požadovaný systém, popř. se jedná o kompaktní jednotku s možností zvolení vestavěných modulů. Na HPLC systémy jsou kladeny nároky z hlediska použitých materiálů, které by měly odolávat korozivním účinkům mobilní fáze, projevuje se snaha o minimalizaci mrtvých objemů a zajištění reprodukovatelnosti bezpulzního průtoku pro široké rozmezí tlaku a zvyšování citlivosti detekce. Nemalé nároky jsou kladeny i na řídící software, který by měl být z hlediska ovládání jednoduchý a zároveň zajišťovat požadavky regulačních autorit ve smyslu správné výrobní resp. laboratorní praxe. Trendy v HPLC instrumentaci jsou automatizace, miniaturizace a aplikace nových typů stacionárních fází a detektorů. V následujícím textu je stručná charakteristika jednotlivých částí kapalinového chromatografu. 10,15 Zásobníky mobilní fáze Nejčastěji jsou to skleněné nádoby se speciálními inertními uzávěry, aby nedocházelo k odpařování rozpouštědel. Nádoby jsou teflonovými hadičkami s filtry (póry 2-20 µm) spojeny s degassery. Obvykle bývají 2-4 zásobníky. 26

27 Odplyňovací zařízení (degasser) Membránové vakuové odplyňovače: mobilní fáze protéká semipermeabilní hadičkou umístěnou v evakuovaném prostoru. Dnes již zřídka používané héliové odplyňovače vytěsňuji: rozpuštěné plyny z mobilní fáze probubláváním heliem vytěsní přímo v zásobní lahvi. Mobilní fázi lze odplynit též působením ultrazvuku. Čerpadla mobilní fáze Vysokotlaké čerpadlo patří přes všechna elektronická zlepšení k výrobně nejnáročnějším součástem chromatografu. Základním požadavkem je zajištění konstantního a bezpulzního průtoku mobilní fáze celým systémem. Kolísání průtoku resp. tlaku ovlivňuje reprodukovatelnost retenčních časů a ploch píků analyzovaných látek. Čerpadla se vyrábějí z odolných materiálů vůči korozi a agresivním složkám mobilních fází (pufry, kyseliny, org. rozpouštědla atd.), nejčastěji z nerezové oceli, titanu, speciálních keramických materiálů a těsnění z teflonu. Požadavky na moderní HPLC analytická čerpadla jsou: průtoková rychlost 0,01 až 10 ml.min -1 ; rozsah tlaků 1 až 60 MPa (až 100 MPa pro UHPLC); tlaková pulsace 1 %. Dnes se převážně používají duální vysokotlaká pístová čerpadla, kde čerpadlo pohání jeden motor. Zatímco se jedna část plní, druhá vytlačuje kapalinu do systému. Výsledkem je (téměř) bezpulsní čerpání. Ještě lepších výsledků je dosahováno elektronickou kontrolou pohybu pístů. Nejčastěji používané čerpadlo, pulsace tlaku je minimalizována viz Obr. 3. Obr3. Schéma duálního vysokotlakého pístového čerpadla a bezpulzního průtoku 15 27

28 Míchání mobilních fází (gradient) Většina systémů umožňuje automatické míchání kapalin v různých poměrech, což urychluje výběr vhodného složení mobilní fáze při izokratické eluci a hlavně se využívá při programování gradientové eluce. Používají se dvě metody směšování vysokotlaký a nízkotlaký gradient. Dávkovací zařízení (autosamplery) Nejrozšířenějším typem systému je dávkovací ventil, nástřik se skládá ze dvou fází, nejprve naplněním smyčky o definovaném objemu a následně přepnutím ventilu a vymytím smyčky mobilní fází do systému. Většina běžných autosamplerů umožňuje přesné dávkování objemu vzorku v rozsahu desetin až stovek µl při zachování vysoké reprodukovatelnosti ( 0,2 %). 16 Komerčně dostupné autosamplery lze naprogramovat a využít kromě dávkování vzorků i k přesnému ředění, přídavku činidel nebo chlazení či ohřátí vzorku před nástřikem. Kolonový prostor Jedná se o část systému, kde je umístěna jedna či více kolon (multidimenzionální chromatografie) popř. předkolon. V současnosti je běžnou součástí termostat, který udržuje stálou teplotu kolony. Například u chirálních separací bývá vyžadována snížená teplota. Naopak zvýšení teploty se využívá ke zrychlení analýzy. Navíc lze použít rychlejší průtok, protože vlivem teploty klesá viskozita mobilní fáze a tím i tlak na koloně. Chromatografická kolona je obvykle vyrobena z nerezové oceli, avšak může být i skleněná či plastová. Obsahuje stacionární fázi (náplňová nebo monolitická). Pro klasickou analytickou HPLC se používají kolony o vnitřním průměru 2,0-5,0 mm a délce mm. Kolona se skládá z pláště uzavřeného porézní kovovou fritou, aby se zabránilo uvolňování stacionární fáze z kolony a současně byl umožněn plynulý průtok mobilní fáze. Oba konce kolony jsou ukončeny ochranným kroužkem a koncovou 28

29 hlavicí, ve které je navrtán vstup pro kapiláru se šroubem viz Obr.4. Spoje mezi kolonou, dávkovačem a detektorem musí být kapilární. Obr. 4: Schéma chromatografické kolony 15 Detektory Detektory slouží k identifikaci látek vycházejících z kolony. Sledují některou z vlastností eluátu pomocí vhodného snímače a signál se po zesílení převádí do zapisovače. Ten pak poskytuje závislosti intenzity daného signálu na čase nebo je vyhodnocení prováděno počítačovým systémem. Detektory obecně dělíme na selektivní, signál je úměrný koncentraci samotné detekované látky v eluátu (UV-VIS, fluorimetrické, elektrochemické), a na univerzální, kdy je odezva úměrná celkové vlastnosti eluátu (refraktometrické, vodivostní) a speciální (MS, NMR, ELSD). 10 Použitý detektor může významně ovlivnit selektivitu i citlivost stanovení. Celková konstrukce detektoru a průtoková cela zvlášť by měla být konstruována tak, aby byly splněny následující požadavky: vysoká citlivost (definovaná jako změna signálu detektoru při jednotkové změně koncentrace analytu), dostatečně velký poměr mezi šumem a měřenou hodnotou, reprodukovatelnost a široká linearita odezvy, nezávislost odezvy na změně složení mobilní fáze při gradientové eluci, nízký mrtvý objem (minimální rozšiřování zón analytu) robustnost ke změnám tlaku a rychlosti průtoku mobilní fáze. 2,10 Charakteristika některých detektorů: Spektrofotometrický detektor (citlivost 10-9 až g/ml) nejvíce používaný v LC, založen na měření absorbance elektromagnetického záření jedné, či více vlnových délek, anebo celého spektra složkami eluátu v rozmezí 190 až 800 nm. Předpokladem 29

30 je dostatečná absorpce analytu v UV nebo viditelné oblasti. Snímání celého spektra je umožněno použitím detektoru s diodovým polem (DAD). Měřený signál je snímán velkým počtem miniaturních plošných diod. Umožňují detekci analytu při jakékoliv zvolené vlnové délce, porovnávat spektra s knihovnou spekter, vypočítat čistotu píku viz Obr ,17 Obr. 5: Příklad záznamu detektoru s diodovým polem 18 Fluorimetrický detektor (citlivost 10-9 až g/ml) princip detekce je založen na tom, že látky s určitými funkčními skupinami (luminofóry) v cele detektoru absorbují budící ultrafialové záření, jehož pohlcená energie se zčásti vyzáří ve formě luminiscenčního (fluorescenčního) záření o nižší energii (vyšší vlnové délce), než má záření excitační. 10 Fluorimetry jsou vysoce selektivní a citlivé a uplatňují se i při stopové analýze. U látek nevykazujících přirozenou fluorescenci je nutné vhodnou derivatizační reakcí připravit fluoreskující deriváty (např. reakcí s dansylchloridem, fluoreskaminem, či o-ftaldialdehydem. 4,13 30

31 Obr. 6: Schéma fluorimetrického detektoru 19 Fluorimetrické detektory jsou málo citlivé na změnu teploty, změnu průtoku mobilní fáze a změny složení mobilní fáze, což je výhodné při použití gradientové eluce. 20 S použitím laseru jako zdroje excitačního záření lze jejich citlivost zvýšit o jeden řád. Fluorimetrické detektory umožňují měřit i chemiluminiscenci při vypnutém zdroji excitačního záření. 10 Hmotnostní detektory (citlivost až g/ml) spojení s HPLC je vysoce selektivní a citlivé, je užitečné při identifikaci a strukturní analýze organických látek. Principem detekce je ionizace molekul látek po průchodu chromatografickou kolonou za vzniku molekulárních iontů a z nich vzniklých fragmentů, které jsou separovány podle poměru hodnot hmotnosti a náboje iontu. Jedná se o velice citlivé detektory, ale velmi ekonomicky náročné. Elektrochemické detektory (Citlivost 10-9 až g/ml) - detekce látek schopných elektrochemických reakcí, které probíhají na rozhraní elektroda eluent. Koncentrace analyzovaného léčiva závisí na hodnotě měřené elektrochemické veličiny dle typu detektoru (voltametrický, amperometrický, potenciometrický, konduktometrický a polarografický). 2 Refraktometrické detektory (citlivost 10 6 g/ml) měří rozdílný index lomu mezi čistou mobilní fází a eluátem s analyzovanou látku. Jsou univerzální pro jakoukoliv látku, ale mají menší citlivost, je nutné je termostatovat a nelze použít pro gradientovou eluci. 2 31

32 Ostatní typy vodivostní, polarimetrické, NMR (nukleární magnetická rezonance), infračervené, ELSD (Evaporative Light-Scattering Detectors), CAD koronové (Charged Aerosol Detectors) aj. 1 Vyhodnocovací zařízení HPLC systémy jsou automatizovány a řízeny počítačem pomocí firemního softwaru. Chromatografický software se liší v jednotlivostech, ale vždy zajišťuje chod celého systému, tj. zapnutí, vypnutí, parametry dávkování vzorku, průtoku a složení mobilní fáze popř. gradientu, teploty, detektoru a také zpracování a archivaci dat v elektronické podobě. 1,10 Další zařízení K chromatografu může být připojeno zařízení pro recyklaci mobilní fáze, automatický sběrač frakcí, za dávkovač lze zapojit přepínač kolon pro předseparaci látek Ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) Nové trendy v chromatografické instrumentaci jsou spjaty s novými technologiemi hlavně ve vývoji stacionárních fází. Účinnost chromatografického systému roste se specifickým povrchem stacionární fáze, tedy se zmenšující se velikostí částic, což však vede ke zvětšení zpětného odporu kolony. Tento fakt byl dlouho limitujícím faktorem HPLC instrumentace, která umožňovala zapojení monolitických a částicových kolon s částicemi 3-10 µm. Nové typy analytických kolon s částicemi 1,7 2,2 µm a vnitřní průměr 1,0-4,6 mm si vyžádali speciálně upravené stroje. První uvedla na trh firma Waters (Acquity UPLC) a tím byl dán nový směr vývoje kapalinové chromatografie a znamenal velký pokrok v oblasti analytické separace. 1,17,21-23 UHPLC systém je navržen pro práci za vysokých tlaků (60 až 100 MPa). Čerpadla, hadičky, těsnění, ventily, kolony a veškeré spoje v systému jsou upraveny tak, aby byly schopny odolávat požadovaným tlakům, systémový objem včetně detekční cely je co 32

33 nejvíce minimalizován. Detektory umožňují rychlý sběr dat při zachování vysoké citlivosti a dobrého rozlišení. 1,8,24 Další pokrok přinesla nová technologie kolon pevného jádra částic s homogenním porézním povrchem, který omezuje difúzi složek zkoumaného vzorku do pórů a z pórů částic. Navíc jsou částice v koloně rovnoměrně rozložené a to zajišťuje vyšší účinnost separace a také lepší opakovatelnost měření viz Obr ,26 Obr. 7: Porovnání difúze složek vzorku na koloně s částicemi s pevným jádrem a běžné koloně 26 Výhodou používání UHPLC je lepší kvantitativní odpověď, zkrácená doba analýzy vedoucí ke snížení spotřeby používaných rozpouštědel, a tím menší zátěž pro životní prostředí. Důsledkem snížení spotřeby rozpouštědel jsou i nižší finanční náklady. Jelikož čas potřebný pro jednu analýzu je kratší, nabízí UHPLC větší produktivitu než HPLC. Rychlejší separace látek pomocí UHPLC je dána velikostí částic kolony (< 2 µm), výkonným čerpadlem, které pracuje za vysokých tlaků s možností použití vyšší rychlosti průtoku mobilní fáze viz Obr. 8. K urychlení analýzy přispívá fakt, že nástřik jednotlivých vzorků se děje v relativně rychlých cyklech (25s) a stačí jen malý objem nástřiku. Systémy jsou vybaveny kolonovými termostaty s předkolonovým ohřevem (snížení případné disperze píků při malém průtoku mobilní fáze) a postkolonové chlazení (teplota optiky detektoru). Výhodou použití vyšších teplot je zmenšení zpětného odporu kolony vlivem snížení viskozity mobilní fáze. 1,8,24 33

34 Obr. 8: Porovnání separace metodou HPLC a UPLC 27 Další trendy v HPLC jsou tzv. on-line chromatografie a miniaturizace analytických systémů, jedná se zejména o mikro-lc a nano-lc, které umožňují rychlé analýzy velkého počtu vzorků o malých objemech a s malými průtoky mobilní fáze. Často bývají tyto systémy spojeny s MS detekcí. 1,28,29 34

35 3.1.4 Stacionární fáze Analytická kolona se stacionární fází je nejdůležitějším prvkem chromatografického systému, zde probíhá rozdělení směsi látek na základě různých separačních dějů a mechanismů závisejících jak na povaze sorbentu tak i analytu. Stacionární fáze je pro molekuly analytu nepropustná a na jejím povrchu dochází k příslušnému chromatografickému procesu. 1 Parametry ideální stacionární fáze: 30,31 dlouhodobá stabilita vůči agresivním složkám mobilní fáze (nízké a vysoké ph) mechanická stabilita (odolnost vysokým tlakům) vlastnosti částic velký povrch, pravidelný kulový tvar s jednotnou velikostí (zamezení turbulentnímu proudění m.f.) velikost pórů odpovídající velikosti molekul analytu teplotní odolnost možnost chemické modifikace povrchu Přestože je v současné době, k dispozici značné množství sorbentů, je většina separačních kolon používaných v HPLC ve farmaceutické analýze na bázi chemicky modifikovaného silikagelu. Více než 80 % tvoří obrácené fáze, jelikož umožňují separaci velké části organických látek, od lipofilních až po silně polární či iontové. Pomocí chemických reakcí se na povrch sorbentu ukotví příslušné funkční skupiny a podle polarity těchto skupin lze sorbenty využít jak v normální tak v reverzní chromatografii pro přípravu stacionárních fází s chemicky vázanými funkčními skupinami. 32 Povrch silikagelu je tvořen silanoly (hydrofilní) a siloxany (hydrofobní), ovlivňují retenci hydrofobních látek při vysokém procentu vodné složky v mobilní fázi. Jak bylo uvedeno výše, lze použít nemodifikovaný v systému normálních fází (NP). Chromatografie NP má některé nevýhody, mezi něž patří především citlivost na malé změny ve složení mobilní fáze, pomalá ekvilibrace kolony, menší množství látek rozpustných v používaných mobilních fázích, což přispívá k celkově nižší robustnosti analýzy. Na druhou stranu lze klasický silikagel i další nemodifikované sorbenty využít při separaci izomerních látek

36 Jak již bylo zmíněno, využívá se především silikagel s chemicky vázanými funkčními skupinami. Nosiče pro přípravu jsou sférické částečky vysoce čistého silikagelu tříděného na jednotnou střední velikost (2 až 7 µm), větší částice ( 10 µm) se využívají především v preparativní analýze. Vysoká čistota má velký význam s ohledem na sekundární interakce, např. příměs kovů v silikagelu zhoršuje symetrii píků. 10 Nejčastějšími modifikačními skupinami pro nepolární systém tzv. reverzních fází jsou funkční skupiny C 18 (oktadecylsilikagel) a C 8 (oktylsilikagel), pro středně polární fáze se využívají amino- nebo kyano- modifikace. Výhoda sorbentů na bázi silikagelu je dána jeho mnoha pozitivními vlastnostmi, mezi něž patří možnost výroby různě velkých částic, s různou velikostí pórů, což umožňuje separaci malých i velkých molekul; také velká mechanická odolnost. Díky snadné modifikaci silanolových skupin lze připravit velké množství sorbentů s odlišnými vlastnostmi. Nemalou výhodou je i možnost použití levnějších a bezpečnějších mobilních fází na bázi vody a organických rozpouštědel. 13,30 Nevýhodou tohoto sorbentu je chemická stabilita v rozmezí ph 3 až 9, z hlediska dlouhodobé stability se udává jen ph 3 až 7. Snížením ph pod hodnotu 4 dochází k hydrolýze siloxanové vazby, v případě vyšších hodnot ph nad 9 se silikagel začíná rozpouštět, což vede v obou případech ke ztrátě chromatografické účinnosti. 30,33,34 Mezi další nevýhody patří kyselý povrch silikagelu, což ovlivňuje hlavně separaci bazických látek (nárůst retenčního času, chvostování píků). Volné silanolové skupiny iontovými interakcemi reagují s protonizovanými bazemi. Cílem výrobců analytických klon je snaha o odstranění těchto negativních vlastností silikagelu při zachování jeho výhod. Jedna z možností je použití jiných anorganických oxidů (oxid hlinitý, titaničitý, zirkoničitý), jejichž velkou předností je vysoká teplotní stabilita a hlavně použití v mnohem širším rozsahu ph. Největší uplatnění našli především zirkoniové kolony, které se liší od klasických kolon vzhledem k odlišným chemickým vlastnostem retencí a selektivitou. Dalším způsobem je nahrazení silikagelu organickými polymery (akrylamid, methakrylát, atd.), které jsou stabilní v celém rozsahu ph a zároveň chemicky odolné, jejich nevýhodou je však nižší odolnost mechanická a nižší separační účinnost. 36

37 Kombinací těchto materiálů a klasického silikagelu vedlo ke vzniku hybridních částic (organicko/anorganický hybrid) na bázi polymerizovaného methylsilikonu. Tyto částice poskytují výhody obou sorbentů a mají o třetinu nižší obsah volných silanolových skupin. Tento druh sorbentů má dostatečnou mechanickou odolnost pro využití v UHPLC. Navíc při zrychlení jednotlivých analýz a možností použití mobilních fází s vysokým obsahem (někdy až 100% obsahem) vodné složky snižuje spotřebu organických rozpouštědel. 22,35,36 Jiným významným druhem stacionární fáze strukturně odlišným od výše zmiňovaných partikulárních sorbentů jsou monolity, kolona je zhotovena z jednoho bloku vysoce porézní hmoty kompaktně vyplňující prostor uvnitř kolony. Monolitické kolony se používají především pro rychlé a ultra rychlé separace. Strukturu monolitů tvoří hustá síť makropórů a mesopórů viz Obr. 9, kterou prochází všechna mobilní fáze, čímž je dosaženo rychlého přenosu hmoty. Makropóry (průtočné póry) snižují zpětný odpor kolony a tím je umožněno použití vysokých průtokových rychlostí, až 5 větších než u konvenčních 5 µm sorbentů. Mesopóry (difúzní póry) zvětšují aktivní povrch sorbentu a tím i separační účinnost. Obr. 9: Fotografie mesopórů a makropórů 37 37

38 Podle chemické podstaty a způsobu přípravy se mohou monolitické stacionární fáze rozdělit: Anorganické monolity; Makroporézní polymerní monolity; Stlačitelné monolity (komprimované gely). Přestože každá připravená monolitická kolona je vlastně prototypem, je jejich příprava většinou poměrně dobře reprodukovatelná. Komerční dostupnost a jedinečné vlastnosti, které je odlišují od ostatních kolon, zejména snadnost přípravy, tolerance k rychlým průtokům dosažitelných za mírných tlaků, velká rychlost, vysoká míra separace, podporují úvahy o jejich značném potenciálu do budoucna Mobilní fáze Separační děj na koloně samozřejmě ovlivňuje kromě stacionární fáze i fáze mobilní, která musí být vhodná pro použití v chromatografickém systému. Obecné požadavky kladené na mobilní fáze jsou: Kvalita rozpouštědel a případných aditiv (např. úprava ph) ovlivňuje velikost šumu a tím i citlivost a mez stanovení. Před použití v systému HPLC je nutná filtrace, hlavně při použití pufrů a solí (filtry s velikostí pórů 0,45 µm; UHPLC 0,22 µm). Mísitelná rozpouštědla, jinak dochází ke zvyšování tlaku v systému a neposkytují se reprodukovatelné výsledky. Kompatibilita s detektorem - při UV detekci je třeba brát ohled na absorpci použitých rozpouštědel a aditiv, při elektrochemické detekci je třeba zajistit dostatečnou vodivost mobilní fáze přídavkem solí a pufrů, ELSD, MS a CAD detektory vyžadují, aby mobilní fáze byla dostatečně těkavá, je nutné používat jen těkavé pufry (kyselina mravenčí, kyselina octová, amoniak, octan amonný, mravenčan amonný, uhličitan amonný). Dále rozpustnost vzorku v mobilní fázi, její nízká viskozita, chemická inertnost. 1,13 38

39 3.1.6 HPLC ve farmaceutické analýze Vysoko účinná kapalinová chromatografie patří mezi všestranné a široce využívané separační metody a ve farmaceutické analýze je v mnoha případech metodou první volby. Při vhodné kombinaci stacionární, mobilní fáze a detekční techniky lze v relativně krátkém čase s vysokou citlivostí a selektivitou separovat jednotlivé složky směsi a získat současně jejich kvalitativní a kvantitativní charakteristiky. Pomocí HPLC lze analyzovat široké spektrum látek od silně polárních až po silně nepolární, od nízkomolekulárních až po látky s poměrně vysokou molekulovou hmotností, což zahrnuje převážnou část terapeuticky používaných látek. 1,2,4 Transfer analytické informace do znalostí o léčivé látce či léčivém přípravku má velký význam pro farmaceutický vývoj, protože v konečném důsledku vede ke kvalitnímu, bezpečnému a účinnému léku. Z hlediska farmaceutických firem tento proces ovlivňuje uvedení léčivého přípravku na trh. 39 V následujících bodech jsou uvedeny některé praktické aplikace HPLC: Hledání nových molekul a určování struktury látek - především spojení s moderními detekčními technikami, jako jsou hmotnostní spektrometrie (LC-MS) a nukleární magnetická rezonance (LC-NMR), se využívá k prokázání struktury aktivních látek nebo nečistot. 1,13 Určování identity a kvantity při prokázání účinnosti, bezpečnosti a jakosti léčiv a léčivých přípravků je nutné určit přítomnost aktivní látky, její obsah v povoleném rozmezí a zároveň stanovit množství nečistot pocházejících buď z výroby nebo degradaci léčiva či přípravku. V těchto případech se obvykle kombinuje HPLC s UV či DAD. Pro ověření identity se využívá shoda retenčního času dané látky se standardem a kvantifikace se provádí metodou vnějšího nebo vnitřního standardu, metodou normalizace nebo z kalibrační závislosti. 1,14 Izolace látek možnosti získávání přírodních látek, přečištění produktů syntéz nebo oddělení vedlejších syntetických reakcí či degradačních procesů (preparativní analýza). 14,40,41 39

40 Monitorování látek v tělních tekutinách hlavní význam pro studium osudu léčiva v organismu. Stanovení plazmatických koncentrací aktivních látek či metabolitů, zjišťování biologické dostupnosti při bioekvivalenčních studiích významné uplatnění ve forenzní medicíně, toxikologii nebo dopingový screening

41 3.1.7 Tenkovrstvá chromatografie (Thin layer chromatography TLC, High performance thin layer chromatography - HPTLC) Chromatografický proces je založen na vzlínání mobilní fáze tenkou vrstvou jemnozrnného sorbentu nebo nosiče zakotvené fáze. Sorbent je buď volně nanesen, častěji spíše fixován na vhodné podložce, kterou je buď skleněná deska nebo hliníková, či plastová fólie. Vzorek se nanese na start a po odpaření rozpouštědla vzorku se deska vloží do uzavřené vyvíjecí komory, která je nasycena parami mobilní fáze. Mobilní fáze unáší dělené látky ze vzorku, které se více či méně zpožďují interakcí (rozpouštěním nebo adsorpcí) se stacionární fází, a tím se vzájemně dělí. Jakmile dosáhne čelo vzlínající mobilní fáze potřebné vzdálenosti, chromatogram se vyjme a provede se detekce. Každá látka je charakterizována polohou na chromatogramu, která se vyjadřuje retenčním faktorem R f (poměr vzdálenosti středu skvrny od startu a vzdálenosti čela od startu). Retenční faktor závisí na konkrétní vyvíjecí soustavě, na povaze látky, ale i na dalších faktorech (např. na teplotě, množství nanesené látky). Velkou předností TLC je jednoduchost provedení a rychlost analýzy, dostupnost příslušného laboratorního vybavení a relativní ekonomická nenáročnost, široké možnosti volby způsobu detekce a možnost od orientačního až po velmi přesné kvantitativní vyhodnocení. Tenkovrstvá chromatografie se ve farmaceutické analýze velice široce využívá pro identifikaci léčiv (např. v lékopisech, včetně Ph. Eur.) jak pro důkazy jednotlivých substancí, tak k identifikaci účinných látek v různých lékových formách, především složených lékových přípravcích, dále při ověřování čistoty látek. Ve farmaceutické chemii je hojně používaná ke sledování průběhu reakce a při určování vhodnosti elučních systémů pro sloupcovou chromatografii a pro detekci látek v jednotlivých frakcích sloupcové chromatografie. 2,43-46 Své místo má chromatografie na tenké vrstvě i v toxikologickém screeningu, je určena k záchytu a identifikaci velkého množství léčiv a drog jako neznámých nox 41

42 ve vzorcích biologického materiálu (moč, žaludeční výplach, zvratky, novorozenecká smolka), či v neznámých tekutinách. Spojuje screeningové a identifikační metody v jednom pracovním postupu. Metoda je kvalitativní a slouží k diagnostice akutních intoxikací, pro kontrolní vyšetření (ověření abstinence, terapie, apod.) a pro zjištění abuzu matky v období těhotenství. 47 V tenkovrstvé chromatografii se uplatňují 2 principy; chromatografie rozdělovací, kdy stacionární fáze je kapalina zachycená v tenké vrstvě a mobilní fáze je také kapalná a adsorpční, kdy stacionární fáze je pevný adsorbent tenké vrstvy, a mobilní fáze je kapalná. Postup při TLC chromatografii: Nanášení vzorku Vzorek se nanese ve formě malé kulaté skvrnky nebo proužku na tenkou vrstvu na vyznačený start, který by měl být alespoň 1 cm nad hladinou mobilní fáze s rozestupy alespoň 0,5 až 1 cm. Vzorek rozpuštěný ve vhodném rozpouštědle (většinou těkavé) se nanáší postupným dávkováním mikropipetou či injekční stříkačkou. Pro snadnější aplikaci lze použít nanášecí zařízení např. firmy Camag Nanomat 4 viz Obr. 10, jeho použití zajišťuje snadné a rychlé použití, hlavně však pohodlné, přesné a reprodukovatelné nanášení. 48 Obr. 10: Nanášecí zařízení Nanomat firmy Camag 48 Na start TLC chromatogramu se vedle sebe nanáší roztok vzorku analyzovaného léčiva a roztok vzorku ověřeného standardu léčiva (pro test způsobilosti i jejich ekvimolární směs). U složených lékových přípravků se nanesou standardy příslušných léčivých látek, pro ověření čistoty se na start nanášejí též standardy předpokládaných 42

43 nečistot, eventuelně rozkladných produktů nebo se velikost a intenzita skvrn nečistot porovná s příslušně naředěným zkoušeným roztokem. 49 Stacionární fáze Prakticky se používají všechny stacionární fáze jako pro kolonovou chromatografii - oxid hlinitý, silikagel, celulóza, iontoměniče, polyamid a silikagel s chemicky vázanými fázemi (-C18, -C8, -NH 2 nebo -CN skupinami). Přilnavost sorbentu k desce se zvyšuje přídavkem pojiva 0,1-10 % (sádra, škrob, polyakrylová kyselina a její soli). TLC desky jsou běžně komerčně dostupné a vlastnosti sorbentů lze měnit různými impregnačními technikami. Síla vrstvy sorbentu se pro analytické účely pohybuje v rozmezí 0,1 až 0,3 mm, velikost částic v rozmezí 5 až 25 µm. Pro HPTLC se používají menší sférické částice (2-10 μm) s jednotnou velikostí nebo monolitické ultratenké vrstvy, zvyšuje se účinnost a citlivost (pg), vyvíjecí dráhu lze zkrátit i na několik cm. 43 K usnadnění detekce analyzovaných látek se přidává fluorescenční indikátor o stejném zrnění, např. aktivovaný sulfát zinku nebo křemičitan hořečnatý, detekovaný analyt pak zháší fluorescenci při 254 nm resp. 366 nm. Pro úplnost je nutno dodat, že některá léčiva (event. jejich reakční produkty) vykazují při 366 nm (event. 254 nm) charakteristickou barevnou fluorescenci, což dále zvyšuje specifičnost důkazu (např. TLC důkazy srdečních glykosidů). 2,47 Někdy stacionární fázi na desce předchází tzv. koncentrační zóna (2-3 cm) tvořená inertním sorbentem, což usnadňuje nanášení vzorků. 43 Vyvíjení Uspořádání může být vzestupné, sestupné (papírová chromatografie), kruhové v komoře nasycené parami rozpouštědel, které vzlíná kapilárními silami. V HPTLC je deska v hermetické komoře s kontrolovaným přetlakem. Vzestupné vyvíjení se provádí dvěma způsoby, v uzavíratelné skleněné komoře nebo mezi dvěma skleněnými deskami. V prvním případě se na dno chromatografické nádoby nalije 43

