Metody vyšetření imunity

Transkript

1 Metody vyšetření imunity

2 Motto lab.vyš Cílem je nalézt abnormální funkci imunitního systému, která přináší vysvětlení příznaků/nemoci /nemocí Některé chybné funkce se nemusí projevovat onemocněním pacienta Některé příznaky/nemoc nemusí být provázeny zjistitelnou poruchou vždy je měřící metoda nedokonalá a málo přesná Technologie se intenzívně vyvíjejí a klinická věda má potíž se vyrovnat s jejich interpretací

3 Oblasti vyšetření imunity Buněčná imunita Zastoupení imunokompetentních buněk Počty buněk, subpopulací, prekurzorů Funkční testy změna fenotypu (membránový znak) při změně funkce (aktivaci) in vivo, in vitro Tvorba produktů buňky - Ig, cytokiny Změny v jaderném materiálu

4 Humorální složky imunity Imunoglobuliny, protilátky - specifické nespecifické proteiny akutní fáze systém komplemetu vyšetření séra (moč, mozkomíšní mok, patologické výpotky)

5 METODY VYŠETŘOVÁNÍ HUMORÁLNÍ IMUNITY aglutinace turbidimetrie a nefelometrie enzymoimunoanalýza (ELISA) elektroforéza, imunofixace, imunoblotting nepřímá imunofluorescence

6 Aglutinace princip: reakce mezi Ag a Ab se projeví tvorbou sraženiny viditelné pouhým okem (aglutinát) korpuskulární Ag (bakterie, Ag na nosiči) + vyšetřované sérum průkaz spec. protilátek hodnocení: kvalitativní (ano/ne), kvantitativní (titrace séra)

7

8 Množství precipitátu Imunoprecipitační metody princip: reakce mezi solubilním Ag a Ab se projeví tvorbou imunokomplexu (precipitátu) PRECIPITAČNÍ KŘIVKA Imunoprecipitační křivka Y Y nadbytek Ab ZÓNA EKVIVALENCE nadbytek Ag koncentrace antigenu konstantní množství protilátky

9 Radiální imunodifuze princip: reakce Ag a Ab v agarózovém gelu po difuzi (prstencový precipitát) gel s homogenním obsahem Ab + vyšetřované sérum průměr prstence úměrný množství Ag uplatnění: stanovení Ig

10 Turbidimetrie a nefelometrie princip: měření množství imunitních komplexů Ag-Ab při nadbytku Ab reakce v tekutém prostředí v kyvetě hodnocení: koncentrace Ag přímo úměrná - rychlosti tvorby zákalu (kinetický systém) - hustotě zákalu ( end point )

11 Nefelometrie precipitace v roztoku měří se intenzita světla odraženého od precipitátu kalibrační křivka

12 Turbidimetrie precipitace v roztoku měří se úbytek intenzity světla, které prošlo roztokem v kyvetě (absorbance precipitátu) kalibrační křivka

13 Uplatnění turbidimetrie a nefelometrie stanovení koncentrace sérových proteinů (imunoglobuliny, proteiny akutní fáze, složky komplementu C3, C4, transferin, albumin ) rychlé, plně automatizované metody pro velké série vzorků

14 Imunoreakce se značenými protilátkami RIA Ab značena radioizotopem EIA Ab značena enzymem detekce reakce dle povahy sbustrátu: fotometrie, fluorometrie, luminometrie, ELISA

15 Enzymová imunosorpční analýza (ELISA) protilátka konjugovaná s enzymem protilátky v testovaném vzorku substrát pro enzym barevný produkt

16 Stanovení optické density hodnocení: fotometricky čím intenzita barevné reakce, tím koncentrace stanovované látky OD koncentrace

17 Uplatnění ELISY Stanovení specifických IgE protilátek proti alergenům ELISA UniCAP alergen adsorbován na pevnou fázi (CNBr celulosa) reaguje s IgE v séru pacienta detekce sekundární protilátkou proti IgE značenou enzymem, hodnocení fluorescence

18 Elektroforéza dělení proteinů na základě pohyblivosti v elektrickém poli (podle náboje nebo velikosti) gel (agaróza, polyakrylamid)

19 Elektroforéza séra základní orientace v zastoupení krevních proteinů

20 Elektroforéza séra

21 Imunofixace (1) elektroforéza séra v několika drahách nanesení protilátek (anti-igg, -IgA, -IgM, -κ, - ) vytvoření precipitátu (např. imunokomplex= IgG+anti-IgG) barvení

22 Imunofixace (2)

23 Aplikace imunofixace detekce paraproteinu/monoklonálního Ig diagnostika monoklonálních gamapatií (mnohočetný myelom, makroglobulinémie, CLL, B-lymfom) paraprotein: syntetizovaný jedním klonem myelomových buněk (nádorově transformované B lymfocyty)

24 Imunoblotting (Western blot) 1) elektroforéza dělení dle velikosti 2) přenos proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu v elektrickém poli 3) imunodetekce: + vzorek séra + značená sekundární Ab (HRP) + substrát vznik barevné reakce

