Mendelova univerzita v Brně. Metody stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů v hroznech a moštech

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Metody stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů v hroznech a moštech Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: Ing. Michal Kumšta Vypracoval: Radomír Hodeček Lednice 2014

2

3

4

5 Poděkování: Tímto bych chtěl poděkovat především přítelkyni a rodině za pomoc, trpělivost a podporu, bez které by tato práce nemohla vzniknout. Dále bych chtěl poděkovat všem, kteří mi pomohli cennými radami, připomínkami a odborným vedením při vypracování této práce. Zvláštní poděkování patří především Ing. Michalu Kumštovi za odborné vedení a ústavu Vinohradnictví a vinařství.

6 Obsah 1 Úvod 9 2 Literární přehled Hydrometrické metody stanovení zkvasitelných sacharidů Ballingův hustoměr Baumého hustoměr Československý normalizovaný moštoměr Klosterneuburský moštoměr Oechsleho moštoměr Wagnerův moštoměr Optické (refraktometrické) metody stanovení zkvasitelných sacharidů Ruční refraktometr Digitální refraktometr Stolní refraktometr Enzymatické metody stanovení zkvasitelných sacharidů Měření sacharózy vysokoúčinnou kapalinocou chromatografií (HPLC) Stanovení zkvasitelných sacharidů FTIR spekroskopií Gravimetrické (vážkové) stanovení zkvasitelných sacharidů Stanovení zkvasitelných sacharidů titračními metodami Stanovení redukujících cukrů dle (EEC No 2676/90) Stanovení redukukujících cukrů dle Bertranda Stanovení redukujících cukrů dle Rebeleina Stanovení redukujících cukrů dle Henniga Stanovení sacharózy a veškerých cukrů 26 3 Cíl práce 28 4 Experimentální část Materiály Metody Hydrometrické Digitální refraktometrie Stanovení redukujících cukrů dle Rebeleina Výsledky práce Diskuze 34 5 Závěr 35 6

7 6 Souhrn 36 7 Resume 37 8 Seznam použité literatury 38 9 Přílohy 41 7

8 Seznam obrázků, tabulek a grafů Grafy Graf 1 Stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů v hroznech a moštech zkoumanými metodami Obrázky Obr. 1 Měření hydrometrem Obr. 2 Popis refraktometru Obr. 3 Digitální refraktometr Obr. 4 Abbého refraktometr Obr. 5 HPLC Obr. 6 FTIR FOSS WineScan SO 2 Tabulky Tab. 1 Popis ručního refraktometru značky AFAB Enterprises Tab. 2 Popis digitálního refraktometru značky AFAB Enterprises Tab. 3 Popis Abbého refraktometru značky AFAB Enterprises Tab. 4 Stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů Československým normalizovaným moštoměrem , bez teploměru Tab. 5 Naměřené hodnoty obsahu zkvasitelných sacharidů Československým normalizovaným moštoměrem ts. číslo 619, s teploměrem Tab. 6 Naměřené hodnoty obsahu zkvasitelných sacharidů Oechsleho moštoměrem ts. č. 1112, bez teploměru Tab. 7 Naměřené hodnoty digitálním refraktometrem s ATC (automatickou teplotní kompenzací) Tab. 8 Naměřené hodnoty titrační metodou pro stanovení obsahu redukujících cukrů dle Rebeleina 8

9 1 Úvod Stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů v hroznech a moštech patří mezi základní kvalitativní parametry a hraje velice důležitou úlohu ve vinohradnictví a vinařství, hlavně z hlediska posouzení zralosti hroznů a vlivu na budoucí obsah alkoholu ve víně. V České republice je cukernatost považována za nejdůležitější faktor pro klasifikaci vín. Sacharidy v révě vinné vznikají jako v každé jiné fotosyntetizující rostlině pomocí fotosyntézy. Jedná se o biochemické procesy, při kterých se přeměňuje přijatá energie světelného záření na energii chemických vazeb (NADPH a ATP). Sacharidy tak vznikají jako energeticky bohaté sloučeniny za účasti oxidu uhličitého, vody a fotosynteticky aktivního záření (FAR), které se pohybuje v oblasti spektra nm. Část sacharidů se ukládá do zásobních orgánů a část je spotřebována jako metabolit. Pro chod fotosyntézy je velice důležitá teplota C. Teploty nižší než 15 C a vyšší než 40 C působí na fotosyntézu negativně. Transportním cukrem v révě vinné je sacharóza, jedná se o tzv. disacharid. Tento disacharid je v bobulích enzymem zvaným invertáza rozštěpen (invertován) na glukózu a fruktózu. Jedná se o monosacharidy nebo také jednoduché cukry, které se v bobulích ukládají během zrání hroznů. Jejich množství je závislé na aktivitě fotosyntézy a jejich poměr by se měl v hroznech pohybovat okolo čísla 0,9. Koncentrace těchto cukrů se může v hroznech také zvyšovat při suchém, teplém a slunném podzimním počasí, v případě že začne docházet k odparu vody z bobulí a následnému zakoncentrovávání cukrů, kyselin a dalších látek. Tento proces může pozitivně ovlivnit i urychlit napadení ušlechtilou plísní, avšak plíseň také částečně odbourává cukry z bobulí jako živný substrát, který spotřebovává pro svůj růst. Sacharidy, jako arabinóza, xylóza, rhamnóza, maltóza, raffinóza a další cukry, se v hroznech vyskytují v tak nízkých koncentracích, že nijak výrazně neovlivňují celkový obsah hlavních zkvasitelných cukrů. Za zkvasitelné cukry jsou považovány cukry, které dokáží kvasinky metabolizovat na alkohol a oxid uhličitý. Jedná se hlavně o cukry glukózu a fruktózu, avšak některé typy kvasinek vlastní také enzym invertázu, a proto jsou schopné za určitých podmínek zkvášet sacharózu. Pro stanovení obsahu zkvasitelných cukrů v hroznech a moštech se dají využít různé metody, avšak popis všech metod by obsahově několikrát překračoval povolený limit dané bakalářské práce. 9

10 Z tohoto důvodu bylo vybráno pouze několik metod, které se hodí, jak pro použití na stanovišti (ve vinici), tak v laboratorních podmínkách. 10

11 2 Literární přehled 2.1 Hydrometrické metody stanovení zkvasitelných sacharidů Přepočet a porovnání údajů mezi hustoměry můžeme najít v přílohové Tabulce č. 3. Princip: Hydrometr, moštoměr nebo také areometr je přístroj používaný k měření hustoty tekutin nebo přímo koncentrace cukru v moštu (Balík J., 2011). Čím je nižší hustota tekutiny, tím hlouběji se potopí moštoměr (Steidl R., 2002). Jedná se o skleněný plovák podélného tvaru s definovanou hmotností fungující na základě Archimédova zákona [5]. Obr. 1 Měření hydrometrem [6] - obrázek byl pozměněn Ballingův hustoměr Tento hustoměr, nebo také cukroměr či sacharometr, vynalezl profesor Karel Josef Napoleon Balling (Kvasný průmysl, 2005). Měření se stanovuje ve stupních Ballinga ( Bg) tyto stupně vyjadřují, kolik kg cukru je ve 100 g moštu. Za předpokladu, že mošt obsahuje na každých 20 % cukru průměrně 3 % necukrů, se musí necukry odpočítávat. Stupně Ballinga se přepočítávají na hmotnostní procenta tak, že na stupně Kl převedeme následujícím vzorcem. (Farkaš J., 1983) 11

