RADIAČNÝ STRES A FOTOINHIBÍCIA FOTOSYNTÉZY U MODELOVÝCH LIŠAJNÍKOV

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a anatomie rostlin RADIAČNÝ STRES A FOTOINHIBÍCIA FOTOSYNTÉZY U MODELOVÝCH LIŠAJNÍKOV Bakalárska práca Romana Gašparová Vedúci práce: prof. Ing. Miloš Barták, CSc. Brno 2016

2 Bibliografický záznam Autor: Romana Gašparová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Radiační stres a fotoinhibice fotosyntézy u modelových lišejníků Studijní program: Experimentální biologie Studijní obor: Speciální biologie, směr Experimentální biologie rostlin Vedoucí práce: prof. Ing. Miloš Barták, CSc. Akademický rok: 2015/2016 Počet stran: 50 Klíčové slova: Fotoinhibice, fotosyntéza, lišejník, stres, fluorescence chlorofylu

3 Bibliografický záznam Autor: Romana Gašparová Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentálnej biológie Názov práce: Radiačný stres a fotoinhibícia fotosyntézy u modelových lišajníkov Študijný program: Experimentálna biológia Študijný odbor: Špeciálna biológia, smer Experimentálna biológia rastlín Vedúci práce: prof. Ing. Miloš Barták, CSc. Akademický rok: 2015/2016 Počet strán: 50 Kľúčové slová: Fotoinhibícia, fotosyntéza, lišajník, stres, fluorescencia chlorofylu

4 Bibliographic entry Author: Romana Gašparová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: Radiation Stress and Photoinhibition in Model Lichen Species Degree programme: Experimental Biology Field of Study: Special Biology, Experimental Biology of Plants Supervisor: prof. Ing. Miloš Barták, CSc. Academic Year: 2015/2016 Number of Pages: 50 Keywords: Photoinhibition, photosynthesis, lichen, stress, chlorophyll fluorescence

5 Abstrakt V této bakalářské práci jsem se věnovala radiační stresové fyziologii u lišejníků. Jedná se o stres navozený fotosynteticky aktivním zářením, který můţe za jistých podmínek způsobit inhibici fotosyntetických dějů. Cílem práce byl literární přehled dosavadních poznatků se zaměřením na regulaci fotosyntézy při působení různých dávek fotosynteticky aktivního záření na stély lišejníků, jenţ prokazují vysokou odolnost vůči širokému spektru stresových faktorů a obecně se vyznačují vysokou kapacitou ochranných mechanismů působících proti fotoinhibičním vlivům světla, alespoň během krátké expozice. Tyto mechanismy zahrnují změny jak na úrovni celé stélky, tak na úrovni struktury a funkce chloroplastových součástí symbiotických fotosyntetizujících organizmů. Práce zabývající se fotoinhibicí přistupují k problematice z hlediska krátkodobého (akutní fotoinhibice) a dlouhodobého působení stresu (kumulativní fotoinhibice). Převaţující metody zkoumání fotoinhibice jsou zaloţené na měření indukované fluorescence chlorofylu, případně na kombinaci fluorometrických a gazometrických metod. Bakalářská práce je věnována jak teoretickým poznatkům, tak praktické experimentální části zaměřené na kvantifikaci fotoinhibičních projevů u lišejníků pomocí měření fluorescence chlorofylu in vivo. Experimentální část je zaměřena na dlouhodobé působení nízké (280 µmol.m -2.s -1 ) a vysoké (1000 µmol.m -2.s -1 ) intenzity fotosynteticky aktivního záření a jeho vlivu na běh primárních fotosyntetických procesů u dvou druhů lišejníků antarktického druhu Umbilicaria antarctica a argentinského druhu Parmotrema sp.. Cílem experimentu bylo zjistit, do jaké míry jsou dané lišejníky schopny snést několikahodinovou expozici a určit mezidruhové rozdíly v jejich citlivosti. Fotosyntetické procesy byly zkoumány na základě měření fluorescence chlorofylu metodou pomalé Kautského kinetiky a následným výpočtem maximálního (Fv/Fm) a efektivního (Φ PSII ) kvantového výtěţku fotochemie PSII. Účinky fotoinhibičního záření byly závislé na době působení a intenzitě záření. V průběhu expozice se projevil kumulativní charakter působení záření s charakteristickým graduálním poklesem zkoumaných parametrů Fv/Fm a Φ PSII. Rovněţ byli potvrzeny rozdíly v senzitivitě mezi zkoumanými druhy, přičemţ argentinský druh projevoval vyšší odolnost vůči experimentálnímu záření.

6 Abstrakt V tejto bakalárskej práci som sa venovala radiačnej stresovej fyziológii u lišajníkov. Ide o stres navodený fotosynteticky aktívnym ţiarením, ktorý za istých podmienok spôsobuje inhibíciu fotosyntetických dejov. Cieľom práce bol literárny prehľad súčasných poznatkov so zameraním na reguláciu fotosyntézy pri pôsobení rôznych dávok fotosynteticky aktívneho ţiarenia na stielky lišajníkov. Tie preukazujú vysokú odolnosť voči širokému spektru stresových faktorov, a vo všeobecnosti sa vyznačujú dostatočnou kapacitou ochranných mechanizmov pôsobiacich proti fotoinhibičným vplyvom svetla, aspoň počas krátkej expozície. Tieto mechanizmy zahŕňajú zmeny na úrovni celej stielky a na úrovni štruktúry a funkcie chloroplastových súčastí symbiotických fotosyntetizujúcich organizmov. Práce zaoberajúce sa fotoinhibíciou pristupujú k problematike z hľadiska krátkodobého (akútna fotoinhibícia) a dlhodobého pôsobenia stresu (kumulatívna fotoinhibícia). Prevaţujúce metódy skúmania fotoinhibície sú zaloţené na meraní indukovanej fluorescencii chlorofylu, poprípade na kombinácii fluorometrických a gazometrických metód. Bakalárska práca je venovaná ako teoretickým poznatkom, tak praktickej experimentálnej časti zameranej na kvantifikáciu fotoinhibičných prejavov u lišajníkov pomocou merania fluorescencie chlorofylu in vivo. Experimentálna časť je zameraná na dlhodobé pôsobenie nízkej (280 µmol.m -2.s -1 ) a vysokej (1000 µmol.m -2.s -1 ) intenzity fotosynteticky aktívneho ţiarenia, a jeho vplyvu na beh primárnych fotosyntetických procesov u dvoch druhov lišajníkov antarktického druhu Umbilicaria antarctica a argentínskeho druhu Parmotrema sp.. Cieľom experimentu bolo zistiť do akej miery sú dané lišajníky schopné zniesť niekoľkohodinovú expozíciu a určiť medzidruhové rozdiely v ich citlivosti. Fotosyntetické procesy boli skúmané na základe merania fluorescencie chlorofylu metódou pomalej Kautského kinetiky a následným výpočtom maximálneho (Fv/Fm) a efektívneho (Φ PSII ) kvantového výťaţku fotochémie PSII. Účinky fotoinhibičného pôsobenia boli závislé na dobe pôsobenia a intenzite ţiarenia. V priebehu expozície sa prejavil kumulatívny charakter pôsobenia ţiarenia s charakteristickým graduálnym poklesom skúmaných parametrov Fv/Fm a Φ PSII. Takisto boli potvrdené rozdiely v senzitivite medzi skúmanými druhmi, pričom argentínsky druh prejavoval vyššiu odolnosť voči experimentálnemu ţiareniu.