44 mobilní fáze a deska se umístí mírně nakloněná, tak aby start byl cca 1 cm nad hladinou mobilní fáze. Do komory lze umístit i více desek pomocí speciálního držáku. Vyvíjení probíhá vzestupně. Komora před umístěním desky by měla být nasycena parami mobilní fáze, aby docházelo k rovnoměrnému vyvíjení a nedocházelo k tzv. okrajovým efektům (prohnutí čela chromatogramu). Obložením stěn komory filtračním papírem zasahujícím do mobilní fáze se dosáhne rychlejšího a dokonalejšího nasycení celého prostoru komory. Dokonalého nasycení se dosahuje při druhém způsobu vyvíjení v tzv. sandwich komorách, kdy je chromatogram umístěn mezi dvě skleněné desky., čímž se redukuje volný prostor a těkající rozpouštědlo okamžitě nasytí vnitřní prostor Vyvíjení chromatogramu: jednoduché (v jedné soustavě) vícenásobné aplikují se různé mobilní fáze, na čele nové mobilní fáze dojde k zakoncentrování dvojrozměrné skvrna se vyvine v jednom směru, deska se vysuší a otočí o 90 a vyvíjí se v jiné soustavě 43,51 Detekce Po vyjmutí a vysušení chromatogramu se detekují jednotlivé separované složky. Pokud nejsou dělené látky barevné, je nutno skvrny vizualizovat. Pozorování v UV záření fluorescence či její zhášení na deskách s indikátorem (254 nebo 366 nm) Použití detekčních činidel - postřik činidlem, při tomto způsobu detekce se využívá skupinových nebo selektivních barevných reakcí dokazovaných léčiv; namočení do roztoku nebo působení par např. jódu. 2,43 Vyhodnocení Kvalitativní Skvrna analyzovaného léčiva a skvrna měřeného standardu se na TLC chromatogramu musí chovat stejně. Shodují se R f hodnoty skvrny analyzovaného léčiva a skvrny standardu léčiva, jejich zbarvení po detekci postřikem činidly je stejné. 2,43 44

45 Kvantitativní Přímé metody - jsou založeny na vyhodnocení skvrn na chromatogramu (vizuální, pomocí přístrojové techniky) Měření plochy skvrny logaritmus plochy je úměrný koncentraci Denzitometrie nejběžnější a nejpřesnější skenovací fotodenzitometry převádějí intenzitu skvrn na chromatogram s píky, jejichž plocha je úměrná množství analytu Radiochemické metody pro radioaktivně značené látky Nepřímá metoda skvrna se vystřihne či seškrábe. Separovaná látka se extrahuje a stanoví se její obsah jinou analytickou metodou. Moderní lékopisné monografie zavádějí požadavek na ověření separační schopnosti chromatografické soustavy a požadavek na ověření detekční schopnosti. K ověření separační schopnosti je předepsáno nanesení směsi dvou standardů, konkrétně uvedených u příslušné TLC zkoušky, které po vyvinutí chromatogramu musejí vykazovat dvě zřetelně oddělené skvrny. Ověření detekční schopnosti se provádí předepsaným postupem, kdy na TLC chromatogramu musejí být jasně viditelné skvrny s nejnižší předepsanou koncentrací. 2,43 45

46 3.2 PŘÍPRAVA VZORKŮ K ANALÝZE Je dobře známo, že příprava vzorku je jedním z kritických kroků při stanovení látek v různých matricích, protože matrice může negativně ovlivnit hodnocení analytu (např. léčiv). Existují metody, které jsou schopny detekovat určitou veličinu analytu v pevné fázi, např. infračervená nebo Ramanova spektroskopie, X-ray difrakce. Avšak v HPLC je třeba vzorek vhodným způsobem upravit, aby stanovované látky byly v určitém druhu rozpouštědla extrahovány do definovaného objemu rozpouštědla. Rozpouštědlo musí být vhodné k nástřiku do systému. Biologické materiály a farmaceutické výrobky jsou složité a často obsahují soli, kyseliny, zásady, bílkoviny a další organické sloučeniny s podobnými vlastnostmi jako samotný analyt. Kromě toho se analyty často vyskytují ve vzorcích v nízké koncentraci. 52 Pro úpravu vzorku před analýzou může být použito široké spektrum izolačních technik a všechny způsoby mají stejný cíl: odstranění případných interferencí; zvýšení koncentrace analytu; pokud je to nutné, převedení analytu na vhodnější formu viz Obr. 11. Způsob úpravy má být robustní, reprodukovatelný a nezávislý na proměnlivosti matrice. Ačkoli se stále využívá mnoho tradičních izolačních technik, trendem posledních let je použití menších objemů počátečních vzorků, snížení spotřeby organických rozpouštědel; větší specifičnost a vyšší selektivita, zvýšení potenciálu pro automatizaci. 53 Většina uvedených technik se využívá jak v izolaci látek z biologického materiálu, tak při hodnocení léčivých přípravků. Obr. 11: Schéma možných úprav vzorků různého skupenství 52 46

47 3.2.1 Biologický materiál Biologický materiál lze definovat jako multikomponentní systém obsahující širokou paletu látek o různé molekulové hmotnosti dohromady tvořící biomatrici. Stanovované látky mohou být endogenního (např. proteiny, enzymy) i exogenního (např. léčiva a jejich metabolity) původu. Biologický materiál lze rozdělit na lidský, živočišný a rostlinný. Vhodný výběr a provedení způsobu izolace stanovovaných látek ovlivňuje celkový proces analytického stanovení z hlediska kvantitativního i kvalitativního. 54 Biologický materiál můžeme rozdělit na tělesné tekutiny a sekrety, exkrety, tkáně orgánů a patologických útvarů. Tělesné tekutiny krev, mozkomíšní mok, žaludeční a duodenální šťáva Sekrety z kožních a slizničních ložisek, poševní sliznice, punktát Exkrety moč, stolice, zvratky, sputum, pot Tkáně orgánů - játra, ledviny, žaludek Tkáně patologických útvarů nádory 55 Vlastní zpracování vzorku je závislé na jeho množství a fyzikálně-chemických vlastnostech samotného analytu. Technika zpracování vyšetřovaného materiálu k přípravě analyzovaného vzorku je tím snazší, čím je materiál tekutější a složkově jednodušší. V tomto směru můžeme seřadit vhodnost materiálu v následujícím pořadí: mozkomíšní mok, slzy, pot, sliny, moč, žluč, plasma, sérum, krev, stolice. Jednoduchá a většinou jako první používaná technika je centrifugace (oddělení séra, plasmy z plné krve, deproteinace). 17 Přímé zpracování vyšetřovaného materiálu je možné především pokud jde o likvor, sliny, případně moč, avšak u komplikovanějších systémů biologické matrice (krev) je obtížné v důsledku řady interferenčních vlivů. Z tohoto důvodu se využívají různé druhy extrakčních metod, extrakce do kapaliny, na pevnou fázi a další. 56 Trendem současnosti je snaha o plně automatizované systémy celého analytického procesu, tedy včetně izolace analytu z biologické matrice. On-line systémy se hlavně uplatňují při analýzách velkých sérií vzorků. 47

48 Krev Jedná se o biologický materiál, který je nejčastěji odebírán k analytickému vyšetření. Většina analýz se provádí z venózní krve. V současnosti se uplatňují tzv. mikrometody, které umožňují provedení velkého množství testů z minimálního množství vzorku. Odběrové zkumavky většinou opatřené vacuovým systémem jsou připraveny pro určitý druh odběru (srážlivá a nesrážlivá krev). 55 V případě použití antikoagulancií (např. heparin, K3 EDTA) je nutné brát v úvahu možné ovlivnění testů nebo stanovení jejich přítomností. Primární nevýhodou testování krve na drogy je krátká detekovatelnost (několik hodin až dnů) po užití drogy. Také invazivní metody odběru vzorku znamenají riziko infekce nebo poškození. 57 Kromě plné krve se k testování využívají další její části. Krevní sérum - nažloutlá, tekutá, nebuněčná složka krve, která vzniká po vysrážení plné krve a následným odstraněním krevního koláče mechanicky a centrifugací. 56 Plasma je nažloutlá slabě opalizující tekutá složka krve. Jedná se o slabě zásaditý roztok bílkovin, elektrolytů a malých organických molekul. Skládá se z vody (91 92 %) a z rozpuštěných látek (8 9 %). Rozpuštěné látky v krevní plazmě můžeme dělit na organické (plazmatické bílkoviny, hormony, enzymy, vitamíny, glukóza atd.) a anorganické (0,9%, fyziologický roztok). Krevní plazma je významným regulátorem acidobazické a osmotické rovnováhy. 58 Přidáním antikoagulačních prostředků nedojde ke srážení fibrinogenu na fibrin a tím ke vzniku krevního koláče. Plasma se snadněji dělí centrifugací a objemový zisk vzorku je proti séru větší. 56 Moč Moč je snadno dostupnou biologickou tekutinou, jejíž analýzou získáváme cenné informace o stavu organizmu a jeho metabolizmu. Vyšetření moči patří mezi základní klinicko-biochemické postupy, které významně přispívají ke stanovení diagnózy, sledování průběhu onemocnění a výsledků léčby. Při analýze moči se využívá celé spektrum metod od nejjednodušších barevných, srážecích zkumavkových reakcí až po náročné a automatizované metody (např. průtoková cytometrie, imunochemické analýzy). Díky diagnostickým proužkům lze základní vyšetření provést nejen 48

49 v podmínkách laboratoře, ale přímo v ordinacích či u lůžka nemocného. 58 Moč je hlavním materiálem pro toxikologický screening. Většina endogenních látek přítomných v moči je dobře rozpustná. Léky, pokud nejsou vázány jako konjugáty, patří zpravidla k méně polárním látkám a mohou být snadno extrahovány organickými rozpouštědly. Stejný stav nastane po hydrolýze polárních lékových konjugátů. 56 Moč je dostupná ve velkém množství, může být sbírána neinvazivní metodou a obsahuje vysoké koncentrace metabolitů. 59 Při analýze drog je nevýhodou moči krátké časové okno po příjmu drogy, během kterého je droga detekovatelná (2-3 dny pro většinu drog), trapná metoda sbírání vzorku s možností podvádění, nemožnost opakování sběru vzorku pro potvrzení předešlých sporných vzorků, chudé korelace mezi stupněm návyku a aktuální drogovou koncentrací. 60 Mezi další biologický materiál využívaný v toxikologickém screeningu patří: Sliny - většina léčiv přechází difúzí do slin, kde je jejich hladina v určité korelaci s plasmatickou koncentrací především nevázaného podílu. Průnik do slin je značně ovlivněn rozpustností a ionizovatelností léčiva v krvi. 56 Pro mnoho sloučenin ionizace poskytne rozpustnost ve vodě, a tak zabrání zpětné difůzi ze slin do plasmy. Nestimulované sliny mají ph v rozmezí 5,6-7 a to se stimulací zvyšuje až k maximální hodnotě Hlavní předností stanovení látek ve slinách je snadná dostupnost a jednoduchost získání materiálu.56 Vlasy - drogy jsou distribuovány do vlasu dvěma procesy, a to inkorporací do rostoucího vlasu z krve či adsorpcí z ostatních médií jako potu, kouře nebo prachu z prostředí. Tři hlavní faktory, které ovlivňují inkorporaci drogy do vlasu, jsou: lipofilita, melaninová afinita, membránová permeabilita. (Membránová permeabilita je založena na ph gradientu mezi krví při ph 7,4 a vlasovou matrix při ph < 5). 62 Vlasová analýza se stává velmi důležitou, protože poskytuje mnoho informací o spotřebě po dlouhou dobu. Na druhou stranu analýza lidských vlasů může také poskytnout důkaz o neužívání drog. 63 Nabízí také snadný sběr vzorku, stabilitu vzorku a především širší diagnostické okno (od týdnů po měsíce)

50 3.2.2 Izolace látek z biologického materiálu Při analýze léčiv a jejich metabolitů v biologickém materiálu se setkáváme se základním problémem, kterým je nízká koncentrace léčiva ve vzorku a naopak vysoká koncentrace endogenních látek působících rušivě. Proto je většinou nutné předčištění a zakoncentrování biologického vzorku. Volba vhodné metody úpravy vzorku je důležitou součástí analýzy biologického materiálu. Závisí na druhu zpracovávaného biologického materiálu a na vlastnostech analyzované látky (chemické struktuře, polaritě, rozpustnosti, ionizaci). Dále jsou popsány některé způsoby úprav vzorku před analýzou, podrobněji je uvedena kapitola týkající se SPE (solid-phase extraction), která je součástí publikované práce. 64 Deproteinace Deproteinace biologického materiálu musí splňovat tyto podmínky: úplné odstranění proteinů (i o malé Mr) samotný precipitát nesmí adsorbovat na svůj povrch sledované léčivo deproteinační činidlo nesmí působit na sledované léčivo, ovlivňovat další pracovní postupy, interferovat při vlastní detekční reakci a ani jinak nesmí ovlivňovat analytickou výtěžnost 56 Obecnou nevýhodou deproteinace (až na ultrafiltraci) je zvýšení obsahu exogenních látek ve vzorku, kdy při malé koncentraci stanovované látky by mohla být ovlivněna přesnost stanovení. Současně dochází k naředění vzorku, proto se často volí selektivní extrakční metody. 64 Precipitační deproteinace - přidáním organických rozpouštědel mísitelných s vodou (methanol, ethanol, aceton, acetonitril); silných kyselin (trifluoroctová, trichloroctová, chloristá, mravenčí, konc. chlorovodíková) nebo silných zásad (1 M, 2 M, ale i 10 M hydroxid sodný či draselný). Enzymová deproteinace se provádí působením proteolytických enzymů, např. k proteolýze vlasů bylo použito směsi Proteinase/dithiotreithol 56 Ultrafiltrace je založena na schopnosti membrán separovat molekuly na základě 50

51 rozdílné relativní molekulové hmotnosti. Vázaná složka analytu zůstává společně s proteiny na stejné straně membrány a membránou prošlý filtrát obsahuje jen volnou složku. Pomocí ultrafiltrace lze na membránách zachytit sloučeniny o velikosti 1 až 10 nm tj.sloučeniny o Mr 500 až 1 milion (viry, pyrogeny, proteiny, peptidy) 56 Výhodou této metody je, že nedochází ke změně koncentrace zředěním nebo přítomností jiných iontů z deproteinačních roztoků. 64 Pro dosažení vyšší selektivity při zachování vysokých objemových kapacit byla ultrafiltrace spojena s afinitními interakcemi do metody afinitní ultrafiltrace. 65 Ultrafiltrace se hodí pro dva druhy sledování: stanovení léčiv, která nejsou vázaná na proteiny, ale pro vlastní analýzu je nutno je oddělit od bílkovinného prostředí stanovení volného podílu z celkového množství léčiva, jehož podíl je vázán na bílkoviny 56 Extrakce nadkritickým plynem (supercritical fluid extraction - SFE) Supercritical fluid je látka, která je nad svou kritickou teplotou a tlakem (scco 2 t c =31 C, p c =73,8 atm), má fyzikální vlastnosti mezi plynem a kapalinou. Rozpouštěcí vlastnosti se mění změnou jeho teploty či tlaku. Nadkritická extrakce pak závisí na jeho schopnosti selektivně rozpouštět různá množství netěkavých látek 66 Například dekontaminované vlasy se umístí do 7 ml náprstku mezi 2 filtry a náprstek se vloží do extrakční komory. SFE procedura se skládá z očistného kroku následovaného extrakčním krokem. Vychytané sloučeniny jsou potom vymývány organickým rozpouštědlem 67 Extrakce do kapaliny (liquid-liquid extraction - LLE) Ačkoli se jedná o nejstarší metodu, LLE se stále řadí mezi důležité způsoby úprav vzorků. Umožňuje mnoho jednoduchých, rychlých a selektivních dělení širokého spektra látek ve velkém koncentračním rozmezí. Princip extrakce spočívá v rozdělení extrahované látky mezi dvě vzájemně nemísitelné kapaliny v rozdělovacím poměru K podle Nerstova zákona: 51

52 K = celková koncentrace v org.fázi / celková koncentrace ve vod.fázi [mg/ml] Při výběru vhodných rozpouštědel pro extrakci je nutno přihlížet především k rozpustnosti extrahovaných látek v obou fázích a k rozdílu v rozdělovacím poměru mezi nimi. Je-li K > 1, tj. přechází-li látka spontánně z původního roztoku do rozpouštědla, pak často stačí pouhým protřepáním obou fází převést všechnu látku do rozpouštědla. Je-li K < 1, musí být provedena vícestupňová extrakce. Po provedené extrakci je organická fáze obsahující analyzovaný vzorek odpařena do sucha v proudu dusíku. Odparek je rozpuštěn v minimálním objemu mobilní fáze a aliquot je vstříknut na kolonu chromatografu. Tímto postupem je vzorek zbaven některých interferenčních látek a současně dojde k zakoncentrování stanovovaných látek 64 Extrakční proces závisí na řadě faktorů: fyzikálně-chemické vlastnosti rozpouštědla potlačení ionizace analytu (úprava ph, přídavek solí) vzájemný poměr nemísitelných fází způsob a doba trvání extrakce (vícestupňová extrakce) 56 Výhody LLE - jednoduchost, minimální nároky na instrumentaci (ekonomická stránka), široká oblast využití. Nevýhody LLE větší objemy vzorků, tvorba emulzí, spotřeba organických rozpouštědel, problém s automatizací. Mikroextrakce rozpouštědly (solvent microextraction - SME) Principem tohoto systému je kapka (cca 2 µl) organického rozpouštědla na konci teflonového vlákna nebo jehly, která je umístěna nad nebo uvnitř roztoku vzorku. Extrakční kapka zůstává na stříkačce po dobu extrakčního času, po té je pístem stříkačky vtažena zpět a provede se nástřik do chromatografického systému viz Obr SME má různé techniky provedení nechráněné rozpouštědlo, kam se řadí SDME (single-drop microextraction), HSSDME (headspace single-drop microextraction), LLME (liquid-liquid microextraction), a DLLME (dispersive liquid-liquid microextraction); 52

53 membránově chráněné rozpouštědlo - HF(2)ME (hollow-fiber-protected 2-phase microextraction) a HF(3)ME (hollow-fiber-protected 3-phase microextraction), kde lze spojit několik dějů dohromady (filtraci, extrakci i derivatizaci) Obr. 11: Schéma provedení SME 69 V současnosti je LLE metoda široce zastoupena a stále rozvíjena, avšak vzhledem k její omezené možnosti automatizace je nahrazována extrakcí na pevných fázích (SPE) Extrakce na pevných fázích (solid-phase extraction, SPE) Principem extrakce biologických vzorků na pevných fázích je rozdělení analytu mezi dvě nemísitelné fáze, přičemž jedna z nich je pevný sorbent, a následné vymytí analytu ze sorbentu elučním činidlem, čímž se dosáhne rychlého a účinného zakoncentrování a zároveň odstranění balastů ze vzorku. Metoda spočívá v selektivním zadržení skupiny látek na pevné fázi, která je ve formě sloupce nebo membrány v krátké kolonce či disku viz Obr 12, Obr. 12: Schéma provedení SPE pomocí extrakční kolonky 77 53

54 Obr. 13: Schéma provedení SPE pomocí extrakčního disku 77 SPE je jednoduchá a rychlá extrakce, vykazující dobrou výtěžnost i reprodukovatelnost. V závislosti na použitém sorbentu s navázanými fázemi lze dosáhnout maximální selektivity separace látek při minimální spotřebě elučních rozpouštědel. Použitím vakuového systému lze tento postup automatizovat, což umožní zpracování několika vzorků najednou. Dále ji lze propojit on-line s některými detekčními technikami a je zde také možnost sekvenční eluce sorbovaných látek a zpracování velkoobjemových vzorků. Analyty jsou při SPE zadržovány stejnými mechanismy jako v případě HPLC. Tento způsob extrakce se jeví jako nejvhodnější technika pro izolaci léků a jejich metabolitů z biologického materiálu. Obecné požadavky na sorbenty pro SPE: musí být nerozpustné v používaných elučních rozpouštědlech, nesmí reagovat s elučními rozpouštědly, musí být inertní k analyzovaným látkám, mají mít velkou adsorpční kapacitu při zachování reverzibility děje. 13 Výhody SPE selektivita, jednoduchost, reprodukovatelnost, malá spotřeba rozpouštědel, časová nenáročnost, snadné skladování a transport vzorků prekoncentrovaných na kolonách (skladování až 8 měsíců při -20 C nebo 3-4 měsíce při 4 C) (10) a možnost automatizace. Nevýhody SPE pro některé specifické izolace nejsou na trhu vhodné kolonky, proměnlivá kvalita sorbentů

55 Extrakční módy Selektivní extrakce - sorpce vybraných látek, ostatní složky matrice nejsou zadržovány, následuje eluce analytů Selektivní eluce - sorpce analytů i ostatních složek matrice, eluce pouze analytů Selektivní promývání - sorpce analytů i ostatních složek matrice, vymytí balastních látek (analyty zůstávají zadrženy), eluce analytů Odstranění balastů - sorpce balastů matrice, analyt prochází bez zadržení Způsob provedení SPE V závislosti na vlastnostech analytu a rozpouštědla je zvolen sorbent pro extrakci. Nejlepší retence analytů je, když se polarita analytu podobá polaritě pevné fáze. Vlastní provedení se skládá z následujících kroků. Aktivace sorbentu (kondicionace kolonky) Nejprve je sorbent aktivován vhodným rozpouštědlem, kdy navlhčením sorbentu dochází k solvataci funkčních skupin, které pak mohou interagovat s analytem. Aktivační proces napomáhá vyšší výtěžnosti analytu a jednoduššímu průchodu tekutiny sorbentem. Polární sorbenty se aktivují nepolárními rozpouštědly (obvykle hexanem) a nepolární sorbenty se aktivují polárními rozpouštědly (methanol nebo acetonitril). Aktivační rozpouštědlo se nechá protéci kolonkou a následuje promytí rozpouštědlem, jehož ph a iontová síla jsou podobná roztoku vzorku (ideální je rozpouštědlo vzorku). Použité objemy těchto roztoků mohou mít rozhodující vliv na výsledek extrakce. Je-li použito nadměrné množství promývacího roztoku, může dojít k deaktivaci sorbentu. 73,78 Aplikace vzorku Následuje pasáž vzorku přes kolonku nebo disk, podle druhu vzorku a sorbentu dochází ke specifickým reakcím na jeho povrchu a zadržování jak sledovaných analytů, tak případných nečistot nebo balastů. Průtoková rychlost je zvolena tak, aby docházelo 55

56 ke kvantitativnímu zadržení analytu na sorbentu a přitom nedocházelo k velkým prodlevám. Promytí Tento krok může být v některých případech vynechán, sorbent je promýván rozpouštědlem s vyšší eluční silou za účelem vymytí sorbovaných nečistot a balastů. Někdy se může provést vysušení sorbentu (proudem inertního plynu) pro odstranění zbytků rozpouštědla, které by mohlo negativně ovlivňovat následnou eluci analytu. Eluce Posledním krokem je eluce analytu vhodným rozpouštědlem s vysokou eluční silou, dochází tak k desorpci analytu ze sorbentu a jeho vymytí z kolonky. Takto získaný eluát je možné podrobit analýze. Jestliže není kompatibilní s analytickým systémem, je třeba provést odpaření eluátu do sucha a odparek rozpustit ve vhodnějším rozpouštědle. Před vlastní SPE se v některých případech musí provést předúprava analyzovaného vzorku. Velmi viskózní vzorky se ředí za účelem dosažení optimálních průtoků, pevné částice se odstraňují filtrací, k vodným roztokům se přidává 1-3 % organického rozpouštědla k zajištění solvatace sorbentu, u reverzních systémů je vhodná úprava ph za účelem snížení ionizace slabých kyselin a zásad. 79 Instrumentace pro extrakci Průchod kapaliny pevnou fází se usnadňuje působením tlaku. Potřebný tlak může být realizován tlakem plynu stlačovaného pístem stříkačky nebo odstředivou silou v centrifugačním zařízení. Častěji se používá podtlaku viz Obr. 14. Průtokový poměr kapaliny přes pevnou fázi může ovlivnit výtěžnost reakce. Podle typu cartridge se doporučují průtoky 0,5 až 5 ml.min -1 a u disků mohou být průtoky 10 vyšší. Velikost používaného vakua se pohybuje v rozmezí 6,8 34,0 kpa. Všechny tyto procesy lze snadno automatizovat a dokonce on-line spojit s některou z chromatografických metod, což přináší řadu výhod. Přímé dávkování vzorku snižuje bezpečnostní rizika při práci s biologickým materiálem

57 Obr. 14: Přístroj firmy Supelco Visiprep SPE 81 Na trhu je v současné době velké množství výrobců, které nabízejí rozmanité spektrum SPE kolonek či disků, typy použitých sorbentů kopírují sorbenty pro běžné analytické kolony. Rozdíl je ve velikosti částic 10 až 100 (obvykle cca 40 µm), materiál je založen na bázi silikagelu, polymerech, pryskyřicích naplněných v polypropylenových kolonkách nebo skleněných pouzdrech, mívají tvar injekční stříkačky viz Obr Obr. 15: Ukázky extrakčních kolonek a disků 82 Nevýhody SPE kolonek - omezený průtok (malý poměr průtočné plochy a sloupce sorbentu), vytvoření kanálků, a tím nerovnoměrného kontaktu analytu s částicemi sorbentu (nehomogenita sorbentu, prostor mezi volnými částicemi), nejednotný průtok, znamená nejednotnou sníženou sorpční kapacitu a reprodukovatelnost. 83 Pokroky v technologii sorbentů umožnily začlenění částic sorbentu jako pevné fáze mezi skleněná a syntetická vlákna. U extrakčních disků jsou částice sorbentu malé a těsně vzájemně uspořádané, což zabezpečuje rovnoměrný kontakt analytu se 57

58 sorbentem a minimalizuje tvorbu kanálků. Hlavními důvody pro používání SPE disků je jejich vyšší selektivita, zakoncentrování vzorku ve velmi úzké zóně membrány, k eluci stačí řádově mikrolitry rozpouštědla. Další výhodou je neomezená průtoková rychlost (tenká vrstva, malý rozdíl tlaků) a také úspora času (1 l vody: 10 min 45mm disk, 2 hod kolonka). Nevýhodou je zatím omezený výběr počtu fází. Ploché disky jsou podobné klasickým membránovým filtrům (síla 1 mm, průměr 4-96 mm). Komerčně se vyrábí rigidní disky (skleněná vlákna se zakotvenou fází) a membránové disky (pružná PVC či PTFE síť s chemicky vázanou stacionární fází, rigidní jsou levnější, dosahují rychlejších průtoků a méně se ucpávají. 84 Nároky na snižování objemů vzorků a použitých rozpouštědel byly podnětem pro rozvoj dalších metod založených na principu extrakce na pevnou fázi. Mezi tyto metody patří: Mikroextrakce na pevných fázích (solid-phase microextraction - SPME) SPME integruje vzorkování, extrakci, koncentraci vzorku do jediného kroku a nabízí jednoduchou snadno automatizovatelnou alternativu k tradičním metodám pro přípravu vzorku. SPME používá křemenné vlákno potažené tenkou vrstvou polymerní stacionární fází (CW-Carbowax, DVB-divinylbenzen, PDMSpolydimethylsiloxan, PA-polyakrylát) nebo směsí polymerů smíšených s porézním pevným materiálem (např. PDMS-Carboxen) viz Obr. 16. Množství extrahovaných analytů závisí na rozdělovacím koeficientu mezi potahem vlákna a vzorkovou matrix. 85 SPME se rychle po svém uvedení zařadila mezi standardní metody přípravy vzorku pro plynovou chromatografii (GC), ale lze ji využít i v kapalinové chromatografii a kapilární elektroforéze. Při odebrání vzorku není třeba žádný dodatek rozpouštědla, SPME šetří čas a náklady pro preparaci a často zvyšuje citlivost analýz. Většina analytů zkoumaných pomocí GC může být efektivně extrahována pomocí SPME. Tato technika umožňuje dosažení velmi nízkých detekčních limitů (5-50 ppt). Přibližná doba přípravy vzorků podle SPME je obvykle v rozmezí od 2 do 15 min. 86,87 58

59 Způsoby extrakce: imerzní sorbentem potažené vlákno je ponořeno přímo do roztoku vzorku, kde se analyty dělí adsorpcí či absorpcí z roztoku do stacionární fáze a kde jsou koncentrovány. Po dosažení rovnováhy nebo po definovaném čase je vlákno vytaženo a přeneseno do GC injektoru, kde jsou analyty teplotně desorbovány a chromatografovány. Agitace (tj.míchání nebo ultrazvuk) vzorkové matrix zlepšuje transport analytů z objemné vzorkové fáze do blízkosti vlákna. headspace - stejný postup jako u imerzní extrakce, pouze vlákno je umístěno do prostoru nad kapalinou v uzavřené nádobě Obr. 16: Schéma pro SMPE 88 Výhody - snadné provedení; ekonomicky nenáročné; bez použití rozpouštědel (ekonomika, zdravotní aspekt); citlivost; možnost automatizace; vzorkování in situ ; opakované použití vlákna Nevýhody - (někdy) náročná optimalizace; omezené použití nepolárních rozpouštědel; horší opakovatelnost; robustnost Další metody založené na podobném principu je např. extrakce pomocí míchadla (stir bar sorptive extraction SBSE), kdy je sorbent ukotven v tenké vrstvě na povrchu magnetického míchadla a extrakce probíhá přímo v roztoku, po osušení je míchadlo umístěno do tepelné desorpční trubice a následuje GC analýza. Jedná se o velmi snadnou a rychlou metodu, která dosahuje nízkých detekčních limitů viz Obr

