PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA UNIVERZITY PALACKÉHO V OLOMOUCI Katedra organické chemie

Transkript

1 PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA UNIVERZITY PALACKÉHO V OLOMOUCI Katedra organické chemie Využití Sonogashira cross-coupling reakce k přípravě 5- substituovaných derivátů uracilu BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Autor: Hanuš Slavík Studijní obor: Bioorganická chemie B1407 Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Lucie Brulíková, Ph.D. Olomouc

2 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně pod vedením RNDr. Lucie Brulíkové, Ph.D. za použití literatury, která je citována a uvedena na konci bakalářské práce. V Olomouci dne Hanuš Slavík 2

3 Poděkování: Mé největší poděkování patří RNDr. Lucii Brulíkové, Ph.D. za čas, který mi věnovala při vypracování této práce, a také za předané vědomosti, zkušenosti a cenné rady. Rovněž bych rád poděkoval celému kolektivu Katedry organické chemie UP a svým spolužákům za ochotu a pomoc. Za podporu také děkuji své rodině a nejbližším přátelům. 3

4 BIBLIOGRAFICKÁ IDENTIFIKACE Jméno a příjmení autora: Hanuš Slavík Název práce: Využití Sonogashira cross-coupling reakce k přípravě 5-substituovaných derivátů uracilu Typ práce: Bakalářská Pracoviště: Katedra organické chemie, PřF UP Vedoucí práce: RNDr. Lucie Brulíková, PhD. Rok obhajoby: 2012 Abstrakt: Předložená bakalářská práce je zaměřena na studium derivátů uracilu modifikovaných v poloze 5 rigidním systémem pomocí metody Sonogashira cross-coupling. Je rozdělena do dvou hlavních částí. V první z nich je nejdříve popsán princip cross-coupling reakcí, konkrétně pak mechanismus Sonogashira cross-couplingu. V rámci teoretické části práce jsou dále uvedeny metody přípravy a reaktivity vybraných známých derivátů uracilu s výše zmíněnou modifikací. Druhá část předložené bakalářské práce se zabývá přípravou derivátů uracilu modifikovaných v poloze pět heterocyklickým systémem propojených s nukleobazí přes rigidní trojnou vazbu. Tyto sloučeniny budou v budoucnu inkorporovány do DNA a zkoumány z hlediska jejich biologické aktivity a schopností interagovat s nukleovými kyselinami. Klíčová slova: uracil, cross-coupling, Sonogashira Počet stran: 40 Počet příloh: 0 Jazyk: český 4

5 BIBLIOGRAPHIC IDENTIFICATION Author s first name and surname: Hanuš Slavík Title: Use of Sonogashira cross-coupling reaction to preparation of 5-substituted derivativ of uracil Type of thesis: Bachelor Department: Department of Organic Chemistry, Faculty of Science, UP Supervisor: RNDr. Lucie Brulíková, PhD. The year of presentation: 2012 Abstract: Presented bachelor thesis deals with study of uracil derivatives modified by rigid system in C5 position which were prepared by Sonogashira cross-coupling reaction. Bachelor thesis is divided into two main parts. There is described principle of crosscoupling reactions, specifically the mechanism of Sonogashira cross-coupling reaction, in the first part. This part also includes specific methods for preparation and describes the reactivity of chosen known derivatives with above mentioned modification. Second part of this bachelor thesis focuses on preparation of uracil derivatives which are modified in position C5 by heterocyclic system connected with main core by rigid triple bond. These compounds will be tested from point of view of their biological activity and ability of interactions with nucleic acids. Keywords: uracil, cross-coupling, Sonogashira Number of pages: 40 Number pf appendixes: 0 Language: czech 5

6 Obsah 1. Úvod 8 2. Cíle bakalářské práce Teoretická část Cross-coupling reakce Mechanismy a rozdělení couplingových reakcí Katalyzátory a ligandy v couplingových reakcích Cross-coupling reakce alkynů (Sonogashira cross-coupling) Syntéza a reaktivita vybraných C5 derivátů uracilu s rigidním linkerem Syntéza, reaktivita a biologická aktivita derivátů fenylethynyluracilu Syntéza fenylethynyluracilu a jeho derivátů Reaktivita derivátů fenylethynyluracilu Biologická aktivita fenylethynyluracilu Komplexy rhodia s 5-fenylethynyluracilem Příprava vícejaderných rigidních systémů Diskuze a výsledky Reakce 5-joduracilu s TMS-acetylenem Odbourávání skupiny TMS Příprava 5-(2-pyridylethynyl)uracilu Příprava 5-(2-thiofenylethynyl)uracilu Příprava 5-(3-thiofenylethynyl)uracilu Příprava derivátů uridinu Budoucí plány Experimentální část Metody Přípravy Závěr Literatura 38 6

7 SEZNAM ZKRATEK Ac - acetyl DABCO - 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan DIPEA - diisopropylethylamin DMF - dimethylformamid DMSO - dimethylsulfoxid DMT - dimethoxytritil EDTA - ethylendiaminotetraoctová kyselina Ekv - molární ekvivalent Et - ethyl FDA - Food and Drug Administration, Úřad pro kontrolu potravin a léčiv HBV - hepatitis B virus, žloutenka typu B HCMV - human cytomegalovirus i-pr - isopropyl L - ligand LC-MS - kapalinová chromatografie hmotnostní spektroskopie Me - methyl MIC 50 - minimální inhibiční koncentrace potřebná k zastavení růstu 50% buněk či organismů NMR - nukleární magnetické resonance Ph - fenyl PPr 3 - triisopropylfosfin SAR - structure/activation relationship, studie srovnávající strukturu a aktivitu (v tomto případě biologickou) (S)-DHPA - (S)-9-(2,3-dihydroxypropyl)adenin TBAF - tetrabutylammoniumfluorid TBDMS - tert-butyldimethylsilyl TEA - triethylamin THF - tetrahydrofuran TLC - thin layer chromatography - chromatografie na tenké vrstvě TMS - trimethylsilyl UV - ultrafialové záření 7

