Bioinspirované mikro- a nanosystémy: možnosti jejich aplikací v katalýze a medicíně

Transkript

1 Bioinspirované mikro- a nanosystémy: možnosti jejich aplikací v katalýze a medicíně Miloš Sedlák Univerzita Pardubice Fakulta chemicko-technologická Ústav organické chemie a technologie Centralizovaný rozvojový projekt MŠMT č. C29: Integrovaný systém vzdělávání v oblasti výskytu a eliminace reziduí léčiv v životním prostředí

2 Bioinspirované organicko-anorganické hybridní materiály Biomimetická mineralizace 2

3 ěkteré přírodní biominerály CaC 3 Coccolith (kalcit trigonální systém) Perleť Ušeně mořské (aragonit ortorombický systém) Perleťový korál (vaterit hexagonální systém) Sedlák M., Kašparová P.: Vesmír, 2003, 82,616. 3

4 Princip funkce molekulárního nástroje při mineralizačním experimentu rukojeť čelo Amfifilní chování při kontaktu s povrchem minerálu umožňuje -řídit velikost a tvar částic - stabilizovat koloidní systém = hydrofilní, vysoká afinita k minerálu = hydrofilní, zanedbatelná afinita k minerálu + minerální superstruktura kontrola modifikace krystalu = minerál bez šablony 4 se šablonou

5 Syntéza série modifikovaných hydrofilních blokových kopolymerů Polymerní templáty pro biomimetický růst minerálních krystalů m - PEG C 2 m-peg Cl (5000 g mol 1 ) Polyethyleneimine (700, 2000 g mol 1 ) m - PEG PEG-b-PEI x 2 y BrC 2 C P S C 3 =C=S m - PEG PEG-b-PEI-R R() x R() y R() R: C 2 C, (C 2 ) 2 P 3 2, (C 2 ) 3 S 3, C 3 =C(S) Sedlák M., Cölfen., Antonietti M.: Macromol. Chem. Phys. 1998, 199,

6 Provedení mineralizačního experimentu Sedlák M., Cölfen., Antonietti M.: Macromol. Chem. Phys. 1998, 199,

7 Vliv přítomnosti polymerního templátu s různými funkčními skupinami na morfologii krystalů síranu barnatého 2µm PEG-b-PEI-S 3 0.5µ m PEG-b-PMAA-Asp 0.5µm 2µm bez aditiva 2µ m PEG-b-PEI-C PEG-b-PEI-P 3 2 Sedlák M., Cölfen.: Macromol. Chem. Phys. 2001, 202,

8 Vliv polymerního templátu modifikovaného chirálními ligandy na morfologii a resoluci vínanu vápenatého R() R() n x y PEG-b-PEI-R R() 2 C PEG-b-PEI-L-Glukonát. PEG-b-PEI-L-istidin. C Samotný CaT PEG-b-PEI-L-Prolin. PEG-b-PEI-L-Askorbát. Mastai Y., Sedlák M., Cölfen., Antonietti M.: Chem. Eur. J. 2002, 8,

9 Další možnosti využití templátů Příprava a charakterizace nanorobotu určeného k vychytávání cholesterolu z vodného prostředí 3 C C 3 C 3 3 C C 3 C 3 3 C ~112 mpeg-b-pll Cl TEA mpeg-b-pll-chol sledováno zvyšování velikosti micel - zachytávání molekul cholesterolu prostřednictvím nekovalentních interakcí RTEM Polymer Počet zachycených molekul cholesterolu na molekulu polymeru Velikost micel (nm) polymer Velikost micel (nm) polymer + zachycený chol. mpeg-b-pll 8.5 -Chol PLL 3 -b-peg-b-pll 4 -Chol mpeg--chol n Chol Chol 2 Drabinová E.; Cölfen.; Sedlák, M.: připraveno k publikování.