60 Obr. 17: Schéma extrakčního míchadla pro SBSE 89 Na pevných fázích se provádí i extrakce využívající tzv. imunosorbenty. Jedná se o imunoextrakci na pevných fázích (solid-phase immunoextraction - SPIE), extrakce založená na protilátkách se používá pro selektivní zakoncentrování a čištění nízkomolekulárních sloučenin od biologických matric. Například pro izolaci morfinu z moči byly použity imonosorbenty tvořené specifickými protilátkami proti morfinu imobilizovanými na křemelině. Metoda je rychlá, jednoduchá a díky čistému extraktu pro HPLC dává spolehlivý výsledek. 90 LSD ImmuneElute extrakční souprava obsahuje protilátky k LSD spojené se zesítěnou agarózovou pryskyřicí. Při inkubaci vzorku s pryskyřicí je LSD vázáno protilátkami. Poté je pryskyřice promyta vodou, aby se odstranily endogenní sloučeniny. Přidáním methanolu se denaturují protilátky, čímž dojde k uvolnění LSD z jejich vazebných míst. Nezáleží na tom, zda je užito sérum nebo moč, v obou případech jsou získány velmi čisté extrakty. Procedura byla také aplikována na vzorky vlasů. Po extrakci methanolem s použitím ultrazvuku bylo odpařeno rozpouštědlo a odparek byl rozpuštěn ve fosfátovém pufru s přídavkem hovězího sérového albuminu. (Přídavek BSA k surovému vlasovému extraktu zlepšuje reprodukovatelnost následné SPIE) Léčivé přípravky Celkové hodnocení farmaceutických přípravků zahrnuje v některých případech kromě základních fyzikálně chemických zkoušek také izolaci jednotlivých komponent přípravku, které jsou následně identifikovány a kvantifikovány. Náročnost izolace závisí na lékové formě, nejčastěji se hodnotí účinná látka, případné nečistoty a konzervační přísada.hplc metoda je pro hodnocení léčivých přípravků používána ve značné míře, 60

61 její výhodou je možnost ověření totožnosti, čistoty a obsahu při vhodně zvolených podmínkách během jedné analýzy. 2 Kapalné lékové formy (injekce, sirupy, kapky) Metoda přímého nástřiku - nejjednodušší způsob úpravy léčivého přípravku, používaný především pro tekuté lékové formy. Vhodným způsobem naředěný roztok se rovnou dávkuje do chromatografického systému. U emulzí a suspenzí se v některých případech využívá LLE. Pevné lékové formy (tablety, tobolky, zásypy) Izolace se nejčastěji provádí jednoduchým způsobem, kdy se pevná léková forma rozmělní a stanovovaný analyt se extrahuje do vhodného rozpouštědla, v některých případech s pomocí ultrazvuku. Dále následuje filtrace nebo centrifugace. Polotuhé lékové formy (masti, pasty, gely) V jednodušším případě se krém nebo mast rozpustí (protřepe, UZ) v mobilní fázi nebo samotném organickém rozpouštědle, zchladí a přefiltruje. Gelové formy se po úpravě ph vesměs extrahují LLE. Transdermální náplasti Účinná látka se extrahuje organickým rozpouštědlem, v některých případech za vyšší teploty. 61

62 3.2.4 Derivatizace I když je vysokoúčinná kapalinová chromatografie metoda aplikovatelná na široké spektrum vzorků, přece jen má svá omezení. Hlavní podmínkou je převedení analyzované látky do roztoku. Na rozdíl od plynové chromatografie, kdy je žádoucí převedení vzorku bez rozkladu na plynnou fázi, je HPLC vhodná i pro přímou analýzu netěkavých a tepelně nestabilních sloučenin. Pokud je samotná látka pro analýzu nevhodná, je možné ji chemickou reakcí převést na jinou sloučeninu s výhodnějšími vlastnostmi. Metody využívající chemických změn, které můžou být prováděny v jakémkoliv místě chromatografického systému, jsou obecně zahrnuty pod pojem reakční chromatografie. V praxi to znamená, že se provede derivatizace analyzované látky s vhodným derivatizačním činidlem. Touto reakcí vznikne sloučenina s vhodnějšími vlastnostmi, které mohou umožnit samotnou separaci nebo zvýšit citlivost detekce, usnadnit identifikaci či stanovení látek. Při provádění derivatizace hraje klíčovou roli výběr podmínek chemické reakce (reakční čas, teplota, ph a další). 13,92 Způsoby realizace derivatizace: Pre-column derivatizace jde o předkolonovou úpravu, tzn. chromatografují se produkty chemické reakce. Sem patří i derivatizace prováděné mimo chromatografický systém, jedná se o derivatizace v roztocích nebo na extrakčních kolonkách. On-line derivatizace chemická reakce probíhá na chromatografické koloně. Vzorek reaguje s činidlem, které může být součástí chromatografické náplně nebo se vzorek a činidlo dávkují postupně za sebou ve vhodném pořadí přímo na chromatografickou kolonu. Post-column derivatizace chemické reakci jsou podrobeny rozdělené složky směsi vycházející z chromatografické kolony. Této reakce se využívá jednak k přeměně látek málo citlivých na detekci na látky lépe detekovatelné a jednak k identifikačním účelům. V praxi lze využít i kombinaci výše uvedených způsobů. 62

63 Derivatizační postupy využívají tvorby derivátů v roztoku nebo v systému kapalinatuhá fáze. Nejrozšířenější způsob derivatizace je v roztoku, uskutečňuje se mimo chromatografický systém nebo v reaktoru zařazeném za směšovací zařízení. Při derivatizaci v systému kapalina-tuhá fáze slouží povrch tuhé fáze jako reagent, katalyzátor nebo jako nosič vázané látky. Její výhodou je, že nedochází k naředění vzorků a umožňuje automatizaci postupu zařazením reakční komory přímo do systému chromatografické soustavy. 13,92 Základním požadavkem na derivatizační reakci je, aby byla rychlá, její průběh byl jednoznačný a aby nebyla příliš náročná na reakční podmínky. Vzniklý produkt musí vykazovat nějakou charakteristickou vlastnost, v oblasti HPLC je můžeme rozdělit do několika skupin: deriváty vhodné k detekci v oblasti UV-VIS spektra deriváty vhodné k detekci fluorimetrické deriváty vhodné k detekci radiochemické deriváty vhodné k detekci elektrochemické deriváty vhodné k detekci atomovou absorpční spektrofotometrií U derivátů amfetaminu hodnocených v dizertační práci se v analýze pomocí HPLC poměrně často využívá derivatizačních reakcí. Prvním důvodem jsou obecně nepříliš vhodné vlastnosti aminů pro chromatografii. Amfetaminy dále nevykazují žádnou výraznou nebo charakteristickou absorpci v UV oblasti, stejně tak jejich přirozená fluorescence je velmi nízká. Výjimku tvoří látky typu extáze (MDMA, MDEA apod.), které vykazují i bez derivatizace přece jen silnější fluorescenci V literatuře je popsána celá řada činidel i postupů. Obvykle následuje fluorescenční detekce nebo detekce v UV-VIS oblasti. Existují však i práce využívající po derivatizaci chemiluminiscenční detekce. 96,97 Činidla používaná pro vznik derivátů pro detekci v UV-VIS oblasti: Pro aminy a aminokyseliny: ninhydin, benzoylchlorid, fenylisokyanát, 2,4-dinitro-1- fluorbenzen, 1,2-naftochinon-4-sulfonát Pro karboxylové kyseliny: fenacylbromid 63

64 Pro hydroxyderiváty: 3,5-dinitrobenzoylchlorid, benzoylchlorid Pro karbonylskupinu: 2,4-dinitrofenylhydrazin 22 Derivatizace pro fluorimetrickou detekci Účelem této techniky je zavést do molekuly takovou skupinu, která vykazuje fluorescenční vlastnosti a umožní tak detekci těchto látek. Tyto deriváty vykazují detekční limit až o tři řády nižší než deriváty detekované v ultrafialové a viditelné oblasti spektra. Pro praktické použití fluoroderivátů by měly platit určité předpoklady: rychlá a kvantitativní reakce za mírných podmínek (vodně-organická rozpouštědla, laboratorní teplota). tvorba nepolárních derivátů dovolující jejich extrakci do nepolárních rozpouštědel. specifičnost pro danou funkční skupinou. nadbytek derivatizačního činidla musí být snadno separován od jeho produktů. deriváty by měly mít uspokojivé chromatografické vlastnosti a měly by být dostatečně stabilní. Činidla používaná pro vznik derivátů pro fluorimetrickou detekci: Pro karbonylovou skupinu: dansylhydrazin, o-fenylendiamin Pro karboxylovou skupinu: 4-brommethyl-7-methoxykumarin Pro aminy a aminokyseliny: 5-N,N -dimethylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid 5-N,N -dimethylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid = dansylchlorid (Dns-Cl) je jedno z nejstarších a nejrozšířenějších derivatizačních činidel vůbec, poskytuje deriváty s aminy i některými fenoly. Reakce s primárními, sekundárními aminy a aminokyselinami probíhá v mírně alkalickém prostředí, vodně-acetonovém prostředí za několikanásobného nadbytku činidla viz Obr 18. Za vyššího ph reaguje i s fenoly, imidazoly a pomalu dokonce i s alkoholy. Rychlost dansylační reakce vzrůstá se vzrůstajícím ph prostředí, ale současně vzrůstá rychlost hydrolýzy derivátů. Optimální ph prostředí se pohybuje od ph 9,5 do ,22,

65 Obr. 18:Schéma reakce Dns-Cl s aminy 9-Fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl) reaguje jak s primárními tak sekundárními aminokyselinami podle uvedeného schématu Obr. 19 za vzniku fluoreskujících derivátů s excitačním maximem při 263 nm a emisním maximem 313 nm a používá se výhradně k derivatizaci před kolonou. Výhodami jsou vysoká rychlost reakce, jednoduché reakční podmínky, dobrá stabilita produktů. Produkty lze hodnotit fluorescenčně, ale i pomocí UV detekce. 22, Obr. 19: Schéma reakce 9-FMOC-Cl s aminy Dalším hojně užívaným fluorescenčním činidlem je 4-(4,5-difenyl-1H-imidazol-2-yl)- benzoylchlorid (DIB-Cl). Byl použit např. v těchto pracech Deriváty silně fluoreskují a jsou stabilní. Reakční podmínky jsou mírné (10 min. při 25 C a ph 9,0). Méně často používaným činidlem je o-ftalyldialdehyd (OPA). 101, Může totiž reagovat pouze s primárními aminy. Produkty se detekují fluorimetricky. Derivatizace hraje důležitou roli i při analýzách studujících enantiomery amfetaminů. Existují dva přístupy. Buď se nechá vzorek reagovat s opticky čistou sloučeninou a tak vzniknou diatereoizomery, které se liší svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Následuje separace na achirální stacionární fázi. Nejobvyklejším činidlem je analog FMOC-Cl 1-(9-fluorenyl)etyl chloroformát (FLEC). Nebo se využívá kolon s chirálními stacionárními fázemi (např. β-cyklodextrin, kolony Chiralcel). 105,106,111 65

66 3.3 VALIDACE ANALYTICKÝCH METOD Validace analytické metody je proces, kterým se zjišťují nejdůležitější charakteristiky metody. Smyslem validace je demonstrovat, že vypracovaná metoda je pro daný účel vhodná. Vhodností se rozumí, že je přesná a správná. Všechny parametry musí být doložené experimentálně, potvrdí se, že zvolená metoda poskytuje reprodukovatelné a spolehlivé výsledky a je vhodná pro zvolené použití. Cílem validace je také zajistit stejnou spolehlivost i při opakovaném použití v jedné nebo i více laboratořích. Validace je zároveň nedílnou součástí registrační dokumentace. Obecně je postup validace takový, že se definují požadavky na zkušební metodu, vyvine se a optimalizuje se metoda, nakonec se metoda validuje, čímž se prokáže její vhodnost a splnění stanovených požadavků. Validace metod ve farmacii se řídí platnými předpisy a doporučeními, především ICH směrnice řady Q (Q2A a Q2B), které unifikují požadavky na validace v regionech EU, USA a Japonska. Na tyto směrnice se odkazuje Evropská agentura pro léčivé přípravky (European Medicines Agency, EMEA), Úřad pro potraviny a léčiva v USA (Food and Drug Administration, FDA), kanadské, australské a většina ostatních regulatorních orgánů. I když se jedná o základní materiály, je třeba si uvědomit, že nejsou v žádném případě vyčerpávající, spíše uvádějí minimální požadavky na validace. Obvyklými parametry, které se ověřují během validace, jsou: Správnost, přesnost (opakovatelnost a mezilehlá přesnost), linearita, detekční a kvantitativní limit, robustnost (ověřuje se už během vývoje metody). 1,2,112,116 Kromě ideálního, cílového stavu, kdy je metoda přesná a správná, můžou nastat ještě další 2 stupně: Metoda přesná a nesprávná hodnota relativní směrodatné odchylky je nízká, ale odchylka od správné hodnoty je velká jedná se o systematickou chybu v analytickém postupu. Metoda nepřesná, ale správná hodnota relativní směrodatné odchylky je vysoká, ale průměrná hodnota odpovídá správné hodnotě jedná se o náhodné chyby v analytickém postupu. Na rozdíl od fyzikálních měření, jejichž výsledky lze uvádět v základních jednotkách 66

67 SI soustavy, jsou chromatografická měření návazná na příslušné certifikované referenční materiály, proto je nutné používat referenční látky s dokumentovanou čistotou. Validace analytické metody je základem pro validaci celých procesů. Pouze validovanou metodou lze dále validovat příslušný výrobní proces. Bez ověřeného systému měření neexistuje způsob, jak posoudit, zda je daný proces vhodný pro zamýšlený účel. Bez důvěry ve výsledky měření vzorků vstupních surovin, mezioperačních kontrol a hotových výrobků by bylo těžké potvrdit, že vyráběný produkt má stále stejnou kvalitu a vyhovuje souboru požadavků pro dané použití. Zkušenosti z praxe dokládají, že validační měření nejsou samoúčelná, naopak významně pomáhají optimalizovat nově vyvíjené metody. 1,2,115 Kdy validovat? Jako každý vývoj analytických metod má svá stádia i validace probíhá podobným způsobem. Rozsah a způsob validace závisí na stupni zralosti metody. Jiné parametry se ověřují při prvních analytických pokusech, jiné při přenosu (transferu) metody do rutinního používání. Validace metod je proces, který je stále otevřený a neustále se vyvíjející. Přesto je z praktického hlediska vhodné definovat časové body v životě analytické metody, kdy je třeba validovat: Při vývoji nové metody. Při revizi metody kvůli úpravám nebo rozšíření na nový problém (revalidace). V případě nějaké změny v syntéze aktivní látky, ve složení léčivého přípravku, či změně v analytické metodě samotné, provádí se revalidace metody. Míra revalidace je závislá na povaze provedené změny a musí být patřičným způsobem zdůvodněna a doložena. Vykazuje-li metoda během času nějaké změny. Metoda je použita v jiné laboratoři (přenos metody = transfer). Srovnání dvou nezávislých metod pro stejný účel (cross-validace). 114,115 67

68 Postupy a náležitosti validace: Validace je provedena na kvalifikovaném přístroji Validační plán co se má validovat Validační protokol cíle a postupy validace Validační zpráva výsledky validace Kompletní dokumentace záznamová, hrubá data Schválení validace a uvolnění metody k používání Doporučené požadavky na validaci dle typu analytické metody na základě ICH směrnice jsou uvedené v tabulce 2. Tab. 2 Parametry ověřované v příslušném rozsahu při validaci metod Zkouška totožnosti Analytická metoda Hodnocení nečistot Kvantitativní Limitní Obsah léčivé látky Správnost Přesnost (opakovatelnost) Mezilehlá přesnost Linearita Detekční limit Kvantitativní limit Selektivita parametr není obvykle požadován +parametr je obvykle požadován 1 parametr není nutný, byla-li provedena reprodukovatelnost 2 někdy může být požadován Zjištěné hodnoty validačních parametrů se zaznamenávají do validačního protokolu, který musí obsahovat též patřičnou dokumentaci (např. chromatogramy). 112,115,116 68

69 Správnost (accuracy) Vyjadřuje blízkost shody nalezených a skutečných hodnot. Správnou hodnotu lze zjistit jinou nezávislou metodou s ověřenou správností, nebo přípravou modelového vzorku obsahujícího všechny složky přípravku a přesný přídavek vhodného standardu. Nejsou-li k dispozici všechny složky přípravku, analyzuje se přípravek se známým přídavkem standardu. Správnost metody lze prakticky provádět několika způsoby: Analýza modelového vzorku pro validaci správnosti stanovení účinné látky. Obvykle se připravuje 9 modelových vzorků placeba s přídavkem stanovované látky v množství 80%, 100% a 120% deklarovaného množství dané látky, třikrát pro každou koncentraci. Standardní přídavek. Není-li k dispozici placebo, analyzují se vzorky s přídavkem standardní látky. V tomto případě se připraví 6 modelových vzorků s maximálně 50% přídavkem stanovované látky. Zároveň je třeba ověřit linearitu ve větším rozsahu. Přídavek nečistot. Je metoda ověřující správnost pro zkoušku čistoty. Koncentrace substance nebo přípravku je 100%, nečistota se přidává v množství rovnajícím se kvantitativnímu limitu. Pro správnou interpretaci výsledků se při výpočtu zahrnuje odezvový faktor nečistot. Správnost se vyjádří jako procentuální výtěžnost (recovery) analytu přidaného do vzorku nebo jako rozdíl správné a získané hodnoty: Recovery (%) = nalezená hodnota. 100 správná hodnota Vypočítaná výtěžnost se společně s relativní směrodatnou odchylkou stanovení popř. intervalem spolehlivosti uvede do validační zprávy. 1,115,116 Přesnost (precision) Přesnost vyjadřuje blízkost shody získaných výsledků po opakovaném zpracování jednoho homogenního vzorku., Je definována relativní směrodatnou odchylkou. Podle podmínek opakování se rozlišují tři úrovně přesnosti: 69

70 Opakovatelnost (repeatability) vyjadřuje míru shody mezi výsledky v rámci jedné série homogenních vzorků měřených za předepsaných podmínek jedním analytikem na stejném přístroji se stejnými činidly. Obvykle se analyzuje 6 nezávislých vzorků připravených přesně podle postupu popsaného v dané metodě (100% koncentrace) nebo se provede nejméně 9 stanovení pokrývající příslušné koncentrační rozmezí (tj. minimálně 3 stanovení na minimálně 3 koncentračních úrovních). Do validační zprávy se uvedou jednotlivé výsledky, vypočítaná průměrná hodnota a relativní směrodatná odchylka stanovení. Mezilehlá přesnost (intermediate precision) vyjadřuje míru shody mezi výsledky analýz získaných s homogenním vzorkem nejméně v časovém odstupu, dvěma různými analytiky, na různých přístrojích v rámci jednoho pracoviště. Každý analytik analyzuje 6 nezávislých vzorků stejné šarže analytu připravených přesně podle předepsaného postupu. Ve validační zprávě se uvádějí výsledky každého analytika a rozdíl mezi průměrnými výsledky jednotlivých analytiků. Účelem je postihnutí nepředvídatelných vlivů na přesnost metody. Reprodukovatelnost (reproducibility) - vyjadřuje míru shody mezi výsledky analýz získaných v různých laboratořích. Provádí se za účelem standardizace analytické metody a není požadována jako součást registrační dokumentace Linearita (linearity) Je to schopnost metody poskytovat výsledky v určitém koncentračním rozsahu přímo úměrné koncentraci sledované látky ve vzorku. K prokázání linearity se použijí navážky referenční látky nebo příslušným způsobem naředěný roztok referenční látky, rušivé vlivy matrice vzorků jsou hodnoceny jinými parametry validace. Obvykle se stanovuje minimálně na pěti různých koncentračních hladinách v rozmezí % nebo % deklarovaného obsahu; LOQ 120 % limitu u příbuzných látek. Pokud je metoda lineární, lze s výhodou určit směrnici z jednoho kalibračního bodu. Pokud není, je třeba výsledky vyhodnocovat z celé kalibrační křivky. Získané výsledky se vhodným statistickým způsobem vyhodnotí, spočítá se korelační koeficient r a rovnice přímky na základě lineární regrese. 1,114 70

71 Rozsah (range) Rozsah, v jakém jsou jednotlivé parametry validovány, zajišťuje dosažení přijatelné úrovně spolehlivosti výsledků hodnocených vzorků, který obsahují analyt v celém očekávaném rozmezí. 113 Tento parametr se obvykle odvozuje z linearity a závisí na účelu, pro který je metoda určena. Dle typu metody je definován rozsah, ve kterém je ověřována linearita: Hodnocení obsahu: minimálně 5 bodů v rozmezí % koncentrace analytu. Obsahová stejnoměrnost: minimálně 5 bodů v rozmezí % koncentrace analytu. Disoluce: ± 20 % daného rozmezí, např. pro přípravek s řízeným uvolňováním (20% u prvního odběru po 90 % u posledního odběru) se ověřuje linearita v rozmezí 0 100%. Zkouška čistoty: minimálně 5 bodů v rozmezí od kvantitativního limitu do 120% specifikačního limitu. Validační zpráva obsahuje hodnoty skutečných koncentrací, odezvy detektoru, výsledky lineární regresní analýzy, tj. hodnotou korelačního koeficientu a rovnici přímky, přikládá se i graf linearity hodnoceného analytu. 1,114,115 Detekční limit a kvantitativní limit Vyjadřují citlivost metody. Detekční limit (limit of detection, LOD) je nejnižší detekovatelná koncentrace látky ve vzorku. Kvantitativní limit (limit of quantitation, LOQ) je nejnižší koncentrace analytu ve vzorku, jenž je stanovitelná s přijatelnou přesností a správností. Oba limity lze stanovit následujícími postupy: Na základě vizuálního hodnocení se určí minimální koncentrace, která může být s jistotou detekována, či kvantifikována. Vyhodnocením poměru signálu k šumu (Signal-to-noise ratio), což je možné u instrumentálních metod. U neinstrumentálních metod se detekční limit hledá experimentálně. Obecně je za LOD považována koncentrace poskytující pík s poměrem signálu k šumu = 3, LOQ je koncentrace poskytující pík s poměrem 71

72 signálu k šumu = 10. Zjištěné limity se ověří analýzou příslušné koncentrace vzorku. Ve validační zprávě se LOD uvádí ve formě absolutní koncentrace (hmotnostní jednotky v definovaném objemu) a zároveň jako relativní koncentrace (v % vztaženo na koncentraci analytu). V příloze se doloží vzorovým chromatogramem ve vhodném měřítku. Výpočtem ze směrodatné odchylky odezvy a směrnice přímky získané při ověřování linearity, podle vzorců =. =., kde σ je směrodatná odchylka a S je směrnice přímky. 115,117,118 Selektivita, specifita (specifity) Selektivita metody je vlastnost změřit správně a specificky danou látku v přítomnosti jiných látek, jejichž přítomnost ve vzorku lze očekávat. Mohou to být další účinné látky u složených přípravků, pomocné látky, nečistoty z výroby, rozkladné produkty, zbytková rozpouštědla. Selektivita u zkoušek totožnosti může být potvrzena pozitivním výsledkem u vzorků obsahující daný analyt (nejlépe referenční látku) a současně negativní výsledek u vzorku bez hodnoceného analytu. Kontrola testování by měla být provedena na vhodném výběru strukturně podobných látek, které lze ve vzorku očekávat. V případě kvantitativních stanovení se např. u chromatografických metod dokládá vzorovými chromatogramy příslušné složky vzorku, které jsou dostatečně separovány. Pokud se látky eluují v těsné blízkosti, selektivita se demonstruje jejich rozlišením. O metodě, která je zcela selektivní pro analyt nebo skupinu analytů říkáme, že je specifická. Ve validační zprávě je obvykle specifita metody doložena srovnáním výsledků analýzy vzorku bez nečistot a vzorku s přidanými nečistotami, rozkladnými produkty a složkami placeba. Přiloženy jsou záznamy typických chromatogramů, umožňuje-li to používaný software, je doložena analýza čistoty píku, tzv. Peak Purity. 114,115,118 72

73 Robustnost (robustness) Vyjadřuje míru vlivu proměnných podmínek na výsledky analýzy. Míra robustnosti vyjadřuje vhodnost metody k rutinnímu požití. Hodnotí se poznatky z vývoje metody a cílem je upozornit na podmínky, které mohou ovlivnit výsledky. Například u metody využívající vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii se sledují vlivy: složení mobilní fáze, ph vodné složky mobilní fáze, teplota na koloně, rychlost průtoku, stabilita analyzovaných vzorků, rozdíl mezi kolonami různých šarží případně i výrobců. Obecně je třeba brát v úvahu velké množství faktorů, ale protože většina z nich má zanedbatelný vliv, měníme obvykle několik faktorů současně. 114,115,118 Test způsobilosti (System Suitability Test, SST) Test způsobilosti analytického systému je nedílnou součástí validace analytické metody, někdy je nazýván malou validací. U instrumentálních fyzikálně-chemických metod (především separačních) není v podstatě možné přesně definovat všechny podmínky, za kterých má být metoda použita, aby poskytovala spolehlivé výsledky. Proto musí být definována kritéria, jejichž splnění umožňuje spolehlivé použití daného analytického systému. Při každém novém použití metody se neopakuje celá validace, ale jsou definována určitá kritéria, která musí být splněna a která se obecně nazývají test způsobilosti analytického systému. Při splnění požadavků testu způsobilosti se předpokládá, že dříve provedená validace platí. Vhodnost analytického systému jako celku se v rámci testu způsobilosti nejčastěji zajišťuje ověřením vybraných parametrů (např. v HPLC pomocí porovnávacích roztoků z referenčních látek): Opakovatelnost nástřiku (Repeatebility of Injections) - Vyjadřuje míru přesnosti daného systému pomocí relativní směrodatné odchylky ploch píků opakovaných nástřiků (5 až 6) referenčního roztoku. Rozlišení (Resolution) Rs Vyjadřuje míru separace mezi vybranými píky, které mají podobnou výšku. Doporučená hodnota je 1,5. 73

74 Faktor symetrie (USP Tailing) A S (T) Je mírou asymetrie píku. Pro přesně symetrický pík je roven 1 a jeho hodnota se zvyšuje u píků s tzv. chvostováním a snižuje s pomalým náběhem tzv. frontováním. Se vzrůstající asymetrií píků je obtížná integrace, a proto se snižuje přesnost stanovení. Není-li v příslušném článku nebo předpisu uvedeno jinak, měl by být faktor symetrie v rozmezí 0,8 1,5. Účinnost kolony (Column Performance) Je vyjadřována jako zdánlivý počet teoretických pater N (Apparent Number of Theoretical Plates). S výhodou se používá jako jeden z parametrů testu způsobilosti, speciálně v případech, kdy je v chromatogramu přítomen pouze jeden pík. Doporučená hodnota je Kapacitní faktor (Capacity Factor) k - Vyjadřuje poměr přenosu hmoty, tj. poměr času, kdy je substance zadržována stacionární fází, k času v mobilní fázi, charakterizuje míru retence. Obecně platí, že jeho optimální hodnota by měla být mezi 2 a 10. Retenční čas (Retention Time) RT Ve zvláštních případech (např. gradientové eluci) je výhodné zadat pro daný pík požadovaný retenční čas s definovanou tolerancí (x±y minut) nebo časový interval (min. x a max. y min.). 1,2,14 V případě, že některý parametr nebo více parametrů neodpovídá, upraví se chromatografické podmínky v rozsahu, aby byla splněna kritéria způsobilosti chromatografického systému, aniž by přitom došlo k podstatnému pozměnění metody, např. poměr jednotlivých složek mobilní fáze nebo její průtoková rychlost kolonou. Jestliže podmínky stanovení odpovídají požadavkům, provede se stanovení obsahu opakovanými nástřiky porovnávacího a zkoušeného roztoku. 114,115 Možnosti úprav chromatografických podmínek, výpočty, kritéria jsou definovány např. v lékopisných monografiích Ph.Eur. kapitola , USP kapitola ,41 74

