FRAKCIONACE BUNĚK / SEPARAČNÍ A ANALYTICKÉ TECHNIKY / PROTEINY / LIPIDY / NÍZKOMOLEKULÁRNÍ LÁTKY /

Transkript

1 FRAKCIONACE BUNĚK / SEPARAČNÍ A ANALYTICKÉ TECHNIKY / PROTEINY / LIPIDY / NÍZKOMOLEKULÁRNÍ LÁTKY / HOMOGENIZACE TKÁNÍ, BUNĚK, CENTRIFUGAČNÍ TECHNIKY KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE, SEPARACE A ANALYTICKÁ STANOVENÍ, MALDI TOF PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE

2 HOMOGENIZACE TKÁNÍ / BUNĚK

3 CENTRIFUGACE / ULTRACENTRIFUGACE: úhlový rotor výkyvný rotor

4 DIFERENCIÁLNÍ CENTRIFUGACE: izolace subcelulárních frakcí

5 CENTRIFUGACE V SACHARÓZOVÉM GRADIENTU (např. izolace nukleárního receptoru s navázaným ligandem)

6 Kapalinová chromatografie (LC, HPLC) PUMPA DÁVKOVÁNÍ KOLONA DETEKTOR

7 HPLC /LC/SPE: typy stacionárních a mobilních fází REVERSNÍ FÁZE nepolární stacionární fáze (C18, C8, fenyl) vs. mobilní fáze se snižující se polaritou (voda/metanol, voda/acetonitril/thf) NORMÁLNÍ FÁZE / IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE polární stacionární fáze (amino-, OH-) vs. mobilní fáze se zvyšující se polaritou GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE specifické zakončení stacionární fáze (protilátka, SH- apod.), rozdělení na základě specifických interakcí

8 HPLC /LC: typy detektorů FOTOMETRICKÝ (změna absorpce, jedna vln. délka nebo diode array detektor spektrum analytu) FLUORIMETRICKÝ (změna fluorescence, jedna excitační a jedna emisní vln. délka nebo diode array) RADIOMETRICKÝ (sloučeniny značené 3 H, 13 C, 32 P, 33 P) HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR (stanovení m/z) další detektory

9 Uspořádání spektrofotometrického a fluorimetrického detektoru zdroj světelného paprsku absorpce světla emise fluorescence

10 Hmotnostní spektrometrie generování iontů (ionizace elektronovým paprskem aj.) separace iontů podle poměru hmotnost / náboj (m/z) nejčastěji ionizace, vznik pozitivních iontů (M+) a event. specifická fragmentace molekul; - chemická ionizace (nepřímá ionizace reakčním plynem jako je metan, amoniak) vznik intenzívního iontu M+1; - separace iontů, např. kvadrupólový analyzátor měření množství jednotlivých iontů hmotnostní spektrum v daném časovém bodě; chromatogram: osa x: čas, osa y: vybraný parametr, např. m/z.

11 Typické spektrum z MS

12 MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry): základní uspořádání konverze dat: TOF spektrum ( t = (m/z) 1/2 hmotnostní spektrum

13 MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry): ionizace vzorku (matrix + analyt)

14 Gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)

15 nízkotlaká LC, SPE: separace bílkovin a nízkomolekulárních látek (nukleotidy, metabolity, xenobiotika)

16 Gelová filtrace: separace standardních bílkovin / spektrofotometrická detekce

17 Gelová filtrace s radiometrickou detekcí specifickou pro značený substrát a metabolity

18 Iontová chromatografie

19 Ionexová HPLC: rozdělení proteinů zvyšující se iontovou silou mobilní fáze

20 Afinitní chromatografie Na sorbentu navázaný substrát, protilátka, koenzym apod.

21 PŘÍKLADY HPLC ANALÝZ Koncentrace steroidního hormonu, stanovení aktivity CYP3A isoenzymů (6beta-OH-T), CYP19 (T E2) Koncentrace mastných kyselin, stanovení aktivity PLA, COX, LOX apod. Stanovení cizorodých látek, které se obtížně zplyňují nebo jsou termolabilní (vysokomolekulární PAHs) Preparativní HPLC (izolace nukleotidů, metabolitů, peptidů, protilátek atd.) MALDI-TOF (LC-MS velkých molekul fragmentovaných bílkovin)

22 Reversní HPLC analýza PAHs: detekce pomocí diode-array detektoru (DAD) chromatogr. záznam při vybraných vlnových délkách

