Popis genetického založení dvojitého osvalení a jeho význam u psů Bakalářská práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Popis genetického založení dvojitého osvalení a jeho význam u psů Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Stehlík Ph.D. Vypracoval: Anna Schmidtová Brno 2012

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Popis genetického založení dvojitého osvalení a jeho využití u psů vypracovala samostatně a použila jen pramenů citovaných v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MENDELU v Brně. dne:. podpis:

3 PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych poděkovat Ing. Liboru Stehlíkovi Ph.D. za odborné vedení, pomoc při zpracování bakalářské práce a mnohé cenné rady. Dále mé rodině a přátelům za morální podporu.

4 ABSTRAKT Bakalářská práce popisuje objev genu myostatinu, zaměřuje se na vliv mutací genu na skot, ovce, koně, člověka a psy, zejména pak na vliv na výkonnost u psů plemene vipet. V roce 1997 byl lokalizován gen myostatinu (MSTN). Díky jeho lokalizaci byly, pomocí experimentů na myších, objeveny mutace způsobující fenotyp dvojitého osvalení. Práce shrnuje informace o výzkumu mutace delece dvou párů bází na nukleotidech 939 a 940 potvrzující vliv na schopnost vipetů, běhajících sprinterské dostihy, vyvinout vyšší rychlost díky většímu osvalení. Dále obsahuje návrh využití mutece gen MSTN u vipetů v praxi, kdy díky zjištění genotypu mohou chovatelé dosáhnout šlechtěním lepších výsledků. Klíčová slova: dvojité osvalení, fenotyp, mutace, myostatin, vipet Bachelor work describes finding of myostatin gene, it focuses on influence of myostatin mutations on cattle, sheep, horses, humans and dogs, and especially on it s influence on racing performance of whippet breed. In 1997 was located myostatin gene (MSTN). Thanks to its localization, mutations were found, which causes double muscling phenotype, using experiments on mice. Work sums up information about research on deletion of two pair basis on nucleotides 939 and 940, which confirms its influence on ability to develop higher speed thanks to higher muscling at whippets performing in dog races. It also suggests how to apply mutations of MSTN gene in whippets on their performance, when thanks to knowing the genotype it helps breeders to achieve better outcomes in breeding. Key words: double muscling, fenotype, mutation, myostatin, whippet

5 OBSAH 1 Úvod Cíl práce Literární přehled Myogeneze Objev genu myostatinu Dvojité osvalení Skot Fenotyp Lokalizace Mutace Negativa Ovce Lokalizace Mutace Fenotyp Koně Fenotyp Lokalizace Mutace Genotypy Člověk Fenotyp Lokalizace Mutace Psi Plemeno vipet Dostihy Fenotyp Lokalizace Mutace Genotyp Výkonnost Využití Metody molekulární genetiky Izolace DNA Gelová elektroforéza Polymerázová řetězová reakce (PCR) PCR - RFLP Sekvenování DNA Sangerova sekvenční metoda Závěr Literatura... 37

6 1 ÚVOD Myostatin je protein negativně regulující růst svalů. Gen, kódující tento protein, byl poprvé popsán v roce 1997 a účinky jeho mutace prokázány pomocí experimentů na myších. V závislosti na objevení lokalizace mutace u myší, byl gen hledán i u jiných živočichů, především skotu, ovcí, koní, psů nebo člověka. Fenotyp mutace genu myostatinu se nazývá dvojité osvalení, ne proto, že by zvířata měla dvojité svaly, ale proto, že jsou od pohledu výrazně osvalená (McPherron et al., 1997). U skotu je fenotyp dvojitého osvalení spojen s vyšší masnou užitkovostí a vyšší kvalitou masa. Některá plemena, jako belgické modré nebo peimontese, jsou na tento fenotyp speciálně šlechtěna (Zahrádková et al., 2009). Proto se vědci rozhodli odhalit gen myostatinu a jeho mutace způsobující nefunkčnost bílkoviny myostatinu, což by mohlo pomoci i chovatelům v úspěšnějším šlechtění a vyvarování se negativních vlivů této mutace na některé vnitřní orgány (McPherron et al., 1997). Dále byla snaha identifikovat dvojité osvalení u některých plemen ovcí chovaných na masnou užitkovost, kde, podobně jako u skotu, je prokázána vyšší výtěžnost masa (Clop et al., 2006). Vzhledem k tomu, že se v současné době koně ani psi nešlechtí na masnou užitkovost, byl u nich zkoumán gen myostatinu a jeho mutace v souvislosti s výkonností. U koní byl výzkum proveden u plemene anglický plnokrevník a byl hledán význam různých genotypů na výkonnost jedinců v souvislosti s jejich úspěšností v dostizích (Hill et al., 2009). U psů byla mutace genu myostatinu objevena u plemene vipet. Toto plemeno se účastní dostihových závodů, pro které bylo vyšlechtěno, a kde někteří jedinci vykazovali značný nárůst svalstva již od narození, kterým se výrazně lišili od ostatních jedinců. Dana S. Mosher a její tým od takto osvalených psů sekvenovali gen myostatinu a objevili mutaci způsobující nefunkčnost bílkoviny myostatinu. Pomocí analýzy vipetů prokázali pozitivní vztah mezi mutací genu myostatinu a výkonech v dostihových závodech (Mosher et al., 2007). Toto je důležitý poznatek pro chovatele vipetů, kteří díky těmto poznatkům mohou přizpůsobit šlechtění vipetů pro produkci takto zvýhodněných psů. 6

7 2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce je popsat mutace v genu myostatinu (MSTN) a fenotyp dvojitého osvalení u několika živočišných druhů. Dále pak analyzovat vliv mutace genu myostatinu na sportovní výkon u psů plemene vipet. Charakterizovat, na základě studia odborné literatury, vývoj svalů, následně regulační faktory myogeneze a objev genu myostatinu. U skotu, ovcí, koní, člověka a psů popsat fenotyp dvojitého osvalení, lokalizace genu myostatinu a jeho mutace vyskytující se u daných živočišných druhů, popřípadě genotyp, nebo negativní či pozitivní dopad mutací. Dále u psů navrhnout způsob využití znalostí o genotypech genu myostatinu a popsat základní metody molekulární genetiky, využívané pro detekci mutací. 7