12 2.1.2 Baumého hustoměr Stupně Baumého hustoměru ( Bé) se přibližně rovnají objemovým procentům alkoholu, který se vytvoří po prokvašení moštu na víno. Například, pokud mošt měří 12 Bé, bude po prokvašení moštu obsah alkoholu ve víně přibližně 12 objemových procent. Přehled o obj. % alkoholu v souvislosti se stupněm Bé, možno pozorovat v přílohové Tabulce č. 1. (Farkaš J., 1983) Československý normalizovaný moštoměr Československý normalizovaný moštoměr (ČNM), také známý jako Normalizovaný moštoměr (NM), vznikl na území Československa ve Výzkumném ústavu vinohradnickém a vinařském v Bratislavě v letech Udává hodnoty ve stupních normalizovaného moštoměru NM. Stupnice je dělená po 0,2 od 10 do 30 a vyjadřuje, kolik kg cukru je obsaženo ve 100 l moštu (1 hl). (Gavorník A., 1976) Stupnice bývá poměrně přesná a výsledky se blíží hodnotám redukujících cukrů stanoveným chemickou analýzou (Pavloušek P., 2011). Moštoměr bývá vybavený teploměrem a je přizpůsobený na měření při teplotě 15 C. Při vyšší nebo nižší teplotě je potřeba udělat korekci měření, která se nachází v přílohové Tabulce č. 2. (Farkaš J., 1983) Z hlediska praktické práce patří tento druh moštoměru k nejpřesnějším a u nás pravděpodobně k nejčastěji používaným (Minárik E. a Navara A., 1986) Klosterneuburský moštoměr Klosterneuburský moštoměr ve zkratce Kl nebo KMW vyjadřuje, kolik kg cukru obsahuje 100 kg moštu. Například 18 Kl je 18 kg cukru v 100 kg moštu. Když chceme zjistit, kolik kg cukru je ve 100 litrech moštu, vynásobíme stupně hustotou daného moštu (18 x 1,10 = 19,80 kg cukru ve 100l moštu). (Farkaš J., 1983) Oechsleho moštoměr Oechsleho moštoměr vyjadřuje hustotu moštu po odpočítání 1 l, tudíž rozdíl mezi hustotou moštu a vody. Když se zjištěné Oechsleho stupně vydělí čtyřmi, dostaneme procento celkového extraktu. Aby se zjistil skutečný obsah cukru, je potřeba z celkového extraktu odpočítat bezcukerný extrakt. Vzájemný poměr extraktu se mění, 12

13 v nepříznivých rocích se odpočítávají 3 % a v příznivých 2 % z celkového extraktu. (Farkaš J., 1983) Wagnerův moštoměr Stupnice Wagnerova moštoměru má dílky 1,5 x menší než stupnice klosterneuburského moštoměru. Cukr v moštu se jím stanoví tak, že číslo přečtené na stupnici se násobí 1,5 x. Alkohol v budoucím víně je možné stanovit z cukernatosti a to tak, že číslo udávající cukernatost moštu se násobí číslem 0,6. (Průcha J. 1946) 2.2 Optické (refraktometrické) metody stanovení zkvasitelných sacharidů Paprsek monochromatického záření prostupuje dvěma prostředími lišícími se hustotou. Na rozhraní obou prostředí se mění jeho rychlost a tím i směr šíření. Lom paprsku probíhá dle poměru hustot obou prostředí. Poměr rychlosti paprsku v jednom a ve druhém prostředí lze vyjádřit jako index lomu (nd). Tento index lomu se vypočítá z poměru rychlosti světla v prvním prostředí a rychlosti světla v druhém prostředí. Index lomu také můžeme vyjádřit pomocí změny směru průniku paprsku prostředím dle Snellova zákonu. U většiny refraktometrů dopadne paprsek pod úhlem 90 na vyleštěnou plochu lámavého hranolu, na kterou se nanese malé množství kapalného vzorku. Na rozhraní vzorku a lámavého hranolu dojde k lomu paprsků. (Jančářová I. a Jančář L. 2003) Refraktometry jsou vyráběny s různými stupnicemi pro měření obsahu rozpuštěných pevných látek v roztoku [1] Ruční refraktometr Měření ručních refraktometrů může probíhat v různých stupnicích. Ruční refraktometry jsou rozděleny do kategorií v závislosti na druhu a potřebném rozsahu měření. Všechny jsou snadno přenosné a dají se tak používat v terénu. Jsou jednoduché na používání a pro funkčnost vyžadují pouze vnější zdroj světla. Modely s označením ATC jsou s Automatickou teplotní kompenzací. [1] Měření moštu je velmi jednoduché. Na optickou část refraktometru stačí kápnout měřenou látku, přiklopit krytku hranolu (tím se látka lépe rozprostře po měřícím 13

14 hranolu), přiložit oko k okuláru, podívat se proti světlu (případně doostřit) a na stupnici pohodlně odečíst výslednou hodnotu. [4] Tab. 1 Popis ručního refraktometru značky AFAB Enterprises [1] Model Stupnice Rozsah Rozlišení Přesnost HR-032ATC Brix 0 32 % Brix 0.2 % Brix +/- 0.2 % Obr. 2 Popis ručního refraktometru [8] Digitální refraktometr Je rychlý, pohodlný a snadný na použití. Jednoduše kápneme jednu nebo dvě kapky šťávy z hroznů či hroznového moštu na měřící optický hranol a stiskneme tlačítko na klávesnici. Speciálně navržený mikroprocesor poskytuje téměř okamžitý odečet v indexu lomu na stupně Brix nebo některou z různých měrných jednotek. Kompenzace nelineární teploty je automatická a zajišťuje, že tekutiny s teplotou mezi 0 až 50 C (32 až 122 F), se měří přesně. [2] Tab. 2 Popis digitálních refraktometů značky AFAB Enterprises [2] Model Stupnice Rozsah Rozlišení Přesnost PA-201 Brix 0-56 Brix 0.1 % +/- 0.1 % PA-202 Brix Refrakční index 0-85 Brix % /- 0.1 % +/ nd 14

15 Obr. 3 Digitální refraktometr [9] Stolní refraktometr Abbého univerzální refraktometr Model AR-001 je určen pro měření indexu lomu (nd) a měření stupňice Brix pro průhledné, poloprůhledné a pevné látky. Přístroj může být připojen k termostatické lázni pro přesné měření v teplotním rozmezí od 0-70 C ( F). [3] Tab. 3. Popis Abbého refraktometru AFAB Enterprises. [3] Rozsah Refrakčního Indexu (nd) do Přesnost Refrakčního Indexu (nd) +/ Rozlišení Refrakčního Indexu (nd) Rozsah ve stupních Brix 0 to 95 Rozlišení ve stupních Brix 0.25 Váha (Kg) 3 Obr. 4 Abbého refraktometr [10] 2.3 Enzymatické metody stanovení zkvasitelných sacharidů Úvod této kapitoly byl převzat z publikace Chemie a analytika sacharidů (Čopíková J., 1997). 15

