Precipitační a aglutinační reakce

Transkript

1 Základy imunologických metod: Precipitační a aglutinační reakce Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol

2 Metody, ve kterých se používají protilátky Neznačený antigen/protilátka Precipitace Aglutinace Značený antigen/protilátka Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Radioimmunoassay (RIA) Western blotting Immunofluorescence Průtoková cytometrie

3 Citlivost imunochemických metod precipitace - 30 mg/ml aglutinace - 1 mg/ml nefelometrie 0,1 mg/ml radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml

4 Imunoprecipitační křivka Charakteristická křivka vyjadřující závislost tvorby imunoprecipitátu na množství antigenu, přidávaného ke konstantnímu množství protilátky

5 Oblast nadbytku protilátky se zvyšujícím se množstvím antigenu vzrůstá precipitát. Na všechna vazebná místa antigenu jsou navázány protilátky. Výsledkem je vznik malých rozpustných komplexů antigenu a protilátky, které se vzájemně nepropojují. V supernatantu neprokazujeme žádný antigen. V oblasti nadbytku protilátky je množství komplexu antigen-protilátka úměrné koncentraci přítomného antigenu. Tyto reakční poměry se využívají u imunoturbidimetrie a imunonefelometrie a nekompetitivních imunoanalýz.

6 Oblast ekvivalence dochází k vzájemnému propojování molekul antigenu a protilátky a tím vznikají velké nerozpustné imunokomplexy s mřížkovitou strukturou, které agregují a vytvářejí imunoprecipitát. V supernatantu neprokazujeme volný antigen ani volnou protilátku Dosažení ekvivalence se používá u imunodifúzních metod.

7 Oblast nadbytku antigenu množství precipitátu klesá v důsledku vysoké koncentrace antigenu. Velké vzájemně propojené imunokomplexy se rozpadají. Všechna vazebná místa protilátek jsou vysycena antigenem a některé molekuly antigenu zůstávají bez navázané protilátky. Vznikají malé rozpustné imunokomplexy. V supernatantu nejsou přítomny volné protilátky, ale vzestupné množství volného antigenu. Podmínka nadbytku antigenu musí být splněna u kompetitivních imunoanalýz.

8 Precipitační reakce Imunoprecipitační křivka je základem pro různé imunochemické metody, které mohou být prováděny v gelu nebo v roztoku Flokulační : postupné ředění jedné z reagujících složek - ve zkumavce Řada metod založených na měření stupně zákalu turbidity Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích Nefelometrie měří rozptýlené (tzv. Tyndallovo) světlo, které vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření.

9

10 Precipitační reakce v gelu Imunodifuzní (ID) : ředění se dosahuje difuzí do prostředí gelu Jedna z nejstarších imunologických metod, dnes ji nahrazuje nefelometrie Velká pracnost, nízký rozsah měření a časová náročnost (až 48 h) Imunoprecipitační metody v gelu: Radiální imunodifuze Dvojitá difuze Imunoelektroforéza

11 Radiální imunodifuze Protilátka je rozpuštěná v gelu; Ag je přidán do jamek Měření koncentrace různých sérových proteinů, např. hladiny imunoglobulinů

12 Dvojitá difuze Ab a Ag difundují proti sobě Stanovení homogenity systému antigen-protilátka Diagnostika specifických autoimunitních onemocnění Používáno následně po purifikaci směsi antigenů Hledání reakcí mezi serologicky příbuznými antigeny Identické Neidentické Částečně identické

13 Dvojitá imunodifuze Ouchterlony Örjan Ouchterlony Vyvinul techniku dvojité imunodifuze v roce 1948

14 Dvojitá difuze (Ouchterlony)

15 Dvojitá difuze

16 Dvojitá difuze

17 Dvojitá difuze

18 Imunoelektroforéza Kombinace separace antigenů elektroforézou s identifikací pomocí dvojité difuze detekce přítomnosti nebo absence proteinu v séru

19 Imunofixační elektroforéza (IFE) Stále používaná metoda pro stanovení monoklonální gamapatie a typu Ig řetězců Monoklonální gamapatie je onemocnění, při kterém jeden klon plazmatických buněk produkuje vyšší hladiny protilátky tato protilátka má těžký řetězec jednoho typu a jeden idiotyp (nazývá se paraprotein nebo M-protein) Po elektroforetické separaci proteinů vyšetřovaného séra se na gel nanesou protilátky anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti kappa a anti lambda

20 Imunofixační elektroforéza (IFE)

21 Raketková imunoelektroforéza Antigen je podroben elektroforéze v gelu obsahujícím protilátku Vzdálenost od startovací jamky k vrcholu raketky odpovídá koncentraci antigenu

22 Aglutinační reakce Ab + částicový Ag Aglutinace (shlukování) Nenáročná, rychlá a levná metoda, ale: Aglutinují pouze protilátky třídy IgG a IgM Nevýhodou je nízká citlivost (0,2 2 µg/ml) Částice s navázanou protilátkou mají tendenci se při skladování shlukovat Přímá aglutinace Pasivní aglutinace Inhibice aglutinace

23 Přímá aglutinace Ag je přirozenou složkou částice Např. testování pacientova séra na přítomnost protilátek proti určité bakterii: Pacientovo sérum je sériově ředěno do zkumavek s danou bakterií. Poslední zkumavka s viditelnou aglutinací určuje titr protilátky v séru

24 Přímá aglutinace Stanovení protilátek proti erytrocytům Erytrocyty: negativně nabité (zeta potenciál), může být ovlivněna agluginační reakce (zejména IgG protilátky) Řešení: Coombsův test - použití anti imunoglobulinového séra Příklad: detekce anti-rh protilátek v krvi Rh- matek

25 Coombsův Test Přímý: přidá se protilátka proti lidskému imunoglobulinu (Coombsovo činidlo) k červeným krvinkám. Aglutinace se objeví, pokud jsou erytrocyty pokryty protilátkami Nepřímý: inkubuje se testované sérum s erytrocyty zdravého dárce. Po promytí se přidá Coombsovo činidlo stanovení Rh protilátek diagnostika získané hemolytické anémie - průkaz volných antierytrocytárních protilátek v plazmě (séru)

26 Přímý a nepřímý Coombsův test Měření vázané protilátky Měření sérové protilátky

27 Pasivní aglutinace Aglutinace mezi protilátkou a solubilním antigenem vázaným na nesolubilní částici (latexová částice) Mnohonásobné zvýšení citlivosti oproti precipitační reakci Diagnostika autoprotilátek u autoimunitních onemocnění Diagnostika autoimunitní thyroitidy: Thyroglobulin je připojen k latexové částici a je použit k detekci anti-thyroidních protilátek v séru pacienta - Diagnostika revmatoidní artritidy

28 Inhibice aglutinace velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag, která aglutinuje. Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab. Průkaz užívání drog (kokain, heroin). Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka).

29 Inhibice aglutinace Kompetice se solubilním Ag Prior to Test + Test + + Patient s sample

30 Inhibice aglutinace V řadě A jsou pozitivní jamky 1-8

31 Průkaz HCG v moči

32 Hemaglutinace