8 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Myogeneze Myogeneze je vývoj a tvorba svalů. Tato tvorba je dána velikostí a počtem svalových vláken, která se tvoří během embryonálního vývoje. Počet svalových vláken (myofibril) je dán především genetickými faktory, ale z části také faktory prostředí, které jsou schopny ovlivnit prenatální myogenezi (Rehfeld et al., 2000). Svalová tkáň vzniká ze středního zárodečného listu mezodermu. Diferenciace mezodermu probíhá v raném embryonálním období společně s vývojem tělní stěny a tělních dutin. V počátku se buňky myotomů začínají přeměňovat v buňky vřetenovitého tvaru myoblasty (prekurzory svalových buněk). Většina těchto myoblastů se později diferencují na svalové buňky, některé ale zůstávají nediferenciované až do dospělosti. Z těchto nediferenciovaných buněk, které se nepodílejí na tvorbě svalových vláken, se stanou satelitní buňky. Diferenciované myoblasty se řadí za sebe do sloupců a v místech, kde se buňky dotýkají, zanikají buněčné membrány. Tím se vytvoří útvary zvané myotuby. Na tyto myotuby postupně naléhají satelitní buňky a vše dohromady kryje společná membrána. Postupem vývoje se myotuby prodlužují a řadí se podél sebe. Jádra myoblastů jsou v této fázi uložena uprostřed myotuby v řadě za sebou, kdy jedna myotuba může obsahovat až 100 jader (Malínský, Lichnovský, 2006). Satelitní buňky zůstávají stále nediferenciované. Slouží jako zásobní materiál, jehož schopnosti buněčného dělení a diferenciace je využito později, kdy se nepřímo zúčastňují regenerace svalového vlákna v období dospělosti (Marvan et al., 1998). Diferenciace svalového vlákna definitivně končí vytvořením L-systému (cisterny diferenciované ze sarkoplazmatického retikula, uspořádány podél myofibril) a T- systému (systém kolmo probíhajících tubulů) (Malínský, Lichnovský, 2006). Existují dva typy svalových vláken, červená a bílá. Červená svalová vlákna jsou tenčí a obsahují méně myofibril a více sarkoplazmy, mitochondrií a myoglobinu (svalové barvivo). Bílá vlákna jsou silnější, mají méně sarkoplazmy, mitochodrií a myoglobinu, ale více myofibril. Rozdíl mezi nimi spočívá ve funkci, zatímco bílá vlákna se smršťují velmi rychle, ale rychle se unaví, červená vlákna jsou vytrvalejší, ale smršťují se pomaleji. Rozdíl je také v uvolňování energie, kdy bílá vlákna ji získávají pomocí anaerobní glykolýzy a červená oxidací (Marvan et al., 1998). 8

9 Na tvorbu svalových vláken mají vliv především vnitřní činitelé (genetické faktory), jako jsou regulační faktory myogeneze (MRF rodina muscle regulatory factors), které tvoří skupinu základních helix-loop-helix (bhlh) faktorů transkripce skládající se z proteinů MyoD, myogenin, Myf-5 a MRF4. MRF faktory jsou produkovány výhradně v kosterní svalovině a mají hlavní roli při vývoji kosterního svalstva (Weintraub et al., 1991). MRF rodina může být rozdělena do dvou funkčních skupin; Primární skupina, skládající se z MyoD a Myf-5, je esenciální pro determinaci kosterních myoblastů a sekundární skupina, myogenin a MRF4, hrají roli později jako diferenciační faktory (Lynn et al., 1996). S pomocí genového inženýrství (metoda gene targetting) byla osvětlena role MRF rodiny během embryogeneze. Pokusy na myších s nulovými mutacemi (null mutation) MyoD, myogenin, Myf-5 a MRF4 zavedenými do zárodků myší odhalilo hierarchický vztah mezi těmito proteiny (Rudnicki a Jaenisch, 1995). U myší, kterým chyběl funkční gen pro MyoD, nebyly zaznamenány žádné zjevné abnormality kosterního svalstva, ale vykazovaly čtyřikrát vyšší hladinu Myf-5 (Rudnicki et al., 1992). Podobně se projevovaly novorozené myši, kterým chyběl funkční gen pro Myf-5; Vykazovaly normální kosterní svalstvo, ale zemřely po narození na několik abnormalit na žebrech (Braun et al., 1992,1994). Novorozené myši bez funkčních genů jak pro MyoD, tak pro Myf-5, úplně postrádaly kosterní myoblasty a svaly (Rudnicki et al., 1993). Myši postrádající myogenin zemřely při narození kvůli absenci myofibrilů, nicméně je přítomen normální počet fungujících myoblastů produkujících MyoD (Hasty et al., 1993). Naopak myši bez funkční MRF4 byly životaschopné a vykazovaly normální kosterní svalstvo, ale měly čtyřikrát zvýšenou hladinu myogeninu (Patapoutian et al., 1995, Zhang et al., 1995). Další rodinou, která se podílí na tvorbě svalů je super rodina růstových faktorů TGF-β (transforming growth factor). V roce 1981 byly TGF-β poprvé popsány Robertsem et al., (1981), kteří zjistili, že TGF-β vyvolává proliferaci (buněčné bujení) u krysích jater. Od té doby bylo zjištěno mnoho různých efektů TGF-β, jako například regulace růstu buněk, proliferace buněk, diferenciace buněk, adheze buněk (soudržnost) nebo apoptóze (řízená buněčná smrt sloužící k eliminaci poškozených nebo nepotřebných buněk) (Massague et al., 1998, 2000, 1990). Tyto efekty jsou vysoce komplexní a někdy obtížné je rozlišit, nicméně jeden z hlavních znaků TGF-β je, že 9

10 jejich projevy jsou závislé na vnitřním prostředí buněk. Bylo prokázáno, že u kosterního svalstva mají členové TGF-β super rodiny vysoký vliv jak na vývoj svalů tak na postnatální (poporodní) kosterní svalovinu. Tato rodina se skládá z více než padesáti strukturálně si podobných ligandů (molekula, která poskytuje vazebné elektrony), většina z nich spadá do tří hlavních podrodin: TGF- β, BMP (bone morphogenetic protein) a aktivitu (Feng et al., 2005). TGF-β 1 je jedním z ligandů podílející se na vývoji svaloviny, ale i jiných tkání. Aktivita TGF-β 1 je specifická pro buněčný obsah, což znamená, že jeho projevy jsou determinovány intracelulárním prostředím buněk. TGF-β 1 je nezbytný pro svoji in vivo funkci, protože reguluje mnoho tkání a procesů. Objasnění role TGF-β 1 v kosterní svalovině započalo experimenty na uměle vypěstovaných svalových buňkách (in vitro) (Kollias et al., 2007). Dalším členem TGF-β super rodiny, který se podílí na tvorbě a regulaci svalové hmoty, je myostatin. 3.2 Objev genu myostatinu Gen myostatin (MSTN) byl poprvé popsán v roce 1997 pomocí experimentů na myších, kdy došlo k úmyslnému knock-outu 3. exonu (část genu, ze které vzniká protein), protein se stal nefunkčním a tyto myši vykazovaly vysoký nárůst kosterní svaloviny (McPherron et al., 1997). Nejvíce nápadný fenotyp svalové hypertrofie byl pozorován u homozygotních myší (u obou alel se nachází mutace, mh/mh), které byly o 30% větší než heterozygotní myši (pouze na jedné alely je mutace, mh/+) a normální myši. Nárůst svalové hmoty se zdál rozšířený po celém těle. Jednotlivé svaly homozygotních jedinců vážily dvakrát až třikrát více než svaly normálních myší (McPherron et al., 1997). Zároveň byla aktivita myostatinu u myší inhibována dvěma různými způsoby. Prvním způsobem byla exprese myostatinu, kterému chybělo restrikční místo (specifické místo na řetězci DNA) a choval se jako dominantní negativní forma růstového faktoru, čímž zabraňoval tvorbě aktivního myostatinového dimeru dnms (Zhu et al., 2000). Druhým způsobem byla exprese myostatinové oblasti, která byla kontrolována lehkými řetězci myostatinu v promotorové oblasti MLC1 (gen kódující proteiny vyskytující se v mozku, slezině a bílých krvinkách) (Yang et al., 2001, Lee et al., 2001). V těchto studiích byl nárůst svalové hmoty patrný, ale 10