8 1. Úvod Analoga přírodních nukleotidů a nukleosidů tvoří podstatnou část zájmu celé řady věd směřujících k vývoji nových léčiv. Jako zdárný příklad rozvoje této oblasti v České republice můžeme uvést antivirotické přípravky prof. Holého založené na bázi acyklických nukleosidů či nukleosidfosfonátů (Obr. 1). Mezi tyto deriváty můžeme řadit např. antiherpetikum (S)-DHPA 1 (prodávaný pod komerčním názvem Duvira gel), adefovir 2 (látka licencovaná v roce 2003 pod komerční název Hepsera k léčbě HBV), cidofovir 3 (preparát schválený FDA v roce 1996 proti HCMV). Obr. 1. Acyklické nukleosidy a nukleotidy. V dnešní době se v klinické praxi využívá spousty antimetabolitů nukleotidové či nukleosidové povahy s širokou variabilitou modifikací jak na heterocyklické, tak na cukerné složce. Tyto preparáty jsou často užívány jako antivirotika, cytostatika či látky s aktivitou antibakteriální, a méně častěji aktivitou antiprotozoální. Velmi zajímavou derivatizací nukleobáze se jeví trojná vazba, která díky své rigiditě může hrát významnou roli při působení těchto látek v biologických systémech. Takovouto modifikaci popisuje celá řada studií, avšak výzkum věnovaný substituci uracilu v poloze C5 tímto rigidním uskupením si zasluhuje svou pozornost. V literatuře lze najít řadu informací o antivirální či cytostatické aktivitě derivátů znázorněných na Obr na str. 9, avšak za povšimnutí stojí rovněž studie věnované vlivu modifikace trojnou vazbou na termální stabilitu DNA:DNA, DNA:RNA nebo RNA:RNA duplexů. U některých látek tato modifikace projevila významný vliv na stabilitu DNA:RNA duplexu prostřednictvím zvýšení π-π interakcí 7. Navíc je to uskupení, které nabízí 8

9 možnost tvorby triazolového skeletu, jehož projevy na termální stabilitu DNA:RNA duplexu byly obdobné 7. Obr. 2. Příklady modifikace uracilu trojnou vazbou. Vzhledem k popsaným skutečnostem se výzkum derivátů uracilu substituovaných v poloze C5 demonstrovaným rigidním systémem může stát přínosem nejen z hlediska studia chemické reaktivity, ale rovněž biologické aktivity. V neposlední řadě může vnést zajímavé výsledky do oblasti studia vlivu na termální stabilitu DNA/RNA s potenciálním využití v antisepse terapii. 9

10 2. Cíle práce Hlavním cílem předložené bakalářské práce byla syntéza derivátů uracilu 8 substituovaných v poloze C5 rigidním linkerem s následnou derivatizací heterocyklickým popř. karbocyklickým systémem. Některé z navržených linkerů či heterocyklických systémů jsou uvedeny na Obr. 3. Obr. 3. Obecná struktura cílových sloučenin. Jednotlivé cíle prezentované práce lze shrnout v následujících bodech: Vyhledání informací o možnostech syntézy derivátů s trojnou vazbou metodou Sonogashira cross-coupling. Syntéza výchozího substrátu - 5-ethynyluracilu - metodou Sonogashira crosscoupling. Couplingová reakce 5-ethynyluracilu s vybranými typy heterocyklických a aromatických sloučenin. V případě dosažení dostatečného počtu doposud neprostudovaných derivátů by byla vytvořena SAR studie cytotoxické, případně antibakteriální aktivity v závislosti na typu cyklu, kterým je zakončen rigidní linker. 10

11 3. Teoretická část Teoretická část předložené bakalářské práce je rozdělena do dvou podkapitol. První z nich pojednává o základních typech cross-coupling reakcí a jejich mechanismech. Nejpodrobněji je prezentována Sonogashira cross-coupling reakce, jež je klíčová pro přípravu cílových derivátů. Ve druhé části jsou popsány některé reakce a práce popisující přípravu vybraných C5 substituovaných derivátů uracilu Cross-coupling reakce Tvorba C-C vazeb patří mezi nejdůležitější reakce v organické syntéze, které nám umožňují elegantní cestou kondenzovat jednotlivé organické struktury. Od počátku 70- tých let dosáhla metodika propojení sp či sp 2 uhlíkových center skutečného rozvoje a to především díky katalyzátorům, které byly pro tyto účely podrobně studovány. Jako ideální katalyzátory se osvědčily komplexy niklu a palladia, jenž umožnily tvorbu C-C vazeb mezi elektrofily typu alkyl/arylhalogenid 9 či sulfonát a nukleofily, které jsou nejčastěji zastoupeny organokovem 10 nebo alkenem. Velmi obecně tedy lze crosscoupling reakce shrnout jednoduchou reakcí znázorněnou na Schématu Schéma 1. Obecné znázornění cross-coupling reakcí. O skutečném masivním rozvoji této oblasti svědčí i fakt, že v databázi SciFinder můžeme nalézt 1908 odkazů na review, z toho jen 238 z roku 2011 (např ). 11

12 Mechanismy a rozdělení couplingových reakcí Podle mechanismu existují dva základní typy těchto reakcí. První z nich jsou klasické cross-couplingy probíhající mechanismem: oxidativní adice, transmetalace, reduktivní eliminace (Schéma 2). Tento typ je daleko častější a spadá zde spoustu konkrétnějších mechanismů (couplingy Grignardových činidel, organoboranů a boronových kyselin, alkynů). Většina z nich nese zároveň zažitý název po svém objeviteli. Schéma 2. Mechanismus klasických couplingů. Druhý typ, který se také nazývá Heckova reakce, probíhá mechanismem: oxidativní adice, inserce, reduktivní eliminace (Schéma 3, str. 13). 12

13 Schéma 3: Mechanismus Heckovy reakce. Vzhledem k faktu, že cross-coupling reakce jsou předmětem mnoha naučných knih a nepřeberného množství článků, včetně zdařilého českého souhrnu 9, nebudou dále podrobně popisovány všechny typy cross-coupling reakcí. Protože pro tuto práci je klíčová Sonogashira cross-coupling reakce, bude dále pojednáno jen o tomto jednom typu mechanismu Katalyzátory a ligandy v couplingových reakcích Reakce mohou být katalyzovány širokým spektrem Pd(0) nebo Ni(0) komplexů, které jsou citlivé na přítomnost kyslíku, a proto je nutné provádět reakce v inertní atmosféře. Nejčastěji používaný je Pd(PPh 3 ) 4, jehož analog niklu je extrémně senzitivní. Také je možné použít oxidované komplexy jako Pd(II) a Ni(II), kdy se aktivní M(0) komplex obvykle vyredukuje přebytkem organokovu nebo báze (např. trialkylaminu). Z nenulových komplexů se pak používají Pd(PPh 3 ) 2 Cl 2 nebo Ni(PPh 3 ) 2 Br 2. Katalytický systém nejvíce ovlivňuje ligand a to na základě elektronové distribuce a sterických vlivů. Při zkoumání reakčních podmínek nebo při tvorbě nové couplingové reakce je ústředním problémem volba katalytického systému, který v dnešní době představuje velkou možnost variability. Zde jsou uvedeny některé možné ligandy či katalytické systémy: ligandy P(furyl) 3, P(tolyl) 3, 1,2-bis(difenylfosfanyl)ethan, 13