10 Metalochromní enzymy biomimetická katalýza asymetrická enryho reakce L L M X X R 2 L L M X X 2 C R 2 R 1 L L M C R 2 X R 1 L L M X M L L R 1 R 1 R 2 R 2 R 2 X Evans, D. A.; Seidel, D.; Rueping, M.; Lam,. W.; Shaw, J.T.; Downey, C. W. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125,

11 Vysoce účinné homogenní katalyzátory enryho reakce 11

12 Farmakologicky významné sloučeniny založené na enantioselektivní enryho reakci (R)Isoprenalin antiastmatikum

13 enry reakce: stereoselektivní syntéza klíčového meziproduktu léčiva Fosamprenavir (komplex Cu 2+ /midazolin-4-on) Léčba IV infekce: peptidomimetický inhibitor IV-proteáz Panov, I.; Drabina, P.; anusek, J.; Sedlák, M.: Synlett 2013, 24,

14 Recyklovatelné katalyzátory enryho reakce pro udržitelné technologie Příprava katalyzátoru koordinací ligandu na polymerní měďnatou sůl Bhosale D.S.;Drabina P.; Palarčík J.; anusek J.; Sedlák M.:Tetrahedron Asymmetry 2014, 25,

15 DLS charakterizace katalyzátoru v ethanolu (96%) PEG-b-PGACu-L-1 Distribuce hydrodynamické velikosti micel PEG-b-PGACu-L-1 závisí na koncentraci: 25 mg ml 1 : 189 ± 33 nm 2,5 mg ml 1 : 134 ± 16 nm 15

16 Enantioselektivní katalýza enryho reakce: srovnání katalyzátorů 20 mol % Cu(II) 3 C C 2 Cu 3 C ipr Pokus Katalyzátor R konverze b (%) L-1/Cu(Ac) 2 ee c (%) PEG-b-PG-CuL-1 konverze b (%) 1 Ph MeC ClC BrC PhC t-bu ee c (%) 3 C C C 3 L-1/Cu(Ac) Cu 2 8 C 3 ipr a omogenní katalyzátor b Výtěžky izolovaného produktu po chromatografickém čištění c Stanoveno PLC na koloně Chiracel D- PEG-b-PG-CuL-1 (6,92% Cu(II) 16

17 Princip recyklace katalyzátoru 3 C rganic layer Cu 2 C 3 ipr věření recyklovatelnosti katalyzátoru pro reakci Me 2 s 2-MeC 6 4 C Bhosale D.S.;Drabina P.; Palarčík J.; anusek J.; Sedlák M.:Tetrahedron Asymmetry 2014, 25,

18 osiče založené na síťovaných perlových kopolymerech styrenu Botnavé Makroporézní Kristensen T. E.; ansen, T.: Eur. J. rg. Chem. 2010,

19 Imobilizace ligandu na polymerní nosiče Testování katalyzátorů připravených z komerčních polymerů : Za 1 týden dosaženo pouze 5% konverze! Polymerní matrice komerčních polymerů výrazně zpomaluje difuzi reaktantů. 19

20 Suspenzní polymerace příprava perlového nosiče PS-VBC-TEG Kopolymerace: styren, 4-vinylbenzychlorid, tetra(ethylenglylol)-bis(4-vinylbenzyl) ether Androvič, L.; Drabina, P.; Panov, I.; Frumarová, B.; Kalendová, A.; Sedlák, M. Tetrahedron: Asymmetry 2014, 25,

21 Charakterizace připraveného perlového polymeru PS-VBC-TEG bsah chloru: 5,84 %; 1,65 mmol/g Velikost kuliček: µm Botnavost: Et 11 ml g 1 TF 22 ml g 1 DMS 18 ml g 1 21

22 Ramanova spektroskopie a) Připravený polymer PS-VBC-TEG b) Ligand zakotvený polymeru PS-VBC-TEG c) Komplex zakotveny PS-VBC-TEG (katalyzátor) 5,21 % Cu(II) polymer 22