11 výrazně nižší než bylo zaznamenáno u transgenních knock-out myší. Nicméně tyto poznatky souhlasí s faktem, že u dnms myši bylo množství zpracovaného myostatinu nižší pouze o 23 40% (Yang et al., 2001). Obr.1: Myš s genotypem +/+ a myš s genotypem mh/mh. (zdroj:mcpherron et. al., 1997) Změny v dostupnosti myostatinu byly také navozeny injekcemi protilátky blokující myostatin u dospělých myší, které jim byly podávány po dobu 2-4 týdnů. Toto vedlo také ke zvýšení velikosti svalové hmoty o 13-30% jak u samců, tak samic. Tento účinek byl pozorován u mladých jedinců stejně jako u 24 týdenních myší. Navíc tento pokus s protilátkami myostatinu neovlivnil, kromě svalů, velikost orgánů ani různé hodnoty krevního séra, což svědčí o tom, že u dospělých jedinců inhibice myostainu ovlivňuje pouze nárůst svalů bez vedlejších účinků (Whittemore et al., 2003). Pomocí RNA izolované z kosterního svalstva člověka, krysy, paviána, skotu, ovce, kuřete, krocana, prasete, dania pruhovaného naklonovali gen myostatinu a porovnali s genem myši, který obsahuje zachovaný C-terminál genu. C-terminál je zralá, aktivní část molekuly myostatinu. Všechny sekvence, které získali z naklonované DNA, obsahovali sekvenci pro sekreci a místo s C-terminálem s cysteinovým zbytkem, který lze nalézt u všech členů TGF-β rodiny. Ze studie vyplývá, že myostatin se vyskytuje u mnoha druhů zvířat. Dokonce u krysy, člověka, prasete, kuřete a krůty je sekvence myostatinu 100% identická v místě C-terminálu a u paviána, skotu a ovce se liší pouze třemi aminokyselinami. Myostatin u dania pruhovaného je pouze z 88% podobný ostatním z této studie (McPherron et al., 1997). 11

12 Ve vztahu k pokusům snažícím se změnit aktivitu myostatinu nebo jeho projev v těle, vyvstala otázka, je-li nárůst svalové hmoty způsoben zmnožením svalových vláken (hyperplazií) nebo zvětšením svalových buněk (hypertrofie). Histologická vyšetření homozygotních myších vedla k závěru, že z velké části se na zvětšení svalové hmoty podílelo zmnožení svalových vláken hyperplazie. Určení množství svalových vláken u kraniálního holenního svalu (tibialis cranialis) ukázalo, že počet svalových vláken byl u homozygotních myší o 86% vyšší než u kontrolní skupiny. Také množství DNA extrahované ze svalových buněk bylo pouze o 50% vyšší (McPherron et al., 1997). Počet svalových vláken a jejich průměr byly zvýšeny u zvířat produkujících propeptid (neaktivní forma bílkoviny) (McPherron et al., 2001). Další provedené pokusy potvrdily také svalovou hypertrofii. Homozygotní myši vykazovaly u holenního svalu a lýtkového svalu (gastrocnemiu) zvětšený plošný průřez o % (McPherron et al., 1997). Svalová hypertrofie byla také popsána u transgenních myší (obsahující uměle přenesené geny), které nadměrně produkovaly myostatin, stejně jako u dnms myší, kde hypertrofie ovlivnila stejně pomalá i rychlá vlákna (Zhu et al., 2000, Yang et al., 2001, Lee et al., 2001). Z těchto poznatků vyplývá, že hypertrofie je pravděpodobně hlavním projevem nepřítomnosti myostatinu u myší. Opačné výsledky byly získány z myší, které projevovaly svalově specifickou myostatinovou expresi. Kosterní svalstvo těchto myší bylo zmenšeno o 20 22% a plošný průřez svalovými vlákny u lýtkového svalu byl o 18% menší než u kontrolní skupiny (bez funkčního myostatinu). Množství buněčných jader bylo také značně nižší. Transgenní samice překvapivě nevykazovaly žádnou ztrátu svalů nebo změny hmotnosti (Reizs-Porszasz et al., 2003). Tyto výsledky vedou k závěru, že v dospělosti vyvolaná nízká nebo utlumená inhibice hladiny myostatinu vede ke svalové hypertrofii, zatímco úplné potlačení funkce myostatinu v prenatálním období vede také k hyperplasii. Dvojité osvalení je způsobeno mutací v genu myostatinu, což potlačuje funkci bílkoviny kódované podle tohoto genu již v prenatálním období. U skotu, který je pozitivní na dvojité osvalení, je důvodem zvýšené svalové hmoty spíše zvýšení počtu svalových vláken hyperplazie, než kombinace hyperplazie a hypertrofie jako je tomu u homozygotních myší. Plošný řez svalovými vlákny pološlašitého svalu (semitendinosus) nebyl výrazně rozdílný u belgického modrého (plemeno šlechtěné na dvojité osvalení) 12

13 než u skotu bez dvojitého osvalení (Wegner et al., 2000). Počet svalových vláken u belgického modrého se po narození významně nemění (Luff et al., 1970). Rozdílné výsledky experimentů jsou zaznamenány u ryb. Snížení myostatinové aktivity expresí myostatinové u dania pruhovaného (danio rerio) způsobilo zvýšení růstu svalů spojené s hyperplazií, což se u transgenních ryb projevilo zvýšením počtu myofibryl (z myofibryl je složeno svalové vlákno) o 10% než u kontrolní skupiny (Xu et al., 2003). Nicméně potlačení exprese genu myostatinu pomocí kontaktu s RNAi (interferenční RNA způsobující potlačení funkce genu) vede k hyperplazii nebo hypertrofii podle množství injektované RNAi, což, na rozdíl od myší, vede při snížené inhibici myostatinové exprese k upřednostňování svalové hyperplasie. Navíc výskyt dvou genů myostatinu u některých druhů ryb přináší do této problematiky nové komplikace, protože tyto dva geny vykazují rozdílný způsob exprese ve svalových a jiných tkáních (Rescan et al., 2001). Kromě toho je jejich exprese rozdílně řízena růstovými hormony u několika druhů ryb (Biga et al., 2004, Roberts et al., 2004). Myostatin u ryb je detekován v několika tkáních včetně svalů, očí, žábrech, slezině, vaječnících, střevech, mozku a v menším množství ve varlatech (Rodgers et al., 2001, Maccatrozzo et al., 2001). Analýzy na daniu pruhovaném naznačovaly, že myostatin je slabě produkován v raném stádiu embrya a jeho produkce se značně zvyšuje v pozdějších stádiích vývoje, stejně jako u kosterního svalstva dospělých jedinců (Xu et al., 2003). Několik studií informovalo o tom, že myostatinová mrna byla produkována hlavně v červených svalech než v bílých, a že tedy myostatin by se mohl podílet na různé rychlosti růstu mezi rychlými a pomalými svaly (Roberts et al., 2004, Rescan et al., 2001). Vliv myostatinu na tukovou tkáň je méně objasněn. McPrerron et al.(1997) v počátečním výzkumu nepozoroval žádný vliv myostatinu na tukovou tkáň u 16 týdenní myši. Současně žádné změny na tukové tkáni nebyly pozorovány ani u myší, kde byl myostatin blokován protilátkou (Whittemore et al., 2003). Naopak Lin et al. (2002) popsal u 12 týdenních homozygotních myší značné snížení váhy tukových polštářků a celkového obsahu lipidů, přičemž celkový obsah proteinů byl značně vyšší než u normální myši, ale tělesná váha byla podobná. Následně McPherron et al. (1997) poukázal na to, že ačkoliv není rozdíl mezi 8 týdenní homozygotní myší a stejně starou normální myší, tak u 32 týdenní se celkový tuk v těle zredukoval o 70%. Z toho 13