14 fenantrolin, bezligandové katalyzátory Pd/C, PdCl 2. Některé moderní ligandy jsou uvedeny na Obr.4. Nejnovější poznatky o použití ideálních katalyzátorů či katalytických systémů jsou popsány v pozoruhodném review z roku Obr. 4. Příklady moderních ligandů Cross-coupling reakce alkynů (Sonogashira cross-coupling) Metoda Sonogashira cross-coupling je reakcí terminálních alkynů 17 s aryl/alkenyllhalogenidy 16, kdy přes alkynylkupráty vznikají jako výsledný produkt aryl/alkenylacetyleny 18 (Schéma 4). Takovéto substráty jsou velmi vhodné pro další syntézy, což je důvodem, proč je tato metoda tak široce používána. V minulosti byla popsána a podrobně diskutována ve 140-ti souhrnných článcích, z nichž dva nejcitovanější pochází z roku ,17. Reakce probíhá v bazickém prostředí za katalýzy palladia a měďné soli. V praxi je nutné tyto reakce provádět v inertní atmosféře, obvykle za laboratorní teploty. Jako rozpouštědlo se pak nejčastěji používá DMF, jako báze TEA a jako měďná sůl CuI. Schéma 4. Obecné schéma Sonogashira cross-coupling reakce. Mechanismus Sonogashira cross-couplingu je shrnut ve Schématu 5, kdy je v palladiovém cyklu, který je typický pro klasické cross-couplingy, produkován 14

15 oxidativní adicí komplex Pd II L 2 R 1 X (kdy X je halogen atom). Kuprátový cyklus, který je typický obvykle pouze pro Sonogashira cross-coupling, pak generuje komplex mědi s reaktantem obsahující volnou trojnou vazbu. V dalším kroku proběhne transmetalace mezi těmito komplexy a regeneruje se měďná sůl. Vzniklý komplex Pd II L 2 R 1 R 2 podléhá reduktivní eliminaci, čímž vznikne produkt reakce a zregeneruje se katalyzátor zpět na komplex Pd 0 L 2. Schéma 5. Mechanismus Sonogashira couplingu. 15

16 3.2. Syntéza a reaktivita vybraných C5 derivátů uracilu s rigidním linkerem V rámci této části bakalářské práce byla snaha o sumarizaci syntetických přístupů vedoucích k derivátům uracilu modifikovaných v poloze 5 ethynylovým zbytkem. Vzhledem k tomu, že deriváty uracilu nesoucí jednu trojnou vazbu tvoří rozsáhlou skupinu látek, jak je demonstrované na Obr. 5., je tato práce zaměřena na přehled derivátů a možnosti jejich syntézy, které již tak běžné nejsou (Obr. 6). Obr. 5. Demonstrace počtu odkazů k některým C5 derivátům uracilu - Scifinder. Derivatizace uracilu rigidním uspořádáním zázorněným na Obr. 6. je popisována jen v několika odkazech a těmto strukturám je věnována i druhá podkapitola teoretické části bakalářské práce. Obr. 6. Obecná struktura popisovaných sloučenin. 16

17 3.2.1 Syntéza, reaktivita a biologická aktivita derivátů fenylethynyluracilu Syntéza fenylethynyluracilu a jeho derivátů V literatuře můžeme nalézt několik odkazů popisujících přípravu fenylethynyluracilu 24a či jeho derivátů 24b-c (Schéma 6), avšak téměř všechny syntézy probíhají za obdobných reakčních podmínek Reakce vždy vychází z 5-joduracilu 7, který Sonogashira cross-couling reakcí s deriváty 23 poskytuje sloučeniny uracilu 24. Všechny reakce byly prováděny pod dusíkem za laboratorní teploty a jejich výtěžky se pohybovaly mezi 42-60%. Jako báze byl nejčastěji využíván TEA nebo diisopropylethylamin. (i) DIPEA nebo TEA, Pd(PPh 3 ) 4, CuI, DMF, rt. Schéma 6. Syntéza derivátů fenylethynyluracilu. V jedné z publikací uvádějící syntézu derivátu 24 také autoři místo běžných katalyzátorů využili 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) 19. Tento katalyzátor bývá používán pro tzv. metal-free Sonogashira cross-coupling reakce, které se ve srovnání s klasickými Sonogashira reakcemi provádějí za vyšší teploty. V našem případě reakce probíhala 48 h při teplotě 130 C. Arcadi a kol. popsali také syntézu amino derivátu fenylethynyluracilu 24 26, která opět probíhala metodou Sonogashira coupling, za katalýzy Pd a přítomnosti diethylaminu ve výtěžku 90% (Schéma 7, str. 18). 17

18 (i) Et 2 NH, Pd(PPh 3 ) 4, CuI, H 2 O. Schéma 7. Syntéza amino derivátu fenylethynyluracilu Reaktivita derivátů fenylethynyluracilu Rigidní linker napojený na nukleobázi je vynikajícím prekurzorem pro další syntézy. Nabízí se možnost reakce na trojné vazbě (např. adice) nebo v tomto případě cyklizace, která zabrání tvorbě vodíkových můstků. V tomto případě byl výchozí látkou opět 5- joduracil 7, na kterém byla provedena reakce Sonogashira coupling s příslušným alkynem a poté cyklizace, která v závislosti na navázaném alkynu trvala někdy až 14 dní. Pro cyklizaci se nakonec jako nejvhodnější podmínky ukázala reakce se stechiometrickým množstvím síranu stříbrného za katalýzy dusičnanu stříbrného při teplotě 50 o C ve směsi vody a 1,4-dioxanu 20 (Schéma 8). (i) AgNO 3, Ag 2 SO 4 nebo aceton, 1:1 dioxan:voda, 50 o C, 6 dní, 37 % výtěžek Schéma 8. Syntéza fenylfuranouracilu Biologická aktivita fenylethynyluracilu Produkty 24 ze Schématu 6 (str. 17) se ukázaly jako efektivní inhibitory druhů Mycobacterium bovis a Mycobacterium tuberculosis, kdy při testech na M. bovis se hodnoty MIC 50 pohybovaly mezi 1 5 μg/ml 18. U M. tuberculosis pak MIC 50 dosahovaly 5 10 μg/ml. Studie dále naznačují, že tyto látky působí jiným 18

19 mechanismem než nukleosidové inhibitory, přičemž konkrétní mechanismus popsán není Komplexy rhodia s 5-fenylethynyluracilem V literatuře můžeme nalézt i práce popisující syntézu komplexů 5- fenylethynyluracilu s rhodiem 25. Předmětem této práce byly reakce komplexů rhodia s uracilem substituovaným poloze C5 rigidním linkerem za účelem studia strukturních forem a následného biologického testování. Tyto reakce probíhají velice selektivně, protože trojná vazba mezi uhlíky je daleko lepším donorem než atom dusíku nebo kyslíku. Nejdříve byla provedena reakce Rh komplexu 28 s 5-fenylethynyluracilem 24a, jako rozpouštědlo byl použit THF (Schéma 9). Konečný Rh komplex 5-fenylethynyluracilu 30 byl připraven reakcí s NaC 5 H 5 v THF. Všechny reakce probíhaly pod dusíkem či argonem. Purifikace byla jednoduchá, obvykle stačila filtrace a promytí hexanem. Struktury připravených látek byly ověřeny pomocí rentgenostrukturní analýzy a NMR spektroskopie. (i) P(i-Pr) 3, THF, 16 h, rt; (ii) THF, 10 h, rt Schéma 9. Syntéza komplexů rhodia. 19