7 Abstract This bachelor thesis is focused on radiation stress physiology of lichens. This kind of stress is caused by photosynthetically active radiation (PAR), which can at certain circumstances cause inhibition of photosynthetic processes. The aim of this thesis was to summarize existing literal findings with special attention on regulation of photosynthesis of lichen thalli under exposure to various levels of PAR. Lichens, in general, show high resistance for wide range of stress factors and have high capacity of photoprotective mechanisms working to cope with inhibitory effects of high light, at last during short-time exposure. These mechanisms include changes both on the level of the thallus, and the level of structure and functioning of chloroplast components of symbiotic photosynthetic organisms. Works dealing with photoinhibition approach this issue from point of short-term (acute photoinhibition) and long-term (cumulative photoinhibition) effect of light. Predominating methods used in research of photoinhibition are based on non destructive measurements of induced chlorophyll fluorescence, sometimes in combination with gasometric methods. This bachelor thesis consists both of the theoretical part and a practical experimental part, which is focused on the quantification of consequences of the effect of excessive light within lichen thalli using chlorophyll fluorescence measurements invivo. Experimental part is focused long-term exposition to low (280 µmol.m -2.s -1 ) and high (1000 µmol.m -2.s -1 ) irradiance, and its effect on course of primary processes of photosynthesis in two lichen species Umbilicaria antarctica, native to polar environment of Antarctica,and Parmotrema sp., found in mountain range of Los Gigantes, Argentina. The aim of this experiment was to determine the extent of ability of mentioned lichens to sustain several hours lasting exposition to two different irradiances and to define interspecific differences in their sensibility to such radiation conditions. Photosynthetic processes were examined using the method of slow induction kinetics of chlorophyll fluorescence based on the Kautsky effect, following determination of photosynthetic efficiency before, and during the exposition using basic fluorescence parameters potential (Fv/Fm), and effective (Φ PSII ) quantum yield of photochemistry of photosystem II. Effects of photoinhibitory light were light intensity- and light duration-dependent. Long-term exposition showed cumulative photoinhibitory effects of irradiation, along with gradual decrease in Fv/Fm and Φ PSII with the time of exposition. Also, the interspecific differences in the sensitivity to such irradiance conditions were observed, with higher ability of the Argentinian species to cope with long lasting irradiance exposure.

8

9

10 Poďakovanie Na tomto mieste by som chcela poďakovať vedúcemu mojej bakalárskej práce, pánovi prof. Ing. Milošovi Bartákovi, CSc. za odborné vedenie, pomoc a čas venovaný konzultáciám. Ďakujem tieţ Mgr. Jane Hazdrovej za pomoc a spoločnosť počas práce v laboratóriu. V neposlednom rade patrí moja vďaka rodine a priateľom, ktorí ma podporovali a verili mi, keď som to sama nedokázala. Prehlásenie Prehlasujem, ţe som svoju bakalársku prácu vypracovala samostatne pod odborným vedením prof. Ing. Miloša Bartáka, CSc., s vyuţitím informačných zdrojov, ktoré sú v práci citované. Brno 10. mája meno priezvisko

11 OBSAH 1. ZOZNAM SKRATIEK ÚVOD FOTOINHIBÍCIA Všeobecná charakteristika Fotoinhibícia na úrovni PSII Štruktúra a funkcia PSII Mechanizmus vzniku fotoinhibície PSII Fotoprotektívne mechanizmy Fotoinhibícia vo vzťahu k lišajníkom Charakteristika lišajníkov Radiačný stres počas vysychania Radiačný stres v hydratovanom stave Prehľad fotoinhibičných štúdií u lišajníkov Kumulatívna (dlhodobá) vs. akútna (krátkodobá) fotoinhibícia Metódy skúmania fotoinhibície Kautského pomalá indukčná kinetika MATERIÁL A METÓDY Experimentálny materiál Umbilicaria antarctica Parmotrema sp Charakteristika experimentu Popis rehydratácie stielok Popis fotoinhibičného ovplyvnenia... 33

12 Meranie parametrov fluorescencie chlorofylu Výpočet základných fluorescenčných parametrov VÝSLEDKY Záznamy pomalej Kautského kinetiky Časový priebeh parametrov v priebehu expozície Parameter F 0 (minimálna fluorescencia): Parameter Fv/Fm (kapacita fotochemických procesov vo fotosystéme II): Parameter Φ PSII (efektívny kvantový výťaţok PSII): DISKUSIA ZÁVER ZOZNAM POUŢITEJ LITERATÚRY... 46

13 1. ZOZNAM SKRATIEK A anteraxantín AR aktinické ţiarenie ( actinic radiation ) ATP adenozíntrifosfát CCD nábojovo-viazaná súčiastka ( charge-coupled device ) DAS stav adaptovaný na tmu ( dark-adapted state ) F 0 minimálna fluorescencia v DAS F 0 minimálna fluorescencia v LAS F 0 Minimálna fluorescencia po vypnutí AR Fm maximálna fluorescencia v DAS Fm maximálna fluorescencia v LAS Fm maximálna fluorescencia po vypnutí AR F S rovnováţna fluorescencia ( steady-state fluorescence ) Fv variabilná fluorescencia Fv/Fm základný fluorescenčný pomer (maximálna kapacita fotochémie PSII) Φ PSII efektívny kvantový výťaţok fotochémie PSII GSH glutatión GSSG oxidovaná forma glutatiónu HL vysoká hodnota oţiarenia ( high light ) 1 Chl molekula chlorofylu v singletovom stave 3 Chl molekula chlorofylu v tripletovom stave LAS stav adaptovaný na svetlo ( light-adapted state ) LED luminiscenčná dióda ( light-emitting diode ) LHC svetlozberné komplexy ( light-harvesting complexes ) 13

14 LL nízka hodnota oţiarenia ( low light ) ML stredná hodnota oţiarenia ( medium light ) NADP + oxidovaný nikotínamidadeníndinukleotidfosfát NPQ nefotochemické zhášanie ( non-photochemical quenching ) 1 O 2 singletový kyslík OEC kyslík-vyvíjajúci komplex, miesto fotolýzy vody ( Oxygen-evolving complex ) P680 dimér chlorofylu a v RC PSII * P680 excitovaná molekula P680 P700 dimér chlorofylu a v RC PSI PAR fotosynteticky aktívne ţiarenie ( photosynthetic active radiation ) Pheo feofytín 3 Pheo tripletová molekula feofytínu PSI fotosystém 1 PSII fotosystém 2 P max maximálna rýchlosť fotosyntézy Q A chinón A, primárny akceptor elektrónu v RC PSII Q B mobilný elektrónový prenášač plastochinónového typu qe energeticky závislé nefotochemicé zhášanie fluorescencie chlorofylu qi zhášanie fluorescencie chlorofylu spôsobené fotoinhibíciou RC reakčné centrum ROS reaktívne formy kyslíka ( reactive oxygen species ) SP saturačný pulz V violaxantín Y Z tyrozínový prenášač elektrónov v PSII Z zeaxantín 14