14 vyplývá, že dalece genu myostatinu ovlivňuje tukovou tkáň v souvislosti se svalovou tkání. Myši postrádající myostatin jsou charakteristické značnou redukcí akumulace tukové tkáně související s věkem, navzdory tomu, že mají normální příjem potravy, tělesnou teplotu a lehce sníženou rychlost metabolismu (Julia-Ekaza et al., 2006). 3.3 Dvojité osvalení Dvojité osvalení je fenotyp způsobený mutacemi genu myostatinu (MSTN). Tyto mutace se projevují nefunkční bílkovinou myostatinu, která působí jako negativní regulátor růstu svalové hmoty. Tzn., svalová hmota se zvětšuje v důsledku hypertrofie a hyperplazie. Jedinci nesoucí fenotyp dvojitého osvalení jsou na první pohled rozeznatelní od normálních jedinců. Fenotyp dvojitého osvalení a mutace MSTN byli popsány u několika savců jako je skot, ovce, kůň, pes a člověk Skot První psaná zmínka svalové hypertrofie u skotu britského farmáře v jeho dobytčím almanachu (Culley 1807) a později popsána Kaiserem (1888), označila začátek nových možností v chovu zvířat, zejména výkrmu skotu. Fenotyp dvojitého osvalení se rozšířil evropskými chovy skotu Fenotyp Fenotyp dvojitého osvalení (double muscling - DM) neznamená, že zvíře má zdvojené svaly, ale zmnožení svalových vláken a zvětšení svalových buněk (Swatland & Kieffer 1974), přičemž DM skot má při narození dvakrát tolik svalových vláken než normální skot (Gerrard et al., 1991). Dále má DM skot vyšší procento bílých svalových vláken a nižší podíl kolagenu. Také bylo zjištěno, že svaly od těchto zvířat obsahují méně pojící tkáně, což by mohlo přispívat k jemnosti masa. V porovnání s kontrolní skupinou a DM skotem se liší hladiny hormonů. Původně se myslelo, že u DM skotu jsou zvýšené hladiny růstových hormonů, ale novější studie prokázaly opak hladiny byly nižší. Podobné výsledky byly u inzulinu, kdy u kontrolní skupiny byla hladina inzulinu vyšší než u DM skotu (Artur et al., 1990). Také jsou zde rozdíly v množství tuku. DM skot má výrazně méně tuku než normální skot, především intramuskulárního, známý jako marbling (Hanset, 1991). Méně marblingu vede ke snížení chuti masa. Je to způsobeno 14

15 redukcí velikosti subkutánní a vnitřní tukové tkáně v adipocytech, ale na druhou stranu je velikost adipocytů s intramuskulárním tukem stejná jako u normálního skotu (Hocquette et al., 1999). Během nuceného fyzického cvičení se DM skot unavil mnohem dříve než normální z důvodu redukce krevní cirkulace vedoucí ke svalovým acidózám, a také k přehřívání svalů během tepelného stresu díky nižší schopnosti ztráty tepla kvůli omezené respirační kapacitě (Ménissier, 1982). Obr. 2: Fenotyp dvojitého osvalení u plemene belgické modré. (zdroj: 15

16 Lokalizace U skotu se gen myostatinu nachází na distálním konci chromozomu 2 (Grobet et al., 1997), skládá se ze tří exonů a dvou intronů a je lokalizován v MSTN (McPherron et al., 1997). Dvojité osvalení, které bylo pozorováno u mnoha plemen skotu během minulých 190 let, se dědí jako jeden hlavní autozomální lokus s několika modifikacemi fenotypové exprese (Ménissier, 1982). Přítomnost mutantní alely u homozygotů vede k svalové hypertrofii, ale mutace nemusí být přítomna v homozygotní formě, aby se projevila. Zvířata, která zdědila jednu kopii mutantní alely křížením s plemenem belgické modré nebo s plemenem piemontese, vykázala zvýšený podíl masa a méně externího a intramuskulárního tuku v porovnání se zvířaty bez mutované alely (Casas et al., 1998) Mutace Je známo několik mutací u sekvence MSTN, které způsobují dvojité osvalení inaktivováním genu myostatinu (Grobet et al., 1997). U belgického modrého je mutace způsobena delecí jedenácti nukleotidů včetně, a tyto se označují jako nt821(del11). To vede k posunu a předčasnému ukončení bioaktivního karboxylového terminálu v genu (Grobet et al., 1997). U plemene piemontese a gaskoňského plemene se G přeměnilo na A což mění cysteinový zbytek na tyrosinový ve stejné vysoce zachované oblasti genu, známý jako C313Y lokalizovaný na nukleotidové pozici 938, náležící k exonu 3, což přeruší disulfidový most nutný pro správnou tvorbu bílkoviny (Kambadur et al., 1997, McPherron & Lee, 1997). Další mutace v místě 419 bp 2. exonu je označována jako nt419 (del7-ins10), kdy dochází k deleci 7 bp a následnému vložení dalších 10 bp, které způsobují náhlé vytvoření stop kodonu u 140. aminokyseliny bílkovinného řetězce. Byly objeveny dvě podobné substituce ve 2. exonu. První záměna cytosinu (C) za thymin (T) v pozici 610 bp a druhá záměna guaninu (G) za thymin (T) v pozici 676 bp způsobují opět náhlé vytvoření stop kodonu blízko N-terminálu aminokyselinového řetězce u 240 respektive 226 aminokyselin. Tyto mutace se nazývají Q204X. Mutace F94L má za následek substituci konzervativního fenylalaninu za leucin v 94. aminokyselině bílkovinného řetězce. Další mutace nt414 (C-T) byla objevena ve 2. exonu a způsobuje záměnu cytosinu (C) za thymin (T), což způsobuje vytvoření stop kodonu u 138. aminokyseliny bílkovinného řetězce. Mutace 16