75 3.4 CHARAKTERIZACE LÁTEK I. část Amfetaminové deriváty Látky amfetaminového (APs) typu jsou z farmakologického hlediska řazeny mezi psychostimulancia, jejichž hlavním účinkem je stimulace CNS, čímž zvyšují duševní činnost a fyzickou výkonnost. Mechanismus působení spočívá v ovlivnění uvolňování neuromediátorů (dopaminu, noradrenalinu a serotoninu) na synapsích v CNS, na receptorové úrovni zvyšují jejich koncentraci v synaptické štěrbině blokováním α 2 presynaptických receptorů. 119 Kromě silného centrálně stimulačního účinku se tyto sloučeniny vyznačují též anorektickým a periferně sympatomimetickým účinkem. Používají se jako léčiva v terapii narkolepsie, jsou relativně úspěšné a díky krátkodobému podávání nevzniká na ně tolerance. APs navozují stav zvýšené úrovně bdělosti, zabraňují spánku, urychlují psychomotoriku a mozek je schopen zachytit a zpracovat větší množství podnětů. Tohoto účinku je však dosaženo na úkor kvality práce mozku. Deriváty amfetaminu někdy také označované jako Budivé aminy, se v přírodě nevyskytují a jsou připravovány synteticky. Strukturou jsou odvozeny od fenylisopropylaminu. Přírodní látky obdobné struktury se nacházejí např. v rostlinách rodu Ephedra (efedrin) nebo Catha edulis (kathinon). 120,121 Mezi zneužívaná stimulancia se zařazují kokainové drogy (kokain, crack), amfetaminové drogy (benzedrin, dexedrin), hlavně jejich derivát methamfetamin (pervitin). Na rozhraní mezi touto skupinou a halucinogeny jsou tzv. halucinogenní aminy, jejichž typickým zástupcem je 3,4- methylendioxymethamfetamin (extáze). APs patří v Evropě a také v České republice k velmi oblíbeným psychostimulačním drogám. Hlavním účinkem psychostimulancií je zlepšení nálady, potlačení únavy a pocitu hladu, celkové zrychlení psychických procesů, zjitřená představivost a uvolnění zábran. Stimulační drogy jsou zneužívány k vyvolání euforie, což je způsobeno snížením odbourávání mediátorů v synaptických štěrbinách. Prvotní efekt stimulancií je velmi 75

76 výrazný a příjemný, jen ojediněle dochází ke stavům podráždění, nervozity a úzkosti. Dlouhodobým podáváním dochází k psychickým změnám (stíha) projevujícím se trýznivými paranoidními halucinacemi. Intioxikace APs je manifestována kromě již výše uvedené stimulace zrychlením srdeční akce, vzestupem krevního tlaku, dilatací bronchů, rozšířením zornic a snížením chuti k jídlu; po odeznění intoxikace se dostavuje vyčerpání a mentální deprese. V případech fatální intoxikace bývá pravděpodobnou příčinou smrti srdeční selhání, křeče, hyperpyrexie, otok plic a mozku. 122 Charakteristickými příznaky dlouhodobého zneužívání jsou anorexie, úbytek hmotnosti, nauzea, zvracení, průjem a neklidný spánek. Zneužívání stimulancií s sebou přináší vysokou míru rizik, mezi něž patří rychlá psychická závislost provázená tolerancí na dávku, nebezpečné prekurzory nelegální výroby a rizika spojená s aplikací drogy (trombózy, záněty žil, embolie a hlavně nákazy hepatitidou a HIV). 123,124 Sledované látky ze skupiny amfetaminových derivátů Methamfetamin (MA) (S)-α, N-dimethylfenylethylamin; C 10 H 15 N Nejčastěji se vyskytuje ve formě soli (hydrochloridu), jedná se o bílý krystalický prášek bez zápachu s hořkou chutí. Případné zabarvení je způsobeno příměsí nečistot z výrobního procesu. Methamfetamin (pervitin, ice) se stal preferovanější drogou díky snadnější nelegální syntéze než u amfetaminu. Jako účinnější se udává pravotočivý izomer. Ve formě soli je nejčastěji aplikován i.v. nebo je ve formě volné baze inhalován, což vede k rychlejšímu průniku a kumulaci látky v mozku. Po podání se objevuje pocit velké fyzické a psychické síly, je narušeno vnímání (halucinace). Obvyklé zneužívané dávky jsou mg per os třikrát až pětkrát denně. Účinek po i.v. aplikaci nastupuje ihned, do 5 10 min při šňupání a při p.o. podání do 1 hodiny. Příznaky intoxikace vymizí za 76

77 8 24 hodin. Biologický poločas je h a je závislý na ph moči, vylučuje se jí téměř z 43 % v nezměněné formě řadu dní. Koncentrace v moči jsou v rozmezí µg.ml -1 a lze jej detekovat i po 14 dnech po aplikaci. Hlavní fyziologicky aktivní metabolity MA jsou amfetamin (AP) a 4-hydroxymethamfetamin (p-ohma) viz Obr. 20, jehož koncentrace v moči jsou 0,2-8,0 µg.ml Amfetamin (AP) (RS)-α, N-dimethylfenylethylamin; C 9 H 13 N Nejčastěji se vyskytuje ve formě soli (sulfátu), jedná se o bílý krystalický prášek, farmakologicky účinná je jeho levotočivá i pravotočivá forma. Je typickým představitelem psychostimulancií, dobře se absorbuje z gastrointestinálního traktu a snadno proniká přes hematoencefalickou bariéru. Zneužívány jsou dávky 5 mg p. o., 2 mg podkožně, mg i. v., euforický efekt může v závislosti na dávce trvat 8 24 hodin. Biologický poločas je hodin. V moči se objevuje během 20 minut, koncentrace může být 1-90 g.ml Hlavním metabolitem AP je 4-hydroxyamfetamin (p-ohap), který se nachází v moči v koncentracích 0,03-0,5 g.ml -1 a je fyziologicky aktivní

78 Obr. 20: Schema metabolismu methamfetaminu a amfetaminu 122 MA - methamfetamin, AP - amfetamin, p-ohma - 4-hydrxymethamfetamin, p-ohap - 4-hydroxyamfetamin, NEP norefedrin, p-nep 4-hydroxynorefedrin, PA-fenylaceton, BA kyselina benzoová, HA kyselina hippurová, GL - glycin Kromě methamfetaminu a amfetaminu jsou velmi často zneužívány jejich mladší syntetické deriváty, jako jsou 3,4-methylendioxymethamfetamin (MDMA, extáze, Adam, XTC atd.); 3,4-methylendioxyethylamfetamin (MDEA, Eva, MDE atd.); 3,4-methylendioxyamfetamin (MDA atd.); 3-methoxy-4,5-methylendioxymethamfetamin (MMDA). Z těchto mladších derivátů byla předmětem dizertační práce pouze MDMA. Extáze (RS)-α, N-dimethyl-3,4-methylendioxyfenylethylamin; C 11 H 15 NO 2, bílý krystalický prášek, výrazné, spíše nahořklé chuti. Rozpouští se ve vodě i alkoholu. Dnes je označována jako tzv. taneční droga, distribuovaná, zneužívaná v podobě různě zbarvených tablet nebo kapslí různých tvarů a velikostí. Dříve byla řadu let používána v psychoterapii. 78

79 MDMA zesiluje smyslové vnímání, navozuje pocity empatie, odstraňuje komunikační bariéry. Po aplikaci se objevuje tachykardie, hypertenze, sucho v ústech, nauzea, nystagmus. V případě intoxikace se objevují závratě, hyperkardie, nervozita a deprese, velké nebezpečí spočívá ve vyřazení termoregulačních mechanismů a dochází k přehřátí a dehydrataci organismu, vedoucí ke ztrátě vědomí až smrti. 123,124 Obvyklá dávka je mg p. o. a efekt se projeví po minutách, maxima dosahuje po 1-1,5 hodině, účinek trvá asi 2 hodiny a pak se postupně vytrácí. Biologický poločas extáze je 6 hodin ,4-methylendioxymethamfetamin podstupuje 4 biotransformační cesty: N-demethylaci, O-demethylaci, deaminaci, konjugaci. Byly identifikovány tyto metabolity: 4-hydroxy-3-metoxymethamfetamin (HMMA) (jako hlavní metabolit), 3,4-methylendioxyamfetamin (MDA), 4-hydroxy-3-methoxyamfetamin (HMA) viz Obr Obr. 21: Metabolismus 3, 4 - methylendioxymethamfetaminu (MDMA)

80 II. část Ostatní látky Aciklovir Aciklovir, je guanin-nukleosidový derivát se systematickým vzorcem 2-amino-9-[(2- hydroxyethoxy)methy]-1,9-dihydro-6h-purin-6-on a jeho sumární vzorec je C 8 H 11 N 5 O 3. Bílý, nebo téměř bílý krystalický prášek, těžce rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v dimethylsulfoxidu, velmi těžce rozpustný v lihu 96%. Rozpouští se ve zředěných roztocích minerálních kyselin a alkalických hydroxidů. Aciklovir je velmi polární a lehce ionizovatelná látka. 14,41 Aciklovir je často používané, synteticky připravené virostatikum specifické proti herpetickým virům, především proti Herpes simplex virus-1 a Herpes simplex virus-2 a částečně působí i proti virovým infekcím způsobeným viry Varicella-zoster virus, viru Epstein-Barové a proti cytomegaloviru. Používá se zejména k léčbě a prevenci kožních a slizničních forem infekčních onemocnění (herpes facialis, respektive labialis, herpes genitalis, planých neštovic a pásového oparu). Aciklovir je velmi selektivní k DNApolymeráze virových částic, což způsobuje jeho velice nízkou toxicitu Účinek acikloviru se aktivuje pomocí specifických kináz. K aktivaci dochází trifosforylací po vychytání acikloviru infikovanou buňkou hostitele. V této aktivní trifosfátové formě pak blokuje specifickou virovou DNA-polymerázu a tím zabraňuje dalšímu množení virů viz Obr ,134 80

81 Obr. 22: Schéma mechanismu účinku ACI 135 Aciklovir lze podat perorálně, intravenózně i topicky. Po perorálním podání se z gastrointestinálního traktu vstřebává asi % podané dávky a maximální plazmatické koncentrace je dosaženo za minut. Vylučuje se ledvinami (glomerulární filtrací i tubulární sekrecí) z cca 90 % v nezměněné formě a přibližně z 10 % ve formě jediného významného metabolitu 9-karboxymethoxymethylguaninu. Biologický poločas acikloviru je 2 3 hodiny při normální renální funkci. 131,133,134 Přípravky použité lokálně a perorálně jsou prakticky bez nežádoucích účinků. Po injekčním podání se může výjimečně vyskytnout tromboflebitida, zhoršení funkce ledvin, poruchy CNS (např. halucinace, třes, dezorientace), alergické reakce. 131,133 Přípravky s obsahem acikloviru (ACI) můžeme rozdělit: perorální formy: tablety s obsahem ACI 200 mg/ 400 mg/ 800mg, suspenze, parenterální formy: lyofilizát pro infúze nebo suché injekce s obsahem ACI 250 mg, lokální formy: 5% krémy, 3% oční masti

82 Vybrané / hodnocené lékopisné nečistoty 41 Nečistota B Guanin 2-amino-1,7-dihydro-6H-purin-6-on Diacetylaciklovir 2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)methoxy]ethylacetát Nečistota G Nečistota J Diguanin9,9 -[ethylenbis(oxymethylen)]bis(2-amino-1,9-dihydro-6h-purin-6-on 82

83 Risperidon 3-{2-[4-(6-fluor-1,2-benzoisoxazol-3-yl)piperidin-1-yl]ethyl}-2-methyl-6,7,8,9- tetrahydro-4h-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-on; C 23 H 27 FN 4 O 2, bílý krystalický prášek, prakticky nerozpustný ve vodě a mírně rozpustný v ethanolu 96%. 41 Risperidon se používá jako antipsychotikum, je selektivní monoaminergní antagonista s jedinečnými vlastnostmi. Má terapeutický účinek při příznacích schizofrenie a ve srovnání s ostatními antipsychotiky méně tlumí psychomotoriku. Vyvážený centrální serotoninový a dopaminový antagonismus může snižovat pohotovost k nežádoucím extrapyramidovým účinkům a současně rozšiřovat terapeutickou účinnost na negativní a afektivní symptomy schizofrenie, manické epizody u bipolární poruchy, přetrvávající agrese při demenci, porucha chování. Risperidon je metabolizován cytochromem CYP2D6 na 9-hydroxy-risperidon, jehož farmakologický účinek je podobný risperidonu. Týden po podání je 70% dávky vyloučeno močí a 14% stolicí. V moči představují risperidon a 9-hydroxy-risperidon 35-45% dávky. Zbývající podíl tvoří neaktivní metabolity. Po perorálním podání psychotickým pacientům je risperidon eliminován s poločasem přibližně 3 hodiny. Eliminační poločas 9-hydroxy-risperidonu a aktivní antipsychotické frakce činí 24 hodin (u intramuskulární injekcí je eliminace ukončena 7 až 8 týdnů po poslední injekci přípravku). 133,136 Přípravky s obsahem risperidonu registrované u nás: 133 perorální formy: tablety s obsahem risperidonu 0,5 6 mg, roztok 1mg.ml -1 intramuskulární injekce s obsahem risperidonu 25; 37,5; 50 mg 83

84 Vybrané / hodnocené lékopisné nečistoty 41 Nečistota C - 9-hydroxy-risperidon R 1 = OH, R 2 = H: (9RS)-3-{2-[4-(6-fluor-1,2-benzoisoxazol-3-yl)piperidin-1-yl]ethyl}-9- hydroxy-2-methyl-6,7,8,9-tetrahydro-4h-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-on Nečistota E R 1 = H, R 2 = CH 3 : (6RS)-3-{2-[4-(6-fluor-1,2-benzoisoxazol-3-yl)piperidin-1-yl]ethyl}- 2,6-dimethyl-6,7,8,9-tetrahydro-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-on Nečistota A X = N-OH: (2,4-difluorfenyl){1-[2-(2-methyl-4-oxo-6,7,8,9-tetrahydro-4Hpyrido[1,2-a]pyrimidin-3-yl) ethyl] piperidin-4-yl} methanon-(e)-oxim Nečistota B X = N-OH: (2,4-difluorfenyl){1-[2-(2-methyl-4-oxo-6,7,8,9-tetrahydro-4Hpyrido[1,2-a]pyrimidin-3-yl) ethyl] piperidin-4-yl} methanon-(z)-oxim 84

85 Natrium-pikosulfát Monohydrát dinatrium-4,4 -[(pyridin-2-yl)methylen]difenyl-bis(sulfátu); C 18 H 13 NNa 2 O 8 S 2.H 2 O; bílý krystalický prášek, snadno rozpustný ve vodě a těžce rozpustný v ethanolu 96%. Pikosulfát sodný patří mezi lokálně působící laxativa difenylmethanové skupiny. Po bakteriálním štěpení pikosulfátu na účinnou laxativní složku, bis-(p-hydroxyphenyl)- pyridyl-2-methan (BHPM) v tlustém střevě dochází ke stimulaci sliznice tlustého střeva. Dojde ke zvýšení peristaltiky tlustého střeva a napomáhání zadržování vody a elektrolytů v lumen tlustého střeva. To vede ke stimulaci defekace, snížení času střevní pasáže a změknutí stolice. Účinek nastupuje za 6-12 hodin v závislosti na uvolňování léčivé látky z přípravku. Vzhledem k nízké celkové biologické dostupnosti po perorálním podání je akutní a chronická toxicita pikosulfátu sodného nízká. Vybrané / hodnocené lékopisné nečistoty: 41 sodný Nečistota A: R = SO 3 Na, 4-[(pyridin-2-yl)(4-hydroxyphenyl)methyl]fenyl-sulfát Nečistota B: R = H; 4,4 -[(pyridin-2-yl)methylen]difenyl-bis(fenol) 85

86 86

87 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 87

88 88

89 Experimentální část je rozdělena na dvě části. I. část Tato část dizertační práce se věnuje analýze drog v biologickém materiálu. Konkrétně byly zkoumány deriváty amfetaminu ve vzorcích moče. Sledované látky byly hodnoceny pomocí chromatografických metod. První práce využívá tenkovrstvé chromatografie pro separaci methamfetaminu, amfetaminu a jejich hlavních metabolitů pomocí vizuální detekce činidlem Fast black K. Dosažené výsledky byly porovnány s komerčně dostupnými testovacími proužky pro detekci methamfetaminu v moči. Druhá práce se zabývá vývojem a validací HPLC metody pro kvalitativní i kvantitativní hodnocení methamfetaminu a jeho metabolitů v moči. Pro izolaci látek z biologické matrice byla zvolena předkolonová deprivatizace dansyl chloridem, která se realizuje současně s SPE izolací a umožňuje použít dostatečně citlivou a relativně selektivní fluorescenční detekci. Kvantifikace byla prováděna metodou vnitřního standardu, jímž byl fenylethylamin (PEA). Obě práce byly publikovány v odborných časopisech viz příloha a v následující kapitole jsou stručně komentovány. II. část Náplní této části byl vývoj nových metod pro analýzu léčivých přípravků. Metodou HPLC resp. UHPLC byly hodnoceny účinné látky, příbuzné látky a popřípadě konzervační láteky v těchto léčivých přípravcích. První práce hodnotí přípravek s 5% obsahem acikloviru, jeho tři příbuzné látky (guanin, diguanin a diacetylaciklovir) společně s konzervačními přísadami (methylparaben, propylparaben) v krému. Sledované látky byly analyzovány pomocí UHPLC s UV detekcí. Pro separaci byla použita gradientová eluce za vyšší teploty. Vyvinutá metoda byla validována. 89

90 Další studie se zabývá analýzou účinné látky risperidonu a jeho příbuzných látek (dle Ph.Eur. nečistoty A,B,C, E). Byla vyvíjena nová metoda pomocí UHPLC s UV detekcí, která v porovnání s lékopisnou metodou poskytuje výrazné zkrácení doby analýzy. Metoda byla validována a použita pro hodnocení risperidonu v tabletách. V poslední práci byla řešena problematika vypracování nové HPLC metody pro stanovení Natrium-pikosulfátu v kapkách. Spolu s účinnou látkou byly hodnoceny rozkladné produkty a konzervační látky. Byly vyvinuty dvě isokratické HPLC metody v závislosti na druhu hodnocené konzervační přísady. Pro hodnocení přípravku s parabeny lépe vyhovovala stacionární fáze HSF5, pro přípravek s natrium-benzoátem byla využita reverzní fáze C18 s přídavkem iontově párového činidla. Obě metody byly validovány s uspokojujícím výsledkem. Při stanovení příbuzných látek bylo validací dokázáno, že kromě klasického hodnocení s vnějším standardem lze využít pohodlnější metodu normalizace. Tyto uvedené práce byly odeslány do odborných časopisů a jsou v procesu hodnocení editory časopisů. První je odeslána do časopisu Analytical Methods, další dvě do Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 90

91 ad I. část 4.1 TLC ANALÝZA VYBRANÝCH AMFETAMINŮ V MOČI Práce je věnována TLC analýze v současnosti nejčastěji zneužívaných drog v Evropě methamphetaminu (MA), 3,4-hydroxymethamphetaminu (MDMA) a jejich metabolitům amphetaminu (AP), p- hydroxyamphetaminu (p-ohap). Jejich účinky a vlastnosti byly podrobněji probrány v Teoretické části. Pro kvalitativní a kvantitativní analýzu sledovaných látek v biologickém materiálu jsou ve velké míře využívány chromatografické metody. Část prací se týká HPLC , hodnocení drog a jejich metabolitů, různé způsoby detekce a úpravy analyzovaných vzorků, derivatizace, ale i přímý nástřik. Pozornost je také věnována využití TLC- různé způsoby detekce, většinou za tvorby barevných produktů. V některých článcích se zaměřují na hledání vhodných isolačních postupů z různých biologických tekutin i materiálů Cílem studie bylo vypracovat jednoduchou a rychlou TLC metodiku a nalezení vhodného izolačního postupu pro analýzu amfetaminů z moče. Nejprve byly studovány chromatografické podmínky pro TLC analýzu a izolace vybraných amfetaminů na kolonkách se sorbentem C 8 a C 18. Pozornost byla věnována výběru vhodné stacionární, mobilní fáze a detekci. Chromatografické podmínky Chromatografické podmínky byly testovány pro methamfetamin a potom aplikovány na ostatní látky. Na chromatografickou desku bylo aplikováno 20 µl moče s analyzovanými látkami (0,1 mg.ml -1 ), 20 µl prázdné moče a roztoky standardů testovaných látek (0,1 mg.ml -1 ). Při hledání detekčního limitu byla koncentrace jednotlivých analytů postupně snižována z 0,1 na 0,01 mg.ml -1. Z mobilních fází byly optimální dvě pro systém normálních fází - ethyl-acetát - ethanol - 26% roztok amoniaku (100:5:5) a cyklohexan - toluen - diethylamin (75:15:10) a jedna pro reverzní fázi methanol - voda - konc. kyselina chlorovodíková (50:50:2) viz Tab 3. Různé způsoby detekce jsou sumarizovány v tabulce 4, pro další testování bylo zvoleno detekční činidlo Fast Black K salt (FBK). Použitím 0,5 % roztoku detekčního 91

92 činidla FBK ve vodě byly získány oranžovo-červené skvrny methamfetaminu na světlehnědém pozadí a zároveň nejnižší detekční limit viz Obr. 23. Aplikace na další látky ukázala barevnou odlišnost primárních a sekundárních aminů, amfetamin a p-hydroxyamfetamin poskytují fialové zbarvení. Z testovaných komerčně dostupných TLC desek byl zvolen sorbent Kiesselgel 60 a vzhledem k optimálním R f hodnotám všech sledovaných látek byla vybrána mobilní fáze ethyl-acetát - ethanol - 26% roztok amoniaku (100:5:5) viz Tab 5. Tyto chromatografické podmínky byly vybrány jak z hlediska dokonalé separace skvrn balastů z biologické matrice, tak z hlediska detekčního limitu. Tab. 3 Testované chromatografické podmínky pro methamfetamin Sorbent Mobilní fáze Rf 100 Silica gel (Silufol UV 254 ;Kavalier, 10 10cm) Ethyl acetate-ethanol-26% amonia 100:5:5 Silica gel Cyclohexane-toluene-diethylamine 28 Silica gel impregnation 0,1 mol/l 75:15:10 KOH 50 Silica gel Silica gel RP C-18 F 254 (Merck; 5 10cm) RP C-18 F 254 Methanol-butanol-0,1 mol/l NaBr 60:40 Toluene-methanol 90:10 Methanol- H2O- conc.hcl 50:50:2 Methanol-17% amonia 2: Tab. 4 Testovaná detekční činidla pro methamfetamin (chromatografické podmínky: m.f. Ethyl acetate-ethanol-26% amonia(100:5:5), sorbent Kieselgel) Detekční činidlo Popis skvrny Limit detekce (µg) Dragendorffovo činidlo I. (fiksace konc. H2SO4) Červené zbarvení 10 Dragendorffovo činidlo II. Slabě červená skvrna. 10 Ninhydrin I. Fialová skvrna 1 Ninhydrin II. FBK Fialová skvrna na tmavém pozadí Intenzivně oranžová skvrna na slabě hnědém pozadí 1 0,5 92

93 Obr.23 Schéma reakce detekčního činidla FBK Tab. 5 Výběr chromatografických podmínek po detekci 0,5% roztokem FBK Mobilní fáze R f 100 TLC deska AP MA MDMA p-hap Složení poměr Fialová skvrna Oranžovočervená skvr. Oranžovočervená skvrna Fialová skvrna EAC-EtOH-NH Kieselgel 100:5:5 CHX-TOL-DEA 75:15: EAC-EtOH-NH Alox 100:5:5 CHX-TOL-DEA :15:10 EAC-EtOH-NH :5:5 Sil G EAC-EtOH-NH UV 100:5:5 RP C-18 (5 )MeOH-H 2 O-HCl 50:50: EAC-ethylacetát, CHX-cyklohexan, TOL-toluen, DEA-diethylamin, EtOH-ethanol Přímá aplikace vzorků moče s drogami bez předchozí izolace na TLC desku byla testována na všech používaných chromatografických deskách. Na deskách Alox (N/UV 254, Macherey-Nagel) a reverzních fázích interferovali skvrny balastů se skvrnami analytů, kromě p-hydroxyamfetaminu. Nejlepších výsledků bylo dosaženo na silikagelových skleněných deskách Kieselgel 60 F 254 (20 20 cm, Merck), kde bylo dosaženo úplné separace skvrn balastů z moče od skvrn stanovovaných látek a detekční limit byl pro MA, MDMA 25 g.ml -1 v moči, a pro AP, p-hap 50 g.ml -1 v moči. (Obr. 24) 93

94 Optimalizace izolačních podmínek Pro izolaci látek z moče (liofylizovaná moč rozpuštěná ve vodě) byla vybrána extrakce na pevných fázích, byly testovány dva sorbenty C 8 a C 18. Optimalizace izolačních postupů byla prováděna za použití TLC desek Kieselgel 60, mobilní fáze EAC- EtOH-NH 3 (100:5:5) a detekce činidlem FBK. Izolace byla prováděna pomocí pomocí vakuového systému Visiprep SPE. Vzhledem k nízké výtěžnosti a nedostatečné reprodukovatelnosti u amfetaminu při izolaci na kolonkách C 18 (aktivace s 1 ml MeOH a 1,5 ml uhličitanu pufru ph 10,0, aplikace 1,5 ml vzorku moče, promytí 2 ml směsi EtOH vody -26% roztok amoniaku (60:30:10) a eluce 2 ml směsi EtOH 26% roztok amoniaku (90:15)) byl vybrán izolační postup s kolonkami C 8. Zjištěný detekční limit izolace byl 0,3 µg. ml -1 pro MA, MDMA a p-hap. Proces izolace na kolonkách C 8 : aktivace 1 ml methanolu a 1,5 ml fosfátový pufr o ph 6,0 aplikace 1,5 ml vzorku moče promytí 2 ml vody (balasty) eluce 2ml methanolu (deriváty amfetaminu) Ve srovnání s imunochemickými detekčními proužky (Human, Německo) je citlivost této metody dvakrát vyšší. Cut-off testovaných detekčních proužků byl 1 µg.ml -1, kromě deklarovaného methamfetaminu proužky pozitivně detekovali i ostatní látky. 94

95 Obr. 24. Typický chromatogram přímé aplikace vzorků amfetaminových derivátů v moči na TLC desku Kieselgel (m.f. ethylacetát ethanol - 26% amoniak (100:5:5) a Fast Black K salt jako detekční činidlo) U-blank moči; X U -amfetaminové deriváty v moči; X S -standard amfetaminů Závěr Závěrem lze konstatovat, že nejlepší chromatografické podmínky pro vybrané látky jsou: silikagelové skleněné desky Kieselgel 60, mobilní fáze ve složení ethylacetát - ethanol - 26% roztok amoniak (100:5:5) a Fast Black K sůl jako detekční činidlo. Pro izolaci všech vybraných látek byl optimální výše uvedený postup na kolonkách C 8, TLC s jejím použitím dosahuje 50x vyšší citlivost a lepší selektivitu. Na druhé straně, přímá aplikace vzorků moče na TLC desku je jednoduchý a rychlý způsob, který může být použit pro předběžnou detekci přítomnosti sledované látky, zejména methamfetaminu, který u chronických uživatelů dosahuje koncentrace v moči od 25 do 300 g.ml

96 4.2 STANOVENÍ 4-HYDROXYMETHAMFETAMINU, 4-HYDROXY- AMFETAMINU, AMFETAMINU A METHAMFETAMINU POMOCÍ HPLC S FLUORESCENČNÍ DETEKCÍ Tato práce navazuje na předchozí studii, také se zabývá analýzou methamfetaminu a jeho metabolitů v moči. Náplní studie bylo vyvinout a validovat relativně jednoduchou a rychlou HPLC metodu, která by mohla být použita pro kvalitativní i kvantitativní hodnocení těchto látek. Dobrá separace MA, AP, p-ohap a p-ohma je velmi důležitá, neboť metabolity se vyskytují v biologických vzorcích společně s matečnou nelegální drogou. Vzhledem ke slabé absorpci analytů v oblasti UV byla zvolena předkolonová derivatizace dansylchloridem, která se realizuje současně s SPE isolací a umožňuje použít dostatečně citlivou a relativně selektivní fluorescenční detekci. Pro kvantifikaci byla zvolena metoda vnitřního standardu. Pro analýzu APs lze využít např. chromatografické separace na C18 s lineárním gradientem acetonitril-voda po předchozí úpravě vzorků séra mikroextrakcí na pevné fázi. Detekční limity pro AP a MA jsou 0,3 mg.l -1 a 0,04 mg.l Pro přímé enantioselektivní dělení MA a AP v moči je možno použít silikagelovou kolonu s vázaným fenylkarbamoylovaným β-cyklodextrinem, mobilní fází je směs acetonitrilu s methanolem a fosforečnanový pufr o různém ph Další autoři publikovali metodu analýzy enantiomerů MA ve vzorcích moči na imunoafinitní koloně s detekčním limitem 18 ng.ml nebo přímou analýzu séra a krve na C18 semimikro koloně s navázaným BSA. Detekční limit těchto analytů se pohyboval okolo 10 ng.ml LC-MS je pro tento účel jednou z nejlepších metod, přesto vzhledem k ekonomické náročnosti má význam se zabývat alternativními možnostmi. Zlepšení detekce lze dosáhnout předkolonovou derivatizací s činidly, které přidávají do molekuly analytu fluorofor za vzniku fluorescenčních derivátů. K tomuto účelu byl použit jako fluorescenční činidlo o-ftaldialdehyd. 156 Použití acetonového roztoku dansyl chloridu spojuje derivatizaci s deproteinací při stanovení MA v lidské plazmě a moči. Proces derivatizace je ale časově náročný, příprava vzorku vyžaduje asi 2 hodiny. 157 Dansylace byla použita nejen 96