25 Uplatnění imunoblottingu průkaz přítomnosti Ab proti jednotlivým Ag (bakteriálním, autoantigenům, ) Borrelia burgdorferi detekce i několika Ab proti specifickým Ag najednou imunodot: komerční uměle čištěné nebo rekombinantní antigeny fixované na membráně

26 Imunodot

27 Autoprotilátky reagují se složkami vlastního organizmu fyziologicky: v nízkých koncentracích, věkem využívají se v diagnostice autoimunitních nemocí orgánově nespecifické (např. proti buněčnému jádru, mitochondriím, ) orgánově specifické (např. proti antigenům slinivky břišní)

28 Nepřímá imunofluorescence

29 ANA protilátky (anti-nuclear) reagují s jadernými antigeny (ds-dna, histony, jadérko, mitotický aparát, ) substrát: Hep 2 buňky nukleolární typ fluorescence (autoprotilátky proti jadérku) homogenní typ fluorescence (autoprotilátky proti ds-dna a histonům)

30 Vyšetření komplementu nefelometrie - stanovení koncentrace C3 a C4 indikace: geneticky podmíněný deficit, patogenetická úloha imunokomplexů inhibitor složky C1 indikace: podezření na deficit (dg. hereditárního angioedému)

31 Funkční testy komplementu CH 50 hemolytický test Princip: testované sérum + ovčí erythrocyty s navázanou Ab aktivace komplementu, lýza ery Hodnocení: spektrofotometricky měření absorbance uvolněného hemoglobinu, přímo úměrné počtu lyzovaných ery převrácená hodnota ředění séra, potřebné k vyvolání 50% hemolýzy

32 METODY DETEKCE BUNĚČNÉ IMUNITY Fenotypizace imunitních buněk - průtoková cytometrie metody stanovení funkční aktivity lymfocytů testy fagocytárních funkcí

33 Průtoková cytometrie (FACS) analýza jednotlivých buněk v suspenzi současné měření řady parametrů chemické, fyzikální a biologické vlastnosti buňky (ph, membránový potenciál, velikost, granularita, viabilita) exprese povrchových membránových molekul obsah DNA a jiných intracelulárních molekul selekce požadované buněčné populace (sortování)

34 Průtoková cytometrie Mnohoparametrový soubor dat o individuálních buňkách získávaný rychlostí buněk / sec Exprese membránových znaků - imunofenotypizace Měření intracelulárních charakteristik - oxidativní vzplanutí, fosforylace proteinů, cytoplazmatická produkce cytokinů, buněčného cyklu

35 Průtokový cytometr PE PE-Cy7 FITC APC detektory fluorescence LASER FSC SSC označené buňky PC analýza

36 Izolace lymfocytů z krve gradientová centrifugace (oddělení buněk podle rozdílů v jejich hustotě)

37 Rozdělení leukocytů podle velikosti a granularity granulocyty scattergram monocyty lymfocyty

38 Značení buněk pro FACS PŘÍMÉ ZNAČENÍ NEPŘÍMÉ ZNAČENÍ excitace (laser) emise fluorescence emise fluorescence fluorochromem značená sekundární Ab/streptavidin fluorochromem značená mab membránový marker purifikovaná/biotinylovaná mab

39 Dvojbarevné značení CD8 PE dot plot CD4 FITC

40 Uplatnění FACS analýzy fenotypizace buněk (diagnostika primárních imunodeficitů, autoimunitních chorob, leukémií a lymfomů, monitorování pacientů po transplantaci) funkční testy leukocytů a trombocytů hodnocení spermatogeneze, detekce virů, bakterií a parazitů, vyšetření chromozomů, vyšetření aktivity enzymů, stanovení intracelulárního vápníku

41 Fenotypizace lymfocytů CD3+/CD4+ Th lymfocyty (52-69%) CD3+/CD8+ cytotoxické lymfocyty (27-46%) CD16+/CD56+ NK buňky (4-18%) CD19+ B lymfocyty (7-18%) diagnostika primárních imunodeficitů (SCID, Brutonova agamaglobulinemie) monitorování odpovědi na léčbu sekundárních imunodeficitů (HIV)

42 Funkční testy lymfocytů exprese aktivačních markerů proliferace cytotoxicita sekrece cytokinů tvorba protilátek

43 Sledování exprese aktivačních markerů časné aktivační markery (CD69) CD69 CD25, CD71 pozdní aktivační markery (VLA) CD4

44 CFSE Rovnoměrné rozdělení intracelulárních proteinů obarvených CFSE mezi dceřinné buňky

45 Proliferace lymfocytů (opakování) rozeznání nativního antigenu (BCR) + kostimulační signál od Th2 lymfocytů (IL-4, 5, CD40L) rozeznání komplexů antigenních peptidů s MHC I/II na povrchu APC buněk (TCR) + kostimulační signál (IL-4/12, CD80/86)

