Prognostické markery nádoru ovaria

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Prognostické markery nádoru ovaria bakalářská práce Hradec Králové, 2007 Lucie Barvířová Podpořeno grantem IGA MZ NR8363-3/2005

2 Děkuji svému školiteli Doc. RNDr. V. Semeckému, CSc. za odborné vedení mé bakalářské práce, za četné rady a mnohé konzultace v průběhu celé práce. Mé velké díky patří mé školitelce - specialistce MUDr. Markétě Tomšové, Ph.D. Velmi si cením jejích připomínek, rad a hlavně její trpělivosti, kterou mi projevovala při vzniku této práce. Mé díky také patří prof. MUDr. B. Melicharovi, Ph.D. za pomoc při statistickém zpracování dat a vyhledávání klinických údajů o pacientkách. Také bych velmi ráda poděkovala celému kolektivu Fingerlandova ústavu patologie Fakultní nemocnice Hradec Králové za podporu nejen při práci na tomtu textu. Tato práce vznikla za podpory IGA MZ NR8363-3/2005

3 Obsah 1. Teoretický úvod Karcinom ovaria Klasifikace nádorů ovaria Klasifikace nádorů z povrchového epitelu Klasifikace nádorů gonadostromálních Klasifikace nádorů germinálních Klasifikace smíšených germinálních a gonadostromálních nádorů Klasifikace nádorů nespecifických pro ovarium Klasifikace nádorů sekundárních Grading a staging karcinomu ovaria Grading nádoru Staging nádoru Prognostické markery stanovitelné imunohistochemicky Průkaz exprese hormonálních receptorů Průkaz proliferační aktivity nádoru Průkaz onkoproteinu HER-2/neu Průkaz onkoproteinů mající vztah k apoptóze Angiogeneze Tumor infiltrující lymfocyty (TIL) Cíle studie Experimentální část Charakteristika souboru Histologické vyšetření Imunohistochemické vyšetření Pomůcky a přístroje Roztoky Pracovní postup Hodnocení imunohistochemické reakce Statistická analýza dat Výsledky Diskuze Závěr Souhrn Summary Literatura Seznam tabulek, grafů a obrázků Seznam zkratek...51

4 1. Teoretický úvod 1.1. Karcinom ovaria Ovaria (vaječníky) jsou párový orgán uložený v malé pánvi. Dosahují velikosti až 3 cm. Mesovariem jsou připojena k děloze. Na řezu lze rozpoznat kůru a dřeň. V kůře jsou rozloženy oocyty a folikuly v různém stadiu vývoje. Dřeň je tvořena řídkou pojivovou tkání a obsahuje nervy, lymfatické a krevní cévy. Ovaria plní dvě hlavní funkce: 1) produkují ženské pohlavní hormony (estrogeny a progesteron) a 2) dozrávají zde vajíčka (22). Karcinom ovaria je jedním z nejčastějších nádorových onemocnění u žen (šestým nejčastějším maligním onemocněním u žen na světě), vyskytuje se nejčastěji ve věku let. Toto onemocnění je častější u žen žijících ve vyspělých zemích (25). Jeho incidence v České republice v roce 2004 byla 24 případů 100 tisíc žen / rok (58). Časná stadia karcinomu jsou obvykle asymptomatická. Nádor bývá proto diagnostikován až v pozdějších stadiích, kdy dochází k rozsevu po dutině břišní. Pokročilá onemocnění pak bývají provázena těmito klinickými příznaky: bolesti a vyklenování břicha (způsobeno nádorovým ascitem), hubnutí, bolesti zad apod (32). Mezi nejznámější rizikové faktory pro vznik ovariálního karcinomu patří nuliparita, časné menarché a pozdní menopauza. Vysoká životní úroveň a s ní související pokles parity je dávána do souvislosti s celosvětově se zvyšující incidencí ovariálního karcinomu. Ochranný význam mají tedy zvyšující se parita, užívání hormonální antikoncepce a chirurgicky navozené protektivní faktory jako např. adnexektomie. Dědičnou forma tohoto nádoru se vyskytuje přibližně u 10% pacientek (21, 24). Diagnóza se stanoví na základě gynekologického palpačního vyšetření, to však dokáže odhalit až nádor větších rozměrů. Dále se využívá ultrazvukové vyšetření zejména s pomocí vaginální sondy, příp. počítačová tomografie. Ke stanovení diagnózy může přispět též stanovení hladiny nádorového markeru CA 125, 4

5 jehož vysoká hladina svědčí pro karcinom. Definitivní diagnosu však dokáže stanovit až histologické vyšetření (32). Prognosa onemocnění závisí na celé řadě faktorů. Ty zahrnují klinické stadium (tzv. staging), histologický typ nádoru, jeho diferenciace (tzv. grading), velikost reziduálního tumoru po primární operaci, chybění či přítomnost ascitu, věk a celkový stav pacientky v době diagnózy (4, 7, 8, 9, 11, 27, 48). V současné době je problém ovariálního karcinomu ve světové literatuře velmi diskutovaným tématem. Existuje velké množství studií, které však často přinášejí rozporuplné údaje. Rozsáhle studovanou oblastí je zejména určení možných prognostických markerů, které by mohly převídat další vývoj onemocnění a pomoci tak při volbě vhodné protinádorové terapie (36). Mezi intenzivně studované prognostické faktory patří zejména určení proliferační aktivity nádoru: imunohistochemicky pomocí antigenů Ki-67 či topoizomerázy IIα, průkaz exprese hormonálních receptorů, markerů apoptózy či jiných onkoproteinů, zejména proteinu HER-2/neu (8, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 28, 37, 51). Léčebný postup zahrnuje jednak chirurgickou léčbu. Radikální operace se skládá z oboustrané adnexektomie, hysterektomie, omentektomie, paraaortální lymfadenektomie a apendectomie. Pacientky jsou dále léčeny chemoterapií, nejčastěji kombinací platinových preparátů s Taxolem(25). 5

6 1.2. Klasifikace nádorů ovaria Nádory ovaria jsou různorodou skupinou. Dělí se na základě původu z povrchového (coelomového) epitelu, zárodečných buněk, mesenchymu viz tabulka 1. Nádory se obecně dělí podle svého chování na maligní (zhoubné, karcinomy), na benigní (nezhoubné) a nádory o nízké malignitě (syn. borderline tumors) (23, 32, 47). Tabulka 1: Klasikace nádorů ovária dle WHO I II III IV V VI VII Nádory z povrchového epitelu Nádory gonadostromální Nádory germinální Nádory smíšené germinální a gonadostromální Nádory nespecifické pro ovárium (mesenchymální, lymfomy) Nádory sekundární Nádory neklasifikovatelné Klasifikace nádorů z povrchového epitelu Nádory vznikající z povrchového epitelu tvoří asi polovinu až dvě třetiny všech ovariálních tumorů. Tyto nádory se dále rozdělují podle své diferenciace nádorových buněk: Nádory serózní Nádory mucinózní Nádory endometroidní Nádory světlobuněčné Nádory přechodobuněčné Nádory dlaždicobuněčné 6