17 typická pro italské plemeno skotu marchigiana byla objevena ve 3. exonu na pozici 817 bp, kde byla identifikována záměna guaninu (G) za thymin (T), čímž došlo k vytvoření stop kodonu v místě 291. aminokyseliny bílkovinného řetězce (Zahrádková et al., 2009) Negativa Mutace myostatinu u skotu způsobuje redukci velikosti vnitřních orgánů a pouze skromný nárůst svalové hmoty (u belgického modrého % v porovnání s % u mutované myši). Podle McPherrona et al. (1997) je možné, že skot téměř dosáhl maximálního limitu v nárůstu svalové hmoty díky šlechtění na masnou užitkovost, zatímco myši takto šlechtěny nebyly. Největší problém u plemen s dvojitým osvalením se objevuje v reprodukci. Objevuje se zde redukce samičí plodnosti, nižší přežitelnost potomků a pozdější pohlavní dospělost (Ménissier, 1982). Hanset et al. (1991) zjistili, že březost u DM skotu je delší než u normálního. To vede k vyšší porodní váze telat a komplikacím při porodu, která způsobují vyšší mortalitu telat u neasistovaných porodů. Dalším zhoršením je vysoké osvalení pánevní oblasti, což zabraňuje roztažení pánve při porodu (Wiener et al., 2002). Na druhou stranu heterozygotní plemenice jsou sice větší než normální, ale nevykazují takové problémy při porodu jako homozygotní zvířata. Zatímco homozygotní zvířata nemají šanci porodit bez asistence, heterozygotní samice mají větší potenciál pro samostatný porod. Proto je pro chovatele výhodné chovat heterozygotní samice, které jsou schopné přirozeného porodu a produkci homozygotních telat, což vede k ekonomičtější produkci telat a menším ztrátám jak telat, tak matek (Bellinge et al., 2004). Nicméně u Belgického modrého zvýšený podíl masa a lepší konverze živin vyváží tyto nedostatky (Hanset et al., 1987). Skutečnost, že mutace na genu myostatinu u skotu se vyskytuje u zvířat, která jsou životaschopná, plodná a produkují vysoce kvalitní maso, dokazuje potenciální hodnotu produkování dalších druhů s dvojím osvalením, jako jsou ovce, prasata, kuřata, krůty a ryby (McPherron et al., 1997). 17

18 3.3.2 Ovce Objevení mutací na genu myostatinu u myší a skotu, které způsobují dvojité osvalení, daly podnět k hledání mutací i u jiných hospodářských zvířat. Jedním z těchto zvířat jsou i ovce. Plemeno belgické texel bylo prvním plemenem, u kterého se lokalizovali mutace na genu myostatinu. Podnětem pro hledání mutací u tohoto plemene byla neobyčejná zmasilost mnoha jedinců texelského plemene, která ale nevedla k zhoršení kvality masa (Clop et al., 2006) Lokalizace Gen myostatinu se u ovcí nachází na 2. chromozomu, stejně jako u skotu Mutace U ovcí je známo několik mutací genu myostatinu. Jako první byla zjištěna mutace 3 -UTR (c.2360g>a) u plemene texel, kdy se guanin (G) zamění za adenin (A) (Clop et al., 2006). Tato změna ovšem u ovcí nezpůsobuje žádnou významnou mutaci, gen je plně funkční, ale texelské plemeno produkuje pouze třetinové množství bílkoviny myostatinu než je tomu u ostatních plemen. Záměna G za A způsobí, že původně nevýznamný úsek tvořený osmi písmeny genetického kódu se stane cílovou sekvencí pro mirna (Petr, 2006), mir1 a mir206 (Clop et al., 2006). MiRNA jsou molekuly ribonukleové kyseliny, které se mohou vázat na sekvence DNA a tím regulovat množství produkované RNA, podle které se tvoří proteiny. U živočichů toto způsobuje potlačení syntézy bílkoviny a u plemene texel je tak zvýšený nárůst svalů pro nedostatek funkční bílkoviny myostatinu (Petr, 2006). Kijas et al. (2007) objevili jednonukleotidový polymorfismus (SNP single nucleotide polymorphism) g+6723g>a, který také ovlivňuje zvýšenou muskularitu u plemene belgické texel. Další mutací je delece jednoho páru bází na nukleotidové pozici 960 (c.960delg), nalezena u norské bílé ovce, která původem vychází z texelského plemene (Boman et al., 2010) Fenotyp Mutantní alela g+6723a způsobuje zvýšení muskularity a snížení tukové tkáně, což bylo měřeno na poražených zvířatech. Studie vedena v australských podmínkách 18

19 chovu neprokázala výrazný dopad mutace na růst a živou váhu u ovcí plemene merino, ale u těžších plemen se mutace projevuje vlivem na maso a tuk. Byl prokázán negativní vliv této mutace na množství intramuskulárního tuku, což by mohlo vést ke snížené kvalitě masa. Výzkum senzorického hodnocení masa s mutací g+6723a ukázal, že tato mutace snižuje kvalitu masa a mohla by záporně ovlivnit preference zákazníků. (Kijas et al., 2007). U plemene Romey byly identifikovány MSTN alely A, B a C. Kombinace těchto alel mají různý vliv na výtěžnost libového masa. Přítomnost alely A má vliv na snížení výnosu z končetin, beder a celkového výnosu., zatímco přítomnost alely B zvyšuje výnos u beder a proporční výnos. Vliv alely B se ztrácí, pokud je přítomna i alela A nebo C, nicméně když jsou přítomny všechny tři alely tak jejich účinnost je stejná. Přítomnost nebo absence alel nemá vliv na porodní váhu, váhu při odstavu a na rychlost růstu před odstavem. (Hickford et al., 2009) U plemene norské bílé ovce jedinci homozygotní (c.960delg) vykazovali nižší denní přírůstek před odstavem, nižší váhu před odstavem, ale vyšší váhu libového masa (Boman et al., 2010) Koně Studie genu myostatinu u koní se zaměřují hlavně na vliv mutací myostatinu spojené s výkonností plnokrevníků. Plnokrevníci byli po století šlechtěni pro rychlost a výdrž. Je známo, že zděděné fyzické i psychické vlohy mají vliv na úspěch koní v dostihových závodech, především je důležitý fenotyp svalů (Hill (b) et al, 2010) Fenotyp Hlavním kritériem přispívajícím k schopnosti plnokrevníků úspěšně závodit na krátkých vzdálenostech je rozsah a vyspělost kosterního svalstva. Sprinteři jsou obecně kratší, zavalitější zvířata s větší svalovou hmotou, které dospívají dříve, než zvířata určena pro vytrvalostní závody (Hill (b) et al., 2010). 19

20 Lokalizace Pomocí studií zkoumající sekvence MSTN na třech exonech chromozomu 18 a jejich vliv na výkonnost koní bylo objeveno šest jednonukleotidových polymorfismů (SNP) v MSTN (Hill (a) et al., 2010) Mutace Byly objevené genotypy g a>c a g c>t. Sekvence těchto genotypů ale nebyly častější u koní vyhrávající závody, ani u koní, kteří žádný závod nevyhráli. Pomocí rozdělení zkoumaných koní do skupin podle délky závodů (do 1600 metrů jedna skupina, druhá nad 1600 metrů), byla objevena silná asociace u g c>t než u g a>c. Zároveň pomocí analýzy SNP byl zjištěn nezávislý efekt g c>t na g a>c, ale ne naopak. Z tohoto důvodu bylo dále pracováno pouze s g c>t (Hill (a) et al., 2010) Genotypy Alela C se vyskytovala dvakrát častěji u koní běhající krátké vzdálenosti, než u koní na dlouhé vzdálenosti. Také genotyp C/C byl obvyklý u sprinterů, u koní na dlouhou trať chyběl. U best race distance (BRD) byly detekovány genotypy C/C, C/T a T/T. Pomocí zařazení jednotlivých genotypů do kategorií podle délky závodu bylo zjištěno, že s prodlužující se délkou závodu výskyt genotypy C/C klesá a téměř vymizel u koní běhající delší vzdálenosti než 1600, ale výskyt genotypu T/T začal od tohoto bodu stoupat. U zkoumaných koní ze závodu National hunt (překážkový dostih na vzdálenost ) se genotyp C/C vůbec nevyskytoval. Tím se potvrdil vztah alely T k vytrvalosti. U vzorků odebraných od plemene quarter horse byla objevena přemíra alely C. Toto plemeno se používá na krátké sprinty, což potvrdilo, že genotyp C/C předurčuje koně k úspěchům na krátkých vzdálenostech a genotyp T/T zase na dlouhých (Hill (a) et al., 2010) Člověk Lidí s mutací na genu myostatinu je velice málo, odhaduje se, že kolem sta jedinců. Zatím nejprozkoumanějším případem je chlapec z Německa. Narodil se bývalé profesionální atletce, která je svalnatější než obvykle a nevykazuje žádné zdravotní 20