16 D-glukóza a D-fruktóza jsou fosforilovány na D-glukóza-6-fosfát (G-6-P) a D-fruktóza-6-fosfátu (F-6-P) za přítomnosti enzymu hexokinázy (HK) a adenosin-5 -trifosfátu (ATP). ATP při fosforilaci glukózy přechází na adenosin-5 -difosfát (ADP). V přítomnosti enzymu glukóza-6-fosfát dehydrogenázy (G6P-DH) se glukóza oxiduje pomocí nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADP + ) na D-glukonát-6-fosfát. Množství vzniklého NADPH redukcí NADP, v průběhu těchto reakcí, je úměrné koncentraci glukózy. Následuje izomerace D-fruktóza-6-fosfátu (F-6-P) pomocí enzymu fosfoglukózoizomerázy (PGI) na glukóza-6-fosfát, a pak opět probíhá oxidace G-6-P na D-glukonát-6-fosfát, také známý jako 6-fosfoglukonová kyselina. NADP + současně přechází na redukovanou formu NADPH. Množství NADPH, vzniklé během reakce, je ve stechiometrickém poměru k D-glukóze. Přírůstek koncentrace NADPH se měří změnou absorbance podle typu přístroje (UV/VIS-spektrometru) při 334, 340 nebo 365 mm. Hexokináza není specifická. Jsou-li v roztoku přítomny také fruktóza a mannosa, budou také převedeny na fosfáty. Oxidace glukózy enzymem G6P-DH v přítomnosti nikotinamidadenindinukletoidfosfátu a vznik jeho redukované formy je již specifická reakce. První změna absorbance je úměrná množství glukózy a druhá změna absorbance je úměrná množství fruktózy. Podobně je možné stanovovat i sacharosu, D-glukózu a D-fruktózu vedle sebe. Nejprve se stanoví glukóza, potom fruktóza, a pak se enzymově pomocí enzymu beta-fruktosidásy zhydrolizuje sacharosa. Po inverzi se opět stanoví glukosa. Množství sacharózy odpovídá množství glukózy před inverzí a po inverzi. K důkazu glukózy a fruktózy se mohou použít diagnostické proužky, což jsou vlastně enzymatické sety. Následující text byl převzat z publikace Vinařství: N vody do laboratorních cvičení (Balík J., 2011). 16

17 Přístroje a pomůcky: UV/VIS spektrofotometr, automatické pipety 1,00, 0,10 a 0,02 ml, automatický dávkovač na redestilovanou vodu s dělením po 0,1 ml, 10 mm plastické kyvety na jedno použití, speciální plastické míchačky. Chemikálie a roztoky: Roztok 1 = rozpuštěný obsah lahvičky (1, Boehringer Mannheim) s 27 ml redestilované vody. Roztok 2 a 3 = neředěný obsah lahvičky (2 a 3, Boehringer Mannheim) Postup: Vzorek náležitě ředíme, je-li koncentrace glukózy a fruktózy do 10 g. l -1, vzorek ředíme 1: 9 v odměrné baňce destilovanou vodou. Pokud je koncentrace g. l -1, ředíme vzorek 1 : 99. Když je koncentrace vyšší než 100 g. l -1, ředíme vzorek 1 : 999. Reakční roztok i vzorek dávkujeme do dvou 10 mm plastových kyvet. První je slepý pokus a druhá je měřený vzorek. Automatickými pipetami dávkujeme redestilovanou vodu pomocí automatického dávkovače. Na promíchání obsahů kyvet použijeme speciální plastické míchačky. Totožné plastické míchačky použijeme i k nadávkování Roztoku 2 a Roztoku 3 tak, že odměřené objemy naneseme na míchačky a spojíme s tekutými obsahy kyvet současně s jejich mícháním. Slepý pokus: Odpipetujeme do kyvety 1 ml Roztoku 1 a 2 ml redestilované vody. Obsah kyvety promícháme a po 3 minutách změříme hodnotu absorbance A 1 na tři desetinná místa při 340 nm. Enzymatickou reakci odstartujeme přidáním 0,02 ml Roztoku 2. Kyvetu promícháme a po 15 minutách změříme hodnotu absorbance A 2 na tři desetinná místa při 340 nm. Po uplynutí 2 minut zkontrolujeme naměřené hodnoty A 2, pokud se hodnoty neliší, můžeme pokračovat v měření fruktózy. Jestliže nejsou hodnoty totožné, opakujeme měření A 2, dokud není hodnota konstantní a zároveň neskončí enzymatická reakce. Následně můžeme přidat 0,02 ml Roztoku 3 a po 15 minutách změříme hodnoty absorbance A 3 na tři desetinná místa při 340 nm. Vzorek: Odpipetujeme do kyvety 1 ml Roztoku 1, 0,1 ml testovaného vzorku a 1,9 ml redestilované vody. Následuje postup jako u slepého pokusu. 17

18 Vyhodnocení: Obsah glukózy vyjádříme v g. l -1 na jedno desetinné místo tak, že použijeme koeficient 0,864, který vynásobíme stupněm ředění a následně vynásobíme celkovým množstvím glukózy. Obsah fruktózy vyjádříme v g. l -1 na jedno desetinné místo tak, že použijeme koeficient 0,869, který vynásobíme stupněm ředění a následně vynásobíme celkovým množstvím fruktózy. Opakovatelnost a reprodukovatelnost: r = 0,056 x X (nebo Y); R = 0,12 + 0,076 x X (nebo Y) 2.4 Měření sacharózy vysokoúčinnou kapalinocou chromatografií (HPLC) Následující text o měření sacharózy HPLC vychází z publikace Compendium of International Methods of Analysis of Wines and Musts Vol. 2 [7]. Princip: Sacharóza se odděluje v koloně s vázaným alkylaminem oxidu křemičitého a detekuje se refraktometricky. Výsledek je kvantifikován a s odkazem na externí standarty analyzován za stejných podmínek. Činidla: destilovaná voda dle normy EN ISO 3696, acetonitril HPLC kvality (CH3 CN) CAS Číslo , sacharóza CAS Číslo Mobilní fáze obsahuje roztok acetonitrilu a destilované vody (80 : 20 (v. v -1 )) filtrovaný membránovou filtrací (0.45 μm). Složení mobilní fáze je pouze jako příklad. Mobilní fáze musí být před použitím odplynovaná. Standartní roztok obsahuje 1,2 g. l -1 vodného roztoku sacharózy vyfiltrovaný membránovou filtrací 0,45 μm. Koncentrace standartního roztoku je dána pouze jako příklad. Vybavení: vysokoúčinná kapalinová chromatografie, 10 μl smyčkový vstřikovač (pro příklad), detektor - diferenciální refraktometr nebo interferometrický refraktometr, alkylamin vázaný na oxid křemičitý dlouhý 25 cm a s průměrem 4 mm (pro příklad), ochranná kolona naplněná stejnou fází (pro příklad), úprava pro izolaci ochranné kolony a analytické sloupce nebo pro udržování jejich teploty na 30 C, rekordér (v případě 18

19 potřeby integrátor), mobilní fáze protékající rychlostí 1 ml. min -1 vybavení pro membránovou filtraci (0,45 μm) Postup: (pro příklad), 1. Příprava vzorku: Použijeme roztok získaný zředěním rektifikovaného moštového koncentrátu na 40 % (m. v -1 ) a vyfiltrujeme jej 0,45 μm membránovou filtrací. 2. Chromatografické stanovení: Do chromatografu aplikujeme 10 μl standartizačního roztoku a 10 μl připraveného vzorku, nástřiky opakujeme ve stejném pořadí (zaznamenávají se chromatografem). Retenční čas sacharosy je přibližně 10 minut. Objem vzorku a sekvence jsou uvedeny jako orientační. Chromatografické stanovení lze provést také pomocí kalibrační křivky. Výpočty: Pro výpočet použijeme průměr dvou výsledků pro standartní roztok a vzorek. Nechť C je obsah sacharózy v g. l -1 ve 40 % (m. v -1 ) roztoku rektifikovaného moštového koncentrátu. Koncentrace sacharózy je v g. kg -1 v rektifikovaném moštovém koncentrátu je potom 2,5. C. Koncentrace sacharózy se vyjadřuje v g. kg -1 na jedno desetinné místo. Charakteristika metody: Opakovatelnost (r): r = 1.1 g. kg -1 Obr. 5 HPLC [11] 2.5 Stanovení zkvasitelných sacharidů FTIR spekroskopií FTIR (Fourierova transformace infračerveného záření) spektroskopie je nedestruktivní technika, která zajišťuje strukturální informace o molekulárních vlastnostech široké škály sloučenin. Hlavní výhodou je rychlost, vysoký stupeň automatizace, střední rozlišení a efektivnost nákladů. Při nedávném zlepšení přístrojového vybavení, spolu s pokrokem v optických vláknech a chemometrii (vícerozměrné analýze dat), se získal analytický nástroj, který je vhodný pro rutinní kvalitativní analýzy a řízení technologických procesů v mnoha průmyslových 19