7 Nádory smíšené epiteliální Nádory nediferecované Serózní nádory jsou tvořeny plochými, kubickými až nízce cylindrickými buňkami, které mohou mít na povrchu řasinky (zejména u benigní varianty); epitel tak připomíná výstelku vejcovodu. Tyto nádory jsou v ováriu nejčasnější a tvoří až třetinu všech epiteliální tumorů. Serózní karcinom je nejčastější ovariální karcinom (tvoří asi 50% všech maligních nádorů ovária). V 70-80% jsou diagnostikovány v pozdních stádiích. Ve dvou třetinách případů serózní karcinom postihuje obě ovária. Karcinom obvykle vytváří objemné nádory (často až 20 cm v průměru), které jsou multilokulární, cystické s papilárními a solidními ložisky. Histologická stavba je tvořena papilárně a solidně uspořadanými okrsky (47). Obr. 1: Serózní karcinom ovária, HE, zvětšeno 200x 7

8 Mucinózní nádory tvoří buňky cylindrické obsahující hlen v cytoplazmě. Benigní mucinosní nádory tvoří až 40% všech benigních nádorů ovaria. Naopak mucinózní karcinomy jsou poměrně vzácné. Více jak polovina mucinózních karcinomů je diagnostikována ve I. stádiu a jsou na rozdíl od serózních karcinomů jednostranné. Jde také o objemné nádory, cystické a multilokulární. Histologicky ho tvoří cystické a glandulární struktury (47). Obr. 2: Mucinózní karcinom ovária, HE, zvětšeno 200x 8

9 Endometroidní nádory jsou charakteristické přítomností epiteliálních elementů, stromálních elementů nebo jejich kombinací a připomínají endometrium. Tyto nádory jsou převážně maligní. Často jsou spojeny s endometriózou buď v ovariu nebo kdekoliv v pánvi, a v 15% - 20% případů též s karcinomem endometria. Histologicky je tvořen žlazovými strukturami (47). Obr. 3: Endometroidní karcinom ovária, HE, zvětšeno 400x Světlobuněčné nádory jsou typické přítomností buněk obsahující hojný glykogen v cytoplasmě, což způsobuje její vodojasnost. Benigní světlobuněčné nádory jsou velmi vzácné, karcinom tvoří asi 5-10% všech ovariálních karcinomů. 9

10 Nejčastěji se jedná o solidní nádor nebo unilokulární tlustostěnnou cystu, do které prominují solidní nádorové uzly (47). Přechodnobuněčné tumory jsou charakteristické přítomností ostrůvků epiteliálních buněk připomínajících urotel, které jsou rozptýleny ve fibrózním stromatu. Tyto nádory představují asi 3% všech epiteliálních ovariálních tumorů a jsou převážně benigní. Přechodnobuněčný karcinom je často promíšen s jiným typem karcinomů, hlavně se serózním (47). Obr. 4: Světlobuněčný karcinom ovária, HE, zvětšeno 400x 10

11 Dlaždicobuněčný karcinom je v ovariu vzácný nádor (47). Smíšený epiteliální nádory jsou tvořeny z více druhů nádorové populace. Například jde o kombinaci serózní a endometroidní diferenciace (47). Nediferencovaný karcinom nevykazuje žádné známky diferenciace (47). Obr. 5: Dlaždicobuněčný karcinom ovária, HE, zvětšeno 200x Klasifikace nádorů gonadostromálních Tumory této skupiny vycházejí ze specializovaného stromatu ovária a mohou být hormonálně aktivní (produkovat např. estrogeny, gestageny či androgeny) či být 11

12 endokrinně němé. Tyto nádory představují zhruba 10% všech ovariálních tumorů. Gonadostromální nádory se rozdělují na 3 skupiny: Nádor z buněk granulozy Nádory ze Sertoliho a Leydigových buněk Nádory ze steroidogenních buněk (32) Klasifikace nádorů germinálních Jde o nádory vznikající ze zárodečných buněk. Převažují u mladých žen. Rozlišujeme tyto nejčastější typy: Dysgerminom Embryonální karcinom Teratom zralý Teratom nezralý Nádor ze žloutkového váčku Choriokarcinom Smíšený maligní germinální nádor (32) Klasifikace smíšených germinálních a gonadostromálních nádorů Tato kategorie vzácných pseudotumorózních a nádorových afekcí složených ze zárodečných buněk a buněk specializovaného stromatu ovárií zahrnuje gonadoblastom a strukturně podobný maligní nádor Talermanův (32). 12

13 Klasifikace nádorů nespecifické pro ovarium V ováriu se sporadicky vyskytují nádory měkkých tkání, např. angiomy, leiomyomy, neurofibromy a lipomy. U mezoteliomu je vždy nutno vyloučit sekundární postižení ovária. Sarkomy a maligní lymfomy jsou v ováriu vzácné (32) Klasifikace nádorů sekundárních Jedná se o nádory, které nevznikají z tkáně ovaria. Ale jsou do tohoto orgánu zaneseny druhotně, a to jako vzdálené metastázy, nebo prorůstáním nádorové masy z okolí. Do ovaria nejčastěji metastazují nádory žaludku, prsu, tlustého střeva či hematologické malignity. Zvláštní formou je tzv. Krukenbergův nádor, což je oboustranné bramborovité zvětšení obou ovárií. Mikroskopicky se jedná o metastázy málo diferencovaného hlenotvorného adenokarcinomu s výraznou fibroprodukcí, nejčastěji z gastrointestinálního traktu (32) Grading a staging karcinomu ovaria Grading nádoru Řada studií udává stupeň diferenciace nádoru tzv. grading za prognostický důležitý faktor (12, 27, 49). U ovariálního karcinomu však neexistuje jednotný obecně uznávaný systém, což činí výsledky obtížně reprodukovatelné. Nejužívanější hodnotící systémy gradingu karcinomů vaječníků jsou tři: systém doporučený FIGO (the International Federation of Gynecology and obstetics), dále WHO (Světová zdravotnická organizace) a doporučení GOG (Gynecologic Oncology Group) (3, 45). Hodnocení je obecně založeno na architektonické stavbě a buněčných charakteristikách. FIGO systém diferenciace nádoru je založen na stanovení poměru 13

14 žlázové a papilární složky k solidním partiím. WHO klasifikace gradingu je založena na architektonických a cytologických rysech. Grading dle GOG je různý pro jednotlivé histologické typy ovariálního karcinomu (43). Někteří autoři se pokusili vytvořit jednotný systém gradingu karcinomu ovária (2, 6). Žádná z těchto klasifikací však nebyla obecně akceptována. Silverberg se při definování nového systému gradingu ovariálních karcinomů inspiroval Nottinghamskou klasifikací gradingu karcinomu prsu. Snažil se vytvořit systém univerzální (použitelný pro všechny histologické typy ovariálního karcinomu), jednoduchý a klinicky validní. Hodnotil tři parametry: 1. architektura nádoru, 2. charakter jader a 3. mitotický index: 1. architektura nádoru - v ovariálním karcinomu převažují tři formy růstu: glandulární (žlazové), papilární, solidní. Prognosticky je nejpříznivější glandulární růst. Naopak solidní růst je spojen s agresivním chováním. Jednotlivé typy růstu byli obodovány. Glandulární růst - skóre 1, papilárně rostoucí skóre 2, solidní tumory skóre charakter jader - taktéž ohodnoceny body. Jádra pravidelná, s nízkým nukleocytoplasmatickým poměrem a s jemným chromatinem skóre 1; jádra vykazující určité odchylky ve velikosti, rozložením chromatinu skóre 2; jádra bizardní, s velkým rozdílem ve velikosti, zhrubělým chromatinem a velkými eozinofilními jadérky skóre mitotická aktivita se hodnotila na 30 zorných polí za použití velkého zvětšení, tzn. objektiv 40x, celkové zvětšení 400x (tzv. HPF - high power field). Byl zaznamenán největší počet mitos na 10 HPF. Opět bylo použito skóre. Nejméně bodů získaly nádory s 9 a méně mitozami, skóre 2 měli nádory s mitózami, skóre 3 měli tumory s více než 25 mitózami. Vzhledem k tomu, že všechny tyto parametry byly skórovány body 1 až 3, konečné skóre se pohybuje v rozmezí mezi 3 až 9 body - viz tabulka 2. 14