20 Strukturní vlastnosti připravených látek Podle sterického a elektronového uspořádání může organický ligand zaujmout různou pozici v rámci celého komplexu, jak je znázorněno na Obr. 7. Obr. 7. Struktury komplexů ovlivnitelné syntetickým postupem a podmínkami. Jednotlivá jádra uracilu mohou vzájemně vytvářet vodíkové můstky znázorněné na Obr. 8. O H N O [Rh] [Rh] O N N H H O [Rh] [Rh] O N N H H O NH N H O N H O [Rh] O N H N H O Obr. 8. Tvorba vodíkových můstků mezi ligandy. O H N N H O [Rh] Příprava vícejaderných rigidních systémů Schindler a kol. popisují využití metody Sonogashira couplingu i pro přípravu derivátů uracilu s delšími rigidními linkery 26. Tyto linkery mohou být zakončeny symetricky, tedy opět molekulou uracilu nebo asymetricky, jinou nukleobazí, popř. modifikovanou cukernou složkou (Schéma 10-13). 20

21 Schéma 10 popisuje syntézu symetrického derivátu uracilu 40 a jeho nesymetrického analogu 39. Výchozí uracil 34 je nejprve převeden na jod derivát, který je následně reagován s 1,4-dibrombenzenem 36 za vzniku sloučeniny 38. Tento substrát pak v následných coupling reakcích poskytuje vícejaderné deriváty 39 a 40. Jednotlivé Pdkatalyzované syntézy byly prováděny v inertní atmosféře argonu a jako rozpouštědlo byl použit DMF, katalytický systém Pd(PPh 3 ) 4 /CuI/Et 3 N. Téměř všechny reakce probíhaly za laboratorní teploty, pouze coupling reakce s 8-bromoadenosinem za teploty 50 C kvůli snížené reaktivitě bromderivátů. (i) ICl, (ii) Et 2 NH, PPh 3, CuI, Pd, (iii) Na, Me 2 CHOH, (iv) BuLi, (v) TEA, Pd(PPh 3 ) 4, CuI, DMF, 21 h, rt, (vi) KOH, MeOH, THF, 7 h, rt, (vii) 8-bromoadenosin, TEA, Pd(PPh 3 ) 4, CuI, DMF, 11 h, 50 C, (viii) Et 3 N, Pd(PPh 3 ) 4, CuI, DMF, 5 h, rt. Schéma 10. Příklad syntézy asymetricky a symetricky zakončených lineárních sloučenin metodou Sonogashiro coupling. Ve Schématu 11 (str. 22) je pak popsána další možná alternativa syntézy vycházející tentokrát z 5-joduracilu 7, kdy rigidní linker je ve struktuře 42 prodloužen ještě o jedno benzenové jádro. 21

22 (i) TEA, PPh 3, CuI, Pd(OAc) 2, PhMe, 8 h, reflux, reflux rt, (ii) Na, Me 2 CHOH, 3 h, reflux, reflux rt (iii) TEA, Pd(PPh 3 ) 4, CuI, DMF, 5 h, rt. Schéma 11. Další alternativa syntézy lineárních symetricky zakončených sloučenin. Kromě lineárních forem byly připraveny i tetrahedrální struktury (Schéma 12), při jejichž přípravě bylo postupováno analogicky jako v případě lineárních sloučenin. (i) ICl, (ii) Et 2 NH, PPh 3, CuI, Pd(OAc) 2, 11 h, rt reflux, reflux rt, (iii) Na, Me 2 CHOH, 6h, rt reflux, reflux rt (iv) TEA, PdCl 2 (PPh 3 ) 2, CuI, DMF Schéma 12. Syntéza tetrahedrálních sloučenin. Většina připravených látek měla špatnou rozpustnost v organických rozpouštědlech, jež reflektovala i jejich náročnou purifikaci. Tyto metody poskytovaly produkt ve výtěžku 50-90%. Byla vyzkoušena i metoda tzv. Eglintonova couplingu (Schéma 13, str. 23), ta však poskytovala výtěžek pouze okolo 26%. 22

23 (i) Cu(OAc) 2, pyridin/ MeOH Schéma 13. Syntéza symetricky zakončených sloučenin metodou Eglinton coupling. Vybrané analytické vlastnosti připravených derivátů Syntetizované látky (39, 40, 42, 44) poskytovaly práškovitou pevnou látku, s bodem tání obvykle nad 300 o C. U lineárních forem byla pomocí rentgenostrukturní analýzy prokázána schopnost tvořit vodíkové můstky ve vhodném rozpouštědle (v případě této práce DMSO) a vytvořit tak porézní dvoudimenzionální vrstvu, z čehož vyplývá spoustu zajímavých možností využití těchto látek v praxi. U všech připravených derivátů v této práci se vyskytovaly silné fluorescenční vlastnosti, kromě látky 45 ve Schématu 13. U všech byly měřeny emisní fluorescenční spektra, deriváty uracilu obvykle vykazovaly nižší emisní maxima než ostatní deriváty. Díky fluorescenčním vlastnostem a jejich zřejmé kompatibilitě s nukleovými kyselinami lze předpokládat i využití v podobě biomarkerů a chemických krystalizaci z DMSO 26. Potenciál a možné využití Jak je zřejmé již ze struktury těchto látek (39, 40, 42, 44, 45), nabízí se široké využití z hlediska inkorporace do biologických systémů. Byly uvažovány aplikace v molekulární diagnostice, genovém či tkáňovém inženýrství či jiné možnosti manipulace s nukleovými kyselinami, zvláště díky stabilitě DNA a RNA duplexu s těmito látkami. Kromě biologických a medicinálních aplikací mají tyto struktury možný potenciál ve výzkumu nových elektronických a optických zařízení. Díky tvorbě vrstev pomocí vodíkových vazeb (Obr. 7, str. 24) lze uvažovat i o polymerních a jiných energeticky výhodných strukturách využitelných například jako absorbenty. 23

