Nanočástice stříbra biologické vlastnosti & aplikace Aleš Panáček

Transkript

1 Nanočástice stříbra biologické vlastnosti & aplikace Aleš Panáček Katedra fyzikální chemie a Regionální centrum pokročilých technologií a materiálů, Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého v Olomouci 1

2 Obsah přednášky A. Nanostříbro v komerčních produktech Využití biologických vlastností nanočástic Ag v běžném životě lidí B. Nanostříbro na KFC 1. Co je za námi Antibakteriální aktivita Antifungální aktivita Cytotoxicita a ekotoxicita 2. Aktuální stav Závislost biologických vlastností na velikosti částic stříbra 3. Co nás čeká Studium biologických vlastností nanočástic stříbra in vivo 2

3 Nanostříbro v komerčních produktech - kosmetika a textil 3

4 Nanostříbro v komerčních produktech kosmetika a textil OMEGA ALTERMED ROZALIA NANOTRADE 4

5 Nanostříbro v komerčních produktech zdravotnické prostředky 1. Krytí Acticoat - antimikrobiotické s nanokrystalick. stříbrem 10x10 cm/1 ks (305 Kč) SMITH & NEPHEW CONSUMER 2. Kompres Atrauman Ag sterilní 10 x 10 cm 10 ks (828 Kč) HARTMANN-RICO 5

6 Nanostříbro v komerčních produktech omyly 6

7 Příprava nanočástic stříbra Modifikovaný Tollensův proces NaOH, redukční látka Ag + + 2NH 3 [Ag(NH 3 ) 2 ] + Ag 0 AgNO mol dm -3 Amoniak 0,005 až 0,2 mol dm -3 Redukční látka mol dm -3 (sacharidy) NaOH ph nm 200 nm 400 nm Řízená příprava změna koncentrace amoniaku a volba redukční látky stříbrná elektroda : E Ag = E o Ag +(RT/F) ln*ag+ ] E o = +0,799 V tvorba komplexu mění koncentraci volného Ag + : Ag+ + 2NH 3 *Ag(NH 3 ) 2 ] + K =*Ag(NH 3 ) 2 ] + /{ [Ag + + *NH 3 ] 2 } E Ag = E o Ag +(RT/F) ln,*ag(nh 3 ) 2 + +/K *NH 3 ] 2 } E = +0,625 V bez NH 3 0,001 M Ag + E = +0,380 V 0,01 M NH 3 cukr E = -0,150 V Kvítek L., Prucek R. Panáček A. et al. J Mat Chem 15 (10), ,

8 Studium biologických vlastností nanočástic stříbra Velikost částic 25 nm (0,005 mol dm -3 NH 3, redukce maltózou) Antibakteriální aktivita gram-negativní a grampozitivní bakterie TEM UV-VIS Antifungální aktivita Candida spp. Cytotoxicita fibroblasty Toxicita Paramecium caudatum Drosophila melanogaster Scenedesmus subspicatus 8

9 Antibakteriální aktivita nanočástic stříbra studie první Studium antibakteriální aktivity nanočástic stříbra v závislosti na jejich velikosti (25 nm 50 nm) Diluční mikrometoda Stanovení MIC μl kultivačního bujónu μl disperze stříbra - bakteriální suspenze - kultivace 24h, 36 C Stanovení MBC - přeočkování na krevní agar - následná kultivace 24h, 36 C Bakteriální kmeny Enterococcus faecalis CCM 4224 Staphylococcus aureus CCM 3953 Escherichia coli CCM 3954 Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus epidermidis 1 Staphylococcus epidermidis 2 Staphylococcus aureus MRSA Enterococcus faecium (VRE) Klebsiella pneumoniae (ESBL-positive) 1) (methicillin-susceptible) 2) (methicillin-resistant) Prof. M. Kolář a RNDr. R. Večeřová, Ústav mikrobiologie LF UP Olomouc 9