15 Tabulka 2. Grading karcinomu ovaria dle Silverberga Počet bodů Grade dobře diferencovaný středně diferencovaný málo diferencovaný Tento definitivní grade nádoru signifikantně koreloval s přežitím jak v časných, tak v pokročilých stadiích u všech typů ovariálního karcinomu; s výjimku tvořil nádor ze světlých buněk, kde významná korelace nebyla zjištěna. Silverberg dále zjistil, že grade ovariálního karcinomu predikuje přežití lépe než histologický typ. Histologie nádoru je však mnohem přínosnější pro předpověď odpovědi nádoru na chemoterapii a může napomoci při volbě vhodné terapie (43). Výpovědní hodnota diferenciace nádoru je však také závislá na pokročilosti onemocnění. U časných stadiích diferenciace nádoru významně koreluje s pětiletým přežitím (41, 55). Zato u pokročilých stadiích však spíše koreluje s odpovědí na podanou chemoterapií (45) Staging nádoru Staging je stanovení stádia pokročilosti nádodu. Staging je stejně jako u jiných nádoru založen na TNM klasifikaci. Ta zahrnuje rozsah primárního nádoru (T), přítomnosti regionálních uzlinových metastáz (N) a na přítomnosti vzdálených metastáz viz tabulka 3A-C. 15

16 Tabulka 3A: Staging ovariálního karcinomu dle primárního nádoru (T) TX T0 T1 T2 T3 T1a T1b T1c T2a T2b T2c T3a T3b T3c primární nádor nelze hodnotit bez známek primárního nádoru nádor ohraničen na vaječníky nádor ohraničen na jeden vaječník, pouzdro intaktní, žádný nádor na povrchu vaječníku, v ascitu nebo peritoneálním výplachu nejsou maligní buňky nádor ohraničen na oba vaječníky, pouzdro intaktní, žádné známky nádoru na povrchu vaječníků, v ascitu nebo peritoneálním výplachu nejsou maligní buňky nádor ohraničen na jeden nebo oba vaječníky buď s rupturou pouzdra, nebo nádorem na povrchu ovária nebo maligní buňky v ascitu či peritoneálním výplachu nádor postihuje jeden či oba vaječníky, šíří se v pánvi šíří se na dělohu a/nebo vejcovod(y) nebo implantáty na děloze nebo vejcovodu (vejcovodech), v ascitu nebo peritoneálním výplachu nejsou maligní buňky šíří se na jiné pánevní tkáně, v ascitu nebo peritoneálním výplachu nejsou maligní buňky šíří se v pánvi (2a nebo 2b), s maligními buňkami v ascitu nebo peritoneálním výplachu nádor postihuje jeden či oba vaječníky, s mikroskopicky prokázanými peritoneálními metastázami mimo pánev mikroskopické peritoneální metastázy mimo pánev makroskopické peritoneální metastázy mimo pánev velikosti 2 cm a méně peritoneální metastázy mimo pánev větší než 2 cm v největším rozměru 16

17 Tabulka 3B: Staging ovariálního karcinomu dle lymfatických uzlin (N) NX N0 N1 regionální mízní uzliny nelze hodnotit v regionálních mízních uzlinách nejsou metastázy metastázy v regionálních mízních uzlinách Tabulka 3C: Staging ovariálního karcinomu dle vzdálených metastáz (M) MX M0 M1 vzdálené metastázy nelze hodnotit nejsou vzdálené metastázy vzdálené metastázy (mimo peritoneální metastázy) V případě ovariálního karcinomu se však častěji používá klasifikace vytvořená International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) viz tabulka 4 (5). Tabulka 4: Staging karcinomu ovaria dle FIGO klasifikace Stadium I T1 N0 M0 Stadium II T2 N0 M0 Stadium III T3 N0 M0 Stadium IV Jakékoliv T N1 M1 17

18 1.4. Prognostické markery stanovitelné imunohistochemicky V poslední době je publikována celá řada studií snažících se identifikovat nějaké prognostické či prediktivní faktory u karcinomu ovária. Jejich význam je však doposud nejasný a výsledky v řadě případů rozporuplné. Často využívanou metodou k identifikaci prognostických markerů je imunohistochemie. Nejčastější studované prognostické faktory lze rozdělit do těchto skupin: 1. steroidní (estrogenové a progesteronové) receptory exprimované nádorovými buňkami, 2. zhodnocení kinetiky buněčného růstu v ovariálních karcinomech prostřednictvím stanovení proliferační aktivity nádorových buněk (zejména za využití proliferačních antigenů jako je Ki-67 nebo topoisomeráza IIα), 3. overexprese onkoproteinu HER-2/neu nádorovými buňkami, 4. exprese onkoproteinů majících vztah k apoptóze (p53, p21, bcl-2, bax a jiné proteiny) nádorovými buňkami, 5. stanovení angiogenního potenciálu ovariálního karcinomu imunohistochemickým průkazem angiogenních faktorů (např. vaskulárního endoteliálního růstového faktoru - VEGF) či kvantifikací kapilár v místech největší angiogenní aktivity 6. průkaz tumor infiltrujících lymfocytů v nádorové tkáni (52) Průkaz exprese hormonálních receptorů Progesteron a estrogeny jsou hormony produkované ováriem, které působí přes specifické receptory. Interakce mezi steroidními hormony a jejich receptory (estrogenové receptory, ER a progesteronové receptory, PR) hraje velmi důležitou roli v procesu karcinogeneze nejen gynekologických malignit, ale i jiných solidních nádorů (zejména u karcinomu prsu a prostaty) (24). 18