24 Obr. 7. Jedna vrstva rigidním linkerem spojených uracilů vzájemně interagujících pomocí vodíkových můstků. 24

25 4. Výsledky a diskuze Diskusní část bakalářské práce je zaměřena na syntézu derivátů uracilu 47 modifikovaných v poloze C5 rigidním systémem (Schéma 13). Z výchozího 5- joduracilu 7 bylo nejprve potřeba připravit dvou krokovou syntézou 5-ethynyluracil 4, na jehož trojnou vazbu se následně navazovaly příslušné heterocykly. Vedlejším cílem bakalářské práce byla syntéza nukleosidových analog 51, která vycházela z 5-jodouridinu 48. Ten je v následné reakci převeden na ethynylový derivát 50, který Sonogashira cross-coupling reakcí poskytuje uridiny 51. (i) TMS-acetylen, TEA, Pd(PPh 3 ) 4, CuI, DMF, rt, (ii) NH 4 OH, rt, (iii) R 2 -Br, TEA, Pd(PPh 3 ) 4, CuI, DMF. Schéma 13. Navržená strategie syntézy derivátů 5-ethynyluracilu a 5- ethynyluridinu. Reakce prováděné metodou Sonogashira coupling byly ve většině případů uskutečněny za laboratorní teploty v inertním prostředí dusíku. Jako rozpouštědlo byl 25

26 použit DMF, bazické prostředí bylo zprostředkováno přídavkem TEA. Reakce byly katalyzovány měďnou solí a komplexem palladia v nulovém oxidačním stavu. V dalších kapitolách jsou pak zahrnuty jednotlivé kroky syntézy ze Schématu 13 a jednotlivé reakce s různými halogenderiváty v posledním kroku Reakce 5-joduracilu s TMS-acetylenem Prvním krokem celé syntézy byla Sonogashira coupling reakce 5-joduracilu 7 s TMS-acetylenem za katalýzy Pd(PPh 3 ) 4, CuI a přítomností TEA jako báze (Schéma 14). Reakce byla prováděna v suchém DMF v inertní atmosféře dusíku. (i) Pd(PPh 3 ) 4, CuI, TEA, DMF, TMS-acetylen, 24h, rt. Schéma 14. Reakce 5-joduracilu s TMS-acetylenem. Tato reakce byla opakována několikrát, vždy se stejnými poměry výchozích reagentů - 1 ekv. výchozí látky 1,8 ekv TMS-acetylenu, 0,2 ekv CuI a 0,1 ekv Pd(PPh 3 ) 4. První z experimentů probíhal 24 h, u dalších experimentů bylo zjištěno, že reakční doba 2 h je dostačující. Barva reakční směsi se vždy měnila z jasně žluté na tmavě hnědou až černou. Klíčovým problémem však byla purifikace surové směsi, která bude podrobně popsána pro všechny jednotlivé experimenty. V prvním případě reakce probíhala 24 h, poté byla analyzována pomocí TLC a LC- MS. Obě metody ukázaly poměrně čisté zastoupení požadovaného produktu. Směs byla tedy předestilována se třemi postupnými přídavky 2 ml toluenu. Jelikož odpařování rozpouštědla DMF by bylo s ohledem na jeho nízkou těkavost velmi zdlouhavé a nedostatečně efektivní, byla předestilovaná směs, zbavená ostatních kapalných složek, dosušena během 24h na lyofilizátoru. Suchá směs byla nejdříve rozsuspendována v 1,2- dichlorethanu, po hodině míchání a působení ultrazvuku zfiltrována a promyta 1,2-26

27 dichlorethanem. Zbytek na filtru i filtrát byly analyzovány pomocí LC-MS, avšak touto metodou nedošlo k efektivní izolaci produktu. Stejným způsobem byla tedy vyzkoušena i jiná rozpouštědla jako acetonitril nebo metanol. V žádném rozpouštědle však nebyla extrakce dostatečně efektivní, a tak jsme přistoupili k čištění na skleněné koloně metodou LC. Jako stacionární fáze byl zvolen silikagel a jako mobilní fáze byla zvolena směs rozpouštědel CHCl 3 /MeOH v poměru 18:1. Jelikož byla surová směs špatně rozpustná v mobilní fázi, byla látka na kolonu nanášena v suché formě adsorbovaná na silikagel. Touto metodou adsorpční preparativní chromatografie byl získán čistý produkt. Látka byla identifikována pomocí 1 H-NMR spektroskopie. Produkt tvořil béžový prášek ve výtěžku 20 %. Takto malé množství bylo získáno, protože značné množství směsi bylo spotřebováno na pokusy se separací různými rozpouštědly. U druhého experimentu byla reakce monitorována v jejím průběhu pomocí TLC a proběhla během 2h. Poté byla směs opět předestilována a zbytky rozpouštědla lyofilizovány za přídavku vody, která urychluje proces lyofilizace. V tomto případě byly po 24h získány černé krystalky, namísto amorfní tuhé hmoty, jako to bylo v předchozím případě. Látka byla čištěna na skleněné koloně metodou LC stejným způsobem jako v předchozím případě. Bohužel se však tímto způsobem nepodařilo získat požadovaný produkt, pravděpodobně došlo k jeho rozkladu během zpracování. Ve třetím případě jsme se rozhodli surovou směs využít na další reakční krok bez předchozí purifikace. U posledního experimentu byl k surové vysušené směsi přidán metanol, směs byla rozsuspendována v ultrazvuku a zfiltrována. Takto se podařilo získat podíl velmi čistého produktu, který zůstal na filtru, avšak velké množství látky bylo obsaženo rovněž ve filtrátu, který byl poté odpařen a surová směs purifikována pomocí LC. Po odpaření látka tvořila béžový prášek. Při čištění na koloně metodou LC bylo postupováno stejně jako v předchozích případech. Produkt se však nepodařilo dostatečně přečistit, ale byl ponechán pro další reakci (viz. kapitola 4.2.). Při posledních pokusech jsme se také pokoušeli odstranit zbytky mědi vytřepáváním surové směsi rozpuštěné v organické fázi dichlormethanu do vodného roztoku EDTA, tato metoda však nebyla dostatečně efektivní z hlediska odstraňování anorganických nečistot. 27

28 4.2. Odbourávání skupiny TMS K přípravě látky 4 byl ve většině případů použit nadbytek vodného koncentrovaného roztoku amoniaku (Schéma 15), kdy v případě dostatečné čistoty výchozí látky 46 postačovala doba 1h k plnému zreagování reakční směsi. (i) NH 4 OH, 1h, rt Schéma 15. Druhý krok, odbourání TMS. K surovému produktu 46 byl přidán koncentrovaný vodný roztok amoniaku, směs byla míchána 1h za laboratorní teploty. Směs byla odpařena a látka 4 čištěna kapalinovou chromatografií stejným způsobem jako v předchozích případech. Bohužel se však nepodařilo získat dostatečné množství látky, část pravděpodobně zůstala na koloně během purifikace nebo se rozložila. V dalším experimentu byla surová látka 46 míchána po dobu 24h za laboratorní teploty s větším nadbytkem koncentrovaného roztoku amoniaku. Anorganické nečistoty se v roztoku nerozpustily a po zastavení reakce byly zfiltrovány. Filtrát byl odpařen, byl přidán metanol a opětovně odpařen, aby se odstranily zbytky amoniaku. Výsledný produkt byl dosušen pod UV lampou a tvořil béžový prášek, který byl použit pro další reakce. Pro další alternativní odbourávání surové směsi 46 byla vyzkoušena i látka TBAF. Derivát 46 byl rozpuštěn v DMF a přidán TBAF. Směs byla míchána za laboratorní teploty po dobu 24h. Výsledek však po změření LC-MS nebyl uspokojivý, proto byla dále používána jen metoda s vodným roztokem amoniaku. Zajímavé bylo také zjistit, zda surový produkt 4 i s anorganickými nečistotami bude dostatečně reaktivní v dalším kroku, proto byla vyzkoušena známá reakce 5- ethynyluracilu 4 s fenyljodidem (Schéma 16). 28