23 HPLC analýza hydroxylovaných metabolitů testosteronu (spektrofotometr. det.) 6 -hydroxytestosteron

24 HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci pyrenyldiazomethanem AA

25 HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci PDAM (fluor. detekce) AA

26 Stanovení aromatázové aktivity (HPLC analýza koncentrace produktu - E2) E2

27 MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry): příklad stanovení peptidových fragmentů Fragmenty po rozštěpení vazeb peptidů Iontová fragmentace peptidu (ion decay mass spectrum): -přesné stanovení mol. hmotnosti; - primární sekvence

28 UŽITÍ LC PRO FRAKCIONACI VZORKŮ -PŘÍKLAD STANOVENÍ ORGANICKÝCH CIZORODÝCH LÁTEK SAMPLING EXTRACTION GPC HIGH-MOLECULAR FRACTION PAH FRACTION hexane Silica gel fractionation DCM/ hexane DCM methanol ALIPHATIC FRACTION GC NEUTRAL AROMATIC FRACTION Aminopropyl silica column SEMIPOLAR FRACTION NPAHs, oxy- PAHs GC POLAR FRACTION carboxy-, aldehydes etc. GC HPLC, GC PAHs<252 PAHs>252 HPLC

29 Uspořádání plynového chromatografu (GC) Detektory: FID ECD (chlor. látky) MS (rozdělení podle hmotností fragmentů)

30 GC: Přechod látek mezi stacionární a mobilní fází

31 GC/ECD (electron capture detector): princip detekce anoda e - e - Cl + e - Cl - vychytávání elektronů chlorovanými látkami, snížení el. proudu Ni 63 Ni 63 = -zářič nosný plyn + analyty

32 GC/MS: Chromatogram Plots Plot 1: c:\... \saze_2_ _2 µl z 300_ric.sm s R IC all Plot 2: c:\... \saze_2_ _2 µl z 300_202.sm s Ion: 202 all Plot 3: c:\... \saze_2_ _2 µl z 300_228.sm s Ion: 228 all Plot 4: c:\... \saze_2_ _2 µl z 300_252.sm s Ion: 252 all Plot 5: c:\... \saze_2_ _2 µl z 300_242.sm s Ion: 242 all M Counts M Counts RIC all saze_2_ _2 µl z 300_ric.sms Naphthalene Acenaphthylene Acenaphthene Fluorene Phenanthrene Anthracene Fluoranthene Benz[a]anthracene Chrysene Benzo[b]fluoranthene Benzo[k]fluoranthene Benzo[a]pyrene Benzo[c]chrysene + Pyrene Indeno[1,2,3-cd]pyrene Dibenz[a,h]anthracene Benzo[ghi]perylene analýza PAHs (SIM fragmenty M + = různé MW) Ion: 202 all saze_2_ _2 µl z 300_202.sm 4 Fluoranthene PAH 202_2 Pyrene MW kc ounts Ion: 228 all saze_2_ _2 µl z 300_228.sm 500 Benzo[c]phenanthrene Benz[a]anthracene Chrysene + Triphenylene PAH 228_1 MW kc ounts Ion: 252 all saze_2_ _2 µl z 300_252.sm 125 Benzo[b]fluoranthene Benzo[k]fluoranthene Benzo[j]fluorathene Benzo[a]fluoranthene MW Benzo[e]pyrene Benzo[a]pyrene 75 Perylene kc ounts Ion: 242 all saze_2_ _2 µl z 300_242.sm MePy 4-MePy 1-MePy 242 No No No No No. No. X15 2-MeBaA MeBaA 3-MeChry 7-MeBaA 9-MeBaA 3+5-MeBaA 2-MeChry 5-MeChry 6-MeChry 4-MeChry 1-MeChry MeBaA No. X2 MW m inutes

33 STANOVENÍ ENZYMATICKÉ AKTIVITY / ENZYMOVÁ KINETIKA E + ES [ES] E + P Stanovení produktu: koncentrace produktu / čas. prot. = pmol produktu / min. (mg prot./ml) Příklady stanovení: - fluorimetrické stanovení produkce resorufinu (EROD, MROD, PROD, BROD); - HPLC stanovení metabolitů mastných kyselin, např. 5-OH-FA (5-LOX); - chemiluminiscenční stanovení luciferázy

34 Enzymová kinetika: ustálený stav (steady state) E + S [ES] P + E

35 SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKCÍ spektrofluorimetrická detekce produktu enzymové reakce silně flureskujícího resorufinu (exc , em. 585 nm)