19 Receptory pro steroidní hormony regulují buněčnou proliferaci a diferenciaci, a v nádorech mohou zásadním způsobem ovlivňovat jejich růst a progresi (28). Takovéto nádory jsou označovány za hormonálně závislé (dependentní). V nádorové progresi hraje významou úlohu vznik buněčné populace, která je na hormonální regulaci nezávislá a brzy po svém vzniku se stane dominantní částí nádoru. Nádory tohoto typu jsou pak nazývány hormonálně nezávislé (independentní) (24). Exprese ER a/nebo PR či jejich kombinace (ER+/PR+, ER+/PR-, ER+/PR-, ER-/PR-) byla identifikována jako prediktivní faktor pro hormonální terapii (28). Na rozdíl od karcinomu prsu se studie o prognostickém významu exprese hormonálních receptorů u karcinomu ovária různí. Existují studie, které neprokazují žádný prognostický význam exprese hormonálních receptorů buňkami ovariálního karcinomu (15, 51). Na druhou stranu však byly publikovány studie, které usuzují na možnost vztahu mezi počtem ER a/nebo PR u ovariálního karcinomu a jeho prognózou. Některé studie popisují delší přežití u pacientek s nádorem exprimujícím PR. Byla též prokázána lepší odpověď na podanou chemoterapii u tumorů s přítomností ER a PR než u tumorů bez exprese receptorů (18, 28) Průkaz proliferační aktivity nádoru Studium buněčné kinetiky, zejména hodnocení proliferační aktivity nádoru zaujímá dnes v nádorové patologii významné místo. Proliferace buněk je jedním ze základních biologických procesů zajišťujících růst a udržení tkáňové homeostázy. Buňka se dělí zdvojnásobením svého obsahu a následným rozdělením ve dvě buňky dceřiné. Tento proces se nazývá buněčný cyklus. Střídá se v něm fáze mitosy a interfáze. Ve fázi mitózy dochází k vlastnímu rozdělení buňky na dvě buňky dceřiné. Interfáze se dělí do několika fází: G1 - dochází k nárůstu buněčné hmoty a k syntéze organel; fáze S syntéza, kdy dochází ke replikaci DNA; fáze G2 dochází k opravě DNA a k přípravě na vlastní dělení. Dělení poté probíhá ve čtyřech fázích: profáze, metafáze, anafáze, telofáze (24). 19

20 Klíčovou úlohu pro vstup buňky do buněčného cyklu je fáze G1, kdy je buňky citlivá k mitogenním signálům. Regulace buněčného cyklu v mnohobuněčném organismu podléhá přísné kontrole. V reakci na okolní i vnitřní stav je buňka schopna aktivovat signální dráhy vedoucí k zástavě buněčného cyklu (24). Metod kvantifikace buněk, které se nacházejí v buněčném cyklu je celá řada. Nejednodušší metodou je kvantifikace mitotických figur v tkáňovém řezu barveném standardním histologickým barvením, t.j. hematoxylinem-eozinem (HE). Určuje se počet mitos na přesně definovaný počet zorných polí určitého zvětšení (33). Poměrně jednoduchou a levnou metodou k určení proliferační aktivity nádorových buněk je imunohistochemie. Nejčastěji prokazovanými antigeny jsou jaderné nonhistonové proteiny jako PCNA (proliferating cell nuclear-antigen), Ki-67 či topoisomeráza IIα. Většinou se jedná o enzymy a kofaktory účastnící se syntézy DNA v průběhu S fáze buněčného cyklu (50). O karcinomu ovaria pojednává mnoho autorů, kteří se snaží stanovit prognostický význam proliferační aktivity nádorových buněk imunohistochemickým průkazem antigenu Ki-67 či topoizomerázy IIα. Většina prací používajících tyto imunohistochemické metody prokázala prognostický význam proliferační aktivity nádorových buněk (15, 16, 37), existují však i práce která tyto výsledky nepotvrdily (8, 52) Průkaz onkoproteinu HER-2/neu Overexprese transmembránového onkoproteinu HER-2/neu je pozorována u 20-30% nádorů různého spektra, zejména u karcinomu prsu, slinných žláz, plic apod. Tato overexprese koreluje se špatnou prognózou nádoru. V klinické praxi má význam existence monoklonální anti-her-2/neu protilátky transtuzumab (Herceptin), která jako první začala být používána v molekulárně cílené léčbě u pacientek s nádorem prsu s HER-2/neu overexpresí (nejprve s metastatickým nádorovým onemocněním, nověji i v adjuvantní terapii) (52). S frekvencí 10-44% byla exprese HER-2/neu popsána i u ovariálního karcinomu (tato variabilita může souviset s použitím různých technik pro jeho 20

21 stanovení) (52). Existují však studie, které potvrzují signifikantně horší prognózu HER-2/neu pozitivních nádorů ve srovnání s HER-2/neu negativními nádory. Amplifikace HER-2/neu je také častější u ovariálních tumorů rezistentních na platinové preparáty (8, 38) Průkaz onkoproteinů majících vztah k apoptóze Velká pozornost je poslední dobou věnována apoptóze nádorových buněk. Charakteristickým rysem nádorových buněk je jejich neschopnost uskutečnit proces apoptózy, což je spojeno s agresivnějším chováním tumoru a zpravidla i selháním chemoterapie a radioterapie. Účinek této terapie totiž spočívá právě v aktivaci apoptózy. Nejvíce je v tomto ohledu prostudován účinek onkogenu bcl-2 (antiapoptotický gen), jehož produktem je protein bcl-2. Jeho nadbytek inhibuje zánik buňky apoptózou a podporuje buněčnou proliferaci. Overexprese proteinu bcl-2 tak může vést k mnohočetné rezistenci nádorových buněk vůči cytostatikům. Jeho velmi důležitou funkcí je též tvorba neaktivních heterodimerů s proapoptoticky působícími molekulami, proto je vzájemný poměr mezi pro- a protiapoptotickými proteiny podstatnější než samotná hladina bcl-2 proteinu. Protein bax je naopak proapoptotický činitel, stejně tak jako protein p53. Jejich inaktivace má za následek nesmrtelnost buňky a rozvoj nádorového bujení (50). Mutace genu pro p53 a akumulace nefunkčního proteinu p53 je dosud nejčastěji popsanou genetickou alterací u ovariálních karcinomů. V literatuře je shoda v tom, že mnohem častěji je zvýšená exprese p53 nacházena u pokročilých stádií ovariálního karcinomu než u časných stadií. Některé studie naznačují, že zvýšená exprese p53 u stadia III-IV je sdružena se snížením pětiletého přežití a potvrdily i overexpresi onkoproteinu p53 jako nezávislý prognostický marker (4, 42, 50). Exprese proteinu p21 v ovariálních karcinomech byla studována jen velmi omezeně. Jedná se o inhibitor cyklin-dependentních kináz, jehož sekrece je aktivována vzestupem hladiny proteinu p53 při poškození DNA. Studie Geislera a kol. prokázala, že kombinace exprese p21 a negativního proteinu p53 je nezávislým prognosticky příznivým faktorem (14). 21

22 Angiogeneze Růst a vývoj nádoru malých rozměrů (do 1-2 mm v průměru) je zajišťován prostřednictvím difúze z okolí. U nádorů větších rozměrů však prostá difúze není dostatečná a odpovídající zásobení včetně odvádění odpadních produktů musí být zajištěno prostřednictvím krve. Nezbytnou podmínkou dalšího růstu nádoru je tedy nastartování novotvorby cév z preexistujícího cévního řečiště - angioinvaze. Po vzniku angiogenního fenotypu v nádoru dochází k jeho prudkému až exponenciálnímu růstu (39, 50). Hypotézu o pozitivním vztahu mezi vaskularizací tumoru a jeho biologickým chování poprvé jednoznačně potvrdili ve své studii Srivastava a kol. v roce 1988 na na souboru maligních melanomů, kde zjistili korelaci mezi relativní plochou cév ve spodině tumoru a jeho recidivami či metastazováním (44). V roce 1991 následovala studie Weidnera, která se zabývala vztahem mezi počtem novotvořených kapilár v nádoru a prognózou karcinomu prsu. V této práci byl počet kapilár kvantifikovaný v místech s největší angiogenní aktivitou (tzv. hot spots ). Studie prokázala signifikantní korelaci mezi maximálním počtem kapilár a metastatickou potencí nádoru (53). Studiem angiogeneze v ovariálních karcinomech se zabývala celá řada prací. Většina vychází z modifikace původní Weidnerovy metody kvantifikace kapilár liší se však volbou detekovaného antigenu, zvětšením a velikostí zorného pole. Některé z nich se zabývá vlivem angiogeneze na další vývoj nádorového onemocnění a některé z nich prokázaly pozitivní korelaci mezi angiogenní aktivitou nádoru a prognózou (13, 30, 35, 46). Identifikována byla celá řada proangiogenních faktorů, mezi nejznámnější patří: basic fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), epidermal growth factor (EGF) a řada dalších. Jedním z nejdůležitějších angiogenních faktorů je VEGF, který způsobí během několika minut extrémní zvýšení permeability cév. Při delším působení funguje jako vysoce specifický mitogen pro endoteliální buňky, indukuje jejich proliferaci a následnou novotvorbu kapilár. VEGF indukuje rovněž expresi proteolytických enzymů nezbytných při remodelaci novotvořených kapilár (50). 22