15 1. ÚVOD Svetlo je nenahraditeľným zdrojom energie pre zelené organizmy. Jeho energiu pouţívajú na tvorbu organických látok. Ako pre všetky premenné faktory ovplyvňujúce ţivot organizmov, je určité rozmedzie, v ktorom je svetlo pre rastliny prospešné. Ak sa toto rozmedzie prekročí, začínajú sa prejavovať negatívne prejavy jeho pôsobenia. Z toho dôvodu je pre fotosyntetizujúce organizmy ţivotne dôleţité jednak vyuţiť kaţdý dopadajúci fotón na fotochemické deje, a zároveň všetku nadbytočnú energiu premeniť na neškodnú formu tepelnú emisiu. Počas fotosyntézy vznikajú vysoko reaktívne oxidačné medziprodukty so schopnosťou poškodiť súčasti chloroplastov. So zvyšovaním svetelnej intenzity sa zvyšuje riziko vzniku oxidantov, ktoré, ak nie sú odstránené z bunky a jej kompartmentov, spôsobujú poškodenie súčastí fotosyntetického aparátu a následnú fotoinhibíciu. Kaţdý rastlinný druh má vlastné rozmedzie, v ktorom je schopný znášať a efektívne vyuţívať svetelnú energiu. Závisí to hlavne na podmienkach, v ktorých sa prirodzene vyskytuje. Lišajníky, ako organizmy schopné fotosyntézy, sú odolné voči mnoţstvu stresových faktorov, zahŕňajúcich nízke a vysoké teploty, nedostatok vody, stres zo zasolenia a v neposlednom rade vysokú radiáciu v oblasti PAR, či UV-B. Sú to extrémofilné organizmy vyznačujúce sa symbiotickým spoluţitím huby a fotosyntetizujúceho organizmu, ktorým môţe byť riasa, alebo sinica. Sú uzatvorené v spoločnej štruktúre, ktorú označujeme ako stielka. Tá je však na rozdiel od tela ostatných autotrofných organizmov (vyšších rastlín) relatívne otvoreným systémom, voľne priepustným pre plyny a vodu. Lišajníky nájdeme na najrôznejších prírodných lokalitách a vďaka tomu, ţe nepotrebujú pôdny substrát na príjem ţivín a vody, často rastú v nehostinných podmienkach vysokých pohorí, na skalách, plne exponované vonkajším faktorom, ako je vietor, mráz a silné slnečné ţiarenie. Cieľom bakalárskej práce bolo spracovať literárny prehľad poznatkov z oblasti radiačnej stresovej fyziológie, so zameraním na fotoinhibíciu u lišajníkov, navodenú ţiarením z oblasti spektra, ktorá je fotosynteticky aktívna (PAR). Dôraz bol kladený na dôsledky stresu a reguláciu fotosyntézy pri pôsobení vysokých dávok PAR. Štúdium fotoinhibície je vo väčšine prípadov zaloţené na krátkodobom ovplyvnení, v snahe determinovať mechanizmy prebiehajúce počas, alebo po krátkodobej, akútnej fotoinhibícii. Z dôvodu nedostatku experimentov zaoberajúcich sa 15

16 dlhodobým ovplyvnení v laboratórnych podmienkach, ktoré navodzuje tzv. kumulatívnu fotoinhibíciu, bol k bakalárskej práci zvolený experiment, ktorý by pomohol vyplniť chýbajúce znalosti. Na experiment boli vybrané dva druhy lupeňovitých lišajníkov z rozdielnych ekologických stanovíšť. Sú to Umbilicaria antarctica, druh lišajníka z prímorskej časti Antarktídy a argentínsky druh Parmotrema sp.. Kumulatívna fotoinhibícia bola u nich navodená kontinuálnym ţiarením z oblasti PAR nízkej a vysokej intenzity, pričom sa v priebehu expozície merala fluorescencia chlorofylu. Cieľom experimentálnej práce teda bolo sledovať vplyv rôznych intenzít viditeľného svetla na indukciu fotoinhibície a zároveň určiť predpokladané medzidruhové rozdiely dvoch ekologicky vzdialených druhov lišajníkov. 16

17 2. FOTOINHIBÍCIA 2.1. Všeobecná charakteristika V roku 1956 vyšla prvá práca zaoberajúca sa fotoinhibíciou. Jej autorom je Bessel Kok, ktorý si v predošlých experimentoch všimol, ţe silné intenzity svetla spôsobujú spomalenie rastu a fotosyntézy zelených rias. V tejto práci autor definuje fotoinhibíciu ako oslabujúci efekt svetla vysokej intenzity na fotosyntetické schopnosti zelených organizmov (Kok 1956). Fotoinhibícia je dnes definovaná ako svetlom indukovaný pokles rýchlosti čistej fotosyntézy. Na úrovni primárnych fotochemických procesov fotosyntézy je chápaná ako viditeľným svetlom indukovaný pokles kvantového výťaţku fotosyntézy a fotochemických procesov fotosystému II (PSII; Ogren a Evans 1992). Je výsledkom nadmernej excitácie fotosyntetického aparátu, ku ktorej dochádza, ak mnoţstvo fotónov dopadajúce na fotosyntetické pigmenty presahuje kapacitu fotochemických a nefotochemických procesov PSII a prenášačov absorbovanej energie v chloroplastovom aparáte. V konečnom dôsledku sa prejaví zníţením maximálneho kvantového výťaţku (Powles, 1984) primárnych fotochemických procesov aj sekundárnych procesov fixácie CO 2. Ďalšími prejavmi sú celkové sploštenie svetelnej krivky fotosyntézy (Leverenz et al., 1990) a v prípade dlhšej expozície inhibičnému ţiareniu, pokles maximálnej rýchlosti fotosyntézy (Pmax). (obrázok 1) K poklesu Pmax dochádza aţ v momente, kedy je fotosyntéza inhibovaná nedostatočnou kapacitou reakčných centier (RC) PSII pre prenos excitačnej energie na všetkých úrovniach intenzity oţiarenia (Leverenz et al., 1990). Nadbytok ţiarenia spôsobuje akumuláciu excitačnej energie vo svetlozberných komplexoch (LHC) fotosystémov, prostredníctvom ktorej sa môţu tvoriť tripletové molekuly chlorofylu ( 3 Chl). Interakciou 3 Chl s molekulou kyslíka za nadmerného osvetlenia vzniká vysoko reaktívny singletový kyslík ( 1 O 2 )Foyer et al., 1994) a ďalšie reaktívne formy kyslíku (ROS). Nadbytok energie absorbovanej chlorofylmi zároveň prispieva k priamej redukcii O2 fotosystémom I (PSI) a následnej tvorbe jeho reaktívnych foriem (Mehler, 1951). K tvorbe prispievajú aj iné formy stresu, ako je sucho, vysoká salinita, nedostatok ţivín, teplotné extrémy, pôsobenie UV a ťaţkých kovov (Gill a Tuteja, 2010). Väčšina ROS sa pôsobením stresoru tvorí v miestach fotosyntetického elektrónového transportu (Elstner a Osswald, 1994). Preto je dôleţitá jeho regulácia za účelom vyváţenia absorpcie a spracovania svetelnej energie, spojeným s minimalizáciou moţných negatívnych dôsledkov. 17

18 Obrázok 1: Svetelná krivka fotosyntézy. α maximálny kvantový výťaţok PSII; Es saturačné oţiarenie, pri ktorom je dosiahnutá maximálna rýchlosť fotosyntézy (Pmax) a s narastajúcou intenzitou svetla nestúpa; β fotoinhibícia, spôsobená presiahnutím kapacity nefotochemických mechanizmov zhášania energie; Ø konvexnosť krivky (prevzaté a upravené z Consalvey, 2005) Fotoinhibícia na úrovni PSII Štruktúra a funkcia PSII Fotosystém II je membránový pigment-proteínový komplex, umiestnený v membráne thylakoidov fotosyntetizujúcich organizmov, ktoré získavajú elektróny na redukciu z vody. Je zodpovedný za iniciáciu primárnych fotosyntetických procesov absorpciou svetelného kvanta a vyuţitím jeho energie k redukcii kľúčového koenzýmu NADP + za súčasnej tvorby ATP. V tomto procese sa zároveň oxidujú molekuly vody za vzniku molekulového kyslíka. Z hľadiska štúdia fotoinhibície je dôleţité poznať jeho štruktúru a funkciu, pretoţe je hlavným cieľom pôsobenia radiačného stresu (Kyle, 1987). PSII je tvorený aspoň 30 proteínmi, kódovanými v jadrovom a v chloroplastovom genóme (Barber, 1998). Na tieto proteíny sa viaţu chlorofyly a, b a karotenoidy. Spolu vytvárajú 18