29 (i) Pd(PPh 3 ) 4, CuI, TEA, DMF, fenyljodid, 24h, rt Schéma 16. Reakce 5-ethynyluracilu s fenyljodidem, prováděno metodou sonogashiro coupling. 5-Ethynyluracil 4 byl smíchán s Pd katalyzátorem, CuI a fenyljodidem. K této směsi byl přidán DMF a TEA a reakce míchána za laboratorní teploty 24 hodin za vzniku látky 24a. Metodou LC-MS však bylo detekováno množství nečistot, požadovaný produkt tvořil pouze 32 %. Tato reakce ukázala, že je nutné pro další reakce použít dostatečně čistý 5-ethynyluracil, proto byla tato látka pro další experimenty vždy purifikována metodou popsanou výše Příprava 5-(2-pyridylethynyl)uracilu Tato látka byla již v minulosti připravena i biologicky testována 18, avšak její syntéza byla provedena (Schéma 17), abychom mohli srovnat reaktivitu 5-ethynyluracilu 4 s pětičlennými a šestičlennými heterocyklickými halogenderiváty. Navíc zmíněná publikace uvádí 1 H NMR spektrum s nepříliš dobře rozlišenými signály a vůbec neuvádí 13 C NMR spektrum, proto je i příprava této látky zahrnuta v experimentální části. (i) Pd(PPh 3 ) 4, CuI, TEA, DMF, 2-brompyridin, 24h, rt. Schéma 17. Reakce poskytující 5-(2-pyridylethynyl)uracil

30 Tato reakce byla provedena za laboratorní teploty a jako reagent byl použit nadbytek 5,5 ekv 2-brompyridinu, kdy reakční směs tvořila čirý hnědý roztok. Reakce probíhala 24 h velice čistě za vzniku látky 52. Reakční směs byla dobře rozpustná v MeOH a přítomnost produktu byla ověřena pomocí LC-MS. Látka byla čištěna metodou LC, stejným způsobem jako v předchozích případech. Přestože se rozmývala na koloně přes velké množství frakcí, i tak bylo izolováno 82,3 mg velmi čistého produktu, což odpovídá 53% výtěžku. Látka tvořila světlý jemný prášek a její struktura byla ověřena pomocí 1 H NMR a MS spektroskopie Příprava 5-(2-thiofenylethynyl)uracilu Příprava látky 53 byla velice obtížná, potvrdila se zde snížená reaktivita pětičlenných heterocyklů ve srovnání s šestičlennými. Produkt se podařilo připravit až po značné optimalizaci reakčních podmínek v množství dostatečném pro potřebné analýzy. Nejvhodnější metoda přípravy výsledného produktu je znázorněna ve Schématu 18, všechny ostatní vyzkoušené metody budou popsány níže. (i) Pd(PPh 3 ) 4, CuI, TEA, DMF, 2-bromthiofen, 1h, 50 C. Schéma 18. Reakce poskytující 5-(2-thiofenylethynyl)uracil. Reakce byla vždy prováděna s 5,6 ekv 2-bromthiofenu. Nejprve byla směs derivátu 4, Pd katalyzátoru, CuI a 2-bromothiofenu v DMF míchána 24 hodin v inertním prostředí dusíku. Analyzovaná reakční směs byla však silně znečištěna a produkt po delší době degradoval (podle LC-MS). Odpařená surová směs byla čištěna metodou LC stejným způsobem jako v předchozích případech, ale bylo izolováno pouze 13 mg čistého produktu (8% výtěžek), který tvořil jasně žlutý prášek. Jiné metody čištění nebyly příliš efektivní, surová směs byla téměř ve všech rozpouštědlech špatně rozpustná, dobře se 30

31 rozpouštěla pouze v DMSO. Nebylo možné látku ani vysrážet chloroformem, vodou či dichlormetanem, extrakce také nebyla díky znečištění produktu účinná. Dále jsme se tedy pokoušeli upravit reakční podmínky, tak abychom získali čistší a lépe izolovatelný produkt. Byla zvýšena reakční teplota na 80 C a pomocí LC-MS reakce monitorována po každé hodině celkem 5 h, přičemž bylo zjištěno, že po 1h už se složení reakční směsi dále nemění a není přítomné žádné množství výchozí látky. Po ukončení reakce byla směs odpařena, ale LC-MS prokázalo velké množství nečistot a jen 22 % zastoupení cílového derivátu 53. Když jsme se pokoušeli tuto látku izolovat a purifikovat kapalinovou chromatografií, získali jsme pouze nepatrné množství požadovaného derivátu. Během purifikace však bylo možné pozorovat neznámou látku, která se velmi rozmývala po celé koloně a pod UV lampou modře fluoreskovala. Tato látka by mohla odpovídat cyklizovanému derivátu 54 (Obr. 9). Obr. 9. Pravděpodobně vznikající vedlejší produkt. Abychom zabránili případné cyklizaci, byla reakční směs zahřívána pouze na 50 0 C po dobu 1h, což bylo dle LC-MS dostačující k plnému zreagování reakční směsi. Surová směs byla po odpaření čištěna pomocí preparativní automatizované LC na přístroji Sepacor a bylo izolováno 29,5 mg čistého produktu tvořícího jasně žluté krystalky. Toto množství odpovídá výtěžku 19 %. Látka 53 byla charakterizována pomocí MS spektroskopie a NMR spektra budou změřeny později. 31