23 Existuje celá řada prací zabývající se expresí VEGF v karcinomech ovária. Některé tento cytokin prokazují v nádorové tkáni imunohistochemicky, jiné stanovují jeho hladinu v ascitu nebo v séru pacientek s ovariálním karcinomem metodou ELISA. Výsledky jsou však značně rozporuplné (10, 30, 29, 54) Tumor infiltrující lymfocyty (TIL) V posledních letech je snaha porozumět roli imunitního systému v progresi nádorů (57). V nádorech se vyskytují tumor infiltrující mononukleární buňky složené z T lymfocytů (helper a suppressor/cytotoxic), NK (natural killer) buněk, B lymfocytů a makrofágů. Tento zánětlivý infiltrát je zpravidla oligoklonální a je indikátorem aktivní imunitní odpovědi organismu proti nádorovým antigenům. Většina infiltrujících T lymfocytů jsou CD8 pozitivní lymfocyty, které zprostředkovávají specifickou cytotoxickou reakci proti nádorovým buňkám. Na druhou stranu většinu z tumor infiltrujících mononukleárních buněk tvoří CD68 pozitivní makrofágy. Jejich rolí je aktivace lymfocytů, neboť tyto buňky jsou antigen prezentující. Makrofágy však tvoří funkčně heterogenní skupinu, často s antagonistickými funkcemi a mohou jak inhibovat, tak stimulovat proliferaci nádorových buněk (17). Řada studií prokazuje prognostický význam tumor infiltrujících lymfocytů u nádorů jako např. karcinom prsu, prostaty, tlustého střeva, jícnu či u maligního melanomu. V případě ovariálního karcinomu však existuje velmi málo prací na toto téma a jejich výsledky jsou rozporuplné (26, 35, 40, 56). 23

24 2. Cíle studie Cílem předkládané práce bylo přispět k hledání signifikantních prognostických markerů u invazivního karcinomu ovária, které je možno stanovit imunohistochemicky a v budoucnu je užívat k rutinní předpovědi možného vývoje nádoru. Výsledky by mohli pomoci při volbě vhodné protinádorové terapie (zejména vytipováním vysoce rizikových pacientek, u kterých by bylo možno volit agresivnější terapii). V této práci jsme se zaměřili na zjištění případného prognostického významu imunohistochemické detekce CD3 pozitivních tumor infiltrujících lymfocytů v nádorové tkáni. Tato práce byla podpořena grantem IGA MZ NR8363-3/

25 3. Experimentální část 3.1. Charakteristika souboru Soubor tvořily invazivní karcinomy ovária diagnostikované v období až na Fingerlandově ústavu patologie, Fakultní nemocnice Hradec Králové, které splňovaly následující požadavky: 1) bylo možno zajistit dostatek materiálu pro imunohistochemické vyšetření, 2) bylo možno dohledat klinické údaje: stádium tumoru dle FIGO klasifikace, velikost reziduálního tumoru po operaci a délka přežívání od primární operace. Tato kritéria splnilo celkem 116 případů a ty byly předmětem studia potenciálních prognostických parametrů Histologické vyšetření Materiál byl rutinně fixovaný v 10% formalínu. Byl makroskopicky prohlédnut, popsán a byli proveden standardizovaný odběr tkáně na histologické vyšetření. Byly odebrány vždy nejméně tři vzorky z nádoru se zaměřením na pouzdro, případně na periferii tumoru. Za optimální byl považován odběr 1 bločku na každý 1 cm velikosti primárního nádoru. K histologickému vyšetření byla odebrána všechna ložiska z omenta podezřelá z metastatického postižení. Vzorky byli zpracovány standardní histologickou technikou: odvodnění ve vzestupných koncentracích etanolu od 70% - 96%, prosycení látkou mísící se s parafinem tj. xylenem a prosycení parafinem. Poté byly tkáňové bloky zality do parafinu a nakrájeny na sáňkových mikrotomech na řezy o síle 2 µm žiletkovými noži. Tyto řezy byli využity k rutinnímu barvení v histologické technice - hematoxylin eosin a také k imunohistochemickému průkazu antigenu CD3. U každého nádoru byl stanoven histologický typ nádoru a současně byl stanoven grading hodnocením dle Silverberga (43). 25

26 3.3. Imunohistochemické vyšeření Základem metody je detekce specifických antigenních determinant (molekul či jejich částí) s využitím imunologické vazby, tj. na principu antigen (Ag) - protilátka (Ab). V našem případě byla použita nepřímá dvoustupňová metoda na průkaz CD3 antigenu. V první fázi reaguje primární specifické antisérum s prokazovaným antigenem - s intracytoplasmatickými peptidy umístěnými na ε řetězci. V druhé fázi je aplikována sekundární protilátka s navázanou křenovou peroxidázou. Tento enzym využívá jako svého substrátu diaminobenzidin (DAB). V případě pozitivity navázané protilátce označenou peroxidázou vzniká nerozpustné hnědé zbarvení. Jako pozitivní byly hodnoceny buňky s hnědou pozitivitou jader. K expresi antigenu CD3 dochází nejprve v perinukleární oblasti. CD3 představuje jeden z nejrannějších příznaků příslušnosti k buněčné linii T- buněk Pomůcky a přístroje Při imunohistochemickém vyšetření byly potřeba tyto pomůcky: laboratorní sklo, kyvety na preparáty, váženka, lžička, kapátka, filtrační papír, krycí skla, pinzeta, olejová tužka na označení lokalizace řezů na skle (super pap pen IM 3580), vlhká komůrka (MIST- magnetic imuno staiing tay), automatická pipeta (Finnpipete); tyto přístroje: ph metr (Inolab), ph elektroda (sen tix 21), mikroskop (Nikon E 2OO), váhy (AND EK 3000i), vodní lázeň (Dako) Roztoky Při práci jsme potřebovali tyto roztoky: etanol 96% (lékárna Fakultní nemocnice Hradec Králové), destilovaná voda, xylen (čistý, směs isomerů, Penta, č.š ), aceton (čistý, Penta, č.š ), pufr S 3308 (DAKO, č.š , 26