19 svetlozberné komplexy a pigment-proteínové komplexy jadra PSII (LHC II, CP43 a CP47), ktoré absorbujú fotóny a induktívnou rezonanciou prenášajú ich energiu do reakčného centra. Reakčné centrum je tvorené heterodimérom proteínov D1 a D2, ktoré na seba viaţu molekuly elektrónových prenášačov a molekuly chlorofylu a. (obrázok 2) Obrázok 2: Štruktúra fotosystému II (prevzaté z Yamamoto, 2001) V RC PSII sa absorbovaná energia vyuţíva najprv na separáciu náboja medzi chlorofylovým dimérom P680 a feofytinom za vzniku radikálového páru P680 + /Pheo -. Elektrón je odoberaný chinónom Q A a ďalej je predávaný na plastochinón Q B, ktorý sa po prijatí dvoch elektrónov odpojuje z RC PSII a v hydrofóbnej časti membrány vstupuje do plastochinónového cyklu za súčasnej protonizácie lumen thylakoidov. V medzičase sa molekula P680 + spätne redukuje elektrónom z OEC (oxygen evolving centre) za pomoci tyrozínového prenášača a mangánových iónov. Jeden z elektrónov na Q B je prenesený na cytochrómový komplex a z neho je mobilným plastocyanínom dopravený k PSI k redukcii molekuly P Z PSI je elektrón pomocou ferredoxínu pouţitý ku konečnej redukcii NADP +. Tento proces sa nazýva lineárny elektrónový transport a je jednou z dvoch ciest prenosu elektrónov vo fotochemických dejoch. Druhá transportná dráha je cyklická, pričom elektrón z ferredoxinu putuje do plastochinónového cyklu bez redukcie NADP +, ale prispieva k zvýšenej tvorbe ATP protonizáciou lumen thylakoidov. (Obrázok 3) 19

20 Obrázok 3.: Schematický nákres procesov prenosu elektrónov v PSII, poloha jednotlivých prenášačov ukazuje energiu potrebnú k ich redukcii v relatívnom zmysle (prevzaté a upravené z Diner a Babcock, 1996) Mechanizmus vzniku fotoinhibície PSII V priebehu záchytu energie a prenosu elektrónov vo fotosystémoch sa tvoria molekuly so silnými oxidačnými vlastnosťami, ktoré môţu viesť k poškodeniu súčastí chloroplastov. Vo svetlozberných komplexoch po absorpcii energie prechádzajú molekuly chlorofylu do excitovaného singletového stavu ( 1 Chl). Pred tým, neţ sa energia dostane do reakčného centra, je pravdepodobný prechod 1 Chl do tripletového stavu, v ktorom je schopný reagovať s O 2 za vzniku 1 O 2. Miera tvorby 3 Chl závisí na priemernej ţivotnosti 1 Chl v anténach fotosystémov. Pretoţe ţivotnosť 1 Chl je dlhšia vo fotosystéme 2, v ňom je aj vyššie riziko vzniku ROS a poškodenia jeho súčastí (Foyer a Harbinson, 1994). V RC PSII dochádza k fotoinhibícii fotodeštrukciou dvoma spôsobmi, pričom v obidvoch prípadoch je zahrnutá oxidačná schopnosť molekuly P680. Po absorpcii energie prechádza chlorofyl P680 do excitovaného stavu ( * P680), v ktorom sa radí k najsilnejším oxidantom tvoreným v biologických systémoch, s redukčným potenciálom +1.1V dostačujúcim k oxidácii vody na O 2 (Aro et al., 1993). 20

21 Jedným spôsobom vzniku fotoinhibície je inhibícia elektrónového transportu na akceptorovej strane PSII (Q A, Q B ). Je spôsobená nadmernou redukciou plastochinónových prenášačov a neschopnosťou Q A prijímať elektróny z P680 v dôsledku nadmernej redukcie plastochinónových prenášačov (Vass et al., 1992). V tomto prípade sa zvyšuje ţivotnosť radikálového páru P680 + /Pheo - a vzniká riziko rekombinácie náboja za vzniku 3 Pheo. Ďalšou rekombináciou náboja 3 Pheo s tripletovou molekulou kyslíka ( 3 O 2 ) vzniká 1 O 2. Ďalšou moţnosťou inhibície z akceptorovej strany je prechod excitovaného chlorofylu P680* do tripletového stavu, ktorý je výrazne stálejší, neţ jeho singletová forma a tým sa zvyšuje pravdepodobnosť jeho reakcie s O 2 vznikajúcim v OEC (Ledford et Niyogi, 2005). K fotoinhibícii na úrovni RC PSII môţe dôjsť aj z donorovej strany (v lumenálnej oblasti D1 proteínu). V tomto prípade je spôsobená nedostatkom redukujúcich elementov. Pri fotolýze vody sa uvoľňujú 4 elektróny, ktoré sú postupne predávané na oxidovaný chlorofyl P V tomto procese je zahrnutá aj oxidovaná forma tyrozínového prenášača Y + Z. V prípade, ţe je inhibovaná fotolýza vody, nie je dostatok elektrónov na redukciu oxidovaných P680 + a Y + Z, ktoré ako silné oxidačné činidlá majú potenciál poškodiť súčasti fotosystému (hlavne proteín D1, na ktorý sú viazané). Prísun elektrónov z OEC je inhibovaný protonizáciou lumenálneho priestoru thylakoidov pod vplyvom nadmerného oţiarenia (Niyogi, 1999) Fotoprotektívne mechanizmy Na úrovni chloroplastov sa proti nadbytku svetla fotobionti chránia celou radou mechanizmov zahŕňajúcich štruktúrne zmeny proteín-pigmentových komplexov, aktiváciu enzýmov k tvorbe špecifických antioxidantov a molekúl pomáhajúcich v spracovaní excitačnej energie. (obrázok 4) Štruktúrne zmeny zahŕňajú fosforyláciu LHC a jej odpojenie od PSII, čím sa zabráni prenosu energie do centra. Alternatívna dráha prenosu elektrónov cyklický elektrónový transport je spojený s acidifikáciou lumen thylakoidov. Zvýšená acidita je podnetom k aktivácii enzýmu violaxantín deepoxidázy, ktorá aktivuje xantofylový cyklus. V ňom sa konvertuje violaxantín (V) cez anteraxantín (A) na zeaxantín (Z), ktorý je schopný energiu absorbovanú chlorofylmi prijať a premeniť na teplo, čím zabráni poškodeniu reakčného centra PSII (Demmig- Adams, 1990). Taktieţ bolo zistené, ţe zeaxantín je schopný priamo zhášať energiu excitovaných chlorofylov (Havaux a Niyogi, 1999). V zneškodňovaní tvoriacich sa ROS hrá 21