20 odvětvích. FTIR spektroskopie je široce používána v potravinářském průmyslu. Přijetí této technologie ve vinařském a vinohradnickém průmyslu bylo relativně pomalé a především omezeno na velká vinařství. Vinařství vyžaduje konstantní monitorování produktu a hlavně kontrolu procesu od začátku hroznového zrání až po stáčení hotového výrobku. Přímé spektroskopické měření se v této souvislosti dobře hodí, umožňuje rychlé a simultánní analýzy několika sloučenin s minimální přípravou vzorku a spotřebou činidla. Komerčně dostupný FTIR přístroj s univerzálním a inovativním softwarem, určený speciálně pro analýzu hroznů a vína, nedávno získal velkou pozornost. FTIR spektroskopie je založena na principu, že funkční skupiny vzorku se rozvibrují při vystavení IR záření, což vede k přechodu zkoumané látky ze základního stavu s nejnižší energií do excitovaného stavu. Žádné dvě molekuly z odlišných struktur nemají přesně stejnou IR absorpci. (Rolene B., Nieuwoudt H., 2008) Zkoumaná látka může být považována za "otisk prstu" (Mossoba, 1999). Kvantitativní analýza cukru bývá založena na pásmu cm -1 ve střední oblasti IR (NIR) spektra (Paré, J a J Bélanger, 1997). Mezi hlavní přednosti NIR spektroskopie patří nízká nasáklivost a nízká odrazivost. Nízká nasáklivost umožňuje projít energii přes vzorky snadno a bez rychlého útlumu. NIR umožňuje analýzu většiny vzorků, aniž by bylo nutné provést předúpravu vzorku. Nízká odrazivost umožňuje NIR energii proniknout pod povrch i vizuálně neprůhledných vzorků. Naopak vysoká odrazivost UV nebo viditelného světla vylučuje analýzu neporušených bobulí. (Rolene B., Nieuwoudt H., 2008) Obr. 6 FTIR FOSS WineScan [12] 2.6 Gravimetrické (vážkové) stanovení zkvasitelných sacharidů Následující text o gravimetrickém stanovení redukujících cukrů vychází z publikace Vinařství: N vody do laboratorních cvičení (Balík J., 2006). Princip: Stanovení je založeno na tom, že redukující sacharid vyloučí z alkalického roztoku síranu měďnatého ekvivalentní množství Cu 2 O, který se žíháním převádí na 20

21 CuO. Množství vyloučeného Cu 2 O závisí na druhu sacharidu, na jeho koncentraci a na době varu s Fehlingovými roztoky. Stanovení je empirické a vyhodnocuje se podle potravinářských tabulek. 2 CuSO 4 + R COH + 4 NaOH Cu2O + R- COOH + 2 Na 2 SO H2O (rovn. 5) 2 Cu2O + O2 4 CuO (rovn. 6) Postup: Odměříme 30 ml Fehlingova roztoku I a 30 ml Fehlingova roztoku II, smícháme a přidáme 60 ml destilované vody. Promícháme a v kuželové baňce rychle zahřejeme k varu. Do vroucího roztoku odpipetujeme 10 ml vzorku a povaříme přesně 2 minuty. Pak roztok ochladíme a vyloučený Cu 2 O zfiltrujeme. Roztok nad sraženinou musí být modrý. Sraženinu na filtru promyjeme horkou vodou a po vysušení žíháme. Obsah sacharidů se zjišťuje pomocí tabulky, kterou lze dohledat v publikaci Vinařství: N vody do laboratorních cvičení (Balík J., 2006), nebo Spracovanie hrozna (Gavorník A., 1976), na základě hmotnosti naváženého CuO. Výsledek uvádíme v g. l -1. Výpočet: Nejprve zvážíme hmotnost prázdného kelímku, následně zvážíme kelímek s vyžíhanou sraženinou CuO a tyto hodnoty od sebe odečteme. Vypočtený rozdíl vyjde v gramech. 2.7 Stanovení zkvasitelných sacharidů titračními metodami Následující text o titračních metodách vychází z publikace Vinařství: N vody do laboratorních cvičení (Balík J., 2006) Při titracích musíme vždy obsah moštu příslušně naředit z důvodu vysokého obsahu zkvasitelných cukrů Stanovení redukujících cukrů dle (EEC No 2676/90) Princip: Redukující cukry ve víně jsou všechny cukry s ketonovou nebo aldehydickou funkční skupinou, které se při varu přímo redukují na alkalicko-měďnatý roztok. Koncentraci redukujících cukrů stanovíme titrací přebytku měďnatého kationtu odměrným roztokem thiosíranu sodného jodometricky. Přístroje a pomůcky: 50 ml byreta, 25, 15, 10 ml pipeta, 250 ml kuželovitá baňka, chladič 21

22 Chemikálie a roztoky: alkalicko-měďnatý rotok 25 g CuSO 4.5H 2 O, 50 g kyseliny citrónové, 388 g Na 2 CO H 2 O a destilovaná voda do 1000 ml (jednotlivé podíli nejdříve rozpustíme v menším množství vody samostatně a pak opatrně smícháme), 0,1 mol. l -1 roztok Na 2 S 2 O 3, 30 % roztok KI, 25 % roztok H 2 SO 4, 0,5 % škrobový maz, kontrolní roztok invertního cukru (5 g. l -1 ) Postup: Do 250 ml kuželovité baňky odpipetujeme 25 ml alkalicko-měďnatého roztoku, 15 ml destilované vody, 10 ml čiřeného filtrátu připraveného dle jednoho z postupů uvedených přílohové části, a přidáme několik kousků pemzy (obsah redukujících cukrů v baňce nesmí překročit 60 mg, jinak musíme vzorek příslušně naředit). Baňku upevníme k svislému chladiči a obsah uvedeme během 2 minut k varu. Po uplynutí přesně 10-ti minut varu, obsah baňky okamžitě zchladíme pod tekoucí vodou na teplotu laboratoře. Přidáme 10 ml 30 % KI, 25 ml 25 % roztoku H 2 SO 4 a 2 ml škrobového mazu. Neprodleně titrujeme 0,1 mol. l -1 roztokem Na 2 S 2 O 3 z modrofialové do bílé barvy, která se nemění po dobu dvou až tří minut. Slepý pokus provedeme s tím rozdílem, že místo 10 ml vzorku napipetujeme stejné množství destilované vody, zbytek stanovení probíhá jako se vzorkem. Pro kontrolu stanovení můžeme uvedený postup opakovat s připraveným roztokem invertního cukru o známé koncentraci. Vyhodnocení: Rozdíl spotřeb vypočteme vynásobením faktoru 0,1 mol. l -1 roztoku Na 2 S 2 O 3 a rozdílu spotřeb 0,1 mol. l -1 roztoku Na 2 S 2 O 3 při titraci slepého pokusu a při titraci vzorku. V přílohové Tabulce č. 4 k vypočítané hodnotě nalezneme odpovídající hmotnost redukujících cukrů stanovených v titrační baňce. Na základě znalosti objemu testovaného vzorku v titrační baňce vyjádříme koncentraci redukujících cukrů ve vzorku v g. l -1 na jedno desetinné místo. Opakovatelnost a reprodukovatelnost: r = 0,015. x ; R koncentrace redukujících cukrů ve vzorku v g l Stanovení redukukujících cukrů dle Bertranda Čiření testovaného vzorku Carrezovými roztoky nalezneme v přílohové části. 22