10 Antibakteriální aktivita nanočástic stříbra studie první Studium antibakteriální aktivity nanočástic stříbra v závislosti na jejich velikosti (25 nm 50 nm) Bakterie AgNO 3 Minimální inhibiční koncentrace MIC (mg/l) 25 nm (Maltóza) Velikost nanočástic stříbra 35 nm (Laktóza) 44 nm (Glukóza) 50 nm (Galaktóza) Enterococcus faecalis CCM ,69 6, Staphylococcus aureus CCM ,69 3, Escherichia coli CCM ,84 1, Pseudomonas aeruginosa CCM ,84 3, Pseudomonas aeruginosa 0,84 3, Staphylococcus epidermidis 1 0,84 1, Staphylococcus epidermidis 2 0,84 1, Staphylococcus aureus MRSA 0,84 3, Enterococcus faecium (VRE) 1,69 6, Klebsiella pneumoniae (ESBL-positive) 1,69 6, ) (methicillin-susceptible) 2) (methicillin-resistant) Panáček A., Kvítek L., Prucek R., Kolář M.: J Phys Chem B 110 (33), ,

11 Antibakteriální aktivita nanočástic stříbra studie druhá Zvýšení antibakteriální aktivity nanočástic stříbra (25 nm) jejich stabilizací Bakterie 1) (methicillin-susceptible) 2) (methicillin-resistant) AgNO 3 Nestabilizované nanočástice Ag MIC (mg/l) Stabilizované nanočástice Ag SDS Tween 80 PVP 360 Enterococcus faecalis CCM ,69 6,75 3,38 6,75 6,75 Staphylococcus aureus CCM ,69 3,38 1,69 3,38 3,38 Escherichia coli CCM ,84 1,69 1,69 1,69 3,38 Pseudomonas aeruginosa CCM ,84 3,38 1,69 3,38 1,69 Pseudomonas aeruginosa 0,84 3,38 3,38 1,69 1,69 Staphylococcus epidermidis 1 0,84 1,69 0,84 1,69 1,69 Staphylococcus epidermidis 2 0,84 1,69 1,69 1,69 1,69 Staphylococcus aureus MRSA 0,84 3,38 1,69 3,38 1,69 Enterococcus faecium (VRE) 1,69 6,75 3,38 3,38 3,38 Klebsiella pneumoniae (ESBL-positive) 1,69 6,75 6,75 3,38 6,75 SDS sodium dodecyl sulfate Tween 80 - polyoxyethylene sorbitan monooleate PVP 360 polyvinylpyrrolidone (M.W.= ) Kvítek L., Panáček A., Soukupová J., Kolář M. et al.: J Phys Chem C, ,

12 Antifungální aktivita nanočástic stříbra Stanovení MIC nanočástic stříbra s velikostí 25 nm Candida spp. AgNO 3 Nestabilizované nanočástice Ag MIC (mg/l) Stabilizované nanočástice Ag SDS Tween 80 PVP 360 C. albicans I 0,42 0,42 0,052 0,1 0,1 C. albicans II 0,42 0,21 0,1 0,21 0,21 C. parapsilois 1,69 1,69 0,84 0,84 0,84 C. tropicalis 0,84 0,84 0,42 0,42 0,42 Inhibice růstu kvasinky C. albicans Panáček A., Kolář M., Večeřová R. et al.: Biomaterials 30, ,

13 Antifungální aktivita nanočástic stříbra Srovnání antifungální aktivity nanočástic stříbra s běžnými antimykotiky Amp Amphotericin Itra Itrakonazol Flu Flukonazol Vori Vorikonazol Casp - Caspofungin Non-stabilised SDS Tween Amp Itra Flu Vori Casp Ag NPs stabilised Ag NPs Panáček A., Kolář M., Večeřová R. et al.: Biomaterials 30, ,

14 Fluorescence intensity Cytotoxicita nanočástic stříbra In vitro stanovení cytotoxicity nanočástic stříbra s velikostí 25 nm Fibroblasty - kožní buňky životnost buněk stanovena fluorescenční spektroskopií Silver NPs Ionic silver Control 40 Nanočástice stříbra LC50(24h) = 25 mg/l Ag 20 AgNO 3 LC50(24h) = 1 mg/l Ag 0 0,06 0,25 0, Concentration of silver (mg/l) Doc. V. Kryštof, LRR UP Olomouc Panáček A., Kolář M., Večeřová R. et al.: Biomaterials 30, ,