32 4.5. Příprava 5-(3-thiofenylethynyl)uracilu Stejně jako v předchozí kapitole i v případě syntézy látky 55 bylo nutno podmínky reakce značně optimalizovat, nejschůdnější metoda přípravy je shrnuta ve Schématu 19. (i) Pd(PPh 3 ) 4, CuI, TEA, DMF, 2-bromthiofen, 1h, 50 C. Schéma 19. Reakce poskytující 5-(3-thiofenylethynyl)uracil. V případě této syntézy bylo postupováno zcela analogicky jako v předchozí kapitole. I zde při teplotě 80 C vznikal podle LC-MS pravděpodobně cyklický derivát, který však nebyl izolován, protože podle LC spektra bylo v surové směsi přítomno pouze 10% požadovaného derivátu. Následně byla tedy reakce provedena při 50 C 1 hodinu a poté izolováno 44 mg čistého produktu tvořícího jasně žluté krystalky. Výtěžek byl 27 % čistého produktu 55, který byl analyzován pomocí a MS spektroskopie a později budou změřeny i NMR spektra Příprava derivátů uridinu Vedlejším cílem bakalářské práce byla příprava derivátů uridinu 51 (Schéma 20). Tato syntéza probíhala analogicky jako u předchozích sloučenin uracilu. Nejprve byl 5- jodouridin reagován s trimethylsilyacetylenem za katalýzy CuI a Pd soli v DMF za vzniku chráněného nukleosidu 49. Surový produkt byl následně odchráněn použitím vodného roztoku amoniaku za vzniku tmavě hnědé medovité látky 50. Vzhledem k tomu, že tato látka měla podle LC-MS spekter čistotu 81%, rozhodli jsme se surový produkt využít k dalším reakcím bez jakékoliv purifikace. Derivát 50 byl podroben Sonogashira cross-coupling reakcím s 2-bromopyridinem, 2-jodothiofenem a 3-bromothiofenem. Reakce probíhaly při 50 C 1 hodinu, za katalýzy Pd(PPh 3 ) 4, CuI a vsuchém DMF. Po 1 hodině byly reakce lyofilizovány a surové směsi analyzovány pomocí LC-MS. Bohužel výsledná spektra ukázala složitou směs 32

33 neidentifikovatelných sloučnin, žádný z nich však neodpovídal cílovému produktu ani výchozí látce. Časové možnosti však nedovolily zabývat se dále těmito reakcemi, proto je zatím tato část syntézy ukončena neúspěšně. (i) TMS-acetylen, Pd(PPh 3 ) 4, CuI, TEA, DMF, rt, 24 h; (ii) NH 4 OH, rt, 48 h; (iii) R-X, Pd(PPh 3 ) 4, CuI, TEA, DMF, 50 C, 1 h. Schéma 20. Příprava derivátů uridinu Budoucí plány V budoucnu by připravené deriváty uracilu modifikované uvedeným rigidním uspořádáním mohli být inkorporovány do DNA a studován jejich vliv na termální stabilitu. Schéma 21 popisuje jeden z možných přístupů k syntéze požadovaných oligodeoxynukleotidů. Schéma 21. Budoucí plány. 33

34 5. Experimentální část 5.1. Metody Teploty tání byly měřeny na bodotávku Melting Point Apparatus SMP 30, Stuart, Velká Británie. Měření NMR spekter bylo provedeno v roztoku DMSO d6 na Brucker AMX-300 spektrometru (300 MHz) s vnitřním standardem TMS. Hodnoty chemického posunu jsou udány v ppm jednotkách, interakční konstanty v Hz. Měření hmotnostních spekter bylo realizováno na hmotnostním spektrometru TSQ Quantum ACCES, THERMO SCIENTIFIC, USA. Silikagel použitý při kapalinové chromatografii Silicagel 60 ( mm) firmy Merck. TLC chromatografie byla prováděna na hliníkových deskách pokrytých silikagelem 60 F254 značky Merck. Preparativní HPLC byla prováděna s využitím přístroje Agilent 1200 series a preparativní kolony YMC- Pack Pro C18 100x20 mml.d. s-5μm, 12 nm Přípravy 5-(Pyridin-2-ylethynyl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione (52) Do kulaté baňky byl přidán 5-ethynyluracil 4 (100 mg, 0,74 mmol), CuI (29,7 mg, 0,16 mmol) a Pd(PPh 3 ) 4 (91,2 mg, 0,08 mmol). Baňka byla uzavřena septem a pod inertní atmosféru dusíku. Ke směsi byl následně přidán DMF (2 ml), TEA (1,6 ml) a 2-bromopyridin (0,4 ml, 4,1 mmol). Tato směs byla míchána za laboratorní teploty 24 hodin. Pak byla odpařena do sucha a čištěna pomocí preparativní kapalinové chromatografie s použitím mobilní fáze MeOH v CHCl 3 (10 %). Výsledkem byla bílá práškovitá látka ve výtěžku 82,3 mg (53%). Teplota tání nad C. 34

35 1 H NMR (400MHz, DMSO) 8.56 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 7.99 (s, 1 H), 7.82 (dt, J = 1.5, 7.8 Hz, 1 H), 7.51 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), (m, 1 H). 13 C NMR (101MHz, DMSO) 162.8, 150.8, 150.5, 147.4, 143.0, 137.2, 127.4, 123.6, 96.5, 91.9, MS m/z pro C 11 H 7 N 3 O 2 : 213,05, nalezeno 214,00 [M+H] +. 5-(Thiophen-2-ylethynyl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione (53) Do kulaté baňky byl přidán 5-ethynyluracil 4 (100 mg, 0,74 mmol), CuI (29,7 mg, 0,16 mmol) a Pd(PPh 3 ) 4 (91,2 mg, 0,08 mmol). Ke směsi byl následně přidán DMF (3,5 ml), TEA (1,6 ml) a 2-bromothiofen (0,4 ml, 4,15 mmol). Takto připravená směs byla zahřívána pod zpětným chladičem na olejové lázni při teplotě 50 0 C po dobu 1h. Pak byla odpařena do sucha a čištěna pomocí preparativní kapalinové chromatografie s použitím mobilní fáze MeOH v CHCl 3 (10 %). Výsledkem byla žlutá krystalická látka ve výtěžku 29,5 mg (19%). Teplota tání C. MS m/z pro C 10 H 6 N 2 O 2 S: 218,02, nalezeno 219,04 [M+H] +. 5-(Thiophen-3-ylethynyl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione (55) Do kulaté baňky byl přidán 5-ethynyluracil 4 (100 mg, 0,74 mmol), CuI (29,7 mg, 0,16 mmol) a Pd(PPh 3 ) 4 (91,2 mg, 0,08 mmol). Ke směsi byl následně přidán DMF (3,5 ml), TEA (1,6 ml) a 3-bromothiofen (0,4 ml, 4,3 mmol). Takto připravená směs byla zahřívána pod zpětným chladičem na olejové lázni při teplotě 50 0 C po dobu 1h. Pak byla odpařena do sucha a čištěna pomocí preparativní kapalinové chromatografie 35

36 s použitím mobilní fáze MeOH v CHCl 3 (5 %). Takto bylo získáno 44 mg žluté krystalické látky ve výtěžku 27%. Teplota tání C. MS m/z pro C 10 H 6 N 2 O 2 S: 218,02, nalezeno 219,04 [M+H] +. 36