23 Enantioselektivní katalýza enryho reakce: srovnání katalyzátorů 20 mol % Cu(II) Pokus Katalyzátor A a B R konverze b (%) ee c (%) konverze b (%) ee c (%) 1 Ph > MeC 6 4 > Katalyzátor A 3 4-CC 6 4 > ClC 6 4 > PhC 6 4 > C 6 4 > C 6 4 >99 98 > n-bu >99 93 > t-bu c-c Katalyzátor B a n-pr, r.t., h (Arai, L 2007) b Výtěžky izolovaného produktu po chromatografickém čištění c Stanoveno PLC na koloně Chiracel D- 23

24 věření recyklovatelnosti katalyzátoru pro reakci Me 2 s t-c 4 9 C Katalyzátor lze recyklovat nejméně 5 bez poklesu výtěžku a bez ztráty enantioselektivity Androvič, L.; Drabina, P.; Panov, I.; Frumarová, B.; Kalendová, A.; Sedlák, M. Tetrahedron: Asymmetry 2014, 25,

25 Příprava nanočástic Fe ydrofilní nanočástice Fe 3 4 (FeS 4 /a, a 3, citronan sodný, 100 C) Fe Fe() 2 3Fe() 2 + ½ 2 Fe() 2 + 2Fe + 2 Fe() 2 + 2Fe Fe Core-shell nanočástice Fe 3 Si 2 (sol-gel metoda) 3. anočástice Fe 3 Si 2 2 McCarhy S.A.; Davies G-L., Gunko Y.K.: ature Protocols 2012, 7,

26 Příprava magneticky separovatelného katalyzátoru Si 2 Fe pyridine 48h,25 C Si Fe 3 2 (C) 2 Si Cu 2+ CuC 3 Fe 3 2 (C) 2 Cu

27 Charakterizace katalyzátoru Fe 3 2 (C) 2 CuL-1 istogram distribuce hydrodynamické velikosti částic (DLS) 115 ± 34 nm Fe 3 2 (C) 2 CuL-1 Ethanol; 0.01mg/ml Morfologie částic Fe 3 2 (C)CuL-1 (SEM) Částice mají sférický charakter, 10 m 2 /g (BET) vysycháním roztoku nanočástic vznikají aglomeráty

28 Enantioselektivní katalýza enryho reakce: srovnání katalyzátorů 5 mol % Cu(II) Pokus Katalyzátor R L-1/Cu(Ac) 2 konverze b (%) ee c (%) Fe 3 2 (C) 2 CuL-1 konverze b (%) 1 Ph MeC ClC BrC ee c (%) 3 C C 2 Cu L-1/Cu(Ac) 2 C C 3 3 C ipr 5 4-PhC cyklohexyl n-butyl t-butyl a omogenní katalyzátor b Výtěžky izolovaného produktu po chromatografickém čištění c Stanoveno PLC na koloně Chiracel D- Fe 3 2 (C) 2 CuL-1 28

29 Příprava meziproduktu syntézy (R)-Salmeterolu (antiastmatikum)

30 Princip recyklace katalyzátoru věření recyklovatelnosti katalyzátoru pro reakci Me 2 s 2-MeC 6 4 C

31 Závislost konverze na množství katalyzátoru pro reakci Me 2 s 2-MeC 6 4 C (10 C) ( ) 0.12 mg/ml ( ) 0.5 mg/ml ( ) 5 mg/ml (ο) 12 mg/ml Závislost hydrodynamické velikosti částic katalyzátoru Fe 3 2 (C) 2 CuL-1 na jeho koncentraci v reakčním prostředí: tvorba agregátů mg/ml Fe 3 2 (C) 2 CuL-1 mol % Fe 3 2 (C) 2 CuL-1 nm hydrodynamic size distribution h half-life of reaction ± 34 (a) > ± 39 (b) ± 27 (c) ± 46 (d) ± 92 (e) * 5* homogenní katalyzátor 3*