27 ph=9,9), 0,8% H 2 O 2 (lékárna Fakultní nemocnice Hradec Králové), pufr PBS (lékárna Fakultní nemocnice Hradec Králové), primární protilátka anti human CD3 (polyklonální,dako, č.š.25517), DAB substrát (DAKO, č.š. 5464), Koďouskův hematoxilin, kanadský balzám (Serve,č.š.50124), Antibody diulent (DAKO, č.š ), Envision Dual link systém peroxidase (DAKO, č.š.30972) Pracovní postup Při imunohistochemickém vyšetření se musí nejdříve řezy natažené na podložních sklech zbavit parafinu to se děje ve třech lázních xylenu, poté ze zavodní přes sestupnou řadu etaholu ( 96% - 70%) v destilované vodě. Před vlastní aplikací primární protilátky se musí ve tkáni demaskovat antigeny. Také se inaktivuje endogenní peroxidáza, která by nám poskytovala falešně pozitivní reakci. Po aplikaci naředěné primární protilátky s Antibody dilulent (1:100) a jejím oplachu se reakce znázorňuje pomocí sekundární protilátky s navázanou peroxidázou Envision Dual link systém peroxidase. Po přidání chromogenu DAB substrát, se dobarví jádra Koďouskovým hematoxylinem. Poté se řezy zbaví vody a prosytí xylenem, který nám řezy projasní. Skla se zamontují pomocí krycího skla s kapkou Kanadského balzámu. Při práci jsme postupovali dle tabulky 5. Tabulka 5.: postup imunohistochemického vyšetření 1. Deparafinace řezů - 3x 10 min xylen, 2x 5 min 96% etanol, 5 min 70% etanol 2. Oplach destilovaná voda 1 min 3. Odhalení antigenů vodní lázeň při 96 C v pufru S min 4. Necháme vychladnout, oplach v destilované vodě 5. Tlumení endogení peroxidázové aktivity 0,9% H min 27

28 6. Oplach destilovanou vodou 1min 7. Oplach v PBS pufru při ph = 7,2 1 min 8. Aplikace primární protilátky anti CD 3 30 min (ředění 1 :100) 9. Oplach v PBS pufru při ph = 7,2 1min 10. Envision Dual link systém peroxidase 30 min 11. Oplach v PBS pufru při ph = 7,2 1min 12. DAB substrát 5min 13. Oplach destilovanou vodou 1min 14. Koďouskův hematoxylin 1min 15. Pramenitá voda 3 min, 3x 96% etanol 3min, aceton 3min, 3x xylen 3min Hodnocení imunohistochemické reakce Tkáňové řezy byly prohlíženy při zvětšení objektivem 40x (tj mm 2 ) za použití mikroskopu Nikon E 200. Bylo prohlédnuto šest různých oblastí, kde bylo přítomno největší množství CD3 pozitivních T lymfocytů (jako pozitivní byly hodnoceny buňky s hnědou pozitivitou jader), z toho tři oblasti s lymfocyty v nádorovém epitelu (tzv. intraepiteliální lymfocyty) a tři oblasti s lymfocyty v nádorovém stromtu (tzv. stromální lymfocyty). Počet tumor infiltrujících lymfocytů byl zhodnocen manuálně a následně jejich počet převeden na 1 mm 2. Imunohistochemické řezy byly hodnoceny bez předchozí znalosti klinických dat. 28

29 3.4. Statistická analýza dat Při statistické analýze získaných dat byl použit tento program: Number Cruncher Statistical System software (NCSS, Kaysville, Utah). Doba celkového přežití byla sledována Kaplan-Meierovou metodou. Srovnání dle jednotlivých sledovaných faktorů (univariantní analýza) byla provedena pomocí log-rank testu, multivariantní analýza Coxovou metodou. Za statisticky významnou bylo považována hodnota p < 0,05. 29

30 4. Výsledky Soubor tvořilo 116 pacientek. Jejich věk se pohyboval v rozmezí 27 až 82 let (průměr 55; medián 53 let). Rozdělení souboru dle četnosti v jednotlivých dekádách věku znázorňuje graf 1. Z grafu je patrno, že toto nádorové onemocnění postihuje nejčastěji ženy v 5. až 7. dekádě (101 pacientek, tj. 87,1 %). Graf 1: Rozdělení pacientek dle dekád věku Počet případů dekáda 4. dekáda 5. dekáda 6. dekáda 7. dekáda 8. dekáda 9. dekáda Věk V tabulce 6 je patrno rozdělení souboru dle pokročilosti nádorového onemocnění (staging). Z této tabulky je zřejmé, že u 87 % pacientek bylo nádorové onemocnění pokročilé (stádium III a IV). Zejména to platí pro serózní a endometroidní karcinom, který byl velmi často byl diagnostikován až v pozdních stádiích (v 81,8 %, resp. v 80,6 %). Naopak mucinózní karcinom byl zjištěn ve stádiu I ve více než ve dvou třetinách případů. 30

31 Tabulka 6: Rozdělení případů dle pokročilosti nádoru Stage Počet Serózní Endometr. Mucinoz. Světlobb. Dedifer. n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) I 24 (20,7) 7 (12,7) 6 (16,6) 10 (71,4) 1 (16,7) 0 (0) II 5 (4,3) 3 (5,5) 1 (2,8) 0 (0) 1 (16,7) 0 (0) III 68 (58,6) 44 (80,0) 20 (55,6) 0 (0) 1 (16,7) 3 (60) IV 19 (16,4) 1 (1,8) 9 (25,0) 4 (28,6) 3 (50,0) 2 (40) V tabulce 7 jsou patrny údaje o velikosti reziduálního tumoru po operaci (tyto údaje se podařilo dohledat pouze u 112 pacientek, u zbylých 4 žen informace o velikosti reziduálního tumoru v klinické dokumentaci nebyla uvedena). Tabulka 7: Rozdělení případů dle velikosti reziduálního tumoru Velikost rezid. tumoru Počet % Žádný 62 55,3 Do 2 cm 21 18,8 Více jak 2 cm 29 25,9 V tabulce 8 je přehled nádorů dle histologického typu. V souboru převládají karcinomy serózní a endometroidní. Tabulka 9 znázorňuje rozdělení nádorů dle jejich diferenciace (gradingu) celkově a dle jednotlivých histologických typů. Je zde patrné, že v souboru převládaly nádory středně a málo diferencované (44,8 %, resp. 41,4 %). Stranou stojí opět karcinom mucinózní, kde bylo poměrně vysoké zastoupení nádorů dobře diferencovaných (42,9 %) a nevyskytl se žádný nízce diferencovaný mucinózní karcinom. 31

32 Tabulka 8: Přehled zastoupení jednotlivých histologických typů Histologický typ Počet % Serózní 55 47,4 Endometroidní 36 31,0 Mucinózní 14 12,1 Světlobuněčný 6 5,2 Nediferencovaný 5 4,3 Tabulka 9: Grading dle jednotlivých histologických typů Histologie Počet (%) Grade 1 Grade 2 Grade 3 Serózní 9 (16,4) 23 (41,8) 23 (41,8) Endometroidní 1 (2,8) 17 (47,2) 18 (50,0) Mucinózní 6 (42,9) 8 (57,1) 0 (0) Světlobuněčný 0 (0) 4 (66,7) 2 (33,3) Dediferencovaný 0 (0) 0 (0) 5 (100) Celkem 16 (13,8) 52 (44,8) 48 (41,4) Z celkového počtu 116 vyšetřených pacietek za období pozorování zemřelo 62 žen (tj. 53 %). Doba pozorování (follow-up) se pohybovala mezi 1 až 120 měsíci, medián doby pozorování pro celou skupinu byl 39 měsíců. Medián doby přežití byl 48 měsíců a 5tileté přežití 43 %. CD3 pozitivní tumor infiltrující lymfocyty (TIL) byly pozorovány ve všech nádorech, jednak v nádorovém stromatu (tzv. stromální lymfocyty), jednak infiltrující nádorový epitel (tzv. intraepiteliální lymfocyty). Medián počtu stromálních TIL byl 32