97 pro derivatizaci APs, ale i dalších analytů často s kratší inkubační dobou Např. lysinalanin ve vzorcích potravin byl derivatizován dansyl chloridem v prostředí isopropylalkoholu při 40 C 60 minut. U různých neuroaktivních aminokyselin byla publikována optimální doba derivatizace v rozmezí 30 do 60 minut při 80 C. Opět s použitím isopropylalkoholu byla u protinádorové látky ES-285 snížena reakční doba na 20 minut při 80 C. U ranitidinu byla provedena dansylace dokonce během 10 minut při 60 C a to v prostředí acetonitrilu. K možnostem detekce je vhodné ještě zmínit, že pro hodnocení methylendioxyderivátů APs v různých biologických matricích bylo popsáno několik vysoce selektivních metod využívajících vlastní fluorescenci stanovovaných látek Chromatografické podmínky Pro analýzu látek byla použita HPLC sestava Shimadzu s fluorescenčním detektorem FL RF-10AXL, excitační vlnová délka byla 343 nm a emisní 530 nm. Optimální chromatografická separace byla dosažena s použitím kolony LiChrospher 100 RP-18 (5 μm)125 mm x 4 mm I.D a s mobilní fází acetonitril voda (65:35, v/v), průtok 1 ml.min -1, teplota kolony 30 C, teplota autosampleru 15 C, nástřik 20 μl. Při optimalizaci chromatografických podmínek byly testovány různé průtoky (0,7 až 1,2 ml.min -1 ) a poměry obou složek mobilní fáze, aby byly získány ostré a symetrické píky s rozlišením na základní linii. Eluční pořadí separovaných látek bylo fenylethylamin, amfetamin, methamfetamin, p-hydroxyamfetamin, p-hydroxymethamfetamin, píky byly ostré, symetrické a s přijatelným rozlišení.(obr. 25) Podmínky izolace a derivatizace Dalším krokem byla optimalizace izolačního postupu spojeného s derivatizací dansylchloridem přímo na extrakční kolonce. Izolace byla prováděna následujícím způsobem. Zkumavka se 100 µl roztoku vnitřního standardu (20 μg.ml -1 ) a 1,0 ml vzorku moči byla protřepána 10 s Vortexem. SPE kolonka LiChroCART RP-18 E (Merck, Německo) byla aktivována promytím 2,0 ml methanolu a 1,5 ml uhličitanového pufru ph 9,0 pomocí vakuového systemu Visiprep SPE. Průtok byl udržován na rychlosti 97

98 přibližně 0,5 ml.min -1. Celý objem vzorku byl aplikován na kolonku, následovalo promytí 1,0 ml vody a vysušení vakuem. Do kolonky byla přidána směs roztoku DNS-Cl a uhličitanového pufru o ph 9,0, kolonka byla uzavřena, obalena alufólií a vložena do sušárny (objem a poměr směsi, reakční teplota a čas byly optimalizovány). Po ochlazení byly produkty derivatizace eluovány 1,5 ml acetonitrilu, doplněny do 2,0 ml mobilní fází a 20 μl bylo nastříknuto na HPLC kolonu. Účelem bylo zkrátit čas potřebný pro přípravu vzorků. Přínos změn podmínek byl indikován velikostí ploch píků, větší plocha znamenala větší výtěžek izolace a derivatizace. První zlepšení výtěžku bylo dosaženo zvýšením objemu derivatizačního činidla z 0,5 ml na 1,0 ml a změnou jeho poměru ve směsi s uhličitanovým pufrem ph 9,0 z původních 2:3 na 1:1. Také byly sledovány vlivy teploty a doby derivatizace (40 až 90 C; 5, 10, 15, 30 a 45 min). Jak lze předpokládat, nižší teplota vyžaduje delší čas derivatizace. Optimální teplota byla 75 C, kdy při reakčních časech 10 a 15 minut se plochy píků prakticky nelišily, z čehož vyplývá, že derivatizační reakce dosáhla maxima již v 10 minutách. Derivatizace při vyšších teplotách, byla provázená řadou problémů způsobených těkavostí rozpouštědla, které vedly k nízké reprodukovatelnosti výsledků. Závislost plochy píku MA na čase derivatizace při různých teplotách zachycuje graf na Obr. 26; chování AP bylo obdobné, z toho lze usuzovat na stejné chování ostatních APs. V této práci použitý acetonitril jako médium při dansylaci umožňuje vyšší teploty inkubace, což zkracuje reakční dobu ve srovnání s podobnými pracemi Naše metoda, která kombinuje SPE extrakci s dansylací, redukuje inkubaci na 10 min ve srovnání s 2 hodinami potřebnými pro současnou deproteinizaci s dansylací v médiu na bázi acetonu. 157 Validace Limit detekce (LOD) a limit kvantifikace (LOQ) byly stanoveny analýzou vzorků modelové moči se snižující se koncentrací APs. Koncentrace na úrovni LOD resp. LOQ poskytovala signál třikrát resp. desetkrát vyšší než šum základní linie. Námi zjištěné hodnoty korespondují s hodnotami metody stanovení dansylovaných APs ve slinách. 162 V porovnání s některými LC-MS detekcemi 163 je naše metoda dokonce citlivější. Linearita byla demonstrována korelačním koeficientem z lineární regrese závislosti 98

99 plochy píků na koncentraci na 6 úrovních mezi LOQ a 500 ng.ml -1 pro MA a AP; resp. mezi LOQ a 100 ng.ml -1 pro p-ohma, p-ohap. Správnost vyjádřená jako výtěžnost byla vypočítána z výsledků tří nezávislých SPE extrakcí modelové moči ve srovnání s výsledky standardních roztoků derivatizovaných přímo v hnědých vialkách, aby byl vyloučen vliv světla. Koncentrační úrovně pro stanovení výtěžnosti byly 5 a 500 ng.ml -1 pro MA a AP; resp. 15 a 100 ng.ml -1 pro p-ohap a p-ohma. Opakovatelnost v rámci jednoho dne byla určena jako relativní směrodatná odchylka z šesti měření ve stejný den a na stejných koncentračních úrovních jako správnost. Měřením vzorků ve dvou různých dnech byla určena reprodukovatelnost. Získané hodnoty validačních parametrů jsou shrnuty v tab. 6. Selektivita je schopnost metody odlišit analyt v přítomnosti jiných složek vzorku. Pro tento účel byl nastříknut též blank modelové moči bez přídavku APs, který byl připraven pro analýzu stejným způsobem, jako modelové vzorky moči s APs. Ze srovnání chromatogramů vyplývá, že píky z blanku neinterferují s píky sledovaných APs (Obr. 25). Stabilita standardů a derivatizovaných vzorků byla zjišťována opakovanými analýzami. Při uchovávání v temnu a při 4 C byly zásobní standardní roztoky stálé minimálně 1 měsíc. Po tuto dobu byly dosaženy prakticky stejné výsledky (RSD menší než 1,0 %), což koresponduje s údajem v literatuře 142. Dansylované vzorky moči po SPE izolaci byly uchovávány v autosampleru při 15 C a dávkovány na kolonu každé 4 hodiny po dobu 24 hodin. Opět byly dosaženy prakticky stejné výsledky (RSD menší než 2,0 %). Stabilita vzorků uchovávaných v temnu při 15 C byla tedy uspokojující po dobu minimálně 24 hodin. Tab. 6 Validační parametry stanovení MA, AP, p-ohap a p-ohma v moči pomocí HPLC s fluorescenční detekcí MA AP p-ohap p-ohma LOD/LOQ (ng/ml) 1/3 2/5 4/12 5/15 Liearita ng/ml; ng/ml; ng/ml; ng/ml; r 2 = r 2 = r 2 = r 2 = Výtěžnost (%) Opakovatelnost (RSD %) 5/500 ng/ml 81/96 5/500 ng/ml 7.1/0.3 5/500 ng/ml 71/83 5/500 ng/ml 7.9/0.8 15/100 ng/ml 64/75 15/100 ng/ml 11.2/2.8 15/100 ng/ml 60/71 15/100 ng/ml 9.7/3.5 Reprodukovatelnost (RSD %) 5/500 ng/ml 9.3/1.2 5/500 ng/ml 11.4/3.7 15/100 ng/ml 14.2/7.8 15/100 ng/ml 16.0/8.6 99

100 Obr. 25. Charakteristický chromatogram směsi APs v moči (1) a blanku moči (2) Mobilní fáze acetonitril voda (65:35, v/v), fluorescenční detekce λ ex 343nm and λ em 530nm Obr. 26. Vztah plochy píku MA a inkubační doby při různých teplotách. 50 C, 60 C, 75 C, 90 C 40 C, Závěr Popsaná metoda umožňuje stanovení methamfetaminu a jeho metabolitů v moči pomocí HPLC s fluorescenční detekcí. Byly navrženy a validovány optimální chromatografické podmínky a postup pro přípravu vzorků, zahrnující extrakci na pevné fázi se současnou derivatizací dansyl chloridem. Spojením těchto dvou kroků a zvýšením inkubační teploty na 75 C byla výrazně zkrácena příprava vzorku, a tím i 100

101 doba analýzy. V rámci testovaných validačních parametrů byla ověřena linearita, výtěžnost, opakovatelnost, reprodukovatelnost a selektivita pro všechny testované látky. Nalezené limity detekce a kvantifikace jsou srovnatelné s údaji v literatuře a v některých případech je vyvinutá metoda citlivější než metody využívající LC-MS

102 ad II. Část Orginály dále uvedených prací jsou součástí přílohy. 4.3 VÝVOJ A VALIDACE RYCHLÉ UPLC METODY STANOVENÍ ACIKLOVIRU, JEHO NEČISTOT A KONZERVAČNÍCH LÁTEK V TOPICKÉM PŘÍPRAVKU Úvod Účinná látka aciklovir je lékem první volby při léčbě virových infekcí způsobených Herpes simplex. Používá se zejména k léčbě a prevenci kožních a slizničních forem infekčních onemocnění. Léčba krémy s obsahem acikloviru obvykle nezpůsobuje žádné vedlejší účinky, jen zřídka se projevují alergické reakce jako je zarudnutí kůže, svědění a vyrážka. Mechanismu účinku spočívá v inhibici replikace virových částic. 132 Podrobněji je o acikloviru pojednáno v Teoretické části. Existuje několik odborných článků o vývoji metod pro stanovení acikloviru v biologickém materiálu jako je plazma 134,165,166, sérum 167 nebo moč 168, také v oblasti léčivých přípravků krémy 169 a tablety 170,171. Nejčastěji používaná metoda pro hodnocení acikloviru je vysoce účinná kapalinová chromatografie spojená s běžnými detektory, zejména UV-VIS 172,173, fluorimetrickým 174,175 a elektrochemickým nebo hmotnostní spektrometrií 176. Zatím byla publikována pouze jedna studie, která se zabývá využitím UPLC pro kvantifikaci substance acikloviru ovšem nečistoty takto nebyly vůbec stanovovány. 177 Příbuzné látky acikloviru jsou analyzovány pomocí gradientové eluce s fosfátovým pufrem a acetonitrilem jako mobilní fází v aktuálním Evropském lékopise 7 41, v předchozím vydání Evropského lékopisu byla používána iontově-párová chromatografie. Naše studie byla zaměřena na analýzu komerčně dostupného 5% krému s aciklovirem, který obsahoval jako antimikrobiální složky methyl-a propylparaben. Vyvinutá UPLC metoda pro stanovení acikloviru, jeho hlavního rozkladného produktu guaninu a dalších příbuzných látek (diguanin, diacetylaciklovir) spolu s konzervačními 102

103 přísadami, využívá vysoké teploty na koloně a gradientu mobilní fáze, což umožňuje radikálně zkrátit čas analýzy a snížit spotřebu rozpouštědel ve srovnání s konvenčním systémem HPLC. Kratší doba analýzy je důležitá výhoda pro provádění farmaceutické kontroly kvality a je dobrým předpokladem pro využití vyvinuté metody i pro jiné přípravky s aciklovirem. Přístrojové vybavení V práci byla použita chromatografická sestava firmy Shimadzu - Shimadzu Nexera UPLC s Shimadzu Prominence UV-VIS detektorem., chromatografický software LabSolution v PH metr (Schott CG 843) byl použit pro nastavení přesného ph pufru octanu amonného, vakuový filtrační systém s 0,22 µm membránovým nylonovým filtrem (Whatman, UK) byl použit pro filtraci mobilní fáze, v ultrazvukové lázni (Kraintek, Slovensko) byla odplyněna mobilní fáze a rozpouštěny vzorky krému (10 min). Chromatografické podmínky Mobilní fáze A se skládala z 0,1 mol.l -1 octanu amonného pufru připraveného z octanu amonného (Sigma-Aldrich, Německo) a vody připravené Milli-Q reverzní osmózou (Millipore, Bedford, USA), ph pufru bylo upraveno na 5,5 kyselinou octovou (Sigma-Aldrich, Německo). Mobilní fáze B se skládala z acetonitrilu (ACN) pro chromatografii (Sigma-Aldrich, Německo), tetrahydrofuranu (THF) pro chromatografii (Sigma-Aldrich, Německo) a vody (90:6:4, v / v / v). Byl použit program gradientu [doba (min) /% B] 0/3, 1.4 / 3, 2.8/60, 4/60, 4,5 / 3, 5/3, průtok byl 0,5 ml.min -1. Separace byla prováděna na chromatografické koloně C18 Syncronis (100 mm x 3.0 mm id s velikostí částic 1,7 µm, ThermoScientific) při teplotě 60 C. Nastřikovaný objem byl 7 µl a UV detektor byl nastaven na 254 nm. Příprava vzorků pro analýzu Pracovní standardy všech látek (Pliva Lachema, Česká republika) byly rozpouštěny v 10% roztoku dimethylsulfoxidu (DMSO) pro analýzu (Merck, Německo). Standardní 103

104 roztok acikloviru byl připraven rozpuštěním 12,50 mg v 2,5 ml DMSO a doplněn do 25 ml vodou. Zásobní roztoky všech příbuzných látek (guanin hydrochloridu; diguaninu diacetylacikloviru) a parabenů byly připraveny rozpuštěním 5,0 mg v 5 ml DMSO a doplněny na 50 ml vodou. Všechny roztoky byly stabilní 1 týden při skladování v chladničce. Standardní roztoky byly připraveny vhodným ředěním ze zásobních roztoků 10% DMSO o koncentracích: guanin (5 μg.ml -1 ), diguanin a diacetylaciklovir (1 μg.ml -1 ), methylparaben (10 μg.ml -1 ), propylparaben(5 μg.ml -1 ). Vzorky krému byly připraveny z komerčně dostupného farmaceutického přípravku s 5% obsahem acikloviru. Asi 0,25 g krému (což odpovídá 12,5 mg acikloviru) bylo přesně naváženo do 25,0 ml odměrné baňky, přidáno 30 ml 10% DMSO a směs byla na 10 minut umístěna do ultrazvuku. Po ochlazení byla baňka doplněna po značku stejným rozpouštědlem a důkladně promíchána. Roztok byl přefiltrován přes 0,22 µm PTFE filtr (Whatman, UK) pomocí injekční stříkačky přímo do vialky. Výsledky a diskuze Původní interní metoda stanovení acikloviru a konzervantů v krému, zahrnující i ověření čistoty byla provedena pomocí analytické kolony C18 (250 4 mm, 5 μm) při teplotě na koloně 25 C, gradientovou elucí s mobilní fází (acetátový pufru ph 4,5 a ACN) s průtokem 1,0 ml.ml -1, detekce byla při 254 nm (Obr. 27). 104

105 Obr. 27 Typický chromatogram krému s 5% obsahem acikloviru podle původních chromatografických podmínek za použití konvenční analytické kolony C18 (250 4 mm, 5 μm). Záměrem změny původní metody bylo zkrácení doby analýzy pomocí UPLC systému s ohledem na dobrou separaci a také snížení spotřeby rozpouštědel. Prvním úkolem studie bylo nalézt nejvhodnější ph pufru pro analýzu s cílem získat dobrou separaci bazických látek acikloviru, guaninu a dalších nečistot na jedné straně a kyselých parabenů na straně druhé. Byly testovány octanové a fosforečnanové pufry v rozmezí hodnot ph od 4,5 až 6,7, kde octanový pufr ph 4,5 prodloužil čas eluce parabenů a fosforečnanový pufr ph 6,7 snížil rozlišení píků acikloviru a guaninu pod přijatelný limit (1,5). Optimálních výsledků bylo dosaženo s octanovým pufrem ph 5,5, kdy píky všech sledovaných látek měly uspokojivý tvar a dostatečné rozlišení. Při prvních analýzách byl jako mobilní fáze B použit pouze ACN, došlo sice ke snížení doby analýzy na 7 minut, ale strmé stoupání gradientu vedlo ke zpětnému tlakovému rázu, který se projevil výrazným šumem na základní linii a ovlivňoval tak integraci píků. Problém byl vyřešen přidáním organického rozpouštědla s nižší polaritou do organické fáze, byl testován přídavek THF a 2-propanolu v rozmezí od 2 do 8 %. Nejlepší výsledky poskytl přídavek 4 % tetrahydrofuranu a umožnil mírnou změnu přechodu a eliminoval účinek tlakového rázu. Další zvýšení koncentrace THF již 105

106 nepřineslo žádné zlepšení analýzy. Změna teploty na koloně byla další možností jak ještě snížit dobu analýzy. Teplota byla testována v rozsahu od 30 do 60 C, což byla maximální teplota pro tento typ kolony doporučeného výrobcem. Při teplotě 60 C se poslední analyt propylparaben eluoval při 4,5 min, což vedlo ke zkrácení doby optimalizované metody o 2 min. Výsledná doba analýzy pomocí UPLC byla 5 minut včetně stabilizace kolony před další aplikací vzorku, čímž bylo dosaženo 5násobného zkrácení času oproti původní metodě a 10násobné snížení spotřeby mobilní fáze. Použitím vyšší teploty dochází ke snížení viskozity mobilní fáze, a tím i snížení zpětných tlakových rázů při gradientové eluci. Během optimalizací podmínek byl gradientový program neustále upravován a výsledné složení a průběh gradientu je uveden výše v chromatografických podmínkách. Validace metody Vyvinutá metoda byla validována v souladu s doporučenými pokyny ICH 112 a vnitřními pokyny naší laboratoře. V rámci validace byl také vypracován systém testu způsobilosti (SST) zahrnující některé vybrané parametry validace. SST je složen z rozlišení píků (minimálně 2,0); faktoru symetrie (mezi 0,8 a 1,5) a opakovatelnosti 5 nástřiků roztoku standardu acikloviru (RSD ne více než 2,0 %). SST parametry byly vypočteny podle Evropského lékopisu 7 a UPLC metoda všechny požadované limity splňuje. Selektivita metody byla vyhodnocována porovnáním chromatogramů reálného vzorku s chromatogramem standardů a placeba krému. Všech 6 testovaných látek bylo přijatelně odděleno, nebyly zjištěny žádné interference a selektivita metody byla potvrzena (Obr. 28) 106

107 Obr. 28 Typické chromatogramy krému s 5% obsahem acykloviru (1), směs standardů (2), a placebo s konzervačními přísadami (3), získané pomocí vyvinuté UPLC metody na analytické koloně C18 (100 x 3 mm, 1,7 μm). G guanin, ACI aciklovir, DG diguanin, DA diacetylaciklovir, MP methylparaben, PP propylparaben. Linearita byla měřena na 5 koncentračních úrovních pro každý analyt, pro aciklovir a parabeny v rozmezí % z předpokládaného obsahu, u nečistot od LOQ až 150% limitu uvedeného v Ph.Eur Každý roztok byl nastřikován třikrát. Data byla vyhodnocena metodou lineární regrese. Linearita byla prokázána na základě korelačního koeficientu, který byl pro každý analyt v předepsaném limitu (Tab. 7). Citlivost metody je vyjádřena jako mez detekce (LOD) a mez kvantifikace (LOQ), které byly stanoveny pro příbuzné látky acikloviru. Výpočty byly založeny na poměru signálu k šumu (S/ ), kde koncentrace S/ = 3 odpovídala LOD a S/N = 10 odpovídala LOQ. Získané hodnoty LOD a LOQ jsou shrnuty v tabulce 7. Správnost byla vyjádřena jako procentuální výtěžnost a hodnota RSD a testována byla pomocí 6 vzorků placeba se standardním přídavkem. Relativní směrodatná odchylka z 6 vzorků připravených z reálného krému byla použita k prokázání přesnosti metody (Tab. 7). 107

108 Krátkodobá stabilita všech látek byla hodnocena porovnáním odezvových faktorů čerstvě připravených a skladovaných roztoků při 4-8 C. Stabilita zředěných standardních roztoků byla vyhovující po dobu 48 hodin, zatímco zásobních roztoků po dobu 1 týdne. Tab. 7 Přehled zjištěných validačních parametrů Parametr Aciklovir Guanin Diguanin Diacetylaciklovir Methyl paraben Propyl paraben Linearita Korel. koef. (r) Přesnost RSD (%) Správnost Recovery (%) RSD (%) LOD µg. ml LOQ µg. ml Selektivita Bez interf. Bez interf. Bez interf. Bez interf. Bez interf. Bez interf. Závěr Byla vyvinuta nová rychlá UPLC metoda pro stanovení acikloviru a jeho 3 příbuzných látek a 2 konzervačních látek v krému za použití chromatografické kolony C18 Syncronis (100 mm 3.0 mm id s velikostí částic 1,7 µm), gradientu (doba (min) /% B: 0/3, 1.4 / 3, 2.8/60, 4/60, 4,5 / 3, 5/3), průtokem 0,5 ml.min -1, teploty na koloně 60 C a detekcí při 254 nm. Ve srovnání s původní konvenční metodou HPLC byla celková doba analýzy zkrácena 5 krát na 5 minut a spotřeba rozpouštědel byla snížena 10 krát. Metoda byla úspěšně validována a získané výsledky byly v souladu s pokyny ICH. Vyvinutá metoda může být použita pro rutinní analýzy ve farmaceutické kontrole kvality stanovení pro acikloviru a jeho nečistot guaninu, diacetylacikloviru, diguaninu a methyl-a propylparaben jako antimikrobiální přísady v topických přípravcích. Zároveň může být využita při zátěžových testech stability, stejně jako pro krátkodobé a dlouhodobé testování stability. 108

109 4.4 VÝVOJ A VALIDACE RYCHLÉ UPLC METODY PRO STANOVENÍ RISPERIDONU A JEHO NEČISTOT V ÚČINNÉ LÁTCE A TABLETÁCH. Úvod Risperidon je látka, která patří do skupiny atypických antipsychotik nejčastěji používaných v léčbě schizofrenie, bipolární nemoci a poruch chování jako autismus. Risperidon byl schválen FDA USA jako jediný lék k léčbě schizofrenie pro mládež ve věku let. 40 Co se týče mechanismu účinku je antagonista dopaminu (D2), serotoninu (5-HT2) a alfa1-adrenergního receptoru. Mezi nejběžnější vedlejší účinky risperidonu patří zvýšení tělesné hmotnosti, nespavost, kolísání krevního tlaku a mnoho dalších spojených s D2, 5-HT2 a alfa1 antagonismem. 132,179 Existuje několik odborných publikací týkajících se analýzy risperidonu jako aktivní substance (API) nebo ve farmaceutických přípravcích 180, ale převážně jsou odborné články zaměřené na analýzu risperidonu a jeho hlavního metabolitu 9-hydroxyrisperidonu 181,182 v biologických matricích (např. plazma, moč) Metody využívající pro stanovení HPLC jsou doplněny různými druhy detekce UV 187, elektrochemickou 188,189 nebo hmotnostní spektrometrií 190,191. Mezi další metody používané pro analýzu risperidonu patří například kapilární elektroforéza 192, GC 193, TLC 194, průtoková injekční analýza 195. Zatím nebyla publikována práce využívající moderní UPLC techniku pro studium risperidonu a jeho nečistot v API nebo tabletách. Tato práce se zaměřuje na zkrácení doby analýzy s využitím právě této metody pro hodnocení risperidonu. Vyvinutá metoda byla validována v souladu s pokyny ICH. Chemikálie Referenční standard risperidonu CRL (čistota 99,1%), stejně jako referenční standard risperidonu pro test způsobilosti CRL byl zakoupen v EDQM (Štrasburk, Francie). Pro přípravu vzorků a pro validaci byly použity komerčně dostupné tablety risperidonu 1mg a placebo. Methanol a acetonitril pro kapalinovou chromatografii byly 109

110 od firmy Sigma-Aldrich (Steinheim, Německo). Octan amonný byl dodán od Penty (Praha, Česká republika). Čištěná voda byla připravená Milli-Q reverzní osmózou (Millipore, Bedford, USA). Přístrojové vybavení Ve studii byl použit chromatografický systém Shimadzu Nexera (Shimadzu, Japonsko) s UV detekcí. Systém se skládá z autosampleru SIL-30AC, dvou pump LC- 30AD, vakuové degaseru DGU-20A5, kolonového prostoru CTO-30A a UV-VIS detektor SPD-20A. Data byla vyhodnocena pomocí softwaru LabSolution (Shimadzu, Japonsko). PH metr (Schott CG 843) byl použit pro nastavení přesného ph octanového pufru, vakuový filtrační systém s 0,22 µm membránovým nylonovým filtrem (Whatman, UK) byl použit pro filtraci mobilní fáze, v ultrazvukové lázni (Kraintek, Slovensko) byla odplyněna mobilní fáze a rozpouštěny vzorky krému (10 min). Chromatografické podmínky Mobilní fáze A byla složena z 0.06 mol.l -1 octanu amonného pufru o ph 6,8, ph, mobilní fáze B z acetonitrilu (ACN) pro chromatografii (Sigma-Aldrich, Německo). Byl použit gradient (T čas -A:B) T 0-0.6min -98:2, T 0.6 ->5.4-80:20, T :20, T 5.8->6.6-2:80, T :80, průtok byl 0,5 ml.min -1. Separace byla prováděna na chromatografické koloně C18 Syncronis (100 mm x 3.0 mm id s velikostí částic 1,7 μm, ThermoScientific) při 40 C. Nastřikovaný objem byl 3 µl a UV detektor byl nastaven na 260 nm. Příprava roztoků Standardní roztoky byly připraveny ředěním příslušné látky methanolem, aby koncentrace byla v rozmezí 0,5 μg.ml -1 až 2 mg.ml -1. Ředění referenčního standardu risperidonu pro test způsobilosti CRL bylo provedeno dle lékopisu (10 mg v 1 ml methanolu). Bylo zváženo a upráškováno dvacet tablet s obsahem risperidonu 1 mg, vypočítána průměrná hmotnost jedné tablety a odváženo množství odpovídající 10 mg risperidonu do 10 ml odměrné baňky. Po přidání 5 ml methanolu, protřepání a doplnění objemu 110

111 methanolem byly všechny vzorky umístěny na 15 minut do ultrazvukové lázně. Před nástřikem na kolonu byly filtrovány postupně přes dva nylonové filtry 0,45 µm a 0,22 µm (Whatman, UK) do vialky. Výsledky a diskuse Nejprve byly optimalizovány podmínky separace jednotlivých analytů. Jako stacionární fáze byla vybrána reverzní fáze C18 kolona Syncronis (100 mm x 3.0 mm id s velikostí částic 1,7 μm, ThermoScientific), optimalizace byla zaměřena především na výběr mobilní fáze (ph, poměr jednotlivých složek a její průtok), teploty na koloně, detekční vlnové délky a programu gradientu. Cílem práce bylo pomocí moderní UPLC metody zkrátit dobu analýzy a také zjednodušení postupů před analýzou ve srovnání s metodou používanou pro hodnocení risperidonu v tabletách v USP Risperidon vykazuje maximální absorpci při 278 nm, ale byla zvolena vlnová délka 260nm, kdy je vyšší odezva detektoru pro většinu stanovaných nečistot. Při počátečním testování mobilní fáze složené z methanolu a různých pufrů o ph 4,5 až ph 7,2 nedocházelo k dostatečnému rozlišení separovaných nečistot. Methanol byl tedy nahrazen acetonitrilem. Separace byla nedostatečná zvláště mezi nečistotou E a risperidonem při použití octanového pufru s nižším ph 4,5, ale i u pufru o vyšším ph (fosforečnanový pufr ph 7,2). Octanový pufr ph 6,8 přinesl kýžený efekt, optimální složení mobilní fáze tedy tvoří acetonitril a octanový pufr o ph 6,8 s poměrem u mobilní fáze A 3:97(v/v), u mobilní fáze B 90:10 (v/v). Během optimalizace podmínek byl gradientový program neustále upravován a výsledné složení a průběh gradientu při průtoku 0,5 ml.min -1 je (T čas -A:B) T 0-0.6min -98:2, T 0.6 ->5.4-80:20, T :20, T 5.8->6.6-2:80, T :80. Dalším způsobem jak ovlivnit dobu separace je změna teploty na koloně. Byly testovány teploty v rozmezí 25 až 50 C. Nejlepších výsledků bylo dosaženo při teplotě 40 C, další zvyšování teploty se negativně odrazilo na symetrii píků a jejich dostatečném rozlišení a nepřineslo žádné zlepšení analýzy. 111

112 Za uvedených chromatografických podmínek bylo dosaženo optimálního rozlišení všech separovaných píků (více než 1,5). Celková doba analýzy včetně kondicionace kolony byla 7 minut, všechny nečistoty včetně risperidonu byly eluovány v rozmezí 4 až 5,5 minut. Validace metody Vyvinutá UHPLC metoda byla validována v souladu s doporučenými pokyny ICH. Selektivita metody byla ověřena porovnáním chromatogramů pomocných látek, rozpouštědla, roztoku referenčního standardu risperidonu pro test způsobilosti CRL a reálného vzorku tablet. Všech 5 testovaných látek bylo separováno s rozlišením více než 1,5 a nebyly zjištěny žádné interference pomocných látek a rozpouštědla. Selektivita metody byla prokázána (Obr. 29) Obr. 29 Typické chromatogramy roztoku pomocný látek (1), vzorku tablet (2), roztoku referenčního standardu risperidonu pro test způsobilosti CRL (3), získané pomocí vyvinuté UPLC metody na analytické koloně C18 (100 x 3 mm, 1,7 µm). Linearita byla měřena na 5 koncentračních úrovních pro každý analyt. Pro aciklovir a parabeny to bylo v rozmezí % předpokládaného obsahu, rovnice kalibrační křivky byla A= c , kde A je plocha píku a c je koncentrace risperidonu ve vzorku. Jelikož nebyly k dispozici standardy jednotlivých nečistot, byla linearita ověřena na naředěném roztoku standardu risperidonu o pěti koncentracích: 0,5 µg.ml -1 (limit zanedbatelnosti, 0,05 %), 1 µg.ml -1, 1,5 µg.ml -1, 2 µg.ml (lékopisný limit