32 anosystémy pro transport léčiv potenciální medicinální aplikace 32

33 3 Systemické fungální infekce Imunosupresivní pacienti : těžká základní choroba (leukemie, AIDS) po podávání imunosupresivních léků (širokospektrá antibiotika a chemoterapeutika) důsledek invazivní medicíny: průnik mikroorganismů do krevního řečiště překonání přirozených barier (kardiální chirurgie, katetrizace, infuse) 1

34 Amfotericin B (AMB) 3 C C 3 C 2 3 C Polyenové makrocyclické antifungální antibiotikum 2 C 3 Izolace: 1955 Streptomyces nodosus M4575 Trejo, W.; Bennett, R. J. Bacteriol. 1963, 85, 436. Absolutní konfigurace: 1970 Totální syntéza: 1987 Mechlinski, W.;et al Tetrahedron Lett. 1970,11, icolaou. K.C.;et al J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 2821.

35 Směrovaný β-glukosidáza senzitivní konjugát AMB star poly(ethylenglykol) (AMB 4 -speg) -C--AMB -C--AMB n n spojka n -C--AMB n -C--AMB molekulární spínač Sedlák M., Drabina P., Bílková E., Šimůnek P., Buchta V. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 2952.

36 Princip cíleného uvolnění AMB z polymerního nosiče -C--AMB AMB--C β glukosidase 2 AMB 4 speg speg 1,6- elimination speg C 2 AMB- 2 speg C 2 2 AMB--C- speg konjugát (C) enzym (E) C-E C E uvolnění

37 Testování konjugátu AMB4-sPEG in vitro enzymatická hydrolýza Konjugát relativně stabilní ve fosfátovém pufru: p = 7,4; c = 0,04 M, 37 C, 24h (odštěpuje se méně než 5 mol % AMB) -C--AMB AMB 4 speg β glukosidase 2 speg AMB- 2 + glukose + C 2 speg Záznam časové změny UV-vis: enzymatická hydrolýza konjugátu ( M); β-glukosidáza (Aspergillus niger. E.C ) (2 mg /1 ml; 66.6 units/g); fosfátový pufr (p = 7,4; M); 37 C. (uvolnění AMB potvrzeno též PLC) Inset: kinetická závislost absorbance na čase při 409 nm [τ 1/2 = (103 ± 4)s].

38 nemocnění tuberkulózou (TBC) TBC nejrozšířenější a nejnebezpečnější infekční onemocnění Podle W ročně nově diagnostikováno 9 mil. lidí a 1,5 mil. zemře ejohroženější skupiny lidí IV infekční, maligně nemocní diabetici závislí na alkoholu a tabáku postižení silikózou geneticky predisponovaní Původce Mycobacterium tuberculosis popř. Mtb - komplex Formy TBC plicní (nejčastější : Mtb nejlépe roste ve tkáních bohatých na kyslík) mimoplicní W report 2012; 38

39 Prevence a léčba TBC Vakcinace: aplikace oslabeného kmenu M. bovis (BCG vakcína) Léčba: užívání antituberkulotik (5 skupin) Perorální antituberkulotika první volby W report 2008; 39

40 Současné trendy ve strategii léčby TBC použití léčiv s dlouhodobým účinkem (slow-acting drugs) Potenciál v aplikaci konjugátů antituberkulotik s biokompatibilními polymery Silva, M.; Lara, A. S.; Leite, C. Q. F.; Ferreira, E. I. Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 2001, 334, 189. C C 3 C ~112 2 ~5 Konjugát I s blokovým kopolymerem mpegbpolyllys Imramovský, A.; Grusová, L.; Beneš, L.; Pejchal, V.; Sedlák, M. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 5952.