22 dôleţitú rolu antioxidant glutatión (GSH), zapájajúci sa do boja proti rôznym druhom stresu. Je schopný oxidácie na GSSG, čím zabráni oxidácii proteínov a lipidov v blízkosti PS. Napriek týmto mechanizmom dochádza k priamemu poškodeniu súčastí fotosyntetického aparátu (zvlášť proteínu D1 v RC PSII) a je nutná ich oprava. Obrázok 4: Schematický diagram fotoprotektívnych mechanizmov vyskytujúcich sa v chloroplastoch (prevzaté a upravené z Niyogi, 1999) Hlavným cieľom fotooxidácie je proteín D1 v RC PSII (Osmond et al., 1993). Poškodený fotosystém 2 sa odpája od svetlozberných komplexov a vo voľných častiach thylakoidných membrán dochádza k jeho oprave, ktorá zahŕňa degradáciu poškodeného D1 proteínu, resyntézu nového a jeho pripojenie spojené s obnovou funkčnosti PSII. Funkčný fotosystém 2 sa vracia do 22

23 stlačenej oblasti membrán, tj. miesta thylakoidov bez prístupu k vnútornému prostrediu (stroma) chloroplastov. Cyklus inaktivácie, poškodenia a opravy PSII je zobrazený v obrázku 5. Obrázok 5.: Zjednodušený cyklus inaktivácie a opravy fotosystému II. Funkčný fotosystém (PSII F ) sa vplyvom nadmerného ţiarenia inaktivuje (PSII I ), ak dôjde k jeho poškodeniu, v nefunkčnom stave (PSII NF ) sa presúva do voľných častí membrán thylakoidov, kde dôjde k odpojeniu proteínu D1 (PSII -D1 ) a k nahradeniu novým proteínom. Opravený fotosystém putuje späť do stlačenej časti thylakoidov (grana), kde znovu nadobúda fotochemickú kompetenciu. Čiernymi čiarami sú znázornené inhibičné vplyvy na jednotlivé procesy. (prevzaté a upravené z Long et al., 1994) 2.3. Fotoinhibícia vo vzťahu k lišajníkom Charakteristika lišajníkov Lišajníky sú extrémofilné organizmy vyskytujúce sa na najrôznejších miestach planéty. Sú výnimočné skutočnosťou, ţe ide o pevne asociovaný mutualistický vzťah dvoch organizmov. Jednou stavebnou zloţkou lišajníka je huba, prevaţne z oddelenia Ascomycota, tzv. mykobiont. Druhou zloţkou je zelený organizmus schopný fotosyntézy, ktorý je označovaný ako fotobiont. Fotobiontom môţe byť riasa, sinica, alebo môţu byt asociované s lišajníkom súčasne. V prípade, 23

24 ţe stielku tvoria tri zloţky, označujeme ju ako tripartitnú (v prípade jedného fotobionta ide o stielku bipartitnú). Vzájomná symbióza im umoţňuje osídľovať extrémne stanovištia. Je to dané ich fyziológiou a anatomickou stavbou tela. Štruktúra stielky nemá súvislé ohraničenie od vonkajšieho prostredia a tvorí tak otvorený systém pre príjem a výdaj vody a plynov. Pórovitý charakter stielky umoţňuje rýchle vysychanie, pri ktorom za zastavujú metabolické funkcie. Poikilohydrizmus, teda tolerancia úplného vyschnutia, je známy u väčšiny lišajníkových druhov. Vo vyschnutom stave a bez prísunu ţivín sú schopné preţiť dlhé obdobia (Hauck et al., 2009). Lišajníky sú schopné rýchlej rehydratácie a takmer okamţitého obnovenia všetkých metabolických funkcií (Aubert et al., 2007). K rehydratácii dochádza buď priamo zráţkami, ale stielky sú schopné nasať vodu aj z vzdušnej vlhkosti (Kalina a Váňa, 2005), v polárnych oblastiach môţe byť rehydratácia sprostredkovaná sublimáciou okolitého snehu, a to aj za teploty pod bodom mrazu (Gloser, 2013) Radiačný stres počas vysychania Vysychanie je často spojené okrem pôsobenia vetru s absorpciou ţiarenia. U lišajníkov rastúcich na skalách, kde sú často vystavené silným intenzitám svetla, to môţe byť prospešné. Počas vysychania sa zastavujú fotosyntetické deje a zniţuje sa fluorescencia chlorofylu, ktorá indikuje aktiváciu fotoprotektívnych mechanizmov. Tie sú v súvislosti s vysychaním spájané s konformačnými zmenami vo svetlozberných systémoch, ktoré svojím odpojením a agregáciou zabránia prenosu nadbytku energie do reakčných centier fotosystémov, čím ich ochránia pred inaktiváciou a fotodeštrukciou (Bilger, 1989). K ochrane proti radiačnému stresu v súvislosti s vysychaním môţe prispievať aj mykobiont, a to zníţenou priepustnosťou svetla cez vrchnú kôrovú vrstvu vyschnutej stielky, ktorú v roku 1994 dokázali autori Büdel a Lange u lišajníka rodu Peltula (Büdel a Lange, 1994). Fotoprotekcia môţe byť zaloţená aj na zmenách morfológie a na dehydratáciou indukovaným pohybom lupeňovitých stielok vplyvom postupujúceho výparu vody (Barták et al., 2006). 24

25 Radiačný stres v hydratovanom stave Lišajníky však čelia radiačným vplyvom aj v plne hydratovanom stave. V takých podmienkach majú aktívny metabolizmus, čo znamená vyššiu citlivosť na negatívne vplyvy nadmerného oţiarenia, ale zároveň moţnosť aktívnej ochrany. Tá môţe byť zabezpečená fotobiontom, ale aj spoluprácou obidvoch symbiontov. Fotobionti sa pred nadbytkom ţiarenia chránia vyššie spomínanými štruktúrnymi zmenami v LHC PSII. Okrem toho majú moţnosť aktívnej svetlom-indukovanej ochrany tvorbou nefotosyntetických pigmentov. Jedným z nich je karotenoid zeaxantín, ktorého zvýšený obsah v závislosti na radiačných podmienkach pozorovala autorka Barbara Demmig-Adamsová v roku 1987 na intaktných listoch vyšších rastlín (Demmig et al., 1987). V roku 1990 spolu s W.W. Adamsom publikovala prácu, v ktorej potvrdila schopnosť zeaxantínu premieňať excitačnú energiu na teplo sledovaním energeticky závislého nefotochemického zhášania fluorescencie chlorofylu (q E ; Demmig-Adams a Adams, 1990). V tom istom roku spolu s kolektívom autorka publikovala prácu, v ktorej sa zamerala na fotoinhibičný vplyv krátkodobého pôsobenia nadmerného oţiarenia na rôzne druhy lišajníkov s riasovým alebo sinicovým fotobiontom. Prejavy fotoinhibície boli zaznamenávané gazometricky ako pokles rýchlosti fixácie CO 2, v kombinácii s nedeštruktívnou metódou merania fluorescencie chlorofylu. Vo všetkých prípadoch pozorovala zníţenie rýchlosti fotosyntézy a efektivity fotochemických procesov PSII vyjadrenej ako pomer variabilnej a maximálnej fluorescencie (Fv/Fm). Lišajníky, ktoré boli vystavené strednej intenzite (ML, medium light ; µmol.m -2.s -1 ) svetla sa zotavovali rýchlejšie, neţ lišajníky vystavené vyššej intenzite (HL, high light ; 1800 µmol.m -2.s -1 ). Zotavovanie z expozície prebiehalo v hydratovanom stave pri oţiarení intenzitou µmol.m -2.s -1. Lišajníky adaptované na tieň vykazovali najpomalšiu fázu zotavovania po radiačnom ovplyvnení. Takisto lišajníky, ktoré majú ako fotobionta sinicu, prejavovali pomalšie zotavenie neţ lišajníky sinicové. Vyššia citlivosť k fotoinhibícii u sinicových lišajníkov je dôsledkom prirodzenej absencie xantofylového cyklu v chloroplastoch sinicových fotobiontov, ktoré nie sú schopné zotaviť sa ani po niekoľkých dňoch po expozícii. Autorka takisto potvrdila fotoprotektívny efekt vysychania stielok vplyvom odpájania svetlozberných komplexov z fotosystémov (Demmig-Adams et al., 1990). 25