37 6. Závěr Tato bakalářská práce je zaměřena na specifickou část derivátů uracilu substituovaných v poloze C5 rigidním řetězcem zakončeným cyklickou molekulou. Je rozdělena do dvou částí. V teoretické části jsou shrnuty některé zásadní poznatky v oblasti těchto sloučenin. Nejdříve je podrobně diskutován princip cross-coupling reakcí, následně pak podrobný mechanismu Sonogashira cross-coupling reakce, jež je pilířem celé syntetické práce. Dále jsou v teoretické části rozebírány syntézy a některé vlastnosti již připravených a popsaných derivátů. Hlavním cílem této práce však byla příprava výchozího 5-ethynyluracilu a jeho substituce na trojné vazbě různými heterocyklickými systémy. Takto byly připraveny tři deriváty 5-ethynyluracilu - 5-(pyridin-2-ylethynyl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione 52, 5- (thiophen-2-ylethynyl)pyrimidine-2,4(1h,3h)-dione 53 a 5-(thiophen-3- ylethynyl)pyrimidine-2,4(1h,3h)-dione 55. Syntéza prvního z nich již byla popsána, ovšem v literatuře chybí 13 C NMR spektrum, proto je i tato látka zahrnuta v experimentální části práce. Větší počet nových látek se z časových důvodů připravit nepodařilo, jelikož se vyskytlo mnoho problémů s purifikací připravených látek a v případě sloučenin 53 a 55 bylo nutno podmínky pracně optimalizovat. Z časových důvodů se také nepodařilo dokončit syntézu nukleosidových analog. Látky připravené v rámci bakalářské práce budou dále studovány z hlediska jejich biologické aktivity, zejména cytostatické a antibakteriální a rovněž inkorporovány do DNA a studován jejich vliv na termální stabilitu DNA. 37

38 7. Literatura 1. Meropol, N. J. Oral fluoropyrimidines in the treatment of colorectal cancer. Eur. J. Cancer 1998, 34 (10), Punt, C. J. A. New drugs in the treatment of colorectal carcinoma. Cancer (N. Y. ) 1998, 83 (4), Srivastav, N. C.; Rai, D.; Tse, C.; Agrawal, B.; Kunimoto, D. Y.; Kumar, R. Inhibition of Mycobacterial Replication by Pyrimidines Possessing Various C-5 Functionalities and Related 2'-Deoxynucleoside Analogues Using in Vitro and in Vivo Models. J. Med. Chem. 2010, 53 (16), Eger, K.; Jalalian, M.; Schmidt, M. Synthesis of a potential antiviral compound: 5-bromoethynyl-2'-deoxyuridine. Tetrahedron 1994, 50 (28), Peters, W. P.; Gupta, M. Administering DPD inhibitors in combination with 5-FU and 5-FU prodrugs. US A1, Oct 16, Spector, T.; Porter, D. J. T.; Rahim, S. G. Pharmaceutical compositions containing uracil reductase inactivators. WO A1, Apr 2, Andersen, N. K.; Chandak, N.; Brulikova, L.; Kumar, P.; Jensen, M. D.; Jensen, F.; Sharma, P. K.; Nielsen, P. Efficient RNA-targeting by the introduction of aromatic stacking in the duplex major groove via 5-(1-phenyl-1,2,3-triazol-4-yl)- 2'-deoxyuridines. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18 (13), Hocek, M. C-C and C-X bond formation by cross-coupling reactions catalyzed by transition metal complexes. Chem. Listy 2003, 97 (12), Knochel, P. Cross-coupling reactions. A practical guide edited by N. Miyaura. Adv. Synth. Catal. 2003, 345 (8), Anon. Cross Coupling Reactions: A Practical Guide. Edited by N. Miyaura. Org. Process Res. Dev. 2003, 7 (6), Ley, S. V.; Thomas, A. W. Modern synthetic methods for copper-mediated C(aryl)-O, C(aryl)-N, and C(aryl)-S bond formation. Angew. Chem., Int. Ed. 2003, 42 (44), Chinchilla, R.; Najera, C. The Sonogashira reaction: a booming methodology in synthetic organic chemistry. Chem. Rev. (Washington, DC, U. S. ) 2007, 107 (3),

39 13. Yin, L.; Liebscher, J. Carbon-carbon coupling reactions catalyzed by heterogeneous palladium catalysts. Chem. Rev. (Washington, DC, U. S. ) 2007, 107 (1), Brown, J. M.; Cooley, N. A. Carbon-carbon bond formation through organometallic elimination reactions. Chem. Rev. 1988, 88 (7), Ananikov, V. P.; Beletskaya, I. P. Toward the ideal catalyst: from atomic centers to a "cocktail" of catalysts. Organometallics 2012, 31 (5), Chinchilla, R.; Najera, C. The Sonogashira reaction: a booming methodology in synthetic organic chemistry. Chem. Rev. (Washington, DC, U. S. ) 2007, 107 (3), Yin, L.; Liebscher, J. Carbon-carbon coupling reactions catalyzed by heterogeneous palladium catalysts. Chem. Rev. (Washington, DC, U. S. ) 2007, 107 (1), Srivastav, N. C.; Rai, D.; Tse, C.; Agrawal, B.; Kunimoto, D. Y.; Kumar, R. Inhibition of Mycobacterial Replication by Pyrimidines Possessing Various C-5 Functionalities and Related 2'-Deoxynucleoside Analogues Using in Vitro and in Vivo Models. J. Med. Chem. 2010, 53 (16), Luque, R.; Macquarrie, D. J. Efficient solvent- and metal-free Sonogashira protocol catalysed by 1,4-diazabicyclo(2.2.2) octane (DABCO). Org. Biomol. Chem. 2009, 7 (8), Hudson, R. H. E.; Moszynski, J. M. A facile synthesis of fluorophores based on 5- phenylethynyluracils. Synlett 2006, (18), Sun, G.; Fecko, C. J.; Nicewonger, R. B.; Webb, W. W.; Begley, T. P. DNA- Protein Cross-Linking: Model Systems for Pyrimidine-Aromatic Amino Acid Cross-Linking. Org. Lett. 2006, 8 (4), Petricci, E.; Radi, M.; Corelli, F.; Botta, M. Microwave-enhanced Sonogashira coupling reaction of substituted pyrimidinones and pyrimidine nucleosides. Tetrahedron Lett. 2003, 44 (51), Farina, V.; Hauck, S. I. Palladium-catalyzed approach to 5-substituted uracil and uridine derivatives. Synlett 1991, (3), Arcadi, A.; Cacchi, S.; Marinelli, F. Palladium-catalyzed coupling of aryl and vinyl triflates or halides with 2-ethynylaniline: an efficient route to functionalized 2-substituted indoles. Tetrahedron Lett. 1989, 30 (19),

40 25. Cowley, M. J.; Lynam, J. M.; Whitwood, A. C. Rhodium vinylidene and alkyne complexes containing a pendant uracil group. J. Organomet. Chem. 2009, 695 (1), Schindler, D.; Eissmann, F.; Weber, E. Rigid rod and tetrahedral hybrid compounds featuring nucleobase and nucleoside end-capped structures. Org. Biomol. Chem. 2009, 7 (17),