23 Princip: Metoda je založena na redukci alkalicko-měďnatého roztoku (Fehlingova), z něhož se vylučuje redukujícími cukry oxid měďný. Oxid měďný převedeme pomocí síranu železitého na oxid měďnatý a množství vytvořeného oxidu železnatého stanovíme manganometricky. Přístroje a pomůcky: 250 ml kónická baňka, 20 ml pipeta, 50 ml byreta, filtrační zařízení, odsávací baňka, vodní vývěva. Chemikálie a roztoky: Carrez I.: 15% roztok K 4 Fe(CN) 6. 3 H 2 O, Carrez II.: 30% roztok ZnSO 4. 7 H 2 O, 0,02mol. l -1 roztok KMnO 4, roztok síranu železitého: 50 g Fe 2 (SO 4 ) ml koncentrované H 2 SO 4 se rozpustí v destilované vodě a doplní na 1000 ml roztoku., Fehling I: 69,3 g CuSO 4. 5H 2 O v 1000 ml roztoku, Fehling II: 346,0 g vinanu sodno-draselného a 103,2 g NaOH se odděleně rozpustí v destilované vodě, smíchají a doplní destilovanou vodou na 1000 ml roztoku. Postup stanovení redukujících cukrů dle Bertranda: Do 250 ml baňky (se zábrusem na fritu) odměříme 25 ml roztoku Fehling I, 25 ml Fehling II a pipetou 20 ml upraveného (čiřeného) vzorku. Směs promícháme a během 4 5 minut přivedeme k varu. Po 2 minutách směs odstavíme z vařiče a ochladíme přidáním 100 ml destilované vody. Vyloučený oxid měďný necháme usadit na dno baňky. Následně tekutinu nad oxidem měďným slijeme na fritu spojenou s vodní vývěvou tak, aby se na fritu přeneslo minimální množství oxidu měďného, Cu 2 O několikrát promyjeme horkou destilovanou vodou a slijeme po 1 3 min. znovu přes fritu. Pak neprodleně přeneseme fritu na kónickou baňku s oxidem měďným a oxid měďný rozpustíme opakovaným přelitím frity s celkem ml roztoku síranu železitého, propláchneme horkou destilovanou vodou. Po rozpuštění oxidu měďného ihned titrujeme obsah kónické baňky 0,02 mol. l -1 roztokem KMnO 4 ze zeleného do růžového zabarvení, které se udrží 30 sekund. Vyhodnocení: Hmotnost Cu 2 O v mg vyjádřená na celá čísla se stanoví z rozdílu spotřeb 0,02 mol. l -1 roztoku KMnO 4 (při titraci vzorku a slepého pokusu) v ml vynásobeným faktorem 0,02 mol. l -1 roztoku KMnO 4 a celkově vynásobeno hodnotou 7,157. Ke stanovené hmotnosti oxidu měďného nalezneme odpovídající hmotnost redukujících cukrů stanovených v 250 ml kónické baňce pomocí tabulky, kterou lze 23

24 dohledat v publikaci Vinařství: N vody do laboratorních cvičení (Balík J., 2006), nebo Spracovanie hrozna (Gavorník A., 1976). Na základě znalosti objemu testovaného vína v 250 ml kónické baňce vyjádříme koncentraci redukujících cukrů ve víně v g. l -1 na jedno desetinné místo Stanovení redukujících cukrů dle Rebeleina Princip: Koncentraci redukujících cukrů stanovíme jodometricky z rozdílu spotřeb roztoku thiosíranu sodného na titraci měďnatého kationtu o definované koncentraci a jeho zůstatku po reakci s redukujícími cukry, bez předchozího odstranění interferujících látek. Přístroje a pomůcky: 50 ml byreta, 10, 5, 2 ml pipeta, 250 ml kuželovitá baňka Chemikálie a roztoky: Roztok 1 = 41,92 g CuSO 4.5H 2 O a 10 ml 0,5 mol. l -1 H 2 SO 4 v 1 l destilované vody. Koncentraci měďnatého kationtu je třeba upravit tak, aby spotřeba roztoku Na 2 S 2 O 3 = roztok 6 o faktoru 1,0000 byla při slepém pokusu 30 ml Roztok 2 = 250 g vinanu sodno-draselného a 80 g NaOH v 1 l destilované vody (rozpouštíme odděleně v destilované vodě a následně smícháme) Roztok 3 = 300 g KI a 100 ml 1 mol. l -1 NaOH v 1 l destilované vody Roztok 4 = 16% kyselina sírová Roztok 5 = 10g škrobu + 10 ml 1 mol. l -1 NaOH a 20 g KI v 1 l destilované vody Roztok 6 = 13,7772 g Na 2 S 2 O 3.5H 2 O + 50 ml 1 mol. l -1 NaOH v 1 l destilované vody Postup měření: Do 250 ml baňky napipetujeme 10 ml Roztoku 1 a 5 ml Roztoku 2. Obsah baňky promícháme. Přidáme několik kousků pemzy a odpipetujeme 2 ml testovaného vzorku. Jestliže vzorek obsahuje více jak 28 g. l -1 redukujících cukrů, je nutné vzorek příslušně naředit. Směs přivedeme k varu během 4-5 minut. Po uplynutí přesně 1 minuty 30 sekund směs neprodleně ochladíme přídavkem 25 ml destilované vody a dochladíme na laboratorní teplotu omýváním baňky studenou vodou. Přidáme 10 ml Roztoku 3, 10 ml Roztoku 4 a 10 ml Roztoku 5. Neprodleně titrujeme Roztokem 6 z modrofialové do bílé barvy, která je stálá po dobu 2 3 minut. 24