41 Syntéza konjugátu I mpeg-b-polylys Distribuce velikostí částic (DLS) M = g mol 1 Ve vodě vznik micelárního systému 173 ± 41 nm (0.1mg/ml) Charakterizace konjugátu: 1 13 C MR, IR, GPC, RTG-práškovou difrakcí, DLS Imramovský, A.; Grusová, L.; Beneš, L.; Pejchal, V.; Sedlák, M. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22,

42 Uvolňování I z polymerního nosiče za podmínek in vitro Fosfátový pufr p = 7,4; ( mol l 1 ); 37 C, za 24h uvolněno cca 13 % I 3 C ~112 C 2 ~5 C 2 C Acetátový pufr p = 4; ( mol l 1 ); 37 C, za 24h uvolněno cca 26% I Imramovský, A.; Grusová, L.; Beneš, L.; Pejchal, V.; Sedlák, M. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22,

43 ávrh konjugátu I k likvidaci rezistentních ložisek anočástice Fe 3 2 Využití nanočástic magnetitu Biokompatibilní, medicinálně využívané Snadno připravitelné, jednoduché zavedení funkčních skupin Možnost cíleného transportu aplikací externího magnetického pole Marszall, M.P. :The Development of Magnetic Drug Delivery and Disposition, The Delivery of anoparticles, Abbass A. ashim (Ed.), ITEC, Shangai

44 Příprava konjugátu Fe 3 2 -I 1. Aktivace isoniazidu 2. Příprava nanočástic konjugátu Fe 3 Si 2 I Sedlák, M.; Bhosale D.S.; L.; Beneš, L.; Palarčík, J.; V.; Kalendová, A.; Královec, K.; Imramovský, A.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, 23,

45 RTG difrakce práškového vzorku Charakterizace konjugátu Fe 3 2 -I Intensity (a.u.) (311) (b) (111) (220) (222) (400) (422) (511) (440) (a) Θ (degree) Difrakční píky Fe 3 2 I podobné samotným nanočásticím Fe ; odpovídají klastrům kubických spinelových nanokrystalů Fe 3 4. Průměrná velikost krystalů Fe 3 4 v klastrech a činí 13 nm (Sherrer). 45

46 FT-IR spektroskopie Charakterizace konjugátu Fe 3 2 -I Pás 1695 cm 1 odpovídá Fe 3 2 I uspořádání: -C--=C-; Elementární analýza: obsah I v konjugátu: 3% (210 µmol g 1 ). 46

47 Charakterizace konjugátu Fe 3 2 -I istogram distribuce hydrodynamické velikosti částic (DLS) 115 ± 34 nm Morfologie částic Fe 3 2 I (SEM) Částice mají sférický charakter, vysycháním roztoku nanočástic vznikají aglomeráty 47

48 Studium uvolňovaní isoniazidu z Fe 3 2 -I za podmínek in vitro Roztok mol l 1 Cl; t 1/2 = 65 s (k obs = s 1 ) Fosfátový pufr p = 5.3 ( mol l 1 ) t 1/2 = 116 s (k obs = s 1 ). Fosfátový pufr p = 7.4 ( mol l 1 ) konjugát stabilní Sedlák, M.; Bhosale D.S.; L.; Beneš, L.; Palarčík, J.; V.; Kalendová, A.; Královec, K.; Imramovský, A.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, 23,

49 Studium toxicity Fe 3 2 -I na buněčných kulturách Testováno na buňkách lidského prsního adenokarcinomu SK-BR-3, sledována adheze a proliferace buněk pomocí xcelligence systému Časová závislost normalizovaných CI hodnot pro I A pro Fe 3 2 -I má podobný charakter Buněčná toxicita konjugátu je srovnatelná se samotným isoniazidem. 49

50 Aplikační možnosti Kromě případné intravenózní aplikace lze uvažovat i o použití nasálním (vhodné pro plicní formy TBC) Sedlák, M.; Bhosale D.S.; L.; Beneš, L.; Palarčík, J.; V.; Kalendová, A.; Královec, K.; Imramovský, A.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, 23,