113 pro nečistoty A,B,C,E) a 3 µg.ml -1, rovnice kalibrační křivky byla A= 6388,2. c 911,7, kde A je plocha píku a c je koncentrace risperidonu ve vzorku. Linearita v uvedených rozmezích byla prokázána pro risperidon i nečistoty.(tab. 8) Citlivost metody byla ověřena na šesti nástřicích roztoku risperidonu o koncentraci 0,05 % (limit zanedbatelnosti), hodnota poměru signálu k šumu (S/N) byla rovna 26. Citlivost metody je dostatečná, jelikož minimální požadavek pro poměr S/N roven 10. Vypočítaná hodnota pro LOQ byla 0,02 %. Přesnost metody byla testována na šesti roztocích risperidonu API o přibližné koncentraci 1 mg.ml -1, dále bylo testováno šest roztoků reálných tablet o stejné koncentraci. Pro ověření přesnosti nečistot bylo připraveno šest modelových vzorků risperidonu s placebem o koncentraci 1 µg.ml -1, která odpovídá lékopisnému limitu pro nespecifikované nečistoty. Všechny roztoky byly třikrát nastříknuty a jejich relativní směrodatná odchylka byla použita k prokázání přesnosti metody. (Tab. 8) Správnost byla vyjádřena jako procentuální výtěžnost doplněná hodnotou RSD. Testována byla pomocí odpovídajícího množství placeba v tabletě se standardním přídavkem risperidonu na třech koncentračních úrovních 0,8 mg.ml -1, 1 mg.ml -1 2 mg.ml -1, každý roztok byl připraven třikrát. Pro čistotu bylo připraveno 6 modelových vzorků placeba s přidaným risperidonem o koncentraci 1 µg.ml -1. Všechny roztoky byly třikrát nastříknuty a jejich procentuální výtěžnost s relativní směrodatnou odchylkou byla použita k prokázání správnosti metody. (Tab. 8). Tab. 8 Přehled validačních parametrů Parametr Risperidon API Risperidon tbl. Nečistoty A- E Linearita Korel. koef. (r 2 ) limit , , ,99 Přesnost RSD (%) limit (%) , , ,0 Správnost Recovery (%) limit (%) - 100,7 98,0 102,0 91,5 85,0 115,0 RSD (%) limit (%) - 0,70 2, ,0 Selektivita Bez interf. Bez interf. Bez interf. a 113

114 Závěr Byla vyvinuta a validována nová rychlá UPLC metoda stanovení risperidonu a jeho 4 příbuzných látek pomocí gradientové eluce (T čas -A:B) T 0-0.6min -98:2, T 0.6 ->5.4-80:20, T :20, T 5.8->6.6-2:80, T :80, za použití chromatografické kolony C18 Syncronis (100 mm 3.0 mm id s velikostí částic 1,7 µm), s průtokem 0,5 ml.min -1, teplotou na koloně 40 C a detekcí při 260 nm. Ve srovnání s konvenční metodou HPLC dle USP 35 byla celková doba analýzy zkrácena čtyřikrát na celkových 8 minut. Metoda byla validována a získané výsledky byly v souladu s pokyny ICH a vnitřními předpisy naší laboratoře. Vyvinutá metoda může být použita pro rutinní analýzy ve farmaceutické kontrole kvality a v zátěžových testech stability léčiv. 114

115 4.5 VÝVOJ A VALIDACE STABILITU INDIKUJÍCÍ METODY PRO STANOVENÍ NATRIUM-PIKOSULFÁTU, JEHO NEČISTOT A KONZERVAČNÍCH LÁTEK VE FARMACEUTICKÝCH PŘÍPRAVCÍCH Úvod Natrium-pikosulfát, systematicky (NaP), je syntetické laxativum stimulačního typu, které je aktivováno bakteriální činností v tlustém střevě, při které vzniká vlastní účinná látka bis-(p-hydroxyphenyl)-pyridyl-2-methan. Ta teprve stimuluje proces peristaltiky. Účinek se projeví po 6-12 hodinách po podání. Akutní a chronická toxicita je nízká kvůli nízké biologické dostupnosti NaP, podrobněji je probráno v Teoretické části. Mnoho prací je zaměřeno na lékařské použití a věnuje se účinkům léčiva. Současná analyticky zaměřená vědecká literatura je však poměrně chudá. NaP není oficinální v současném USP. 40 V dnes již neplatném Ph.Eur se pro zkoušku na příbuzné látky používala TLC, zatímco v současném Ph.Eur.7 41 se k tomuto účelu se v souhlasu s všeobecným trendem již používá HPLC. Ta využívá dělení na reverzní fázi C 18 se směsí acetonitril fosforečnanový pufr ph 7,5 s přídavkem cetyltrimethylamonium bromidu (iontově párové činidlo) jako mobilní fází. Lékopis uvádí 3 nečistoty, z nichž nečistota A (ImpA) a nečistota B (ImpB) jsou hlavní rozkladné produkty, což je v souladu s údaji ze současné literatury o stabilitě léčiva. I. Savic 196 se spolupracovníky zkoumala tepelnou a oxidační stabilitu. Pro tento účel používali podobné chromatografické podmínky jen bez intově párového činidla a tuto metodu aplikovali při analýze účinné látky jako substance a v tabletách. jimi uveřejněné degradační schéma vedlo ke stejným degradačním produktům a nečistota A (impa) byla označena i jako hlavní rozkladný produkt oxidačního procesu. Separací a hodnocením konzervačních látek se nezabývali. M. Blanko se spolupracovníky 197 popsali analýzu NaP v léčivých přípravcích s obsahem sorbitolu a methylparabenu jako konzervační přísady pomocí kapilární zónové elektroforézy. Také se zaměřily na stabilitu, ale hlavně z pohledu methylparabenu. Produkty jeho hydrolýzy a transesterifikace byly stanovovány jednak pomocí HPCE 115

116 a jednak pomocí HPLC s reverzní fází C18. Mobilní fáze se skládala z 0,05 mol.l -1 síranu sodného a methanolu (70:30). Jejich metoda vyžadovala časově náročné promývání kolony před každým nástřikem, aby se odstranil sorbitol, který jinak způsoboval nereprodukovatelné výsledky. V této práci naopak neřešili rozkladné produkty NaP. Abusus laxativ včetně NaP lze detekovat pomocí HPLC s detekcí v diodovém poli, analyzuje se hlavní metabolit NaP. 198 Další screeningové postupy mohou využívat tenkovrstvou chromatografii, 199,200 GC/MS 201 nebo HPLC opět s detekcí v diodovém poli. 202 Naše studie je zaměřená na vývoj jednoduché izokratické HPLC metody pro stanovení NaP, jeho hlavních degradačních produktů a konzervačních látek methylparabenu (MP) nebo natrium-benzoátu (NaB) v léčivých přípravcích. Postup by měl být vhodný pro použití v kontrolních laboratořích a pro stabilitní testování léčivých přípravků s NaP. Jedna metoda pro hodnocení přípravků konzervovaných NaB využívá iontově párovou chromatografii na koloně s reverzní fází C18. Za těchto podmínek ale vykazuje MPHB relativně silnou retenci a lze jej eluovat v rozumném čase pouze gradientovou elucí. Jak vyplývá z literatury o separačním mechanismu vysoce fluorovaných stacionárních fází, nabízejí tyto fáze mírně odlišnou selektivitu než klasické stacionární alkylsiloxanové reverzní fáze. Pentafluorfenylsiloxanová fáze byla tedy s výhodou vyzkoušena a aplikována při analýze přípravků s MPHB. Obě vyvinuté metody mají dostatečnou citlivost a lze je použít jako stabilitu indikující. Navíc byl v této práci použit nový způsob přípravy roztoku pro test vhodnosti systému, který obsahuje vedle NaP oba rozkladné produkty. Roztok se připravuje řízenou částečnou hydrolýzou velmi rychlým jednoduchým postupem, který šetří peníze za relativně drahý standard, který by se jinak musel použít. Instrumentace HPLC chromatograf se skládal ze systému Shimadzu Prominence s vakuovým degaserem DGU-20A3, binárním čerpadlem LC20-AD, autosamplerem SIL-20AC HT, kolonovým termostatem CTO-20AC, UV/VIS detektorem s proměnnou vlnovou délkou SPD-20AC a řídícím modulem CBM- 20AC. Pro sběr dat a výpočty sloužil 116

117 chromatografický software LabSolution v Přesné ph pufrů byla nastaveno pomocí ph metru (Schott CG 843). Pufry byly před použitím do mobilní fáze filtrovány přes nylonový membránový filtr 0,4 μm (Whatman, UK). Chromatografické podmínky NaP-NaB metoda: Pufr pro mobilní fázi byl připraven z 1,145 g hydrogenfosforečnanu sodného dihydrátu (Merck, Germany) rozpuštěním v 900 ml vody (připravené reverzní osmózou, Milli-Q; Millipore, Bedford, USA), potom bylo přidáno 0,2 g cetyltrimethylamonium bromidu (Merck, Germany). ph bylo upraveno kyselinou fosforečnou (Merck, Germany) na 7,0 a objem byl doplněn vodou na 1000 ml. Vlastní mobilní fázi tvořila směs acetonitrilu (Sigma-Aldrich, Germany), propan-2- olu (Merck, Germany) a pufru (43:2:55, v/v/v). Chromatografická kolona Purospher STAR RP-18 endcapped, LiChroCART (250 mm 4.0 mm i.d. s velikostí částic 5 µm, Merck, Germany) byla temperována na 40 C. NaP-MPHB metoda: Pufr pro mobilní fázi tvořila 0,05 mol.l-1 kyselina fosforečná s ph nastaveným na 3,5 pomocí 5 mol.l -1 hydroxidu sodného. Mobilní fázi tvořila směs acetonitrilu a pufru (20:80, v/v). Chromatografická kolona Discovery HSF5 (150 4,6 mm, 5 μm; (Supelco Inc., Bellefonte, PA) byla temperována na 25 C. Následující podmínky byly shodné pro obě metody: Průtok mobilní fáze byl 1 ml.min -1. Teplota autosampleru byla nastavena na 8 C, nástřik byl 4 µl a UV detektor používal vlnovou délku 263 nm. Příprava roztoků Diluent: mobilní fáze. Zkoušený roztok: Množství perorálních kapek odpovídající 11,25 mg natriumpikosulfátu monohydrátu se rozpustí v diluentu a doplní jím do 25 ml. Podobně se připraví roztok placeba. Porovnávací roztok a (pro stanovení obsahu): 5 ml zásobního roztoku konzervační látky se přidá k 56,25 mg pracovního standardu NaP a doplní se diluentem do 25 ml. 5 ml tohoto roztoku se doplní do 25 ml diluentem. 117

118 Porovnávací roztok b (pro hodnocení příbuzných látek): 0,5 ml porovnávacího roztoku a se doplní diluentem do 50 ml. 1 ml tohoto roztoku se doplní do 10 ml diluentem. Zásobní roztok konzervační látky: vhodné množství konzervační látky (MPHB nebo NaB) se doplní do 25 ml, aby se získala žádoucí koncentrace. SST roztok: v 5 ml odměrné baňce se k 2,5 mg pracovního standardu NaP přidá 0,5 ml 0,2 mol.l-1 kyseliny chlorovodíkové. Směs se zahřívá 2 min na vodní lázni. Po ochlazení se ihned přidá 0,5 ml 0,2 mol.l -1 hydroxidu sodného, aby se zastavil hydrolytický degradační pochod, 0,6 ml zásobního roztoku konzervační látky a baňka se doplní diluentem po značku. Výsledky a diskuze Vývoj metody Předběžná zátěžová studie: Cílem bylo získat roztok s hlavními degradačními produkty, aby se dalo hodnotit, zda vyvíjená metoda umožní hodnotit degradační produkty s dostatečnou selektivitou a zda je stabilitu indikující. Pro hydrolýzu bylo vyzkoušeno kyselé (0,1 mol.l -1 HCl) a alkalické (0,1 mol.l -1 NaOH) prostředí za teploty laboratoře i při zvýšené teplotě. Bylo zjištěno, že NaP je stabilní bylo v 0,1 mol.l -1 NaOH i 70 C minimálně po dobu 15 hodin, zatímco v kyselém prostředí se NaP téměř úplně rozkládal na ImpA a ImpB. Podmínky kyselé hydrolýzy byly optimalizovány, aby mohly být použity pro přípravu SST roztoku, který obsahoval zkoumané léčivo, ImpA a ImpB. To, že to jsou skutečně ImpA a ImpB bylo potvrzeno srovnáním s lékopisnou chemickou referenční látkou pikosulfátem pro test vhodnosti systému CRS (získaným z EDQM). Příprava SST roztoku z pracovního standardu NaP řízenou částečnou hydrolýzou je spolehlivá a šetří peníze za relativně drahou chemickou referenční látku. Vhodná vlnová délka UV detektoru a korekční faktory pro ImpA (0,7) a ImpB (0,5) byly převzaty z lékopisné monografie o NaP. Pro prvotní pokusy byly vyzkoušeny lékopisné chromatografické podmínky, ale při analýze léčivého přípravku se neosvědčily. Nebylo možné je použít beze změny, protože pík NaB interferoval s píkem ImpB a na druhé straně eluce MPHB vyžadovala příliš dlouhý čas. Série změn vedla 118

119 k lepší separaci s elučním pořadí NaB, ImpB, ImpA, NaP a MPHB. ph hodnota pufru pro mobilní fázi byla snížena na 7,0 což poskytlo lepší rozlišení píku NaB a sorbent na bázi silikagelu méně trpěl. Přídavek propan-2-olu zlepšil tvar píků a tím též rozlišení u všech látek, ale MPHB se stále příliš zadržoval na koloně. Změny koncentrace iontově párového činidla se věrně odrážely v retenci látek podle počtu ionizovatelných skupin v jejich molekulách, retence NaP se silně prodlužovala, zatímco retence ImpB se vůbec neměnila. Ani tyto změny, ani změny v poměru acetonitril : propan-2-ol : pufr nebyly schopné poskytnout chromatogram všech látek v rozumném čase. Jestliže byly separovány NaP a jeho příbuzné látky, MPHB vyžadoval příliš dlouhý čas, který nešlo zkrátit bez ztráty rozlišení ostatních látek. To by se sice dalo překonat gradientovou elucí, ale to nebylo záměrem této práce. Lze tedy konstatovat, že první vyvinutá metoda řeší hodnocení přípravků s NaB a NaP, jehož pík se eluuje poslední s retenčním časem okolo 11,5 min (Obr. 30). Obr. 30.Typické chromatogramy SST roztoku (1), zkoušeného roztoku z perorálních kapek (2), porovnávacího roztoku a (3), porovnávacího roztoku b (4) a placeba (5) získané finální NaP-NaB metodou s kolonou Purospher STAR RP-18 e ( mm, 5 µm). NaB natrium-benzoát, ImpB nečistota B, ImpA nečistota A, NaP natriumpikosulfát. 119

120 Z důvodů zmíněných výše byla pro analýzu přípravků s MPHB jako konzervační látkou (tj. pro metodu NaP-MPHB) musela být vybraná jiná stacionární fáze. Pokusy s HSF5 kolonou ukázaly mnohem vhodnější selektivitu a přinesly lepší separaci všech testovaných látek v relativně krátkém čase. Protože nebylo použito žádné iontově párové činidlo, eluční pořadí píků NaP a jeho příbuzných látek bylo obrácené. Prvotní experimenty byly provedeny s mobilní fází tvořenou pouze acetonitrilem a vodou a vedly k příliš krátkým retenčním časům. Náhrady vody fosforečnanovým pufrem podstatně prodloužila retenční časy. Potom bylo optimalizováno ph v rozsahu 2,5 až 7,0. Vyšší ph mělo za následek vyšší retenci NaP, ale také zhoršovalo tvar píku. Optimální hodnota ph byla 3,5. Nízká hodnota ph mobilní fáze s sebou přinesla riziko nežádoucí hydrolýzy v průběhu analýzy, ale tento fakt se na výsledcích negativně neprojevil. Čas strávený v prostředí mobilní fáze za teploty 25 C byl pravděpodobně příliš krátký a teplota autosampleru byla nastavena na 8 C kvůli stabilitě roztoků. Teplota na koloně byla optimalizována v rozsahu od 20 do 40 C. Vyšší teplota mírně zkracovala retenční čas a rozlišení, optimální hodnota byla 25 C. Ačkoli stabilita konzervačních látek není předmětem této práce, je zřejmé, že lze očekávat přítomnost 4-hydroxybenzoové kyseliny, rozkladného produktu MPHB, jehož pík ale neinterferoval s ostatními hodnocenými látkami (Obr. 31). Pro úplnost byl vyzkoušen taky přídavek cetyltrimethylamonium bromidu, eluční pořadí se obrátilo, ale separace byla slabá, kolona vyžadovala dlouhý čas na ustálení, a jak jsme očekávali, vymytí iontově párového činidla z kolony bylo velmi obtížné. Na rozdíl od metody z literárního pramenu 197 sorbitol z léčivého přípravku nemusí být nijak zvlášť eluován z kolony ani u jedné z námi vyvinutých metod 120

121 Obr 31 Typické chromatogramy SST roztoku (1), zkoušeného roztoku z perorálních kapek (2), porovnávacího roztoku a (3), porovnávacího roztoku b (4), 4- hydroxybenzoové kyseliny(5) a placeba (6) získané finální NaP-MPHB metodou s kolonou Discovery HSF5 column ( mm, 5 µm). NaP natrium-pikosulfát, PHBA4- hydroxybenzoic acid, ImpA nečistota A, ImpB nečistota B, MPHB methylparaben. Validace metody Po vyvinutí a optimalizaci chromatografických podmínek bylo nezbytné provést validaci metody. Test způsobilosti je její nedílnou součástí. Validační parametry byly získávány a vyhodnoceny podle ICH směrnice 112 laboratoře. Test způsobilosti systému a podle vnitřních předpisů naší SST se skládal z rozlišení píků (minimum 2.0), faktoru symetrie (doporučené rozmezí je 0,8 1,5) a z opakovatelnosti plochy píku z 5 nástřiků porovnávacího roztoku a (RSD ne více než 2.0 %). Jednotlivé parametry byly počítány podle Ph.Eur Obě metody splnily vyžadované limity pro rozlišení a pro opakovatelnost nástřiku. Faktor symetrie pro pík NaP v metodě NaP-NaB byl reálně 1,9, v metodě NaP-MPHB 2,1, což překračuje doporučený limit. Takto vysoká hodnota je způsobena tím, že molekula NaP je snadno ionizovatelná. Jak ale vyplývá z následujících validačních parametrů, takovéto chvostování neovlivnilo vhodnost metod pro zamýšlené použití. Faktory symetrie ostatních píků byly v doporučeném rozmezí. 121

122 Selektivita Selektivita vyvinuté metody byla testována proto, aby se zjistilo, zda je metoda schopna stanovovat NaP, ImpA, ImpB a NaB nebo MPHB bez interferencí s píky složek perorálních kapek či píky rozpouštědel. Chromatogramy vzorku a standardů byly porovnány s chromatogramem zkoušeného roztoku připraveného z placeba. Všechny 4 zkoumané látky byly přijatelně separovány a žádná interference se neobjevila. Tím byla potvrzena selektivita obou metod. U metody NaP-MPHB byla ještě posouzena interference s 4-hydroxybenzoovou kyselinou, rozkladným hydrolytickým produktem MPHB, žádná interference nebyla shledána (Obr. 31) Linearita, rozsah Analytické rozsahy pro NaP a konzervační látky byly od 80 do 120 % očekávané koncentrace, pro nečistoty od LOQ do 3 % počítáno na obsah NaP. Linearita byla měřena na 5 koncentračních úrovních podle výše specifikovaných rozsahů. Každá roztok byl nastříknut třikrát. Na základě lineární regrese získaných dat byl spočítán korelační koeficient, kterým je linearita metody charakterizována a který byl pro všechny látky v přijatelném limitu. (Tab. 9, Tab. 10). Tab. 9 Výsledky validace metody NaP-NaB Parametr NaP ImpA, ImpB NaB Linearita Korel. koef. (r) 0,9998 0,9999 0,9998 Přesnost RSD (%, Ext.std.) 0,38 2,85 0,49 RSD (%, Normaliz.) 0,73 Správnost Výtěžnost (%) 100,30 101,87 100,55 RSD (%) 1,01 3,99 0,29 LOD µg. ml -1 0,06 LOQ µg. ml -1 0,20 Selektivita Bez interf. Bez interf. Bez interf. Tab. 10 Výsledky validace metody NaP-MPHB Parametr NaP Imp MPHB Linearita Korel. koef. (r) 0,9991 0,9978 0,9992 Přesnost RSD (%, Ext.std.) 0,75 1,31 0,70 RSD (%, Normaliz.) 2,16 Správnost Výtěžnost (%) 99,84 101,76 103,59 RSD (%) 1,41 6,05 1,85 LOD µg. ml -1 0,06 LOQ µg. ml -1 0,18 Selektivita Bez interf. Bez interf. Bez interf. 122

123 Citlivost, LOD a LOQ Citlivost metody se vyjadřuje limitem detekce (LOD) a limitem kvantifikace (LOQ), oba byly zjišťovány pro příbuzné látky NaP. Výpočty byly založeny na poměru signálu k šumu (S/N), přičemž koncentrace s poměrem signálu k šumu S/N = 3 odpovídá LOD a koncentrace s S/N = 10 odpovídá LOQ, který byl u obou metod nalezen nižší než limit zanedbatelnosti (0,05 % NaP). Získané hodnoty LOD a LOQ jsou uvedeny v Tab. 9 a Tab. 10. Správnost Správnost se vyjadřuje jako % výtěžnosti s RSD a byla potvrzena s použitím 6 roztoků placeba s přidanými standardy NaP a NaB nebo MPHB. Protože standardy čistých nečistot nebyly k dispozici, byl pro účely hodnocení správnosti stanovení příbuzných látek k roztokům placeba přidán NaP ve vhodné koncentraci, která simulovala nečistotu (Tab. 9, Tab. 10). Přesnost Opakovatelnost metody byla vyjádřena jako RSD z analýz 6 zkoušených roztoků připravených z modelových perorálních kapek. Pro zdokumentování přesnosti stanovení příbuzných látek byly použity 2 způsoby výpočtu, a to s použitím externího standardu (porovnávací roztok b) nebo normalizační metodou. Oba způsoby byly použity při analýze 6 vzorků čerstvě připravených perorálních kapek s takovým přídavkem hydrolyzovaného roztoku NaP, aby byl dosažen asi 0,07% obsah nečistoty A, která potom byla stanovena. Nalezené výsledky byly vyhodnoceny. Obě metody jsou vhodné pro zamýšlené použití. Výpočet normalizační metodou nabízí pohodlnější postup bez nutnosti přípravy porovnávacího roztoku b. Porovnání nalezených výsledků viz Tab. 9, Tab. 10. Stabilita roztoků Krátkodobá stabilita roztoků se hodnotila pomocí response faktorů u čerstvě připravených roztoků a u roztoků skladovaných. Porovnávací roztoky a byly skladovány v autosampleru při 8 C chráněny před světlem a v časových intervalech analyzovány. Bylo shledáno, že jsou stabilní po dobu minimálně 24 hodin. 123

124 Závěr Byly vyvinuty dvě nové metody pro stanovení NaP se 2 příbuznými látkami a konzervačními přísadami v perorálních kapkách. První slouží pro přípravky s NaB a používá HPLC kolonu Purospher STAR RP-18 endcapped ( mm, 5 µm) s mobilní fází acetonitril propan-2-ol fosforečnanový pufr ph 7,0 s přídavkem cetyltrimethylamonium bromidu jako iontově párového činidla (43:2:55). Druhá HPLC metoda slouží pro léčivé přípravky s obsahem MPHB jako konzervační látky. Používá chromatografickou kolonu Discovery HSF5 ( mm, 5 μm) s mobilní fází acetonitril fosforečnanový pufr ph 3,5 (20:80). Obě dvě metody jsou rychlé a izokratické a byly uspokojivě validovány v souhlasu s předpisy ICH. Pro hodnocení příbuzných látek doporučujeme pohodlnější postup s výpočtem normalizací, který poskytl podobné validační parametry jako výpočet s vnějším standardem. Námi navržená příprava SST roztoku je jednoduchá a rychlá a využívá řízenou částečnou hydrolýzu NaP k získání ImpA a ImpB. Tento postup šetří finanční prostředky za další chemické referenční látky. Vyvinuté metody mohou být využity pro rutinní analýzu v laboratořích farmaceutické kontroly pro stanovení NaP, jeho degradačních produktů a konzervačních látek NaB nebo MPHB v léčivých přípravcích. Metody se mohou uplatnit i ve stresových zkouškách právě tak jako v krátkodobých a dlouhodobých testech stability. 124

125 5 PŘÍLOHY 125

126 126

127 5.1 PUBLIKOVANÉ PRÁCE V ODBORNÝCH ČASOPIECH 127

128 128

129 129

130 130

131 131

132 132

133 133

134 134

135 5.2 PRÁCE ZASLANÉ DO ODBORNÝCH ČASOPISŮ 135

136 136

137 137

138 138

139 139

140 140

141 Development and Validation of Rapid UPLC Method for Determination of Risperidone and its Impurities in bulk powder and tablets. Tomas Nejedly*, Pavla Pilarova, Petr Kastner, Jiri Klimes Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove, Charles University in Prague, Heyrovskeho 1203, Hradec Kralove, Czech Republic, Corresponding author: *Tomas Nejedly Mailing address: Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Analysis, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove, Charles University in Prague, Heyrovskeho 1203, Hradec Kralove, Czech Republic. Ph: ; Fax:

142 Abstract The aim of this study was to develop a new, rapid and sensitive UPLC method with UV detection for simultaneous determination of risperidone and four relative substances presented in tablets. The active substance, risperidone is the most frequently used atypical antipsychotic drug for treatment of schizophrenia, bipolar disease and behavioral disorders in youth, up to 17 years. Study is based on main impurities determined in USP35 and European Pharmacopoeia 7 (Imp A, B, C and E). Developed method is based on binary gradient elution using RP-18 chromatographic column (100 mm 3.5 mm 1.7 µm). Ammonium acetate buffer ph 6.8 and acetonitrile were used as mobile phases in gradient mode with flow rate of 0.5ml/min and temperature 40 C. Wavelength of UV detector was set to 260nm. The developed method allows shortening analysis time up to four times comparing to conventional HPLC method used by USP35 for determination of related substances of risperidone in tablets. This method was validated in accordance with ICH requirements. Keywords: Risperidone; UPLC; Method development; Validation; USP 142

143 1. Introduction Risperidone, with its molecular formula C23H27FN4O2 and IUPAC name 3-[2-[4- (6-fluoro-1,2-benzisoxazol-3-yl)-1-piperidinyl]ethyl]-6,7,8,9-tetrahydro-2-methyl- 4H-pyrido[1,2-a] pyrimidin-4-one [Fig. 1] [1] belongs to the group of atypical antipsychotic drugs most commonly used in therapy of schizophrenia, bipolar disease and behavioral disorders as autism. Risperidone was approved by USA s FDA as the only drug to treat schizophrenia in youths, ages10-17 years. Pharmacological mechanism is in antagonism of dopamine (D2), serotonin (5-HT2) and alfa1-adrenergic receptors. The most common side effects of risperidone are weight gain, hyperprolaktinemia, insomnia, unstable blood pressure and many others connected with D2, 5-HT2 and alfa1 antagonism [2] [3]. Fig.1Chemical structure of Risperidone There have been several analytical research publications made with focus on risperidone in Active Pharmaceutical Ingredience (API) and in pharmaceutical formulations. In human biological samples was risperidone analyzed together with its active metabolite 9-hydroxy risperidone. [4][5] HPLC methods were applied for determination of risperidone in bulk powder, pharmaceutical formulation [6] and biological samples such as plasma[7] [8], urine [9] and postmortem fluids [10]. Methods were based on UV[11], electrochemical[12][13] or mass spectrometric detection[14][15]. There are just a few publications based on impurity analyzes [16] and degradation products identification [17]. Many other analytical techniques were used for determination of risperidone such as capillary electrophoresis[18], voltammetry[19], gas chromatography[20], dual-plate overpressure layer chromatography[21], thin layer chromatography[22] and flow injection analysis[23]. Many research articles focused on FT-IR and FT-Ramman spectroscopy to determine polymorphs in pharmaceutical formulation [24][25]. 143