25 Slepý pokus provedeme pouze s tím rozdílem, že místo 2 ml testovaného vzorku přidáme 2 ml destilované vody. Vyhodnocení: Koncentrace redukujících cukrů ve víně v g. l -1, vyjádřená na jedno desetinné místo, je získána z rozdílu hodnot spotřeby Roztoku 6 při titraci slepého pokusu a spotřeby Roztoku 6 při titraci vzorku Stanovení redukujících cukrů dle Henniga Princip: Metoda je založena na vizuálním posouzení reakce přítomných redukujících cukrů s Fehlingovým roztokem ve zkumavkách. Žlutá barva znamená nedostatečné množství Fehlingova roztoku na přítomnou koncentraci redukujících cukrů. Naopak modré zbarvení znamená přebytek Fehlingova roztoku. Přístroje a pomůcky: 50 ml odměrný válec, 10 vysokých skleněných zkumavek, varná vodní lázeň, 10 ml byreta nebo pipeta, 250 ml kónická baňka. Chemikálie a roztoky: aktivní uhlí, Fehling I: 69,3 g CuSO 4. 5H 2 O v 1 l roztoku, Fehling II: 346 g vinanu sodno-draselného a 103,2 g NaOH se odděleně rozpustí v destilované vodě, smíchají a doplní destilovanou vodou na 1 l roztoku Postup: K 100 ml vzorku v 250 ml baňce přidáme 2 6 g aktivního uhlí (filtrát musí být bezbarvý), důkladně promícháme a po uplynutí 60 minut filtrujeme. Smícháme 30 ml roztoku Fehling I a 30 ml roztoku Fehling II. Směs dávkujeme pomocí byrety, případně pipety postupně do zkumavek v množstvích 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 a 10 ml. Do každé zkumavky přidáme pipetou 5 ml filtrátu a promícháme. Jestliže vzorek obsahuje redukujících cukrů více jak 10 g. l -1, je nutné jej před stanovením příslušně ředit. Zkumavky zahříváme ve vroucí lázni po dobu 20 minut. Následně zkumavky ochladíme a asi po 10 minutách hodnotíme zbarvení zkumavek. Vyhodnocení: Počet žlutých zkumavek se rovná a. Koncentrace redukujících cukrů v testovaném vzorku se pohybuje v rozmezí ( a až a + l ) g. l

26 2.7.5 Stanovení sacharózy a veškerých cukrů Princip: Sacharóza za varu přímo neredukuje alkalicko měďnatý roztok. Její koncentrace se stanoví z rozdílu stanovené koncentrace redukujících cukrů po inverzi a před inverzí vynásobením faktorem 0,95. Veškeré cukry jsou součtem stanovené koncentrace redukujících cukrů a sacharózy. 1. Příprava testovaného vzorku čiřením neutrálním octanem olovnatým Přístroje a pomůcky: 1, 2, 5 nebo 20 ml pipeta, dvě 100 ml odměrné baňky, vodní lázeň, teploměr, filtrační zařízení. Chemikálie a roztoky: nasycený roztok neutrálního octanu olovnatho (250 mg rozpouštíme v horké destilované vodě na objem 500 ml), CaCO 3, koncentrovaná HCl, 30 % roztok NaOH, 1 % roztok fenolftaleinu v alkoholu Postup: U testovaného vzorku s obsahem cukrů g. l -1 pipetujeme po 2 ml do dvou 100 ml odměrných baňek. U vzorku s obsahem cukrů nad 250 g. l -1 pipetujeme po 1 ml do dvou 100 ml baněk. V obou baňkách upravíme obsahy destilovanou vodou na objem asi 30 ml a do baňky (A) přidáme 2,5 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Baňku (A) s vloženým teploměrem zahříváme ve vodní lázni při C přesně 5 minut. Následně opláchneme teploměr destilovanou vodou, obsah baňky ochladíme a neutralizujeme 30 % roztokem NaOH na fenolftalein. Do obou odměrných baněk přidáme 0,5 g uhličitanu vápenatého a 1 ml nasyceného roztoku neutrálního octanu olovnatého. Během 15 minut stání několikrát baňky promícháme. Pak doplníme destilovanou vodou po značku, promícháme a filtrujeme. 1 ml filtrátu odpovídá 0,02 ml původního vzorku, respektive 0,01 ml. V připravených filtrátech stanovíme obsah cukrů podle postupu Stanovení redukujících cukrů (EEC No 2676/90) viz. přílohová část. Vyhodnocení: Stanovená koncentrace redukujících cukrů v testovaném vzorku určená pomocí odměrné baňky (B) vyjadřuje koncentraci přímo redukujících cukrů v g. l -1 na jedno desetinné místo. Matematický rozdíl mezi stanovenou koncentrací redukujících cukrů v testovaném vzorku pomocí odměrné baňky (A) a stanovenou koncentrací redukujících 26

27 cukrů pomocí odměrné baňky (B) vynásobený číslem 0,95 vyjadřuje koncentraci sacharózy v g. l -1 na jedno desetinné místo. Koncentraci veškerých cukrů vypočítáme jako součet stanovené koncentrace přímo redukujícíchc cukrů a sacharózy v g. l -1 na jedno desetinné místo. 27

28 3 Cíl práce Cílem této práce bylo prostudovat literaturu týkající se metabolismu kvasinek a metod stanovení sacharidů. Praktickou částí bylo popsat a porovnat metody používané pro zadaný účel z hlediska přesnosti, rychlosti a náročnosti na instrumentální vybavení. Klíčovou roli v této bakalářské práci hrál výběr vhodných metod pro vinařskou praxi. 28

29 4 Experimentální část 4.1 Materiály Jako materiál byly použity hrozny z vinařské oblasti Morava, podoblasti Znojemské a vinařské obce Miroslavské Knínice. Na stanovišti se prolínají hlinité až jílovito-hlinité půdy s vyšším obsahem skeletu. Vinice je orientována na jiho-východ, stanoviště se nachází 350 metrů nad mořem. K pokusu jsou využity tři bílé odrůdy a to Rulandské šedé, Sauvignon blanc a Tramín červený. Pro kvalitativní analýzu obsahu sacharidů v hroznech byly hrozny odebírány z obou stran listové stěny, zastíněné i exponované ke slunci. Vybíraly se především hrozny v dobrém zdravotním stavu a z celé homogenní plochy vinice. Z každé odrůdy bylo odebráno padesát hroznů. Hrozny byly ihned vylisovány a získaný mošt byl přes noc vložen do ledničky. V ledničce proběhla sedimentace kalových částic, zároveň byl mošt chráněn nízkou teplotou proti rozkvašení. Druhý den probíhalo měření zkvasitelných sacharidů. Měření bylo provedeno v laboratoři na Zahradnické fakultě Mendelovy univerzity v Lednici, na ústavu Vinohradnictví a vinařství. 4.2 Metody K pokusu byly vybrány metody hydrometrické, refraktometrické a titrační. U hydrometrických metod probíhalo měření Československým normalizovaným moštoměrem a Oechsleho moštoměrem. Československý normalizovaný moštoměr měl dvě varianty, a to s teploměrem a bez teploměru. Refraktometrické měření probíhalo na digitálním refraktometru, který měřil v Brixově stupnici a stupních Refrakce v rozmezí 0 53 % a jako titrační metoda byla použita metoda stanovení redukujících cukrů dle Rebeleina Hydrometrické Československý normalizovaný moštoměr, dále jen ČNM nebo Oechsleho moštoměr, jsou přístroje stálé hmotnosti používané k měření koncentrace sacharidů v moštu, kterou určují hloubkou svého ponoru. Přesnost měření je dána především teplotou měřené kapaliny a jejím povrchovým napětím. Tento ČNM je cejchovaný na přesné měření při teplotě 15 C a Oechsleho moštoměr je cejchovaný na teplotu 20 C. 29