26 Prehľad fotoinhibičných štúdií u lišajníkov Na niekoľkých pracoviskách vo svete prebieha výskum fotoinhibície u lišajníkov v laboratórnych podmienkach, ktoré umoţňujú presnú reguláciu abiotických faktorov. Týmto spôsobom je moţné determinovať fyziologické procesy prebiehajúce počas stresu z radiácie v definovaných podmienkach teploty a vlhkosti vzduchu. Z hľadiska snahy poznať presné procesy indukované stresovým faktorom je to výhodné oproti terénnym výskumom, kde nie sme schopní presne určiť pôsobenie vonkajších faktorov a tak sú výsledky len ťaţko interpretovateľné. Radiačný stres sa v laboratóriu často kombinuje s inými faktormi, ako sú toxicky pôsobiace chemické látky, sucho, vplyv vysokej alebo nízkej teploty a podobne. Od roku 2000 sa výskumná skupina v laboratóriu fotosyntetických procesov (Oddelenie fyziológie a anatómie rastlín, MU Brno) venuje fotoinhibícii u antarktických lišajníkov vďaka existencii výskumnej stanice Masarykovej univerzity (Mendel) na ostrove Jamesa Rossa. Lišajníky, ako organizmy zvládajúce podmienky hraničiace s moţnosťou existencie, sú v danej oblasti hojne zastúpené. V roku 2003, Barták a kolektív, chceli dokázať hypotézu, ţe je moţné navodiť fotoinhibíciu u riasových lišajníkov (Umbilicaria decussata, Usnea antarctica) v laboratórnych podmienkach simulujúcich prostredie prímorskej Antarktídy v jarnom období, tj. nízke teploty, stielky sú v hydratovanom stave vďaka zráţkam a topiacemu sa snehu a sú vystavené silnému slnečnému ţiareniu. Hypotézu potvrdili aplikáciou krátkodobého pôsobenia (30 minút) ţiarenia vysokej intenzity (HL, high light ) na hydratované stielky lišajníkov, zároveň však dokázali dostatočnú kapacitu fotoprotektívnych mechanizmov zaloţených na tvorbe zeaxantínu (Z) a glutatiónu (GSH) počas fáze zotavovania v tme. Dokázali medzidruhové rozdiely, a síce, ţe lupeňovitý morfotyp stielky sa prejavuje väčšou citlivosťou k radiačnému stresu (Barták et al., 2003). V roku 2004 sledovali priestorovú distribúciu fluorescencie chlorofylu a fotosyntetických procesov v stielke lišajníka Umbilicaria antarctica (Barták et al., 2004). Autori zistili, ţe heterogenita je spôsobená rozdielmi v anatómii, spôsobe rastu stielky a ontogenetickým štádiom fotobionta. Okrajové časti stielky preukazujú niţšiu fyziologickú aktivitu a vyššiu citlivosť na radiačný stres navodený krátkym ţiarením vysokej intenzity (1500 µmol.m -2.s -1 ). Úplné zotavenie po expozícii v tme ale naznačuje dostatočné fotoprotektívne mechanizmy na prekonanie dôsledkov fotoinhibície v hydratovanom stave. Ide o mechanizmy nefotochemického zhášania energie, do ktorých sa aktívne zapájajú molekuly Z a GSH (Barták et al., 2004). Obsah 26

27 celkového GSH sa však po expozícii zníţil, čo je opačný trend, neţ ukazujú výsledky prác zameriavajúcich sa na fyziologické procesy u lišajníkov počas vysychania (Kranner, 2002). Ďalší výskum bol zameraný na medzidruhové rozdiely v citlivosti na krátkodobé pôsobenie HL u antarktického druhu Umbilicaria antarctica a stredoeurópskeho druhu Lasallia pustulata. Autori v publikácii uvádzajú výsledky, ktoré dokazujú vyššiu citlivosť antarktického lupeňovitého druhu na pôsobenie HL voči druhu stredoeurópskemu. Je to z dôvodu prirodzenej adaptácie L. pustulata k vyšším svetelným podmienkam vyššou kapacitou konštitutívnej ochrany (obsah GSH). Konverzia V na Z sa zdá byť primárnym fotoochranným mechanizmom zapájajúcim sa v odpovedi na krátkodobé pôsobenie vysokej intenzity svetla (Vrábliková et al., 2005). Nasledujúce experimenty kombinovali krátkodobú expozíciu s dlhodobou. V roku 2008 Barták a kolektív zaloţili experiment, v ktorom sledovali vplyv 4 rôznych radiačných reţimov na primárne procesy fotosyntézy a aktiváciu fotoprotektívnych mechanizmov xantofylového cyklu u lišajníka Lasallia pustulata. Krátkodobý prístup zahrňoval 30 minútovú expozíciu vysokému oţiareniu (1800 µmol.m -2.s -1 ), dlhodobá expozícia trvala 5 dní pri oţiarení 600 µmol.m -2.s -1 (ML). Ďalšie expozície boli zamerané na repetitívnu expozíciu stielky kaţdých 24 hodín po dobu 30 minút intenzite 1500 µmol.m -2.s -1, pričom stielky boli v medzičase (5 dní) buď v tme, alebo pri strednej intenzite osvetlenia (600 µmol.m -2.s -1 ). Stielky boli po celý čas v plne hydratovanom stave. Výsledky ukázali, ţe pokles maximálneho kvantového výťaţku PSII (Fv/Fm) je závislý na intenzite svetla a pri dlhodobej expozícii prejavuje kumulatívny charakter. Z toho autori usudzujú, ţe dĺţka expozície má na primárnu fotochémiu fotosyntézy väčší vplyv neţ intenzita oţiarenia a frekvencia expozície. Zároveň potvrdili, ţe aktivácia nefotochemických ochranných mechanizmov s rýchlou odozvou (ako je konverzia violaxantínu na zeaxantín) je zastúpená v odpovedi hlavne na krátkodobé ovplyvnenia vysokými intenzitami svetla (Barták et al., 2008) Kumulatívna (dlhodobá) vs. akútna (krátkodobá) fotoinhibícia Všetky doteraz zmienené experimenty sledovali predovšetkým odozvu na krátkodobé pôsobenie HI. Ide o tzv. akútnu fotoinhibíciu, navodenú vysokou intenzitou svetla (nad 1000 µmol.m -2.s -1 ), presahujúcou beţné radiačné podmienky (ak si odmyslíme slnečné svetlo dopadajúce na exponované stielky počas bezoblačných letných dní), pôsobiacou 30 aţ 60 minút. 27