15 Ekotoxicita nanočástic stříbra Paramecium caudatum Příprava koncentrované disperze nanoag time of concentratio n [hours] concentration of silver in the dispersion a [mg L -1 ] particle size/ half-widt h b [nm] Zeta potential [mv] conductivit y [ms cm -1 ] / / / / / / / / / / ph Doc. M. Dittrich, Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové Kvítek L., Vaníčková M., Panáček A. et al. J Phys Chem C 113, ,

16 Ekotoxicita nanočástic stříbra Paramecium caudatum Testování toxicity nanočástic Ag LT50 a LC50 (1h) Nanočástice stříbra LC50(1h) = 39 mg/l Ag 25 mg/l Ag- zcela netoxická konc. Stabilizované nanočástice mírné zkrácení LT50 AgNO 3 0,4 mg/l Ag vedlo k okamžité smrti organismu nano Ag iontové Ag nano Ag + Tween Tvorba puchýřů na buněčné stěně P. caudatum a její destrukce při působení nanoag o koncentraci 60 mg/l Ag Kvítek L., Vaníčková M., Panáček A. et al. J Phys Chem C 113, ,

17 konc. chlorofylu a (mg/l) Ekotoxicita nanočástic stříbra Scenedesmus subspicatus Spektrofotometrické stanovení úbytku chlorofylu a Nanočástice Ag (25 nm) LC50 >60 mg/l Ag AgNO 3 LC50 = 5 mg/l Ag Ag0 Ag+ kontrola RNDr. P. Hašler, Katedra botaniky PřF UP doc. P. Ilík, Katedra biofyziky PřF UP 0 kontrola 0, koncentrace Ag (mg/l) 17

18 Ekotoxicita nanočástic stříbra Drosophila melanogaster Příprava práškové disperze vysoce koncentrovaný a stabilní systém (2,5 mg Ag na 1 g prášku) 1. krok stabilizace 0,01% BSA a zkoncentrování disperze přes dialyzační membrány 2. krok 5% mannitol, následně homogenizace 3. krok mikroenkapsulace - sušení při 105 C ve sprejové sušárně za vzniku 3 μm mikročástic Prášková disperze nanočástic Ag Doc. M. Dittrich, Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové Panacek A. et al., Environmental Science&Technology, 45,

19 Ekotoxicita nanočástic stříbra Drosophila melanogaster Akutní toxicita závislost toxického účinku na dávce nanoag (25 nm) 10 mg/l až 100 mg/l v chovném mediu - 10 mg/l Ag bez akutního toxického účinku, mírné snížení pigmentace - 20 mg/l Ag - LC50-60 mg/l Ag- LC100 Nedokončení vývojového stadia Dr. D. Šafářová, Katedra buněčné biologie a genetiky, PřF UP Olomouc Srovnání much kultivovaných na mediu s obsahem a bez obsahu nanoag (20 mg/l Ag) Panacek A. et al., Environmental Science&Technology, 45,

20 Ekotoxicita nanočástic stříbra Drosophila melanogaster Chronická toxicita nanoag (25 nm) 5 mg/l v chovném mediu sledování počtu vylíhnutých jedinců v osmi generacích Pokles a následný růst počtu jedinců ovlivnění reprodukce much a následná adaptace na přítomnost Ag zkrácení doby vývojového cyklu ze 14 na 11 dní, menší velikost (hmotnost) much Snížení pigmentace ovlivnění metabolismu biogenních aminů (dopamin, octopamin) potřebných pro tvorbu melaninu Panacek A. et al., Environmental Science&Technology, 45,

21 Antimikrobiální aktivita a toxicita nanočástic stříbra v porovnání s AgNO 3 NanoAg AgNO 3 Antibakteriální aktivita (MIC; 24h) 1-7 mg/l 1-2 mg/l Antifungální aktivita (MIC; 36h) 1 mg/l 1 mg/l Cytotoxicita fibroblasty (LC50; 24h) 25 mg/l 1 mg/l P. caudatum >25 mg/l* 0,4 mg/l** Toxicita S. subspicatus (LC50; 48h) >60 mg/l 5 mg/l D. melanogaster (LC50) 20 mg/l - *netoxická koncentrace **koncentrace vedoucí k okamžité smrti 21