33 338 lymfocytů/mm 2 (rozmezí lymfocytů/mm 2 ). Medián počtu intraepiteliálnich TIL byl 125 lymfocytů /mm 2 (rozmezí lymfocytů /mm 2 ). Obr 6: CD3 pozitivní T lymfocyty v nádorovém stromatu (stromální), imunohistochemie CD3, zvětšeno 200x Při statistickém zpracování v univariantní analýze (log-rang test) byly jako statisticky významné faktory mající vliv na délku přežití zjištěny tyto parametry: věk (p = 0,02), stage (p = 0,000005), reziduální tumor (p = 0,00001), grade (p = 0,02) a počet intraepiteliálních CD3 pozitivních TIL (p = 0,000002) viz tabulka 10. V multivariantní analýze (Coxova regresní analýza) jsme jako nezávislé prognostické faktory na délku přežití nalezli tyto parametry: věk (p = 0,01), 33

34 přítomnost reziduálního tumoru (p = 0,004), stage (p = 0,004) a počet intraepiteliálních CD3 pozitivních TIL (p = 0,00001) - viz tabulka 11. Histologie a počet stromálních CD3 pozitivních TIL nekoreloval s dobou přežití pacientek s ovariálním karcinomem v univariantní ani multivariantní analýze. Obr 7: CD3 pozitivní T lymfocyty v nádorovém epitelu (intraepiteliální), imunohistochemie CD3, zvětšeno 200x 34

35 Tabulka 10: Výsledky univariantní analýzy Nezávislý parametr Medián přežití (měsíce) p Věk (nižší než median vs. vyšší) > 60 vs. 40 0,02 Stage (I/II vs. III/IV) > 60 vs. 37 0, Grade (dobře/středně vs. málo diferencov.) > 60 vs. 39 0,02 Histologie (serózní vs. ostatní) 48 vs. 48 0,77 Reziduální tumor (nepřítomen vs. přítomen) > 60 vs. 28 0,00001 Stromální TIL (nižší než median vs. vyšší) 56 vs. 48 0,80 Intraepiteliální TIL (nižší než median vs. vyšší) 29 vs. > 60 0, Tabulka 11: Výsledky multivariantní analýzy Nezávislý parametr Relativní riziko 95 % C.I. p Věk 0,50 0,29 0,85 0,01 Stage 0,23 0,09 0,64 0,004 Reziduální tumor 0,43 0,24 0,74 0,004 Intraepiteliální TIL 3,91 2,22-6,91 0,

36 5. Diskuze Karcinom ovária je šestým nejčastějším maligním onemocněním u žen na světě. Tento nádor je nejčastější příčinou smrti ze všech gynekologických maligních nádorů. Vysoká mortalita je zapříčiněna zejména tím, že je tento nádor často diagnostikován až v pokročilých stádiích (stádium III, event. IV), neboť časná stádia jsou obvykle asymptomatická a neexistují efektivní skríningové metody. Průměrné 5- leté přežití je 40%, v pokročilých stádiích je to však pouhých 10-20%. Z hlediska prognózy mají zásadní význam stádium nádoru dle FIGO, velikost reziduálního tumoru, věk a celkový stav pacientky v době diagnózy, histologie tumoru a v případě časných stádií též stupeň diferenciace nádoru (grade) (25, 47). V současné době je problém ovariálního karcinomu ve světové literatuře velmi diskutovaným tématem. Existuje velké množství studií, které přinášejí často rozporuplné údaje. Rozsáhle studovanou oblastí je zejména určení možných prognostických markerů, které by mohly predikovat další vývoj onemocnění a pomoci tak onkologům při volbě vhodné protinádorové terapie (agresivnější terapie u nádorů s prognosticky nepříznivými faktory). Prezentovaná data této práce potvrdily výsledky řady předchozích studií, že u ovariálního karcinomu mají zásadní prognostický význam zejména klinické parametry. Mezi nejdůležitější z nich patří věk pacientky v době diagnózy a velikost nádorového rezidua po primární operaci (7, 9, 11, 27, 31, 36, 48). Na našem souboru ovariálního karcinomu byly tyto dva faktory potvrzeny jako statisticky významné, jak v univariantní analýze (věk p = 0,02, reziduální tumor p = 0,00001), tak zejména v analýze multivariantní ( věk p = 0,01, reziduální tumor p = 0,004). Srovnávali jsme přežití pacientek mladších než je medián a starších, příčemž medián doby přežití byl u mladších žen 60 měsíců, u starších jen 40 měsíců. Relativní riziko úmrtí je u žen mladších jen 0,5 oproti starším pacientkám. Rozdíly u skupiny s přítomným reziduálním tumorem a skupiny bez něj jsou ještě nápadnější: medián doby přežití 28 měsíců oproti 60 měsícům. Relativní riziko úmrtí u pacientek 36

37 bez nádorového rezidua po primární chirurgické operaci je jen 0,43 oproti pacientkám s reziduálním nádorem. Pokročilost nádorového onemocnění (stage) je dalším významným prognostickým faktorem. V naší studii jsme porovnávali skupinu pacientek s časným nádorovým onemocněním (tj. stádium I a II dle FIGO) a skupinu s pokročilým onemocněním (tj. stádium III a IV dle FIGO). Univariantní i multivariantní analýza nalezla stage jako statisticky významný prognostický faktor (p = 0,000005, resp. p = 0,004). Medián doby přežití u pacientky s časným onemocněním byl 60 měsíců, zatímco u žen s pokročilým nádorovým onemocněním jen 37 měsíců. Relativní riziko úmrtí u žen s nádorem v časných stádiích je pouze 0,23 oproti pacientkám s pokročilým nádorovým onemocněním. K obdobným výsledkům jako jsou naše dospěly i jiné studie (7, 12, 49). Oproti tomu studie autorů Chi a kol. na souboru 282 pacientek s ovariálním karcinomem nalezla prognostický význam pokročilosti nádorového onemocnění jen v analýze univariantní, v multivariantní však již ne (11). Některé práce za prognosticky významný faktor považují i histologický typ ovariálního karcinomu. Brun a kol. ve své studii prokázali horší prognózu u serózního karcinomu ve srovnání s ostatními histologickými typy. Ve své studii popisovali 1,7x vyšší riziko úmrtí na tento histologický typ karcinomu (7). Obdobné výsledky jako Brun publikovali na velmi rozsáhlém souboru (1189 pacientek) též Clark a kol. (12). Další práce, která nalezla prognostický význam histologického typu ovariálního karcinomu, byla studie autorů Makar a kol. Tito autoři na souboru 455 pacientek s ovariálním karcinomem ve stádiu III prokázali histologický typ jako významný prognostický faktor (p < 0,001). Dle jejich studie má nejlepší prognózu endometroidní karcinom, prognosticky nejhorší je karcinom světlobuněčný, jehož riziko úmrtí je 7x vyšší než u karcinomu endometroidního (27). Omura a kol. na souboru 726 pacientek s ovariálním karcinomem ve stádiu III a IV nalezli horší prognózu u mucinózního a světlobuněčného karcinomu, neboť se jedná o nádory málo citlivé na chemoterapii (31). V naší studii jsme srovnávali přežití skupiny pacientek se serózním karcinomem ovária se skupinou pacientek s ostatními histologický typy. 37