51 Aplikace magnetických částic Fe 3 2 v biomedicinálním výzkumu určování složení proteinů Jednou z metod určování složení proteinů je založeno na jejich enzymatické fragmentaci s následnou analýzou pomocí metod hmotnostní spektrometrie. Problém separace enzymu po proteolýze byl řešen imobilizací trypsinu na Fe 3 2 Slováková M., Křížková M., Kupčík R., Bulánek, R., Bílková Z., Sedlák M.: připraveno k publikování 51

52 Aplikace magnetických částic Fe 3 2 v biomedicinálním výzkumu určování složení proteinů MS-MALDI spektra po štěpeníα-s1-kaseinu Fe 3 2 -C-trypsin,2 h, 25 C 52

53 Aplikace magnetických částic Fe 3 2 v biomedicinálním výzkumu určování složení proteinů Analýza a interpretace MS-MALDI spekter po štěpeníα-s1-kaseinu Fe 3 2 -C-trypsin Protein m/z submited m/z matched Delta ppm Modification s Missed cleavage s Peptide sequence α-casein S (R)LSMK(E) (K)EGIAQQK(E) (R)YLGYLEQLLR(L) (K)IQKEDVPSER(Y) (R)FFVAPFPEVFGK(E) (K)VPQLEIVPSAEER(L) Phospho 0 (K)VPQLEIVPSAEER(L) (K)QGLPQEVLELLR(F) (K)YKVPQLEIVPSAEER(L) Phospho 0 (K)DIGSESTEDQAMEDIK(Q) Phospho 1 (K)YKVPQLEIVPSAEER(L) (K)PIKQGLPQEVLELLR(F) (K)EPMIGVQELAYFYPELFR(Q) (K)EGIAQQKEPMIGVQELAYFYPELFR(Q) Slováková M., Křížková M., Kupčík R., Bulánek, R., Bílková Z., Sedlák M.: připraveno k publikování 53

54 Aplikace magnetických částic Fe 3 2 v biomedicinálním výzkumu určování složení proteinů výsledky sekvenční analýzy umožňují určit nebo identifikovat jednotlivé proteiny VÝZKUM ÚLY PRTEIŮ PŘI VZIKU EMCÍ DIAGSTIKA EMCÍ SLEDVÁÍM BIMARKERŮ VÝVJ VÝC LÉKŮ 54

55 Shrnutí Byly připraveny a charakterizovány nové mikro- a nanosystémy jako recyklovatelné enantioselektivní katalyzátory a nové transportní systémy vybraných léčiv. Vodnými nosiči byly koloidní blokové kopolymery PEGu, magnetické nanočástice Fe 3 2 a botnavý kopolymer styrenu. Připravené heterogenní katalyzátory splňují řadu požadavků zelené a udržitelné chemie a představují ekologicky vstřícné systémy s vysokým aplikačním potenciálem. Připravené konjugáty vybraných léčiv představují nové nadějné formy známých léčiv. 55

56 Prof. Dr. elmut Cölfen Universität Konstanz Poděkování Doc. Ing. Jiří anusek, Ph.D. Univerzita Pardubice Dr. Klaus Tauer Max-Planck Institut Potsdam Mgr. Ilia Panov, Ph.D. Karlova Univerzita v Praze Ing. Jiří Váňa, Ph.D. Karlova Univerzita v Praze Ing. Ladislav Androvič Univerzita Pardubice Dattatry Shivariao Bhosale, MSc. Univerzita Pardubice Doc. Ing. Pavel Drabina, Ph.D. Univerzita Pardubice Ing. Eliška Drabinová, Ph.D. Univerzita Pardubice Lydie, armand, Ph.D. Univerzita Pardubice Mgr. Marcela Slováková, Ph.D. Univerzita Pardubice

57 Děkuji za pozornost