22 d (nm) Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich velikosti Syntéza nanočástic Ag Tollens proces + polyakrylová kyselina (PAA, M.W ), komplexuje ionty Ag +, adsorpcí ovlivňuje povrch vznikajících nanočástic Ag 80 AgNO mol dm -3 amoniak 0,005 mol dm -3 NaOH ph 11,5 PAA až 1, mol dm -3 Maltosa mol dm Bez PAA 28 nm mol/l 36 nm ,00E-11 5,00E-08 1,00E-07 1,50E-07 PAA (mol/l) 9, mol/l 53 nm 1, mol/l 77 nm 22

23 Absorbance Absorbance Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich velikosti Syntéza nanočástic Ag Tollens proces + polyakrylová kyselina (PAA, M.W ), komplexuje ionty Ag +, adsorpcí ovlivňuje povrch vznikajících nanočástic Ag 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 (28 nm) (36 nm) 1, (41 nm) 2, (44 nm) 4, (47 nm) 9, (53 nm) 1, (59 nm) 3, (64 nm) 7, (72 nm) 1, (77 nm) 0 (28 nm) (36 1, (41 2, (44 4, (47 9, (53 1, (59 3, (64 7, (72 1, ( vln. délka (nm) vln. délka (nm) 23

24 Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich velikosti Syntéza nanočástic Ag Tollens proces + polyakrylová kyselina (PAA, M.W ), komplexuje ionty Ag +, adsorpcí ovlivňuje povrch vznikajících nanočástic Ag 50 nm 24

25 Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich velikosti Antibakteriální a antifungální aktivita MIC (mg/l) Bakterie/kvasinka 28 nm (bez PAA) 36 nm 47 nm 64 nm 71 nm 77 nm Staphylococcus aureus CCM ,38 6, Escherichia coli CCM ,69 6,75 13, Pseudomonas aeruginosa CCM ,38 6, C. albicans I 0,42 0,42 1,69 1,69 6,75 13,5 C. parapsilosis 1,69 3,38 3,38 6,75 13,5 13,5 C. tropicalis 0,84 1,69 1,69 3,38 6,75 13,5 25

26 Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich velikosti In vitro cytotoxicita 28 nm 77 nm Velikost nanočástic (nm) 24hod.-LC 50 (mg/l) MIC (mg/l) , > 54mg 26

27 LT50 (s) Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich velikosti Ekotoxicita - Paramecium caudatum nm 36 nm 54 nm 77 nm Nad 100 mg/l Ag mizí závislost toxicity na velikosti nanočástic Ag koncentrace Ag (mg/l) 27

28 In vivo stanovení antimikrobní aktivity nanočástic Ag Nano Ag ve formě vodné disperze a masti Mast ambiderman + koncentrát nanočástic Ag testování antimikrobní aktivity diskovou metodou In vitro cytotoxicita na 3D kožních modelech EpiSkin ( Lidská kůže in vivo Model lidské kůže EpiSkin in vitro doc. H. Kolářová, Ústav lékařské biofyziky LF UP Staphylococcus aureus 3953 Staphylococcus epidermidis 879 In vivo antimikrobní aktivita a toxicita vyvolání lokální infekce léčba nanostříbrem Pseudomonas aeruginosa 532 prof. M. Kolář, Ústav mikrobiologie LF UP Candida albicans II doc. K. Urbánek, Ústav farmakologie LF UP 28

29 Poděkování - přátelům a kolegům z KFC - Libor Kvítek vedoucí skupiny Nanokovy - Robert Prucek - kolegům z LF UP Olomouc - Milan Kolář a Renata Večeřová, Ústav mikrobiologie LF UP Olomouc - Karel Urbánek, Ústav farmakologie LF UP Olomouc - Hana Kolářová a Kateřina Tománková, Ústav biofyziky LF UP Olomouc - finanční podpora MŠMT, ESF a GAČR CZ.1.05/2.1.00/ M MSM , MSM , MSM GACR GAP304/10/1316 prof. M. Kolář, Ústav mikrobiologie LF UP 29

30 Poděkování VÁM VŠEM ZA POZORNOST 30