144 There is no article based on modern UPLC technique studying risperidone and its pharmacopoeias impurities in bulk powder or tablets. In this presented paper we have focused on shortening time of single analysis for determination risperidone and its related substances. Method was validated with accordance to ICH guidelines [26]. 2. Material and methods 2.1. Chemicals Risperidone reference standard (purity of 99.1%) as well as Risperidone for system suitability chemical reference standard was purchased from European Directorate for the Quality of Medicine and Healthcare (Strasbourg, France). Commercially available tablets of 1mg of risperidone and its placebo were used for real samples preparation and method validation. Methanol and acetonitrile for liquid chromatography was from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany). Ammonium acetate was supplied from Penta (Prague, Czech Republic). HPLC grade water was prepared by Milli-Q reverse osmosis (Millipore, Bedford, USA) Instruments Shimadzu Nexera (Shimadzu, Japan) UFLC system with Shimadzu prominence UV-VIS detector was used for this study. System is consisted of autosampler SIL- 30AC, two pumps LC-30AD, vacuum degasser DGU-20A5, column oven CTO- 30A and UV-VIS detector SPD-20A. Data were gathered up and calculated by LabSolution chromatographic software (Shimadzu, Japan) Chromatographic conditions RP-18 chromatographic column Syncronis C18 (100mm 3.0mm i.d. with particle size of 1.7µm, ThermoScientific) was used for separation of analytes. The mobile phases were consisted of 0.06M ammonium acetate buffer ph 6.8, prepared by dissolution of ammonium acetate in Milli-Q water, and acetonitrile(sigma-aldrich, 144

145 United Kingdom). Mobile phase was filtered under vacuum (0.22µm nylon filter, Whatman) and sonicated for 10 minutes Preparation of the standard solutions Standard solutions were prepared by dilution of the substance with methanol to make concentration in the range from 0.5µg/ml to 2 mg/ml. Dilution of risperidone for system suitability chemical reference standard was made as same as pharmacopoeia describes (10 mg in 1 ml of methanol) Sample preparation Twenty tablets with 1 mg of risperidone were accurately weighed and powdered. Mean tablet weight was counted and an appropriate amount of powder were weighed, equivalent to 10 tablets (10 mg of risperidone), and transferred in 10 ml volumetric flask. About 5 ml of methanol was added, then shaken and brought to volume with methanol. All samples were sonicated for 15 minutes and then filtered with two syringe nylon filters (Whatman, UK), 0.4 µm and 0.22 µm. 3. Results and discussion 3.1. Method development Source data for this work were acquired from United States Pharmacopoeia 35 where the method for determination of risperidone related substances in tablets is based on binary gradient HPLC system. The aim of this work is to shorten the time of analysis from 30 minutes using modern UPLC system and simplification of preanalytical procedures. C18 reverse phase silica gel column was used for separation of analytes. We focused on the optimization of mobile phase, such as ph, components and their ratio, flow rate, temperature, detection wavelength and gradient scheme. 145

146 Risperidone exhibits maximum absorption at 278nm, but the wave length 260nm was chosen for better sensitivity for determination of all impurities that enhance detector response for most of impurities. After initial attempts with methanol and buffer between ph 4.5 and ph 7.2, the components of mobile phase became acetonitrile and ammonium acetate buffer ph 6.8. For mobile phase A was the ratio ACN-buffer (3:97,v/v); for B (90:10,v/v). After many trials of sufficient peak resolution the flow rate was set to 0,5ml/min in gradient mode (T time -A:B) T 0-0.6min -98:2, T 0.6 ->5.4-80:20, T :20, T 5.8->6.6-2:80, T :80 The injection volume was 3 μl. The temperatures from 25 C to 50 C were tested to improve the method and shorten the time of single analysis. The best results were exhibited at temperature of 40 C. The higher temperature led to worse resolution of peaks and peak symmetry. The developed chromatographic method conditions achieved resolution of all peaks more then 1.5 with symmetric peaks. The retention time of risperidone was 5.2 min and all impurities were between 4 min and 5.5 min. Run time of single analysis was 8 minutes including column reconditioning Method validation Selectivity The tablet excipients, solvent sample and system suitability test solution were analyzed under the final chromatographic condition and compared with risperidone standard solution to prove the selectivity of developed method. No peak from placebo and blank chromatogram interacted with risperidone peak as well as peaks of impurities. [Fig. 2] The system suitability test chromatogram shows one peak of risperidone and four resoluted peaks of impurities with resolution more than

147 Method is selective for determination of risperidone and its related substances in active pharmaceutical ingredients and tablets. Fig. 2.: Chromatograms of excipients (A), tablet sample (B) and risperidone system suitability sample(c) Linearity The linearity of the method for determination of risperidone was measured at five concentration levels in range between mg/ml for risperidone in triplicate injections. The equation of calibration curve was A=43899c where A is peak area and c is concentration of risperidone in sample. Linearity was proven (R ). As we do not have any impurity standard in satisfactory purity we used diluted solutions of risperidone in appropriate concentrations for evaluation of linearity as well as sensitivity, precision and accuracy. Linearity for impurities determination was demonstrated in the range of risperidone standard sample concentrations: 0.5 µg/ml (disregard limit, 0.05%), 1 µg/ml, 1.5 µg/ml, 2 µg/ml (limit for impurities A,B,C,E) and 3 µg/ml. The curve equation was A=6388.2c where A is peak area and c is concentration of risperidone in sample. Linearity was proven by correlation coefficient R 2 = (R ) Sensitivity The sample with concentration of disregard limit (0.5µg/ml) was six times injected. 147

148 Average signal to noise parameter was found to be 26. The minimum requirement for this parameter is 10 for quantification and so the sensitivity of this UPLC method is satisfactory Precision The method precision was determined by preparing six test solutions of approximate concentration 1mg/ml of risperidone substance. All samples were injected in triplicate and results were evaluated by relative standard deviation (R.S.D.) of the risperidone peak areas. The obtained R.S.D. value for risperidone API was 0.79% that match required limit of 1%. The method precision was also tested for determination risperidone in tablets. Six samples solutions with concentration about 1mg/ml of risperidone were prepared and every sample was injected in triplicate. R.S.D. value from six results was counted as 1.74% that fulfilled requirement (up to 2%). The precision for impurities was proven by analyzing six model samples prepared by risperidone substance addition to placebo in concentration 1µg/ml that corresponds to the pharmacopoeias limit for unspecified impurities. The precision was proven by three injection of each sample and R.S.D. value was found to be 0.52% (limit is 7 % for determination of impurity in pharmaceutical formulation in concentration range %) Accuracy The accuracy was evaluated by applying developed method to the samples made from risperidone drug substance and tablet placebo powder in amount corresponding to proportion in real tablets. They were prepared in concentrations 0.8mg/ml, 1 mg/ml and 1.2mg/ml, all in triplicate. The accuracy was calculated as the percentage of the drug recovered in presence of tablet excipients. Mean recovery for risperidone from 1mg tablet is 100.7% ±0.7% that fulfilled the limit for accuracy in pharmaceutical formulations (98%-102%). The method is accurate for use for determination of risperidone in 1 mg tablets. The accuracy for impurities was proven by analyzing six model samples prepared by addition of known amount of risperidone substance to excipient sample in concentration 1µg/ml that corresponds to the pharmacopoeias limit for unspecified 148

149 impurities. The accuracy was proven by three injection of each sample and mean recovery was 91.5%±0.5% (limit is %) 4. Conclusion A validated fast chromatographic method was developed for determination of risperidone in drug substance and tablets using a modern UPLC instrumentation. The method is suitable for determination of related substances possibly present in risperidone pharmaceutical formulations. It can be used for the pharmaceutical dosage form quality control as well as stability indicating analytical tests. References [1] USP 35-NF30, Volume 3, pp , The United States Pharmacopoeial Convention, Inc., Rockville, MD, published , ISBN [2] D. Lincová, H. Farghali, Základní a aplikovaná farmakologie, druhé vydání, Galén, Czech Republic, 2007, p. 181, ISBN [3] S. Grand, A. Fitton,, Drugs, 48 (1994), pp [4] Aravagiri, M., Marder, S.R., Van Putten, T., Midha, K.K., J. of Pharm. Sci., 82 (1993), pp [5] Woestenborghs, R., Lorreyne, W., Van Rompaey, F., J. Chromatogr. Biomed. Appl., 121 (1992), pp [6] M.A. Raggi, G. Casmenti, R. Mandrioli, C. Sabbioni, V. Volterra, J. Pharm. Biomed. Anal., 23 (2000), pp [7] T.Nagasaki, T. Ohkubo, K. Sugavara, N. Yasui, H. Furukori, S. Kaneko, J. Pharm. Biomed. Anal., 19 (1999), pp [8] M.C. Price, D.W. Hoffman, Ther. Drug Monit., 19 (1997), pp [9] M. De Meulder, B.M.M. Remmerie, R. de Vries, L.L.A. Sips, S. Boom, E.W.J. Hooijschuur, N.C. van de Merbel, P.M.M.B.L. Timmerman, J. of Chromatogr. B, 870(2008), pp [10] A.C. Sprigfield, E. Bodiford, J. Anal. Toxicol., 20 (1996), pp [11] A. Avenoso, G. Facciola, M. Salemi, E. Spina, J. of Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl., 746 (2000), pp [12] J.P. Le-Moing, S. Edouard, J.C. Levron, J. of Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl., 125 (1993), pp [13] A.E. Balant-Gorgia, M. Gex-Fabry, C. Genet, L.P. Balant, J. Ther. Drug Monit., 21 (1999), pp [14] B.M.M. Remmerie, L.L.A. Sips, R. de Vries, J. de Jong, A.M. Schothuis, E.W.J. Hooijschuur, N.C. van de Merbel, J. Chromatogr. B, 783 (2003), pp [15] B. Čabovska, S.L. Cox, A.A. Vinks, J. of Chromatogr. B, 852 (2007), pp [16] Z.A. El-Sherif, B. El-Zeany, O.M. El-Houssini, J. Pharm. Biomed. Anal., 36 (2005), pp [17] R.S. Tomar, T.J. Joseph, A.S.R. Murthy, D.V. Yadav, G. Subbaiah, K.V.S.R.K. Reddy J. Pharm. Biomed. Anal., 36 (2004), pp

150 [18] Zhu, X., Thiam, S., Valle, B.C., Warner, I.M, J. Anal. Chem., 74 (2002), pp [19] Z.C. Meng, J.B. Zheng, X.H. Zhu, Acta Chim. Sin., 63 (2005), pp [20] J. Schuberth, Volatile Organic Compounds, Anal. Chem., 68 (1996), pp [21] A. Pelander, I. Ozanpera, J. Sistonen, I. Rasanen, E. Vuori, J. Anal. Toxicol., 27 (2003), pp [22] Z.A. El-Sherif, B. El-Zeany, O.M. El-Houssini, J. Pharm. Biomed. Anal., 36 (2005), pp [23] Z.H. Song, C.N. Wang, J. Pharm. Biomed. Anal., 36 (2004), pp [24] M.G. Orkoula, C.G. Kontoyannis, J. Pharm. Biomed. Anal., 47(2008), pp [25] I. Karabas, M.G. Orkoula, C.G. Kontoyannis, Talanta, 71 (2007), pp [26] ICH Q2 (R1); Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology 150

151 Development and Validation of Stability Indicating HPLC Method for Determination of Sodium Picosulfate, its Impurities and Preservatives in Pharmaceutical Preparations Petr Kastner*, Pavla Pilarova, Pavla Vinsova, Katerina Burdova, Tomas Nejedly, Jiri Klimes Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove, Charles University in Prague, Heyrovskeho 1203, Hradec Kralove, Czech Republic, Corresponding author: *Petr Kastner Mailing address: Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Analysis, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove, Charles University in Prague, Heyrovskeho 1203, Hradec Kralove, Czech Republic. Ph: ; Fax:

152 Abstract The aim of this study was to develop a new and sensitive HPLC method with UV detection for simultaneous determination of sodium picosulfate, its two degradation products and preservatives methyl parahydroxybenzoate or sodium benzoate present in pharmaceutical preparation of oral solution type. The active substance is the drug of the group of stimulating laxatives. A novel money-saving way of preparation of system suitability test solution using controlled partial hydrolysis of sodium picosulfate yielding the main degradation products was developed. The first chromatographic system was optimized for evaluation of preparations with sodium benzoate as preservative and used RP-18 chromatographic column ( mm, 5 µm), acetonitrile propan-2-ol - phosphate puffer ph 7.0 with addition of cetyltrimethylammonium bromide (43:2:55) as mobile phase. The second method was developed for preparations with methyl parahydroxybenzoate as preservative and was based on separations with HSF5 chromatographic column ( mm, 5 µm) with acetonitrile phosphate puffer ph 3.5 (20:80) as mobile phase. Wavelength of UV detector was set to 263 nm. Both new methods were validated in accordance with ICH requirements which include linearity, precision, accuracy, specificity, range, detection and quantitation limits and stability of samples. More comfortable normalization method was preferably recommended for purity determination. Both stability indicating methods can be used for routine analysis in pharmaceutical quality control. Keywords: Picosulfate; Preservative, HPLC; HSF5 152

153 1. Introduction Sodium picosulfate, systematically 4,4 [(pyridin-2-yl)methylene]diphenyl bis(sodium sulfate) (NaP), is a synthetic laxative which acts by contact on the colon mucous membrane. It is activated by the bacterial activity in the large intestine and the proper active substance bis-(p-hydroxyphenyl)-pyridyl-2-methan yields. It stimulates peristalsis process. Effect is manifested after 6-12 hours. After oral administration, the acute and chronic toxicity of sodium picosulfate is low due to low overall bioavailability. Many papers are devoted to the drug effect from medicinal point of view, but there are only few papers in recent analytical literature. NaP is still not official in actual United State Pharmacopoeia [1]. Thin layer chomatography was used for purity testing in previous 6 th edition of European Pharmacopoeia [2] whereas HPLC is official in actual European Pharmacopoeia [3]. It uses reversed phase C18 stationary phase with acetonitrile - phosphate buffer ph 7.5 with cetyltrimethylammonium bromide as ionpair reagent as mobile phase. Three impurities are listed. Those named A (ImpA) and B (ImpB) are main degradation products which are in accordance with recent literature about stability of this drug. I. Savic and co-workers [4] investigated thermal and oxidation stability. They used similar chromatographic conditions but without ion-pair reagent and applied them on active ingredient bulk and tablets. Their degradation scheme led to the same degradation products and ImpA was also marked as the main product of oxidation degradation process. Separation and evaluation of preservatives was not discussed. M. Blanco and co-workers [5] described evaluation of NaP in pharmaceutical formulations by capillary zone electrophoresis in the presence of sweetener and methyl parahydroxybenzoate as preservative. They focused also on stability of pharmaceutical preparation but mainly from point of view of methyl parahydroxybenzoate. Its hydrolytic and transesterification products were determined using HPCE and HPLC with C18 stationary phase. Mobile phase consisted of 0.05 M Na 2 SO 4 methanol (70:30). Their HPLC method needed tedious column washing before every new injection to remove sorbitol (sweetener of pharmaceutical preparation) from HPLC column. Degradation products of NaP were not solved. HPLC with diode array detection is used for detection of laxative abuse incl. NaP; its main metabolite is 153

154 evaluated [6]. Other screening methods for laxatives in urine were described in the literature and used thin-layer chromatography [7] [8], GC/MS [9] or HPLC with diodearray detection again [10]. This study is focused on development of simple isocratic HPLC method for determination of NaP, its main degradation products and preservative - methyl parahydroxybenzoate (MPHB) or sodium benzoate (NaB) in pharmaceutical preparations [Fig. 1]. The procedure should be suitable for the application in drug quality control and in stability testing of pharmaceutical preparations with picosulfate. One method using ion pair chromatography with C18 column was validated for preparations with NaB. Because of strong retention, MPHB could be determined in reasonable time only under gradient conditions. How resulted from literature about separation mechanism of highly fluorinated stationary phases, they offer slightly another selectivity than alkylsiloxane ones [11] [12] [13]. Thus pentafluorophenylpropylsiloxane stationary phase was tried for analysis of preparations with MPHB as preservative and it proved to be advantageous. Both methods have sufficient sensitivity and are stability indicating ones. They were also satisfactory validated. Additionally, innovative preparation of system suitability test solution which contains besides NaP both its impurities yielded by controlled partial hydrolysis is very simple, rapid and money-saving, otherwise relatively expensive standard would have to use. 154 Fig.1Chemical structures of determined substances

155 2. Material and methods 2.1. Instrumentations The chromatograph consisted of a Shimadzu Prominence system with DGU-20A3 vacuum degasser, LC20-AD binary pump, SIL-20AC HT autosampler, CTO-20AC column oven, SPD-20AC UV/VIS variable wavelength detector and CBM- 20AC communication module. The data were collected and calculated by chromatographic software LabSolution v A ph meter (Schott CG 843) was used for adjusting of exact ph value of buffers, which were filtered through 0.4 μm nylon membrane filter (Whatman, UK) Chromatographic conditions NaP-NaB method: Buffer for the mobile phase: g of sodium hydrogenphosphate dihydrate (Merck, Germany) was dissolved in 900 ml of water (prepared by Milli-Q reverse osmosis; Millipore, Bedford, USA), 0.2 g of cetyltrimethylammonium bromide (Merck, Germany) was added. ph value was adjusted to 7.0 by means of dropwise addition of phosphoric acid (Merck, Germany). Buffer was completed to 1000 ml with water. Mobile phase consisted of acetonitrile for chromatography (Sigma-Aldrich, Germany), propan-2-ol (Merck, Germany) and buffer (43:2:55, v/v/v). Chromatographic column Purospher STAR RP-18 endcapped, LiChroCART (250 mm 4.0 mm i.d. with particle size of 5 µm, Merck, Germany) was kept at 40 C. NaP-MPHB method: Buffer for the mobile phase consisted of 0.05 M phosphoric acid with ph adjusted to 3.5 with 5 M sodium hydroxide. Mobile phase was a mixture of acetonitrile and the buffer (20:80, v/v). Chromatographic column Discovery HSF5 ( mm, 5 μm; (Supelco Inc., Bellefonte, PA) was maintained at 25 C. Following conditions were common for the both methods: Flow of the mobile phase was 1 ml.min -1. Temperature in the autosampler was set at 8 C. Injection volume was 4 µl and UV detector was set at 263 nm. 155

156 2.3. Preparation of solutions Diluent: mobile phase. Test solution: An amount of oral drops equivalent to mg of sodium picosulphate monohydrate was dissolved and diluted to volume 25 ml with the diluent. Similar method was employed to prepare placebo solution. Reference solution a (for content determination): 5 ml of stock solution of preservative were added to mg of sodium picosulphate monohydrate working standard in 25 ml volumetric flask, diluent was added and after dissolution the volume was completed with diluent. 5 ml of this solution was diluted with diluent to 25 ml. Reference solution b (for purity determination): 0.5 ml of reference solution a was completed to 50 mlwith diluent. 1 ml of this solution was diluted with diluent to 10 ml. Stock solution of preservative: Appropriate amount of preservative (MPHB or NaB) was dissolved in diluent and completed to 25 ml to get the desired concentration. SST solution: 0.5 ml of 0.2 M hydrochloric acid was added to 2.5 mg of sodium picosulphate monohydrate working standard and the mixture was heated on a waterbath for 2 min. After cooling, 0.5 ml of 0.2 M sodium hydroxide was immediately added to stop the degradation process. 0.6 ml of stock solution of preservative was added and volume was completed to 5 ml with diluent. 3. Results and discussion 3.1. Method development Preliminary stress studies: The main aim of this part was to get a solution which contained main degradation products. It enabled to evaluate the developed method from point of view of selectivity and suitability to stability indication. Acid (0.1 M HCl) and alkali (0.1 M NaOH) conditions were tested at room and increased temperature. It was found from these experiments, that NaP is stable in 0.1 M NaOH at 70 C minimally for 156

157 15 hours, whereas in acid conditions NaP was almost totally decomposed to ImpA and ImpB. Conditions of acid hydrolysis were then optimized to use them for preparation of SST solution which contained tested drugs, ImpA and ImpB. Identification of NaP, ImpA and ImpB was confirmed using pharmacopoeial chemical reference substance picosulfate for system suitability CRS (available from EDQM). Preparation of SST solution from NaP by controlled hydrolysis is reliable and money-saving procedure fully replacing use of relatively expensive chemical reference standard. Suitable wavelength for UV detector was adopted from pharmacopoeial monograph on NaP as well as correction factors for ImpA (0.7) and ImpB (0.5). Pharmacopoeial chromatographic conditions for NaP purity testing were tested for oral drops analysis first with unsatisfying results [3]. It was not possible to use them without changes, because NaB interfered with ImpB peak and on the other hand MPHB needed too long time for elution. Series of changes led to better separation with elution order NaB, ImpB, ImpA, NaP and MPHB. ph value of buffer was decreased to 7.0 which gave better resolution of NaB peak and the silica based sorbent was not so stressed. Addition of propan-2-ol improved peak shapes and resolution of all substances, but MPHB remained too retained due to high differences in lipophilicity and structure. Changes in concentration of ion-pair reagent influenced substances retention in such a way which closely corresponded with the number of ionisable groups in the molecule. NaP retention was strongly prolonged whereas ImpB retention was not changed at all. Neither these changes nor changes in acetonitrile : propan-2-ol : buffer ratio were able to reach enough resolution in reasonable analysis time. When separation of NaP with its impurities was satisfactory, MPHB required too long time for elution, which could not be reduced without loss of resolution of other compounds again. It could be overcome only with gradient elution, but it was not aim of our work. Thus it can be stated that first developed NaP-NaB method solved evaluation of preparations with NaB and NaP, whose peak is the last eluted with retention time about 11.5 min [Fig. 2]. 157

158 Fig. 2.: Typical chromatograms of SST solution (1), oral drops sample (2) reference solution a (3), reference solution b (4) and placebo (5) obtained with the final NaP-NaB method using Purospher STAR RP-18 e column ( mm, 5 µm). NaB sodium benzoate, ImpB impurity B, ImpA impurity A, NaP sodium picosulfate. From reasons stated above another stationary phase for analysis of preparations with MPHB as preservative had to be chosen (NaP-MPHB method). Experiments with HSF5 column showed more suitable selectivity and brought better separation of all compounds under test in relatively short time. As no ion-pair reagents were used, elution order of NaP and its impurities was reversed. Preliminary experiments were made only with buffer and ACN and led to very short retention times. Phosphate buffer instead of water substantially prolonged retention times. ph value of the buffer was then optimized in the range from 2.5 to 7.0. Higher ph values made longer retention of NaP, but also worse peak shape. Optimum ph value was 3.5. Low ph of the mobile phase brought the risk of undesired hydrolysis during analysis time, but this fact was not negatively manifested on the results, time spent in the medium of mobile phase at 25 C was probably too short, for the sake of stability of solutions autosampler was cooled at 158

159 8 C. Column temperature was optimized in the range from 20 to 40 C. Higher temperature slightly decreased retention time and resolution, optimum was 25 C. Although stability of preservatives was not particularly investigated in this work in detail, possibly presented 4-hydroxybenzoic acid, degradation product of MPHB can be expected, but its peak did not interfere with other evaluated peaks [Fig. 3]. Addition of cetyltrimethylammonium bromide was also tested, elution order was changed, but separation was poor, column conditioning needed long time and as expected ion-pair reagent was difficult to wash from the column. Fig. 3.: Typical chromatograms of SST solution (1), oral drops sample (2) reference solution a (3), reference solution b (4) 4-hydroxybenzoic acid solution (5) and placebo (6) obtained with the final NaP-MPHB method using Discovery HSF5 column ( mm, 5 µm). NaP sodium picosulfate, PHBA 4-hydroxybenzoic acid, ImpA impurity A, ImpB impurity B, MPHB methyl parahydroxybenzoate. In contrast to previous cited method [5], sorbitol from the preparation need not be washed from the column with separate procedure even in one our developed method. 159

160 3.2. Method validation After development and optimizing of chromatographic conditions it was necessary to carry out the method validation. Within it, the system suitability test (SST) and validation parameters were measured and evaluated in accordance with ICH guidelines recommendations [14] and in-house guidelines in our laboratory System suitability test SST consisted of peak resolution (minimum requirement 2.0), symmetry factor (recommended range ) and area repeatability of 5 injections of reference solution a (RSD not more than 2.0 %). The SST parameters were calculated according to the European Pharmacopoeia 7 [3]. The results for both methods fulfilled the required limits for resolution and area repeatability. Symmetry factor of NaP peak was really 1.9 in the NaP-NaB method and 2.1 in the NaP-MPHB method and exceeded recommended range. Such high values are caused by highly ionizable character of NaP at ph value of mobile phase. All following validation parameters were in satisfactory range, therefore it can be concluded that, such tailing of NaP peak did not negatively influence suitability of our methods for intended use. Symmetry factors of other peaks under interest were in recommended range Selectivity Selectivity of the developed method was tested In order to the method was able to determine NaP, ImpA, ImpB and NaB or MPHB without peak interferences with peaks from preparation components or solvents. Chromatograms of sample and chromatograms of standards were compared to chromatograms of placebo. All 4 tested substances were acceptably separated, no interference was found and the selectivity of both the method was confirmed. In the case of NaP-MPHB method also interference with 4-hydroxybenzoic acid degradation product of MPHB was judged and no interference was found. [Fig. 2 and Fig. 3] Linearity, range Analytical ranges for NaP and preservatives were from 80 to 120 % of expected 160

161 amounts, for impurities from LOQ to 3 % calculated respectively to NaP content. Linearity was measured at 5 concentration levels for each analyte in specified range. Each solution was injected in triplicate. The method of linear regression was used for data evaluation. Linearity was demonstrated by a correlation coefficient, which was for every compound in acceptable limit (Tab. 1, Tab. 2). Table 1 NaP-NaB method validation results Parameter NaP ImpA, ImpB NaB Linearity Correl. coeff. (r) 0,9998 0,9999 0,9998 Precision RSD (%, Ext.std.) 0,38 2,85 0,49 RSD (%, Normaliz.) 0,73 Accuracy Recovery (%) 100,30 101,87 100,55 RSD (%) 1,01 3,99 0,29 LOD µg. ml -1 0,06 LOQ µg. ml -1 0,20 Selectivity No interf. No interf. No interf. Table 2 NaP-MPHB method validation results Parameter NaP Imp MPHB Linearity Correl. coeff. (r) 0,9991 0,9978 0,9992 Precision RSD (%, Ext.std.) 0,75 1,31 0,70 RSD (%, Normaliz.) 2,16 Accuracy Recovery (%) 99,84 101,76 103,59 RSD (%) 1,41 6,05 1,85 LOD µg. ml-1 0,06 LOQ µg. ml-1 0,18 Selectivity No interf. No interf. No interf Sensitivity, LOD and LOQ Sensitivity of the method is expressed as the limit of detection (LOD) and the limit of quantitation (LOQ), both were provided for related substances of NaP. Calculations were based on signal-to-noise ratio (S/N) where concentration with S/N = 3 corresponded to LOD and that with S/N = 10 corresponded to LOQ, which was below disregard limit (0.05 % of NaP) in both methods. Obtained LOD and LOQ are summarized in the Tab. 1 and Tab Accuracy Accuracy was expressed as % of recovery and RSD and was confirmed using 6 161

162 placebo samples spiked with standard solutions of NaP and NaB or MPHB. For the sake of evaluation of accuracy of related substance determination, test solutions prepared from placebo spiked with appropriate concentration of NaP simulating any unknown impurity because standard of individual impurity was not available (Tab. 1, Tab. 2) Precision RSD from analyses of 6 samples prepared from model oral drops preparation demonstrated repeatability of the method. Two calculation methods were used for demonstration of precision of impurity determination. Calculation by means of external standard (reference solution b) or calculation using normalization method were applied on freshly prepared model oral drops spiked with hydrolyzed solution to get ImpA concentration about 0.07 %. Found results were evaluated. Both methods are suitable for intended use. Calculation using normalization method offers more comfortable and simple procedure without reference solution b. Comparison of results see in Tab. 1, Tab Solutions stability Short-term stability of reference solutions was evaluated by comparison of response factors of freshly prepared and stored ones. Reference standard solutions were stored at 8 C protected from light in autosampler and analyzed. They were stable for minimum 24 hours. 162

163 4. Conclusion Two new methods for determination of NaP with its 2 related substances and preservative in oral drops were developed. First one serves for preparations with NaB as preservative, uses chromatographic column Purospher STAR RP-18 endcapped ( mm, 5 µm) with mobile phase acetonitrile propan-2-ol - phosphate puffer ph 7.0 with addition of cetyltrimethylammonium bromide as ion-pair reagent (43:2:55). Second HPLC method serves for preparations with MPHB as preservative, uses chromatographic column Discovery HSF5 ( mm, 5 μm) with mobile phase acetonitrile phosphate puffer ph 3.5 (20:80). Both the methods are rapid and isocratic and were successfully validated and the validation results obtained were in accordance with guidelines of ICH. More comfortable normalization method for impurities content calculation had similar validation results to them from external standard method and we recommend it for use. Our preparation of system suitability test solution is simple and rapid and uses controlled partial hydrolysis of NaP to produce ImpA and ImpB. This procedure saves money for further standards. The developed methods can be used for routine analysis in pharmaceutical quality control for determination of NaP, its degradation products and preservatives NaB or MPHB in pharmaceutical formulations. Methods can be useful in stress stability tests as well as short term and long term stability testing. References [1] USP 35-NF30, The United States Pharmacopoeial Convention, Inc., Rockville, MD, published , ISBN [2] European Pharmacopoeia 6.0, Sodium picosulfate monograph, p , Strasbourg, France, published , ISBN [3] European Pharmacopoeia 7.0, Sodium picosulfate monograph, p , Strasbourg, France, published , ISBN [4] I. Savic, G. Nikolic, V. Marinkovic, I. Savic, Chemical Industry & Chemical ENgineering Quarterly, 16 (2010), pp [5] M. Blanco, J. Coello, H. Iturriaga, S. Maspoch, M. A. Romero. J. Chromatogr. B, 751 (2001), pp [6] L.M.L. Stolk, K. Hoogtanders, Pharm. World Sci., 21 (1999), pp