28 Fluorescencia sa sleduje bezprostredne po expozícii. Lišajníky sa následne nechajú zotavovať v podmienkach úplnej tmy, alebo mierneho osvetlenia, aby sa zistila schopnosť návratu fotosyntetickej aktivity k pôvodným hodnotám pred navodením fotoinhibície. V ďalších štúdiách sa však začali sledovať účinky dlhodobého pôsobenia PAR. V takom prípade hovoríme o tzv. kumulatívnej fotoinhibícii. Je to navodenie radiačného stresu niekoľkohodinovým aţ niekoľkodenným pôsobením svetla. Intenzita sa však volí o niečo niţšia (do 1000 µmol.m -2.s -1 ) a sleduje sa vplyv rôznych intenzít na fotochemické procesy fotosyntézy v priebehu expozície. K takým štúdiám patrí práca z roku 2008, kedy Barták a kolektív kombinovali krátkodobú expozíciu s dlhodobou. Sledovali vplyv 4 rôznych radiačných reţimov na primárne procesy fotosyntézy a aktiváciu fotoprotektívnych mechanizmov xantofylového cyklu u lišajníka Lasallia pustulata. Krátkodobý prístup zahrňoval 30 minútovú expozíciu vysokému oţiareniu (1800 µmol.m -2.s -1 ), dlhodobá expozícia trvala 5 dní pri oţiarení 600 µmol.m -2.s -1 (ML). Ďalšie expozície boli zamerané na repetitívnu expozíciu stielky kaţdých 24 hodín po dobu 30 minút intenzite 1500 µmol.m -2.s -1, pričom stielky boli v medzičase (5 dní) buď v tme, alebo pri strednej intenzite osvetlenia (600 µmol.m -2.s -1 ). Stielky boli po celý čas v plne hydratovanom stave. Výsledky ukázali, ţe pokles maximálneho kvantového výťaţku PSII (Fv/Fm) je závislý na intenzite svetla a pri dlhodobej expozícii prejavuje kumulatívny charakter. Z toho autori usudzujú, ţe dĺţka expozície má na primárnu fotochémiu fotosyntézy väčší vplyv neţ intenzita oţiarenia a frekvencia expozície. Zároveň potvrdili, ţe aktivácia nefotochemických ochranných mechanizmov s rýchlou odozvou (ako je konverzia violaxantínu na zeaxantín) je zastúpená v odpovedi hlavne na krátkodobé ovplyvnenia vysokými intenzitami svetla (Barták et al., 2008). Ďalšie práce na tému kumulatívnej fotoinhibície sú z roku 2012 a 2014 (Barták et al., 2012; Očenášová et al., 2014). V roku 2012 bola zisťovaná odpoveď antarktického kríčkovitého lišajníka Usnea antarctica na krátkodobú a dlhodobú expozíciu rôznym dávkam PAR. V krátkodobom prístupe išlo o intenzity 1000 a 2000 µmol.m -2.s -1 po dobu 30 a 60 minút, dlhodobá expozícia trvala 6 hodín pri oţiarení s intenzitou 300, 600 a 1000 µmol.m -2.s -1. Krátkodobá expozícia viedla k poklesu skúmaných fluorescenčných parametrov (Fv/Fm, ΦPSII). Pokles bol očakávane významnejší u varianty ovplyvnenej silnejšou intenzitou, ale stielky ovplyvnené dlhší čas (60 minút) preukázali niţšiu mieru fotoinhibície, neţ stielky po 30 minútovej expozícii. Zotavovanie z ovplyvnenia bolo závislé na intenzite a dĺţke expozície. 28

29 Úplné zotavenie dosiahli stielky po hodinovej expozícii, zatiaľ čo stielky exponované pol hodinu sa zotavili iba čiastočne. Dlhodobá expozícia odhalila kumulatívny charakter fotoinhibičných účinkov svetla. Najvýraznejší a najrýchlejší pokles Fv/Fm bol u varianty 1000 µmol.m -2.s -1. Vo všetkých ovplyvneniach bol pozorovaný bifázický pokles hodnôt Fv/Fm s rýchlou a pomalou fázou, Φ PSII však javil rovnomerný pokles bez viditeľnej rýchlej fázy. Celkový pokles parametrov bol závislý na intenzite svetla (Barták et al., 2012).Práca z roku 2014 zahŕňala iba dlhodobý prístup a skúmala sa aktivácia nefotochemického zhášania excitačnej energie, navodená intenzitami 300, 600 a 1000 µ mol.m -2.s Metódy skúmania fotoinhibície Kautského pomalá indukčná kinetika Ide o metódu, ktorá zaznamenáva kinetiku fotosyntetických procesov na úrovni fotosystémov počas prechodu fotosyntetizujúceho organizmu zo stavu adaptovaného na tmu (DAS, dark-adapted state ) do stavu adaptovaného na svetlo (LAS, light-adapted state) a následnú spätnú relaxáciu do DAS. Nutnosť adaptácie na tmu (10-20 minút) je z dôvodu potreby správneho určenia základných fluorescenčných parametrov F 0 a Fm. V DAS sú všetky akceptory elektrónov v PSII plne oxidované a pripravené na prenos elektrónov. Minimálna fluorescencia je zistená po aplikácii slabého pulzu ţiarenia (spravidla <0,1 µmol.m -2.s -1 ). Pri aplikácii tak nízkej intenzity nedochádza k prenosu ţiadneho elektrónu z fotosystému II do nadväzujúcich elektrónových prenášačov, a preto je všetka energia vyuţitá k emisii fluorescenčného ţiarenia molekulami chlorofylu a. Po zistení F 0 nasleduje krátky (ca. 1 s) saturačný pulz (SP) svetla (intenzita aţ do 10 mmol.m -2.s -1 ), ktorý spôsobí úplnú redukciu chinónu Q A a tým dočasne zastaví transport elektrónov vo fotosystéme II, čím fluorescencia chlorofylu dosiahne maximum (Fm). Pulz musí byť dostatočne krátky, aby nedošlo k aktivácii mechanizmov nefotochemického zhášania excitačnej energie (NPQ). Po klesnutí fluorescencie na minimum sa stielky vystavia aktinickému ţiareniu (AR, actinic radiation ), počas ktorého stielka postupne prechádza do LAS. Počas tejto fázy sa vyvaţujú procesy elektrónového transportu a s nimi späté biochemické reakcie. Zároveň dochádza k aktivácii rôznych regulačných, adaptačných a ochranných mechanizmov, ktoré sa prejavia na intenzite fluorescenčného signálu v čase. Po nejakom čase dôjde k rovnováhe 29

30 a fluorescencia chlorofylu sa ďalej nemení (F S ).Po aplikácii ďalšieho saturačného pulzu vieme zistiť hodnotu Fm, ktorá zodpovedá maximálnej fluorescencii chlorofylu v LAS. Po vypnutí AR a aplikácii krátkeho (2 3 s) pulzu slabého ţiarenia z červenej oblasti spektra (far-red), ktorá urýchľuje reoxidáciu elektrónových akceptorov, sa zaznamená minimálna fluorescencie F 0 v LAS a stielky sa začínajú adaptovať na tmu. Adaptácia s LAS do DAS je charakterizovaná zmenami v hodnotách maximálnej a minimálnej fluorescencie po vypnutí AR označovanými ako Fm a F 0 (Roháček et al., 2008). (Obrázok 6) Obrázok 6: Príklad záznamu Kautského krivky fluorescencie chlorofylu s dvoma saturačnými pulzami (prevzaté a upravené z Pláteníková, 2013) 3. MATERIÁL A METÓDY 3.1. Experimentálny materiál Na experiment boli vybrané dva lišajníky: antarktický druh Umbilicaria antarctica a argentínsky druh Parmotrema sp.. Obidva lišajníky majú rovnaký morfologický typ stielky, a to lupeňovitý. Ide o heteromérickú stielku, čo znamená, ţe z anatomického hľadiska vieme v rámci stielky rozlíšiť štruktúrne a funkčne odlišné oblasti. Na priereze stielky (obrázok 7) je rozlíšiteľná horná kôrová vrstva tvorená pevne prepletenými hýfami mykobionta (huba z 30