46 Proliferační testy (1) 3 H- tymidinový test kultivace izolovaných lymfocytů v médiu se stimulačními látkami (3-7 dní/37 C) inkubace s radioaktivně značeným tymidinem ( 3 H) inkorporace 3 H- tymidinu do DNA proliferujících lymfocytů detekce -záření ( -counter) čím proliferace tím naměřená radioaktivita

47 Látky stimulující proliferaci lymfocytů antigeny aktivují paměťové buňky vytvořené po očkování tetanický toxoid, tuberkulin jsou nutné APC monoklonální protilátky aktivace celé populace T lymfocytů anti-cd3, anti-tcr

48 Látky nespecificky stimulující proliferaci lymfocytů mitogeny rostlinné lektiny (vazba na sacharidy) ConA, PHA (T lymfocyty) PWM (B lymfocyty) LPS (B lymfocyty) superantigeny stafylokokové proteiny produkty onkogenních retrovirů

49 Cytotoxické mechanismy Tc a NK buněk (opakování) FasL - Fas TNF - TNFR TNFR granzymy TNF perforiny, granzymy CTL ADCC (NK buňky) nádorová buňka

50 Cytotoxické testy vyšetření schopnosti T lymfocytů a NK buněk zabíjet cílové buňky (nádorové, virem infikované) test založený na uvolňovaní radioaktivně značeného chromu ( 51 Cr) z nádorových buněk vitální barvení nádorových buněk mikroskopické nebo cytometrické vyhodnocení

51 Provedení testu s 51 Cr izolované lymfocyty + inkubace (37 C/3,5h) nádorové buňky inkubované s 51 Cr Výpočet % cytotoxické aktivity 100x (aktivita vzorku-spon)/(max-spon) 51 Cr detekce -záření v supernatantu

52 Stanovení sekrece cytokinů ELISA intracelulární stanovení průtokovým cytometrem ELISPOT detekce a kvantifikace T lymfocytů reagujících na antigenní podnět sekrecí konkrétních cytokinů počet spotů v jamce = počet buněk sekretujících cytokiny

53 Uplatnění funkčních testů lymfocytů diagnostika SCID diagnostika a prognostika zhoubných nádorů monitorování buněčné imunity (sekundární imunodeficity, traumata, sepse, pooperační stavy) monitorování rozvoje štěpu po transplantaci kostní dřeně testování nových léků (farmakologie, protinádorová imunoterapie)

54 Fagocytóza (opakování) fagocytující buňky neutrofily, eozinofily, monocyty, makrofágy fagocytované částice bakterie, pozůstatky vlastních buněk organismu fáze fagocytózy diapedéza, chemotaxe, rozpoznání, ingesce, usmrcení a destrukce částic určených k fagocytóze

55 Testy fagocytárních funkcí stanovení exprese adhezívních molekul testování chemotaxe fagocytóza baktericidní test testy oxidačního vzplanutí

56 Testování chemotaxe fagocytů suspenze testovaných buněk médium médium chemotaxin (fmlp)

57 Fagocytóza (1) vyšetření fáze ingesce substrát Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, polymerové partikule suspenze partikul nebo kvasinek + plná krev (inkubace 37 C/1hod) zhotovení krevního nátěru fixace a barvení odečítání ve světelném mikroskopu

58 Fagocytóza (2) hodnocení 100 buněk, pozitivní obsahují 3 a více pohlcených částic fagocytární aktivita % fagocytů s pohlcenými částicemi ze všech fagocytujících buněk fagocytární index průměrný počet částic pohlcených jednou buňkou

59 Baktericidní test vyšetření fáze usmrcení pohlcené částice substrát Staphylococus aureus, Candida albicans inkubace plné krve s mikroorganismy (37 C/1hod) hodnocení mikroskopicky (vitální barvení trypanovou modří) cytometricky (vitální barvení PI, Hoechst) očkování na plotny (počítání narostlých kolonií)

60 Testy oxidačního vzplanutí (1) vyšetření schopnosti fagocytů tvořit kyslíkové radikály (aktivace NADPH oxidázy) testy využívající průtokovou cytometrii plná krev + forbolové estery + dihydrorhodamin vznik rhodaminu (působení kyslíkových radikálů) měření intenzity fluorescence

61 Principy studií aktivovaných bazofilů Anafylaktická degranulace bazofilů rychlé morfologické změny, exocytoza IC granulí a uvolnění preformovaných mediátorů Piecemeal degranulace pomalé morfologické změny bez degranulace CD63, CD203c, CRTH2-FITC /CD203c-PE/CD3-PC7 CD69, Cd107a, CD123, CD 164, basogranulin a další... Detekce mediátorů a enzymů CD63 CD203c synonymum gp53, lysosyme-associated membrane protein (LAMP)-3 Rodina transmembránový znak typu 4, tetraspanin diferenciační Ag povrchu neuronů E-NPP3 pyrofosfatáza /fosfodiesteráza E-NPP3 Klidové bazofily Velmi vzácně Konstitutivně přítomné IgE aktiv. bazofily Zvýšení během 10 min, vysoká exprese (1 log) Méne výrazný vzestup exprese