30 Pokud je teplota měřeného moštu jiná než teplota stanovená výrobcem, je nutná korekce teploty dle příslušných korekčních tabulek. Odměrný válec postavíme do misky, následně nalijeme již odkalený mošt až po horní okraj odměrného válce. Mošt lijeme do odměrného válce opatrně, aby nevznikala pěna, která musí být při vzniku z povrchu odstraněna. Také dáváme pozor, aby mošt již nezačal kvasit. V případě tvorby oxidu uhličitého je nutné odstranění kvasinek pasterizací a odplynění vzorku ultrazvukem. Při naplnění odměrného válce nejdříve změříme teplotu moštu teploměrem. V případě, že daný moštoměr neobsahuje integrovaný teploměr, naměřenou teplotu si zaznamenáme. Později se bude zaznamenaná teplota hodit ke korekci obsahu sacharidů dle korekčních tabulek. Následně opatrně vyjmeme moštoměr z ochraného tubusu, omyjeme jej destilovanou vodou a osušíme. Když je moštoměr dokonale čistý, vezmeme jej za horní konec a pozvolna jej vpouštíme do moštu. Nikdy moštoměr do moštu nevhazujeme. Pokud se moštoměr při vpouštění do moštu ustálí v rovnovážné poloze, opatrně jej palcem a ukazováčkem mírně roztočíme, abychom se ujistili, že se nedotýká stěny odměrného válce. Při zastavení se skloníme k moštoměru a odečteme hodnotu, na které se moštoměr zastavil. Odečítání musí vždy probíhat tím způsobem, že oči jsou ve vodorovné poloze s vodorovnou hladinou moštu. Při odečítání z jiného úhlu by mohlo dojít k nepřesnému čtení hodnoty. Po stanovení cukernatosti moštoměr vyjmeme, opláchneme destilovanou vodou, osušíme a vložíme do ochranného tubusu. Následně provedeme korekci obsahu sacharidů na teplotu a příslušný převod z měrné stupnice na g. l -1. Stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů moštoměry můžeme vidět v Tab. 4, 5 a 6. Tab. 4 Naměřené hodnoty obsahu zkvasitelných sacharidů Československým normalizovaným moštoměrem , bez teploměru Odrůda Cukernatost NM Teplota C Korekce na 15 C Cukernatost v g. l -1 Sauvignon blanc 18, ,1 181 Rulandské šedé 18, ,8 188 Tramín červený ,

31 Tab. 5 Naměřené hodnoty obsahu zkvasitelných sacharidů Československým normalizovaným moštoměrem ts. číslo 619, s teploměrem Odrůda Cukernatost NM Teplota C Korekce na 15 C Cukernatost v g. l -1 Sauvignon blanc ,1 181 Rulandské šedé 18, ,8 188 Tramín červený ,1 221 Korekce cukernatosti na teplotu byla provedena podle cejchování Československých normalizovaných moštoměrů na 15 C dle Tab. 2. Tab. 6 Stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů Oechsleho moštoměrem ts. č. 1112, bez teploměru Odrůda Sauvignon blanc Rulandské šedé Tramín červený Cukernatost Oe Teplota C Korekce na teplotu 20 C Přepočet na NM Cukernatost v g. l , , ,1 221 Korekce cukernatosti na teplotu byla provedena dle cejchování Oechsleho moštoměru na 20 NM. A. Gavorník uvádí, že korekce pro 1 C je 0,2 Oe, při teplotě nižší než 20 C se hodnota 0,2 na každý stupeň odčítá a naopak. Převod na NM proběhl dle přílohové Tabulky č Digitální refraktometrie Měření probíhalo na univerzitním digitálním refraktometru v prostorech laboratoře. Měřil se již odkalený mošt a to tím způsobem, že se odebral pomocí pipety vzorek moštu a pár kapek vzorku se naneslo na měřící hranol refraktometru. Následně byl refraktometr zapnut a po několika vteřinách bylo měření ukončeno zobrazením naměřené hodnoty na displeji refraktometru. Refraktometr byl vybaven ATC automatickou kompenzací teploty. Naměřené hodnoty jsou napsané v Tab

32 1 titrace 2 titrace 3 titrace Aritmetický průměr Spotřeba při slepém pokusu Redukující Přepočty probíhaly Oe = Refrakce x 4,25; stupně Oechsle se převedly na stupně Normalizovaného moštoměru již podle přílohové Tabulky č. 3. Tab. 7 Naměřené hodnoty digitálním refraktometrem s ATC (automatickou teplotní kompenzací) Odrůda Cukernatost Přepočet na Přepočet na Cukernatost Refr Oe NM v g. l -1 Sauvignon blanc 18,7 79, Rulandské šedé 19,4 82,45 18,8 188 Tramín červený 22,4 95,2 21, Stanovení redukujících cukrů dle Rebeleina Této metodě se více věnuje podkapitola Titrační metody, podle které byl celý postup stanovení proveden. Naměřené hodnoty jsou zapsané v Tab. 8. Vzorek byl díky vysoké koncentraci sacharidů naředěn destilovanou vodou v poměru 1:9 (mošt : destilovaná voda). Tab. 8 Naměřené hodnoty titrační metodou pro stanovení obsahu redukujících cukrů dle Rebeleina cukry v g. l -1 cukry v g. l -1 naředěné Redukující nenaředěné Odrůda Sauvignon blanc Rulandské šedé Tramín červený 15,6 15,4 15,8 15,6 33,7 18, ,2 14,9 14,5 14,9 33,7 18, ,5 11, ,7 33,7 22, Výsledky práce Při měření obsahu zkvasitelných cukrů se jako nejrychlejší metoda prokázala metoda refraktometrická. U této metody s digitálním refraktometrem stačilo pouze 32

33 Obsah zkvasitelných sacharidů nakapat několik kapek z bobule na měřící hranol refraktometru, spustit zařízení a měření bylo za několik málo vteřin skončeno. Nejzdlouhavější metodou se prokázala metoda titrační, u této metody se dělalo také více opakování, aby bylo možné odhalit případnou chybu z hlediska laboratorní obsluhy. Hydrometrické metody byly z časového hlediska o něco pomalejší než měření digitálním refraktometrem. Z hlediska potřeby různého množství vzorku pro stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů byl nejméně náročný pokus s digitálním refraktometrem, kde stačilo pár kapek moštu. Hned v zápětí se umístila titrační metoda dle Rebeleina, na kterou je potřeba 2 ml vzorku. Největší spotřeba moštu byla u měření hydrometry, kde bylo potřeba naplnit odměrný válec, ve kterém měření probíhalo, měřeným moštem. Odměrný válec měl obsah 500 ml. Z hlediska instrumentálního vybavení byla nejnáročnější titrační metoda dle Rebeleina, při které byla potřeba 50 ml byreta, 10, 5 a 2 ml pipety, 4x 250 ml kuželovitá baňka, dále různé chemikálie a roztoky popsané v kapitole o titračních metodách. Za titrační metodou se nacházela metoda hydrometrická, kde byl potřeba daný hydrometr a odměrný válec. Jako nejméňě náročná na instrumentální vybavení se ukázala metoda refraktometrická. v g. l -1 Stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů v hroznech a moštech zkoumanými metodami ČNM ČNM Oechsle Digitální refraktometr 0-53% Rebelein Sauvignon blanc Rulandské šedé Tramín červený Graf 1 Porovnání různých metod užívaných pro stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů v moštech 33