21 problémy. Identita otce nebyla zveřejněna. I ostatní příbuzní vykazovali neobvyklou sílu, ale kromě matky a chlapce nikdo neposkytl vzorky pro analýzu (Schuelke et al., 2004) Fenotyp Hned po narození chlapec vypadal neobyčejně svalnatě s vystouplými svaly na stehnech a pažích. Fyzická vyšetření, kromě zvýšeného šlachového reflexu, byla v pořádku. Svalová hypertrofie byla potvrzena ultrasonografickým vyšetřením, když byl chlapec starý šest dní. Ve věku čtyř a půl let mu stále zvyšuje svalová hmota a síla a je schopen udržet v každé ruce tříkilovou činku s pažemi nataženými před sebe (Schuelke et al., 2004). Obr. 3: Fotka čtyřletého chlapce s mutací genu myostatinu u obou alel. (zdroj:schuelke et. al., 2004) Lokalizace Gen myostatinu se u lidí nachází na druhém chromozomu, stejně jak je tomu u skotu nebo ovcí (McPherron et al., 1997). 21

22 Mutace Schuelke et al. (2004) sekvenovali všechny regiony exonů a postranních intronů z genu myostatinu chlapce a jeho matky. Nenalezli žádné mutace v kódovacím regionu, ale na nukleotidu g.ivs1+5 byla změna g a, která se nacházela na obou alelách chlapce a jedné alele matky (Schuelke et al., 2004) Psi U psů se gen myostatinu (MSTN) zkoumal v souvislosti s jejich výkonností, jestli mutace na MSTN má pozitivní vliv na výkon u sprinterů a vytrvalců. Byly zkoumány dvě hlavní skupiny psů vipeti a psi závodící ve psích spřeženích (Huson et al., 2011, Mosher et al., 2007). 22

23 Plemeno vipet Toto plemeno vzniklo pravděpodobně v 18. nebo 19. století v severní Anglii, i když kresby a sošky ze starého Egypta naznačují, že už tehdy existovala forma malého anglického chrta (greyhound) ( Plemena organizovaně nechovaná se vyznačují nestejnou kohoutkovou výškou, proto se nemuselo jednat o vipety, ale pouze malé anglické chrty. Vipet byl záměrně vyšlechtěn křížením teriérů s anglickým chrtem. Nejčastěji zmiňovaným teriérem, používaným ke křížení anglického chrta, je staroanglický černo tříslově zbarvený teriér (old english black and tan terrier) ( Vipet byl uznán jako registrované plemeno v Anglii v roce 1891, z čehož vychází u nás FCI standard ( Ve stejném roce byl vipet poprvé předveden na výstavě pod názvem,,snap dog. V překladu to může znamenat jako,,pes pro chytání, což indikuje, že vipet byl používán jako lovecký pes. Na druhou stranu toto označení může znamenat,,to co se chytá, protože v počátcích dostihů anglických chrtů se vipeti používali jako návnada, která se s malým náskokem vypustila před závodícími chrty ( Vipet se účastnil také coursingu, hry kde ve vymezeném prostoru lovili psi králíky nebo krysy a kdo jich ulovil nejvíce, vyhrál ( Vipet je středně velké plemeno, které patří do skupiny chrtů vycházejících z greyhounda. Největší z této skupiny je anglický chrt (greyhound), střední je vipet a nejmenší je italský chrtík. Italský chrtík je také možným předkem vipeta. Výška a váha (45-55 cm, kg) se u vipeta odvíjí od země původu (Amerika, Anglie) a ze zaměření (dostihy, výstavy). Srst u vipeta je krátká a velice jemná, přičemž barva může být jakákoliv i kombinace. Vzhledem k velice malému množství podkožního tuku jsou vipeti v klidu citliví na počasí, v pohybu jim nevadí ani déšť ( Podle FCI standardu je celkový vzhled vipeta kombinací osvalení a síly s elegancí a ladností linií, stavěn pro rychlost a výkon, přičemž je třeba vyvarovat se jakékoliv formy přehánění. Mozkovna dlouhá a suchá, ploché temeno, zužuje se směrem k tlamě, poměrně široké mezi očima. Čelisti silné, mohutné, dobře vymodelované s dokonalým nůžkovým skusem. Oči oválné, jasné. Uši růžicové, malé, tvořeny jemnou kůží. Krk má být dlouhý, svalnatý a elegantně klenutý. Hřbetní linie 23

24 tvoří půvabný oblouk, hřbet je široký a dobře osvalený. Hrudník je velice hluboký, poskytující dostatek prostoru pro srdce. Ocas je dlouhý, zužující se, v pohybu nesen v lehkém oblouku. Hrudní končetiny rovné a svislé, pánevní končetiny silné s širokými stehny a nízko posazenými hlezny. Pohyb u vipeta je dokonale volný, z profilu dlouhý přirozený krok s vydatným posunem díky dobrému překroku hrudních končetin a podsunutí pánevních končetin pod trup. Chování vipeta by mělo být vyrovnané, jemné, přítulné, vysoce přizpůsobivé v domácím prostředí. Vyřazujícími vadami jsou agresivita nebo bázlivost ( Vipet má silně vyvinutý lovecký instinkt a je zrozený k běhu. Proto se hojně využívá pro psí dostihy. 24

25 Dostihy Chrtí dostihy se běhají na dráze ve tvaru oválu. Vipeti většinou běhají 360 m, ale mohou běhat i tratě o délce 280 m nebo rovinné dostihy. Povrch dráhy je buď travnatý, nebo písčitý. Na startu se vybíhá z šesti startovacích boxů, feny a psi běhají zvlášť, pouze při malém počtu psů mohou běžet společně. Jako návnada, aby psi běželi se používá umělý,,zajíc, který může být buď klasický (tažen pomocí kladek na vlasci, musí se po každém použití znovu natáhnout) nebo nekonečný, kdy je tažné zařízení namontováno na vnitřní straně kruhu a může jezdit pořád dokola. Postup do finále se hodnotí dvěma způsoby. Podle času, kdy se měří časy všech startujících, běží se dvakrát a šest nejlepších postupuje do finále. Nebo podle pořadí, kdy se běží rozběh, opravný běh, semifinále a finále. Psi se rozřadí do skupin, ve kterých poběží podle rychlostních tabulek. Pro závodění je nutná licence. Aby pes licenci dostal, musí splnit jeden sólo běh, kdy se hodnotí jeho zájem o návnadu a dva společné běhy, kde pes nesmí projevit zájem o své kolegy. Vipeti skládají licenční zkoušky po dosažení 12 měsíců ( Fenotyp Plemeno vipet (anglicky whippet) bylo vyšlechtěno koncem 19. století speciálně pro závodění ( Navzdory jeho drobné postavě (výška okolo 50 cm a váha 10 kg, je schopen vyvinout rychlost až 56 km/h (American kennel club, 1998). Majitelé vipetů oznámili výskyt fenotypu dvojitého osvalení, který se objevil v chovech. Majitelé je pojmenovali jako bully vipeti. Tito psi mají široký hrudník a neobyčejně vyvinuté svalstvo na nohách a krku a fenotypově jsou podobní na ostatní druhy, u kterých bylo identifikováno dvojité osvalení, jako jsou myši, skot a ovce. Díky jejich svalnatému vzhledu jsou lehce rozeznatelní od normálních jedinců. Vipeti s dvojitým osvalením bývají často utraceni v mladém věku, protože nevyhovují americkému plemennému standartu a navíc polovina z těchto psů má předkus (Mosher et al., 2007). Další skupinou jsou psi z aljašských psích spřežení. Tito psi sloužili původně k přepravě lidí na sněhu (Collins, 1991), ale s nástupem moderních způsobů dopravy jejich význam upadl. V roce 1930 popularita psích spřežení vzrostla se zahájením 25