164 [7] F.A. de Wolff, E.J.M. de Haas, M. Verwey, Clin. Chem. 27 (1981), pp [8] A. Duncan, A. Cameron, M. Stewart, R. Russel, Ann. Clin. Biochem., 28 (1991), pp [9] R.M. Kok, D.B. Faber, J. Chromatogr. 222 (1981), pp [10] R.O. Fullinfaw, R.W. Bury, R.F.W. Moulds, J. Chromatogr. 222 (1988), pp [11] K. Jinno, H. Nakamura, Chromatographia, 39 (1994), pp [12] M.R. Euerby, A.P. McKeown, P. Petersson, J. Sep. Sci. 26 (2003), pp [13] W. Kiridena, C. DeKay, W.W. Koziol, Z. Ali, H. Ahmed, C.F.Poole, Chromatographia, 63 (2006), pp [14] R1/Step4/Q2_R1 Guideline.pdf (accessed 09/12) 164

165 5.3 PŘEHLED PLAKÁTOVÝCH SDĚLENÍ Klimeš J., Pilařová P.:Příspěvek k TLC analýze metamphetaminu. XXIV konf. Syntéza a analýza léčiv, Hradec Králové, Sborník konference, str. 31 Pilařová P., Klimeš J.: Analýza biologicky aktivních látek kapalinovou chromatografií. XXV. konf. Syntéza a analýza liečiv, Bratislava, Sborník konference, str. 36 Klimeš J., Pilařová P., Kastner P.: Současnost a trendy analytických přístupů v problematice toxikomanie. 30. konference Syntéza a analýza léčiv, Brno Sborník konference srt.21. ISBN Pilařová P., Klimeš J., Jedlička A.: Analýza vybraných psychostimulancií s využitím kapalinové chromatografie. 31. konference Syntéza a analýza liečiv, Bratislava, Sborník konference str.97. Pilařová P., Klimeš J., Hrbek T.: Analýza derivátů amfetaminu v moči s využitím mikrokolonové HPLC 32. konference Syntéza a analýza léčiv, Velké Karlovice, Sborník konference str.78. ISBN P. Pilařová, L. Hlaváčková, J. Klimeš: HPLC analýza amfetaminů s využitím fluorescenční detekce, 33. konferencia Syntéza a analýza liečiv, Nitra, ; Farm. Obzor LXXIII, str ; ISSN P. Pilařová: Inovace výuky kontroly chemických léčiv dle ČL spektrofotometrie,33. konferencia Syntéza a analýza liečiv, Nitra, ; Farm. Obzor LXXIII, str ; ISSN

166 Pilařová P., Hlaváčková L., Klimeš J.: Determination of Amphetmines by HPLC with Fluorescence Detection, 11 th International Synposium on separation Sciences, Pardubice, ; Book of Abstracts, str.224; ISBN Pilařová P., Slaninová L., Klimeš J.: Hodnocení diklofenaku sodného v topických přípravcích, 35. konference Syntéza a analýza léčiv, Velké Karlovice, ; Sborník konference, str. 128; ISBN X Pilařová P., Kastner P., Rysl T., Klimeš J.: HPLC analýza bromhexin-hydrochloridu a jeho degradačních produktů, 36. konferencia Syntéza a analýza liečiv, Bratislava, ; Sborník konference, str. 112; ISBN Kastner P., Pilařová P., Topková K., Chmurová K.: HPLC analýza klotrimazolu včetně příbuzných látek a benzylalkoholu v přípravku typu krému, 36. konferencia Syntéza a analýza liečiv, Bratislava, ; Sborník konference, str. 112; ISBN Kastner P., Pilařová P., Pasáková I., Minaříková L., Klimeš J.: Stabilita bromhexinu hydrochloridu v tekutém přípravku, 37. konference Syntéza a analýza léčiv, Brno, ; Chem. Listy 102, (2008), str. 224 Pilařová P., Kastner P., Voříšková M., Minaříková L., Klimeš J.: Vývoj metody stanovení kafru v masti, 37. konference Syntéza a analýza léčiv, Brno, ; Chem. Listy 102, (2008), str. 241 Pilařová P., Kastner P., Sommernitzová N., Klimeš J.: Vývoj metody stanovení metformin-hydrochloridu v léčivém přípravku, 38. konference Syntéza a analýza léčiv, Hradec Králové, ; Sborník konference, str. 132; ISBN

167 Kastner P., Pilařová P., Foltinská B., Klimeš J.: HPLC metoda sledování stability lamotriginu v přípravku, 38. konference Syntéza a analýza léčiv, Hradec Králové, ; Sborník konference, str. 96; ISBN Pilařová P., Kastner P., Kendziorová N., Klimeš J.: HPLC analýza metforminhydrochloridu s využitím různých stacionárních fází, 39. konferencia Syntéza a analýza liečiv, Modra-Harmónia, ; Sborník konference, str. 107; ISBN Kastner P., Pilařová P., Vinšová P., Šalamounová A., Klimeš J.: Porovnání klasické náplňové a monolitické kolony na HPLC metodách pro stanovení a hodnocení čistoty léčiva v přípravku, 39. konferencia Syntéza a analýza liečiv, Modra-Harmónia, ; Sborník konference, str. 80; ISBN Pilařová P., Kastner P., Nejedlý T., Klimeš J.: Development Of Hplc Method For Determination Of Aciclovir, Its Related Substances And Preservatives In Topical Preparations, 40. konference Syntéza a analýza léčiv, Brno, ; Sborník konference [CD] Kastner P., Vinšová P., Pilařová P., Klimeš J.: Hplc Method For Simultaneous Determination Of Sodium Picosulfate Including Its Degradation Products And Methyl Parahydroxybenzoate In Pharmaceutical Preparations, 40. konference Syntéza a analýza léčiv, Brno, ; Sborník konference [CD] 167

168 168

169 6 ZÁVĚR 169

170 170

171 Předložená dizertační práce je věnována vývoji metod s využitím kapalinové chromatografie, zahrnuje tenkovrstvou chromatografii, vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii i novější modifikaci - ultra účinnou kapalinovou chromatografii. Práce se také zabývá izolačními postupy sledovaných látek z biologické matrice resp. léčivého přípravku. Všechny vyvinuté metody jsou ověřeny pomocí validačních postupů, které především zahrnují přesnost, správnost, selektivitu, linearitu a citlivost. V rámci dizertační práce byly řešeny dvě tématické části. V prvním případě byla pomocí tenkovrstvé chromatografie vyvinuta metoda separace a izolace methamfetaminu, amfetaminu a jejich hlavních metabolitů z moče. Byly použity silikagelové skleněné desky Kieselgel 60, mobilní fáze ve složení ethylacetát - ethanol - 26% roztok amoniak (100:5:5) a Fast Black K sůl jako detekční činidlo. Pro izolaci všech vybraných látek byl optimalizován postup na kolonkách C 8. Byla také úspěšně testována přímá aplikace vzorků moče na TLC desku, kdy za výše uvedených podmínek došlo k úplné separaci analytů a balastů matrice. Na tuto problematiku navazovala druhá práce, kdy byla vyvinuta a validována HPLC metoda s fluorescenční detekcí pro hodnocení methamfetaminu a jeho metabolitů v moči. Byly navrženy a validovány optimální chromatografické podmínky (kolona LiChrospher 100 RP-18 (5 μm)125 x 4 mm; mobilní fáze acetonitril voda (65:35, v/v), průtok 1 ml.min -1, teplota kolony 30 C, teplota autosampleru 15 C, nástřik 20 μl) a postup pro přípravu vzorků, zahrnující extrakci na pevné fázi se současnou derivatizací dansyl chloridem. Spojením těchto dvou kroků a zvýšením inkubační teploty na 75 C byla výrazně zkrácena příprava vzorku, a tím i doba analýzy. Obě zmíněné metody byly publikovány v odborných časopisech. V druhé tématické části byly řešeny vývoje nových metod pro analýzu léčivých přípravků metodou HPLC resp. UHPLC. První práce se zabývá hodnocením krému s 5% obsahem acikloviru, jeho tří příbuzných látek (guanin, diguanin a diacetylaciklovir) společně s konzervačními přísadami (methylparaben, propylparaben). Pro separaci jednotlivých složek v krému byla použita metoda UHPLC s UV detekcí s gradientovou elucí za vyšší teploty. Vyvinutá metoda byla validována. V další studii byla analyzována účinná látka risperidon spolu se čtyřmi lékopisnými nečistotami pomocí UHPLC s UV 171

172 detekcí. Metoda byla validována a použita pro hodnocení risperidonu v tabletách. Obě vyvinuté metody přinesli výrazné zkrácení doby analýzy v porovnání s konvenčními metodami, což vedlo i k žádoucí úspoře organických rozpouštědel. Poslední popsaná nová HPLC metoda stanovuje Natrium-pikosulfát v kapkách. Kromě účinné látky byly hodnoceny rozkladné produkty a konzervační přísady. Byly vyvinuty dvě isokratické HPLC metody na různých stacionárních fázích v závislosti na použité konzervační látce v léčivém přípravku. Obě metody byly validovány s uspokojujícím výsledkem. Všechny tři prezentované metody byly zaslány k posouzení do odborných časopisů. 172

173 7 LITERATURA 173

174 174

175 1 Kazakevich Y., Lobrutto R., HPLC for Pharmaceutical Scientists, John Wiley & Sons, 2007, New York, USA, ISBN-13: Klimeš J.a kol., Kontrolně-analytické hodnocení léčiv lékopisnými metodami, Nukleus HK, 2011, ISBN Karlíček R. a kol., Analytická chemie pro farmaceuty, Praha, Nakladatelství Karolinum, 2005, ISBN Šaršúnová M., Hanč O. a kol., Vysokoúčinná kapalinová chromatografia vo farmácii a biochemii, Osveta, 1985, ČSFR 5 [online] [cit ] 6 [online] [cit ] 7 [online] ] 8 Barcel O-Barrachina E., Moyano E., Galceran M. T., Lliberia J. L., Bag O B., Cortes M. A., J. Chromatogr. A, 1125, 2006, Nguyen D. T.-T., Guillarme D., Rudaz S., Veuthey J.-L., J. Sep. Sci., 29, 2006, Churáček J. a kol., Nové trendy v teorii a instrumentaci vybraných analytických metod, Academia, 1993, Praha, ČR 11 Meyer V. R., Practical high-performance liquid chromatogramy, John Wiley & Sons, 2007, New York, USA, ISBN: [online] [cit ] 13 Synder L. R., Kirkland J.J., Glajch J. L., Practical HPLC Method Development, 2 th, John Wiley & Sons, 19977, New York, USA, ISBN X 14 Český lékopis 2009, Grada Publishing, a.s., 2009, Praha, ČR ISBN [online] [cit ] 16 Sadek P. C., Troubleshooting HPLC systémy, John Wiley & Sons, 2000, New York, USA 17 Štulík a kol., Analytické separační metody, Univerzita Karlova v Praze, 2005, Praha, ČR 18 [online] ] 19 [online] [cit ] 20 Popl, M., Fluorimetrické detektory v kapalinové chromatografii, VŠCHT, 1991 Praha, ČR 21 Holzbecher Z., Churáček J. a kol., Analytická chemie, SNTL, 1987, Praha, ČR [online] [cit ] 23 [online] [cit ] 24 Nováková L., Matysová L., Solich P., Talanta, 68, 2006, [online] detail/686086[cit ] 175

176 26 [online] [cit ] 27 [online] [cit ] 28 [online] [cit ] 29 [online] [cit ] 30 Nawrocki J., Dunlap C., McCormick A., Carr P. W., J. Chromatogr. A, 1028, 2004, [online] [cit ] 32 Jandera P., Pokroky ve vývoji kolon HPLC současný stav a perspektivy, Sborník konference Vitamíny, 2003, Pardubice, ČR 33 Nawrocki J., J. Chromatogr. A, 779, 1997, Afeyan N. B., Gordon N. F., Mazsaroff I., Verady L., Fulton S. P., Yang Y. B., Regnier F. E., J. Chromatogr. A, 519, 1990, Heftman E., Chromatography,6 th, Elsevier, 2004, New York, USA, ISBN [online] [cit ] 37 [online] [cit ] 38 Švec F., Chem. Listy, 98, 2004, Cram S. P., Polite L. N., American chemical society short course: How to develop, validace and troubleshoot GC and HPLC methods, Washington, 2001, USA 40 The United States Pharmacopoeia XXV, The United States Pharmacopoeial Convention, Rockville, MD, 2012, USA, ISBN The European Pharmacopoeia 7.0, Aciclovir monograph, p , Strasbourg, France, published, ISBN Jamali F., The importace of stereospecific analysis in drug discovery and development, Abstract book of 15 th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, Florencie, Itálie 43 Bauer K., Gros L., Sauer W., Thin Layer Chromatography, Huting Buch Verlag, 1991, Heidelberg, Germany 44 Stahl E., Thin Layer Chromatography, Laboratory Handbook, Springer, 1969, Berlin, ISBN Wall P. E., Thin-Layer Chromatography: A Modern Practical Approach, Royal Society of Chemistry, 2005, Cambridge, UK, ISBN X 46 [online] [cit ] 47 [online] [cit ] 48 [online] [cit ] 49 [online] [cit ] 50 [online] metody v analyticke chemii/prednasky doc.cap/ [cit ] 51 [online] [cit ] 176

177 52 Kataoka H., TrAC Trends Anal. Chem, 22, 2003, Pavlović D. M., Babić S., Horvat Alka J.M., Kaštelan-Macan M., TrAC Trends Anal. Chem, 26, 2007, Roger M. Smith, J. Chromatography A, 1000, 2003, [online] telstvi/vyuka/studijni-materialy/cnpazo42/studijni-materialy/odbxry_krve.pdf [cit ] 56 Babjuk J., Perlík F., Šídlo Z., Bioanalytika léků, Avicenum, 1990, Praha, ČR, ISBN 31-67, Huestis M. A., Oyler J. M., Cone E. J.,. Wstadik A. T., Schoendorfer D., Joseph R. E., J. Chromatogr. B, 733, 1999, Trojan S., a kol., Lékařská fyziologie 4., přeprac. a uprav vydání. Grada Publishing a.s, 2003, 772, Praha, ČR, ISBN Casari C., Andrews A. R. J., Forensic Sci. Int. 120, 2001, Tagliaro F., De Battisti Z., Groppi A., Nakahara Y., Scarcella D., Valentini R., Marigo M., J.Chromatogr. B, 723, 1999, Kidwell D.A., Holland J. C., Athanaselis S., J Chromatogr. B, 713, 1998, Theodoridisa G., Kosterb E. H. M, De Jongb G. J., J. Chromatogr. B, 745, 2000, Girod Ch., Staub Ch., Forensic Sci. Int., 107, 2000, Klíma J., Grafnetterová J.: Využití kapalinové a plynové chromatografie v klinické farmakologii, Avicenum 1987, , Praha, ČR 65 Glatz Z., Chem. Listy, 94, 2000, Allen D. L., Oliver., Forensic Sci. Int., 107, 2000, Cirimele P., Kintz P., Majdalani R., Mangin P., J. Chromatogr., 673, 1995, de Jager L. S., Andrews A. R. J., J. Chromatogr. A, 911, 2001, Andruch V., Kocúrová L., Balogh I. S., Škrlíková J., Microchem. J., 102, 2012, ALOthman Z. A., Dawod M., Kim J., Chung D. S., Anal. Chim. Acta, 739, 2012, Kokosa J. M., TrAC Trends Anal. Chem., In Press, Accepted Manuscript, [online] Simpson N. J. K., Solid-phase Extraction Principles, Techniques, and Applications, Marcel Dekker, 2000, New York, USA, ISBN: [online] [cit ] 74 [online] sics.par.0001.file.tmp/spe_basics.pdf [cit ] 75 [online] [cit ] 76 [online] ethod_development.par.0001.file.tmp/spe_method_development.pdf [cit ] 177

178 77 [online] [cit ] 78 Churáček, J.: Analytická separace látek, SNTL, 1990, Praha, ČR 79 Poole C. F., Gunatilleka A. D., Setrhuraman R., J. Chromatogr. A, 885, 2000, Camel V., Spectrochim. Acta B, 58, 2003, [online] [cit ] 82 [online] [cit ] 83 [online] [cit ] 84 [online] [cit ] 85 Ugland H. G., Krogh M., Rasmussen K. E.:, J. Pharm. Biomed. Anal., 19, 1999, [online] [cit ] 87 Wardencki W., Curyło J., Namieśnik J., J. Biochem. Biophys. Meth., 70, 2007, [online] [cit ] 89 Chunfeng Duan, Zheng Shen, Dapeng Wu, Yafeng Guan, TrAC Trends Anal. Chem., 30, 2011, Rashid B. A., Aherne G.W., Katmeh M.F., Kwasowski P., Stevenson D., J. Chromatogr. A, 797, 1998, Röhrich J., Zörntlein S., Becker J., Forensic Sci Int., 107, 2000, Komárek, K., Franc, J., Churáček, J., Reakční chromatografie v organické analýze, SNTL, 1989, Praha, ČR 93 Talwar D., Watson I. D., Stewart M. J., J.Chromatogr. B, 735, 1999, Bogusz M. J., Kala M., Maier R. D., J. Anal. Toxicol., 21, 1997, Tedeshi L., Frison G., Castagna F., Giorgetti R., Ferrara S. D., Int. J. Legal. Med., 105, 1993, Hayakawa K., Miyoshi Y., Kurimoto H., Matsushima Y. et al., Biol. Pharm. Bull., 16, 1993, Hayakawa K., Imaizumi N., Ishikura H., Minogawa E. et al., J.Chromatogr.,, 515, 1990, Molins-Legua C., Campins-Falco P., Cabeza A.S., Anal. Chim. Acta, 378, 1999, Wang T.K., Fuh M.S., J. Chromatogr. B, 686, 1996, Hayakawa Kazuichi, J. Chomatogr. A, 464, 1991, Herraez-Hernandez R., Campins-Falco P., Sevillano-Cabeza A., J.Chromatogr. B, 1996, 679: La Croix R., Pianezzola E., Strolin Benedetti M., J.Chromatogr. B,, 656, 1994, Herraez-Hernandez R., Campins-Falco P., Verdu-Andres J., Analyst,, 126, 2001, Al-Dirbashi O. Y., Wada M., Kuroda N., Takashi M., Nakashima K., Biomed. Chromatogr., 14, 2000, Al-Dirbashi O. Y., Wada M., Kuroda N., Takashi M., Nakashima K, J Forensic Sci, 45, 2000, Al-Dirbashi O. Y., Kuroda N., Menchini F., Noda S. et al, Analyst, 123, 1998, Herraez-Hernandez R., Falco P.C., Chromatographia, 52, 2000,

179 108 Herraez-Hernandez R., Falco P. C., Diaz-Oltra S., Chromatographia, 49, 1999, Foster B. S., Gilbert D. D., Hutchaleelaha A., Mayersohn M., J.Anal.Toxicol., 22, 1998, Gunaratna Ch.,Kissinger P.T., J. Chromatogr. A, 82, 1998, Katagi M., Nishioka H., Nakajima K., Tsuchihashi H., Fujima H. et al., J. Chromatogr. B, 676, 1996, International Conference on Harmonization (ICH) Guidline Q2A, Text on Validation of Analytical Procedures [online] R1/Step4/Q2_R1 Guideline.pdf [cit ] 113 ICH Guidline Q2B, Validation of Analytical Procedures, Methodology [online] R1/Step4/Q2_R1 Guideline.pdf [cit ] 114 Dohnal J., Brusová H., Moderní přístupy k farmaceutické analýze, Farmaceutická fakulta Veterinární a farmaceutické univerzity Brno, 2010, Praha, ČR 27 42, 64-83, ISBN Ryska M., Validace bioanalytických HPLC/MS metod, In Spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (HPLC/MS), Sborník přednášek kurzu HPLC/MS pořádaného Spektrofotometrickou společností Jana Marka Marci a Univerzitou Pardubice, Pardubice , , ISBN Shabir G.A. et al., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 30, 2007, Holík M., Příručka, Validace analytických metod, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity 118 Suchánek M., Kvalimetrie: Validace analytických metod, EURACHEM, 1997, Praha, ČR, ISBN Divácká I., Psychostimulancia, 2000, Praha, ČR 120 Mann J., Jedy, drogy, léky, Academia, 1996, s.95 a 168 Praha, ČR 121 Nešpor K., Czémy L., Léčba a prevence závislostí, 1.vydání Psychiatrické centrum, 1996, Praha, ČR 122 Osterloh J. D., Abused drugs monograph series, Amphetamines, Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, 1994, Texas, USA 123 Zábranský, T., Drogová epidemologie, Univerzita Palackého, Olomouc Farghali, H. a kol.: Farmakologie a toxikologie, Grada, Praha Endo M., Imanichi H., Moriyasu M., Hashimoto Y., J. Chromatogr., 196, 1980, Bečková I., Višňovský P., Fisherová M.: Farmakologie drogových závislostí, Karolinum, 1999, Praha, ČR 127 Riedl O., Vondráček V., kol., Klinická toxikologie, Avicenum, 1980, Praha, ČR 128 Sato M., Psychopharmol. Bull, 22, 1986, Kikura R., Nakahara Y., Mieczkowski T., Tagliaro F., Forensic Sci. Int., 84, 1997, Helmlin H.J., Bracher K., Bourquin D., Vonlanthen D., Brenneisen R., J. Anal. Toxicol., 20, 1996,

180 131 Lüllmann H., Mohr K., Wehling M., Farmakologie a toxikologie, překlad 15., Grada Publishing a.s., 2004, Praha, ČR, ISBN Lincová D., Farghali H. a kol., Základní a aplikovaná farmakologie, Galén, 2007, Praha, ČR ISBN Mikro-verze AISLP pro MS Windows, SPC přípravků 134 Bangaru R. A., Bansal Y. K., Rao A. R. M., Gandhi T. P., J. Chromatogr. B, 739, 2000, Loregian A., Gatti R., Palu` G., De Palo E. F., J. Chromatogr. B,, vol. 764, 2001, Le Moing J.P., Edouard S., Levron J.C., J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 614, 1993, Falcó P.C., Legua C.M., Hernardez R.H., Cabeza A.S., J. Chromatogr. B, 663, 1995, Kumihashi M., Ameno K., Shibayama T., Suga K., Miyauchi H., Jamal M., Wang W., Uekita I., Ijiri I., J. Chromatogr. B, 845, 2007, Falcó P.C., Hernardez R.H., Cabeza A.S., Trümpler I., Anal. Chem. Acta, 344, 1997, Helmlin J. H., Berenneisen R., J. Chromatogr. A, 593, 1992, He Y., Kang Y-J., J. Chromatogr. A, 1133, 2006, Tiaft D., Thin Layer Chromatografic RF Values of Toxicologically Relevant Substances on Standardized Systems, 1992, Weinheim, Ger 143 Ojanpera I., Lillsunde P., Vartiovaara J., Vuori E., J. Planar Chromatogr., 4, 1991, Lillsunde P., Korte T., J. Anal. Toxicol., 15, 1991, Klimeš J., Pilařová P., Česk. a Slov. Farmacie, 45, 1996, Raikos N., Tsoukali H., Psaroulis D., Vassiliadis N., Tsoungas M., Njau S. N., Forensic Sci. Int., 128, 2002, Mitrevski, Z. Zdravkovski, Forensic Sci. Int., 152, 2005, Kankaanpää A., Meririnne E., Ellermaa S., Ariniemi K., Seppälä T., Forensic Sci. Int., 121, 2001, Talwar D., Watson I. D., Stewart M. J., J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl., 735, 1999, Pilařová P. Kastner P., Klimeš J., J. Planar Chromatogr., 21, 2008, Chou Ch-Ch., Lee M-R., Anal. Chim. Acta, 538, 2005, Katagi M., Nishioka H., Nakajima K., Tsuchihashi H., Fujima H., Wada H., Nakamaura K., Makino K., J. Chromatogr. B, 676, 1996, Kudo K., Tsuchihashi H., Ikeda N., Anal. Chim. Acta, 492, 2003, Lua A.C., Sutono Y., Chou T-Y., Anal. Chim. Acta, 576, 2006, Miki A., Katagi M., Tsuchihashi H., Procedings of the 121st Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan, 4, 2001,s. 171 Saporo. 156 Herráez-Hernández R., Falcó P.C., Díaz-Oltra S., Chromatographia, 49, 1999, Wang T.K., Fuh M. S., J. Chromatogr. B, 686, 1996,

181 158 Faist V., Drusch S., Kiesner Ch., Elmadfa I., Erbersdobler H.F.: Int. Dairy J. 10, 2000, Kang X., Xiao J., Huang X., Gu Z., Clin. Chim. Acta 366, 2006, Maraschiello C., Miranda E., Millán E., Floriano P., Vilageliu J., J. Chromatogr. B, 791, 2003, Mancinelli R., Gentili S., Giiducci M.S., Macchia T., J. Chromatogr. B, 735, 1999, Concheiro M., Castro A., Quintela O., Lopéz-Rivadulla M., Cruz A., Forensic Sci. Int., 150, 2005, Lua A.C., Sutono Y., Chou T-Y., Anal. Chim. Acta, 576, 2006, Pilařová P. Kastner P., Klimeš J.,Chem. listy 107, v tisku, akceptovaný manuscript, Boulieu R., Gallant C., Silberstein N., J. Chromatogr., B Biomed. Sci. Appl., 693, 1997, Swart K. J., Hundt H.K.L., Groenewald A.M., J. Chromatogr., A, 663, 1994, Bahrami Gh., Mirzaeei Sh., Kiani A., J. Chromatogr., B, 816, 2005, Svensson J-O., Barkholt L., Säwe J., J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl., 690, 1997, Tzanavaras P. D., Themelis D. G., J. Pharm. Biomed. Anal., 4, 2007, Huidobro L., Rupérez F. J., Barbas C., J. Pharm. Biomed. Anal., 4, 2005, Basavaiah K., Prameela H. C., Il Farmaco, 6, 2002, Darville J. M., Lovering A. M., MacGowan A. P., Int. J. Antimicrob. Agents, 30, 2007, Basavaiah K, Prameela H. C, Chandrashekar U., Il Farmaco, 12, 2003, Pen K. K., Yuen K. H., J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl., 1, 1997, Šalamoun J., Šprta V., Sládek T., Smrž M., J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl., 1987, 420, Yadav M., Upadhyay V., Singhal P., Goswami S., Shrivastav P. S., J. Chromatogr., B, 877, 2009, Hasan S., Chander P., Ali J., Babota S., Ali M., Drug Test. Anal., 3, 2011, The European Pharmacopoeia 6.0, Aciclovir monograph, p , Strasbourg, France, published, ISBN Grand S., Fitton A., Drugs, 48, 1994, Raggi M.A., Casmenti G., Mandrioli R., Sabbioni C., Volterra V., J. Pharm. Biomed. Anal., 23, 2000, Aravagiri, M., Marder, S.R., Van Putten, T., Midha, K.K., J. of Pharm. Sci., 82, 1993, Woestenborghs, R., Lorreyne, W., Van Rompaey, F., J. Chromatogr. Biomed. Appl., 121, 1992, Nagasaki T., Ohkubo T., Sugavara K., Yasui N., Furukori H., Kaneko S., J. Pharm. Biomed. Anal., 19, 1999, Price M.C., Hoffman D.W., Ther. Drug Monit., 19, 1997, De Meulder M., Remmerie B.M.M., de Vries R., Sips L.L.A., Boom S., Hooijschuur E.W.J., van de Merbel N.C., Timmerman P.M.M.B.L., J. of Chromatogr. B, 870, 2008, Sprigfield A.C., Bodiford E., J. Anal. Toxicol., 20, 1996,

182 187 Avenoso A., Facciola G., Salemi M., Spina E., J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl., 746, 2000, Le-Moing J.P., Edouard S., Levron J.C., J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl., 125, 1993, Balant-Gorgia A.E., Gex-Fabry M., Genet C., Balant L.P., Ther. J., Drug Monit., 21, 1999, Remmerie B.M.M., Sips L.L.A., de Vries R., de Jong J., Schothuis A.M., Hooijschuur E.W.J., van de Merbel N.C., J. Chromatogr. B, 783, 2003, Tomar R.S., Joseph T.J., Murthy A.S.R., Yadav D.V., Subbaiah G., Reddy K.V.S.R.K., J. Pharm. Biomed. Anal., 36, 200), Zhu X., Thiam, S, Valle B.C., Warner I.M, J. Anal. Chem., 74, 2002, Schuberth J., Volatile Organic Compounds, Anal. Chem., 68, 1996, El-Sherif Z.A, El-Zeany B., El-Houssini O.M., J. Pharm. Biomed. Anal., 36, 2005, Song Z.H., Wang C.N., J. Pharm. Biomed. Anal., 36, 2004, Savic I., Nikolic G., Marinkovic V., Savic I., Chemical Industry & Chemical ENgineering Quarterly, 16, 201), Blanco M., Coello J., Iturriaga H., Maspoch S., Romero M. A.. J. Chromatogr. B, 751, 2001, Stolk L.M.L., Hoogtanders K., Pharm. World Sci., 21, 199), de Wolff F.A., de Haas E.J.M., Verwey M., Clin. Chem., 27, 1981, Duncan A., Cameron A., Stewart, Russel R., Ann. Clin. Biochem., 28, 1991, Kok R. M., Faber D.B., J. Chromatogr B, 222, 1981, Fullinfaw R.O., Bury R.W., Moulds R.F.W., J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl., 433, 1988, Jinno K., Nakamura H., Chromatographia, 39, 1994, Euerby M.R., McKeown A.P., Petersson P., J. Sep. Sci., 26, 2003, Kiridena W., DeKay C., Koziol W.W., Ali Z., Ahmed H., Poole C.F., Chromatographia, 63, 2006,

183 8 ABSTRAKT 183

184 184

185 185

186 186

187 187