38 V univariantní ani multivariantní analýze jsme nenalezli žádný prognostický význam histologického typu. Medián doby přežití byl u obou skupin pacientek 48 měsíců. Mezi další histologické prognostické faktory je řazen stupeň diferenciace (grade) ovariálního karcinomu. Makar a kol. v multivariantní analýze zjistili, že riziko úmrtí pacientek se středně a málo diferencovaným ovariálním karcinomem je oproti dobře diferencovanému 2,5x vyšší (p < 0,001) (27). Taktéž Clark a kol. ve své studii na rozsáhlém souboru 1189 ovariálních karcinomů potvrdili stupeň diferenciace za nezávislý prognostický faktor (12). Některé studie však nalezly grade jako prognosticky významný faktor pouze v univariantní analýze, multivariantní analýza však tento výsledek nepotvrdila (7, 49). Jiné práce naopak prognostický význam stupně diferenciance neprokázaly vůbec (1). Tyto rozdílné výsledky jsou zřejmě částečně způsobeny inter- a intrapersonální variabilitou v hodnocení gradingu a též nejednotností v systému určování stupně diferenciace. K eliminaci této chyby jsme v naší práci použili hodnocení gradingu dle Silverberga (43). Grade je však považován za významný prognostický faktor u časných stádií ovariálního karcinomu (stage I a II) (45, 55). V naší studii jsme v univariantní analýze prognostický význam diferenciace ovariálního karcinomu nalezli (p = 0,02). Medián doby přežití byl ve skupině karcinomů dobře diferencovaných 60 měsíců, zatímco ve skupině karcinomů středně a málo diferencovaným byl jen 39 měsíců. Multivariantní analýza však grade za nezávislý prognostický faktor nepotvrdila. Reakce mezi imunitním systémem organismu a nádorem hraje velmi důležitou roli v progresi nádorového růstu. Recentní studie ukazují, že tato interakce může být ovlivněna tvorbou solubilních substancí nádorovými buňkami a tumor infiltrujícími lymfocyty (17). Přítomnost tumor intiltrujících lymfocytů v nádoru je považována za indikátor odpovědi imunitního systému organismu na nádorové antigeny a řada studií výraznou lymfocytární infiltraci nádoru považuje za pozitivní prognostický parametr na celkové přežití (40). Již v roce 1991 ve své práci autoři Ma a kol. vyšetřili soubor 94 pacientek s karcinomem ovaria za využití α-naftyl acetázy k detekci tumor infiltrujících lymfocytů. Využili tedy histochemické, nikoliv imunohistochemické detekce těchto lymfocytů. 38

39 Autoři ve své práci nalezli korelaci mezi přítomností TIL v nádorové tkáni a celkovým přežitím pacientek s ovariálním karcinomem, ale též se stádiem maligního onemocnění, histologickým typem a diferenciací karcinomu (26). V roce 2003 publikovali výsledky své studie Zhang L. a kol. Imunohistochemicky vyšetřili celkem 186 karcinomů ovaria ve stádiu III a IV dle FIGO za použití antigenu CD3 k detekci T lymfocytů v nádorové tkáni a nalezli korelaci mezi přítomností či absencí TIL a klinickým průběhem pokročilého karcinomu ovária. Přítomnost TIL v nádorové tkáni byla spojena s mediánem doby přežití 2.8x delším než u nádorů bez TIL. V multivariantní analýze potvrdili TIL za nezávislý prognostický faktor (p < 0.001) (56). Další prací zabývající se prognostickým významem TIL u ovariálního karcinomu je studie autorů Raspollini a kol. z roku Imunohistochemicky vyšetřili celkem 95 serózních karcinomů ovaria ve stádiu III dle FIGO. Taktéž tato práce potvrdila prognosticky významný TIL na celkové přežití pacientek s touto malignitou (p = ). Navíc nalezli asociaci mezi počtem CD3 pozitivních TIL a odpovědí na první linii chemoterapie (35). V roce 2005 byla publikována další práce zaměřující se na význam TIL u ovariálního karcinomu. V této studii Sato a kol. jako první rozlišují stromální (v nádorovém stromatu) a intraepiteliální (v nádorovém epitelu) lymfocyty. Autoři vyšetřili celkem 117 karcinomů ovaria ve všech stádiích a zastoupeny byly všechny histologické typy. Kromě antigenu CD3 stanovovali imunohistochemicky i další markery T lymfocytů (např. CD4 a CD8). V případě CD3 pozitivních T lymfocytů nenalezli žádnou korelaci mezi jejich počtem v nádorovém stromatu ani intraepiteliálně a prognózou onemocnění. Jako jediný subtyp lymfocytů, který měl v této studii prognostický význam na celkovou dobu přežití, byl počet intraepiteliálních CD8 pozitivních TIL (p = 0,002) (40). Obdobně jako Sato a kol. (40) jsme i my v naší studii zhodnotili zvlášť prognostický význam CD3 pozitivních T lymfocytů v nádorovém stromatu a zvlášť T lymfocytů infiltrujících nádorový epitel, tzv. intraepiteliálních lymfocytů. V případě stromálních lymfocytů jsme nenalezli žádný prognostický význam v univariantní ani multivariantní analýze. U pacientek s počtem stromálních T lymfocytů vyšších než medián byl medián doby přežití 48 měsíců, u pacientek s počtem stromálních T 39

40 lymfocytů nižším než medián jen 56 měsíců, což se však ukázalo statisticky nevýznamné (p = 0,80). Mnohem zajímavější statistické výsledky (jak v univariantní, tak multivariantní analýze) byly v případě tzv. intraepiteliálních CD3+ T lymfocytů. Medián doby přežití byl u žen s počtem intraepiteliálních T lymfocytů vyšších jak medián více jak 60 měsíců, zatímco u pacientek s počtem těchto lymfocytů nižším jak medián pouhých 29 měsíců. Tento parametr je velmi silným prognostickým faktorem (v univariantní analýze p = 0,000002, v multivariantní analýze p = 0,00001). Relativní riziko úmrtí pacientek s ovariálním karcinomem, kde je přítomnost intraepiteliálních lymfocytů nižší než medián, je 3,91x vyšší než u žen s počtem těchto lymfocytů vyšším než medián. Naše výsledky tedy potvrzují nálezy předchozích studií, že přítomnost intraepiteliálních tumor infiltrujících lymfocytů má prognostický význam na přežití žen s malignitou, s tak špatnou prognózou jako je karcinom ovária. Ačkoliv většina pacietek s pokročilým ovariálním karcinomem v iniciální fázi reaguje na chemoterapii, dlouhodobé výsledky chemoterapie nejsou již tak příznivé. Manipulace s imunitním systémem vedoucí k navození imunitní odpovědi organismu proti nádoru nabízí možnost zefektivnění protinádorové léčby s eradikací reziduálních nádorových buněk (35). 40