26 závodů, čímž se z těchto psů stali výkonní atleti (Rennick 1987). V průběhu se závod rozdělil do několika disciplín: sprint, závod na krátkou vzdálenost a závod na dlouhou vzdálenost (Swenson, 1987, Welch, 1989). Psi do psích spřežení nemají žádný plemenný standart. Jsou to kříženci různých plemen, protože jsou selektováni a šlechtěni speciálně pro jejich výkonnost, psychiku, vytrvalost a sílu v tahu. Většinou se jedná o křížence severských plemen jako je sibiřský husky, aljašský malamut a další plemena, která vykazují různé předpoklady pro závodění jako je vytrvalost nebo rychlost (Huson et al., 2011) Lokalizace MSTN se u psů nachází na 37. chromozomu a skládá se ze tří exonů obsahujících 5083 párů bazí (bp) (Mosher et al., 2007) Mutace U vipetů byla objevena delece 2 bp na 3. exonu MSTN genu. Tato delece způsobuje odstranění nukleotidů 939 a 940 na třetím exonu, což vede k zformování předčasnému stop kodonu na aminokyselině 313 místo na normálním cysteinu. Ztráta cysteinu způsobuje narušení správné funkce proteinu (Mosher et al., 2007). Obr. 4: Delece 2 bp na nukleotidech 939 a 940 (zdroj: Mosher et al., 2007) 26

27 U 91 zkoumaných psů ze psích spřežení nebyly nalezeny žádné škodlivé mutace, ale byly lokalizovány čtyři SNP v nekódujících oblastech MSTN. U 24 psů byl pozorován polymorfismus nacházející se ve 2. intronu a je to 4 bp delece v pozici v genu MSTN. U 23 psů byl pozorován polymorfismus T/A posledního kódujícího regionu na nukleotidu Dva další polymorfismy byly nalezeny na 5 konci MSTN genu a to záměna G za A na nukleotidu u 11 psů a vložení A na nukleotidu u 73 psů (Huson et al., 2011) Genotyp U vipetů byly nalezeny tři genotypy. Genotyp +/+ znamená, že jedinec nemá mutaci. Genotyp mh/+ znamená, že se u jedince mutace vyskytuje pouze na jedné alele. Genotyp mh/mh znamená, že jedinec má mutaci v obou alelách. Jsou tu rozdíly ve stavbě těla. Homozygot +/+ má normální stavbu těla. Heterozygot mh/+ je svalnatější než homozygot +/+, přičemž homozygot mh/mh je silně osvalený (Mosher et al., 2007). Mosher et al. (2007) při výzkumu zjistili, že z 22 vipetů byli 4 bully vipeti homozygoti mh/mh, zatímco všech 5 psů, kteří zplodili bully vipeta byly heterozygoti mh/+. Žádný ze zbývajících 13 normálně vypadajících vipetů nesoucí genotyp +/+ neměl v rodinné historii zaznamenán výskyt fenotypu dvojitého osvalení. 27

28 Obr. 4: Ukázka tří možných genotypů: +/+ homozygot bez mutace, mh/+ heterozygot s jednou mutovanou alelou a mh/mh homozygot s dvěma mutovanými alelami (zdroj: Mosher et al., 2007) Výkonnost Mosher et al. (2007) se domnívali, že zvýšený podíl svalové hmoty u heterozygotů (mh/+) umožňuje jedincům vyvinout vyšší rychlost než u normálních psů (+/+). Pomocí analýzy genotypu od 85 psů, u kterých byly známy výsledky závodů, zjistili asociaci mezi genotypem psa a závodními výsledky. Mosher a její tým zjistili pozitivní korelaci mezi množstvím psů nesoucí mh deleci, buď jako homozygoti nebo heterozygoti, a zařazením v závodní třídě (A, B, C, D od nejrychlejší po nejpomalejší). V experimentu se objevil pouze jeden homozygotní pes (mh/mh), který ale závodil v A závodní třídě, proto byl zahrnut mezi heterozygoty. Statistickými metodami byl zjištěn rozdíl ve frekvenci výskytu psů s mutací mezi závodními třídami A a B, ale ne mezi C a D. Například 12 z 41 psů ze dvou nejrychlejších tříd (A, B) neslo mh deleci, zatímco ze dvou pomalejších závodních tříd (C, D) se delece vyskytovala pouze u jednoho psa z 43 zkoumaných psů. závodní třída genotyp +/+ mh/+ A 12 8 B

29 C 25 0 D 17 1 celkem Tab. 1: Tabulka ukazující počet psů běhajících v závodních třídách (A, B, C, D od nejrychlejší po nejpomalejší) a vztah ke genotypu. (zdroj: Mosher et al., 2007) Pro nalezení mutace myostatinu i u jiných plemen než je vipet, Mosher et al. (2007) sekvenovali 3. exon genu MSNT přibližně u 4 jedinců z každého plemene, které se vyznačuje svalnatou stavbou těla (bulmastif, buldog, kanárská doga, mini bulteriér, americký stafordšírský teriér a stafordšírský bulteriér). Zároveň sekvenovali 3. exon genu MSTN u plemen používaná pro závodění (anglický chrt a lurcher) a u dvou kříženců vipeta. Ani u jednoho ze psů nebyla nalezena 2 bp delece. Huson et al. (2011) sekvenovali gen MSTN z DNA získané od 91 aljašských psů ze psích spřežení používaných pro sprint a ze dvou vipetů (jeden z nich nesl 2 bp deleci a sloužil jako srovnávací vzorek). Ze sekvenovaných 91 psů bylo 46 psů označeno za elitní závodníky a 37 psů jako slabí závodníci. Zbývajících 8 psů bylo sekvenováno, i když u nich nebyla vyhodnocena závodní úspěšnost. Žádné mutace, které by negativně ovlivnily funkčnost bílkoviny myostatinu včetně 2 bp delece na nukleotidu , nebyly nalezeny. Huson et al. (2011) našli 4 polymorfismy u psů ze psích spřežení a analyzovali je u 77 čistokrevných psů, aby určili, jestli jsou tyto 4 polymorfismy jedinečné pro populaci sprintujících psů. Bylo použito průměrně 4 psů z 16 plemen (afgánský chrt, akita, australský ovčák, basenji, bígl, boxer, bulteriér, flat coated retriever, německý drátosrstý ohař, anglický chrt, ibizský chrt, italský chrt, mastif, faraónský pes, Sluka, sibiřský husky, vipet) a šakal zlatý (canis aureus) (Mosher et al., 2007). Nicméně analýza neodhalila žádný vliv na výkonnost psů ze psích spřežení používaných pro sprint (Huson et al., 2011). Zdá se, že 2 bp mutace genu MSTN se vyskytuje pouze u vipetů. Anglický chrt s vipetem sdílí společný genom po předcích a obě plemena byla šlechtěna pro závodění, což indikuje, že mutace genu MSTN by se mohla vyskytovat i u závodících jedinců anglického chrta. Nicméně žádný z testovaných anglických chrtů nenesl mutaci. Mosher 29