34 V Grafu 1 můžeme vidět, již po korekci a přepočtu, metody užité k pokusu stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů v hroznech a moštech. Obsahy zkvasitelných sacharidů jsou uvedeny v g. l -1. V grafu jsou pro lepší přehled a čitelnost znázorněny pouze naměřené hodnoty od 170 g. l -1 do 230 g. l Diskuze Obsah zkvasitelných sacharidů byl měřen různými analytickými metodami. Měření bylo provedeno na Ústavu vinohradnictví a vinařství Zahradnické fakulty v Lednici na Moravě. Při měření moštoměry se ukázalo v Grafu 1, že oba použité Československé normalizované moštoměry naměřily stejný obsah zkvasitelných sacharidů. Oechsleho moštoměr však u vzorku Rulandského šedého naměřil o jeden gram navíc, tato chyba mohla vzniknout při přepočtu a odečítání obsahu necukrů. Při pohledu na hodnoty naměřené digitálním refraktometrem se naměřené hodnoty lišily o jeden a dva gramy. O jeden gram nižsí hodnotu naměřil refraktometr u Sauvignonu a o dva gramy nižší naměřil digitální refraktometr u Rulandského šedého. Jako nejpřesnější metoda by měla být titrační metoda dle Rebeleina, při které by měla probíhat chemická reakce pouze s redukujícími sacharidy. Tato metoda měla v podstatě stejné výsledky jako Československé normalizované moštoměry, až na stanovení u odrůdy Tramín červený, kde byla stanovená hodnota o jeden gram nižší než u ČNM. Oproti digitálnímu refraktometru byla titrační metodou naměřena u Sauvignonu a Tramínu hodnota o jeden gram vyšší. Při srovnání těchto metod Československé normalizované moštoměry měřily, až na vyjímku u vzorku Tramínu červeného, stejně, jako titrační metoda dle Rebeleina. Oechsleho moštoměr naměřil také přesné hodnoty, až na jednu výjimku u Rulandského šedého, oproti ČNM a titrační metodě dle Rebeleina. Digitální refraktometr vykazoval nejvíce odlišné měření. 34

35 5 Závěr V roce 2013 byly testovány vybrané analytické metody pro stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů v hroznech a moštech. Tyto metody byly porovnávány mezi sebou z hlediska přesnosti, rychlosti a náročnosti na instrumentální vybavení. Měření probíhalo na Ústavu vinohradnictví a vinařství Zahradnické fakulty v Lednici na Moravě. Z výsledků testování bylo vyhodnoceno, že pro předběžné stanovení zkvasitelných sacharidů může být použito stanovení digitálním refraktometrem, jedná se o nenáročné a rychlé stanovení s nižší přesností. Pro stanovení ve vinařském provozu se nejvíce hodí Československý normalizovaný moštoměr, který má při měření hodnoty velmi blízké k titračním metodám. Titrační metody jsou považovány za nejpřesnější, což se prokázalo také při pokusu. Může zde ale hrát velkou roli lidský faktor a navíc jsou tyto metody nejnáročnější na instrumentální vybavení a čas. V poslední době získává na popularitě u nás i ve světě FTIR spektroskopie, která je vhodná pro stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů a mnoha dalších látek, avšak pro spoustu vinařství je nedostupná díky značným pořizovacím nákladům. 35

36 6 Souhrn Tato bakalářská práce se zabývá analytickými metodami pro stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů v hroznech a moštech. Na začátku byla prostudována literatura týkající se metabolismu kvasinek a metod pro stanovení obsahu sacharidů. Vybrané analytické metody jsou zde popsány z hlediska přesnosti, rychlosti a náročnosti na instrumentální vybavení. V závěru jsou vybrány vhodné metody pro vinařskou praxi. Předmětem pokusu bylo srovnání různých analytických metod vhodných pro stanovení obsahu zkvasitelných sacharidů. Měření probíhalo na Ústavu vinohradnictví a vinařství Zahradnické fakulty v Lednici na Moravě a to Československým normalizovaným moštoměrem s teploměrem a bez teploměru, Oechsleho moštoměrem, digitálním refraktometrem a titrační metodou dle Rebeleina. Klíčová slova: zkvasitelné sacharidy, analytické hodnocení, Československý normalizovaný moštoměr, Oechsleho moštoměr, refraktometr, titrační metoda dle Rebeleina 36

37 7 Resume This Bachelor thesis is mainly concerned with analytical methods used for ingredients determination of fermentable saccharides in grapes and musts. The process started with studies of literary sources focused on yeast cells metabolism and methods of ingredients determination of saccharides. The selected analytical methods are further on described with respect to accuracy, speed and demands of instrumental facilities. Finally, the suitable methods for viticulture practical area are presented. The aim of experiment was to compare diverse analytical methods which would be suitable for ingredients determination of fermentable saccharides. The measurments were carried out at The Department of Viniculture and Viticulture at the Faculty of Horticulture in city of Lednice in South Moravia, and powered by the Czecho-slovak normalized must-meter both with a thermometer and without one, the Oechsle s must-meter, digital refractometer and by the titration method according to Rebelein. Key words: fermentable saccharides, analytical evaluation, Czecho-slovak normalized must-meter, Oechsle s must-meter, refractometer, titration method according to Rebelein 37

38 8 Seznam použité literatury Internetové zdroje 1 Hand refractometers. AFAB Enterprises [online]. Florida USA, [cit ]. Dostupné z: 2 Digital Refractometer. AFAB Enterprises [online]. Florida USA, [cit ]. Dostupné z: 3 Abbe Refractometer. AFAB Enterprises [online]. Florida USA, [cit ]. Dostupné z: 4 Refraktometr na měření cukernatosti moštů (moštoměr, cukroměr). REINBERK, František. Refraktometr.cz [online]. Hradec Králové [cit ]. Dostupné z: 5 Zjišťování cukernatosti kvasů. Zahrádkář: rádce ovocnářů, zelinářů, vinařů a ostatních pěstitelů. Praha: Srpen, 2004, č. 8. Dostupné z: 6 JACQUET, Didier a Bill WRIGHT. WINE & MUST ANALYSES MANUAL: Soluble Solids by Hydrometry. Napa Valley, Dostupné z: lder/laboratory%20analyses%20manual.doc 7 OIV. INTERNATIONAL ORGANISATION OF VINE AND WINE [online]. 2. vyd Paris, France, 2014 [cit ]. 2014, 2. ISBN Dostupné z: 8 Kaposervis Ostrava: Refraktometry. [online]. [cit ]. Dostupné z: 9 Hanna instruments: Digital Refractometers. [online] [cit ]. Dostupné z: 10 BDL Czech Republic: Abbého refraktometr RMT. BDL CZECH REPUBLIC S.R.O. [online] [cit ]. Dostupné z: 38

39 eshop_products_types/ _l.jpg 11 HPLC High Performance Liquid Chromatography Series. TORONTECH [online] [cit ]. Dostupné z: 12 Wine: WineScan SO2. FOSS [online] [cit ]. Dostupné z: Tištěné zdroje BALÍK, Josef. Vinařství: Návody do laboratorních cvičení. V Brně: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2006, 96 s. ISBN ČOPÍKOVÁ, Jana. Chemie a analytika sacharidů. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 1997, 104 s. ISBN FARKAŠ, Ján. Technológia a biochémia vína. Bratislava: Alfa, FARKAŠ, Ján. Biotechnológia vína. Bratislava: Alfa, FTIR Spectroscopy for Grape and Wine Analysis, Rolene Bauer, Hilhne Nieuwoudt, Florian F. Bauer, Jens Kossmann, Klaus R. Koch, and Kim H. Esbensen, Analytical Chemistry (5), GAVORNÍK, Anton a Ján GAJDOŠ. Spracovanie hrozna. Bratislava: Príroda, JANČÁŘOVÁ, Irena a Luděk JANČÁŘ. Analytická chemie. Vyd. 1. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2003, 195 s. ISBN Kvasný průmysl: odborný časopis pro výrobu nápojů a biochemické technologie. Praha: Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, Praha ve spolupr. se Sahm, s. r. o, 2005, č. 4. ISSN MINÁRIK, Erich a Anton NAVARA. Chémia a mikrobiológia vína. 1.vyd. Bratislava: Príroda, 1986, 547 s. 39