31 odd. Ascomycota). Fotobiont je lokalizovaný pod hornou kôrovou vrstvou a v oboch prípadoch ide o riasu rodu Trebouxia v rôznych ontogenetických štádiách, kde tvorí takmer súvislú vrstvu. V niektorých miestach môţe úplne chýbať, naopak niekde tvorí vrstvu hrubú aţ 200 µm (e.g. Barták et al., 2004). Pod vrstvou fotobionta sa nachádza dreň tvorená voľne prepletenými hýfami mykobionta a spodnú časť stielky tvorí dolná kôrová vrstva. K substrátu sa lišajníky prichytávajú špeciálnymi útvarmi, ako sú rhiziny, cilie, tomentum alebo umbilicus (Barták, 2014) Obrázok 7: Priečny rez stielkou lišajníka Umbilicaria antarctica. Na reze vidno z hora: vrchnú kôrovú vrstvu, vrstvu fotobionta, dreň a spodnú kôrovú vrstvu. (a) Okrajová časť stielky s niţším obsahom fotobionta, lokalizovaným bliţšie k povrchu. (b) Stredná časť stielky s hustou populáciou fotobionta a hrubšou hornou kôrovou vrstvou. Z rezov je zjavná heterogenita rozmiestnenia fotobionta (prevzaté z Barták et al., 2004) Napriek ich rozdielnemu ekofyziologickému pozadiu, oba druhy sú v priebehu roku aspoň časť vegetačného obdobia vystavované intenzitám ţiarenia, ktoré môţeme označiť za fotoinhibičné, tj. prekračujúce kapacitu svetlozberných systémov. Cieľom experimentu bolo porovnať medzidruhové rozdiely v senzitivite na pôsobenie ţiarenia rôznej intenzity Umbilicaria antarctica U. antarctica pochádza z prímorskej časti Antarktídy, z ostrova Galindez neďaleko ukrajinskej stanice Vernadsky ( S, W). Stielky boli zbierané v okolí skalnatého vrcholu Woozle Hill (53 m n.m.) v období antarktického leta. Bezprostredne po zbere 31

32 boli stielky lišajníka vysušené v prirodzených podmienkach vonkajšieho prostredia. Stielky boli v suchom stave prenesené o laboratória v Brne, kde boli skladované pri 5 C pod osvetlením 10 µmol.m -2.s Parmotrema sp. Parmotrema pochádza z Argentíny, z provincie Córdoba. V zimnom období sa teploty pod bodom mrazu nevyskytujú, s výnimkou prípadov, kedy sa na územie dostane masa studeného vzduchu pochádzajúceho z Antarktídy. Celkovo je oblasť značne klimaticky variabilná, zvlášť v jarnom období. Náš experimentálny druh bol odobraný z podhorskej lokality masívu Los Gigantes charakteristickej nadmorskou výškou 820 m a riedkym porastom pabukov (Nothofagus sp.) v novembri roku Stielky boli odoberané z vetvičiek pabukov, na ktorých tvorili bohaté nárasty. V tej dobe bola v Argentíne skorá jar, stromy boli neolistené a tak boli lišajníky vystavené zvýšeným hodnotám dopadajúceho ţiarenia. Po odbere boli stielky vysušené pri laboratórnej teplote a v suchom stave prepravené do Brna, kde boli aţ do experimentu skladované v tme pri teplote 5 C Obrázok 8: Stielky lišajníka (A)Umbilicaria antarctica, (B) Parmotrema sp.(foto Gašparová) 32

33 3.2. Charakteristika experimentu Popis rehydratácie stielok Po dobu hodín pred experimentom boli stielky lišajníkov namočené v deionizovanej vode, aby sa zabezpečila plná hydratácia a obnovenie funkčnosti fotosyntetického aparátu symbiotických vnútrostielkových rias rodu Trebouxia. Tri aţ päť náhodne vybraných vitálnych stielok U. antarctica pre kaţdú variantu ovplyvnenia boli prenesené na Petriho misku. Vzhľadom na teplotné pomery prirodzeného stanovištia boli misky vyplnené ľadom, ktorý sa v priebehu expozície dopĺňal. Stielky tak boli udrţiavané pri nulovej teplote počas celého merania. Teplotné optimum pre primárne procesy fotosyntézy u Umbilicaria antarctica však boli stanovené v rozmedzí C (e.g. Vrábliková et al., 2005), to ale nereflektuje teplotné pomery v prirodzenom habitate. Pre kaţdú variantu ovplyvnenia Parmotrema sp. boli náhodne vybrané tri aţ päť stielok, ktoré boli umiestnené na Petriho misku a udrţiavané pri laboratórnej teplote (22 C), znova vzhľadom na teplotné pomery lokality, z ktorej bol lišajník odobraný. V priebehu expozície boli stielky postrekované deionizovanou vodou, aby sa zabránilo vysychaniu a ohrievaniu organizmu vplyvom pôsobenia ţiarenia Popis fotoinhibičného ovplyvnenia Hydratované stielky lišajníkov boli vystavené trom intenzitám fotosynteticky aktívneho ţiarenia (PAR). Zvolené hodnoty ţiarenia boli 280, 600 a 1000 µmol.m -2.s -1. Experiment bol navrhnutý na zistenie účinku dlhodobo pôsobiaceho ţiarenia na dynamiku primárnych fotosyntetických procesov a mechanizmov zapájajúcich sa v ochrane pred radiačným stresom. Dĺţka expozície trvala minimálne 5 hodín u kaţdej varianty, pričom v priebehu expozície sa v určených časových intervaloch merala fluorescencia chlorofylu. Svetlo bolo zabezpečené prístrojom KL 2500 LCD (Schott, Nemecko) s 250 W halogénovým zdrojom typu ELC. Z neho bolo svetlo vedené optickými vláknami v ohybnej trubici do hlavice s kruhovou plochou. Intenzita ţiarenia bola nastavená ovládaním na prístroji a výškou hlavice od stielky lišajníkov, meraná rádiometrom (Li-1600 LiCor, USA). Výška bola zvolená tak, aby sa zachovala homogenita ţiarenia dopadajúceho na povrch stielok. (Obrázok 9) 33

34 Obrázok 9: Stielka lišajníka v Petriho miske (vľavo dole) osvetlená svetlom z prístroja firmy Schott (vpravo) Meranie parametrov fluorescencie chlorofylu Fluorescencia chlorofylu bola meraná prístrojom Handy FluorCam HFC010 (Photon Systems Instruments, ČR). Ide o zobrazovací fluorometer, ktorý zaznamenáva indukovaný fluorescenčný signál zo skúmaného objektu na základe uţívateľom nastaveného protokolu (intenzita ţiarenia, časový sled meraní). Fluorescencia je indukovaná pomocou svetla z LED panelov v komore prístroja a signál zaznamenáva CCD kamera, ktorá je uprostred. Na základe získaných signálov softvér vypočíta základné fluorescenčné parametre, ktoré je schopný farebne zobraziť, čím nám okrem iného umoţňuje pozorovať heterogenitu signálu a vypočítaných parametrov fluorescencie chlorofyluv rámci jednotlivých stielok. Fluorescencia experimentálneho materiálu bola meraná pred fotoinhibičným ovplyvnením, aby sa získali informácie o vitalite stielok a ich vhodnosti k pokusu, a niekoľkokrát behom expozície v určených časových intervaloch. Zo začiatku sa zvolil interval kratší (20 minút), aby sme zaznamenali rýchlu fázu odpovede na danú intenzitu ţiarenia. Asi po hodine celkovej expozície sa interval predlţoval aţ na konečnú hodnotu jednej hodiny. Merala sa pomalá indukčná kinetika fluorescencie chlorofylu na základe tzv. Kautského efektu (viď. časť ), doplnená o metódu saturačných pulzov. 34