30 et al. (2007) nastínili tři možná vysvětlení. První možností je, že bylo zkoumáno nedostatečné množství vzorků, pokud se mutace genu MSTN u anglického chrta vyskytuje vzácně. Druhou možností je výskyt mutace pouze u některých linií anglického chrta, které nebyly zkoumány. Nebo třetí možnost, že se mutace u anglického chrta vůbec nevyskytuje a tím pádem je mutace relativně nová u čistokrevných plemen. To může být způsobeno tím, že mutace neposkytuje závodním anglickým chrtům žádnou výhodu, naopak je může znevýhodňovat. Studie knock-out myší ukázaly vyšší množství rychlých vláken než pomalých (Girgentrah et al., 2005). To poskytuje výhodu pro vipety, kteří běhají krátké vzdálenosti, ale nevýhodu a anglických chrtů, kteří běhají delší závody a je u nich vyžadována spíše vytrvalost. Zároveň je dokázáno zmenšení několika orgánů, včetně plic, u skotu s dvojitým osvalením (Ansay et al., 1979). Pokud by se u psů s mutací genu MSTN vyskytovala i malá redukce kapacity plic, byla by to značná nevýhoda pro psy běhající delší vzdálenosti (Mosher et al., 2007) Využití Plemeno vipet bylo vyšlechtěno speciálně pro rychlý pohyb, proto je přirozené, že se začalo používat k dostihovým závodům. Chovatelé se vždy snaží šlechtit stále lepší a výkonnější jedince. Výzkum mutace MSTN prokázal, že zvýšený podíl svalové hmoty má vliv na schopnost vyvinout vyšší rychlost. Tento poznatek může být důležitý pro chovatele chovající vipety běhající dostihové závody. Vzhledem k tomu, že do výzkumu byl zahrnut pouze jeden homozygotní pes (mh/mh) a zbytek heterozygotních (mh/+), lze předpokládat, že lepších výsledků se dosahuje u heterozygotů. Možným vysvětlením je, že u homozygotních jedinců (mh/mh) se mohou vyskytovat zdravotní problémy jako je snížená kapacita plic nebo problémy při reprodukci, a že tyto problémy u heterozygotních (mh/+) jedinců nejsou tak markantní. Pro produkci heterozygotů (mh/+) jsou možné tři způsoby křížení genotypů podle Mendelova zákona dědičnosti o uniforitě potomků. Nejjistější je křížit genotypy +/+ a mh/mh, kdy se narodí 100 % heterozygotů mh/+, ale v tomto případě lze očekávat problémy při reprodukci pokud by samice byla homozygot mh/mh (kvůli zvýšenému osvalení v pánevní oblasti lze předpokládat problémy při porodu). 30

31 +/+ \ mh/mh mh mh + mh/+ mh/+ + mh/+ mh/+ Tab. 2: Křížení dvou homozygotů znázorněno podle Mendelova zákona o uniformitě potomků. Druhou možností je křížit genotyp +/+ a mh/+, kdy je možnost narození z 50 % homozygotů +/+ a z 50 % heterozygotů mh/+, ale je zde redukce možných problému při porodu. +/+ \ mh/+ mh + + mh/+ +/+ + mh/+ +/+ Tab. 3: Křížení homozygota +/+ a heterozygota mh/+ podle Mendelova zákona o uniformitě potomků. Třetí možností je křížení dvou heterozygotů mh/+, kdy je pravděpodobnost narození z 50 % heterozygotů mh/+, 25 % homozygotů mh/mh a 25 % homozygotů +/+. mh/+ \ mh/+ mh + mh mh/mh mh/+ + mh/+ +/+ Tab. 4: Křížení dvou heterozygotů podle Mendelova zákona o uniformitě potomků. V případě vynalezení jednoduchého způsobu detekce mutace genu MSTN by toto mohlo mít komerční využití. Pokud by majitelé závodních psů znali jejich genotyp, mohli by tento poznatek využít při křížení těchto psů pro produkci heterozygotů mh/+ a tím získat výhodu při dostihových závodech. 31

32 3.4 Metody molekulární genetiky Izolace DNA Izolace DNA je extrakce DNA z nitrobuněčného obsahu. DNA lze izolovat z jakékoliv živočišné tkáně obsahující živé buňky. Pokud se ve vzorku nachází více druhů buněk, je možné buňky separovat například centrifugací. Je-li námi zkoumaná DNA obsažena v buněčné organele, je třeba separovat z buněčného obsahu dané organely před samotnou izolací. K uvolnění buněčného obsahu je potřeba rozrušit buněčnou membránu pomocí detergentů. Jako detergenty se používají soli žlučových kyselin nebo detergenty iontové povahy. Buněčnou membránu je možno rozrušit také pomocí různých fyzikálně nebo fyzikálně chemických metod, jako je ultrazvuk. Následně je třeba oddělit DNA od buněčného obsahu. Toho docílíme částečnou denaturací. Protože DNA a RNA mají velmi podobné vlastnosti, často se získá směs těchto dvou látek. Oddělit RNA lze přidáním enzymu ribonukleázy, která štěpí RNA na oligonukleotidy, ale nedegraduje DNA (Anzenbachen a Kovář, 1986) Gelová elektroforéza Tato metoda je založena na pohybu záporně nabitých molekul DNA elektrickým polem směrem k anodě. Elektroforéza se provádí na nosiči (nejčastěji gelu), který je tvořen systémem polymorfních molekul s póry. Těmito póry se molekuly DNA v závislosti na své délce pohybují různou rychlostí (kratší řetězce cestují rychleji, než delší) ( Polymerázová řetězová reakce (PCR) Tuto metodu vyvinul Kary Mullis a v roce 1993 za ni obdržel Nobelovu cenu za chemii. PCR metodou se provádí amplifikace (zmnožení) genů a dalších sekvencí DNA. Amplifikace sekvencí DNA se provádí výhradně in vitro (v laboratorních podmínkách), kdy jsou během několika hodin sekvence DNA amplifikovány i milionkrát. Je k tomu zapotřebí znát krátké nukleotidové sekvence ohraničující zkoumanou oblast a syntetické oligonukleotidy komplementární k těmto sekvencím, aby mohla začít enzymatická amplifikace části DNA mezi zkoumanými sekvencemi. Amplifikace DNA pomocí metody PCR zjednodušuje mnoho aplikací, při kterých je nezbytné mít velké množství 32