MIKROSKOPIE MICROSCOPY OF TIME VARIABLE BIOLOGIC OBJECTS

Transkript

1 VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA STROJNÍHO INŽENÝRSTVÍ ÚSTAV FYZIKÁLNÍHO INŽENÝRSTVÍ FACULTY OF MECHANICAL ENGINEERING INSTITUTE OF PHYSICAL ENGINEERING MIKROSKOPIE ČASOVĚ PROMĚNNÝCH BIOLOGICKÝCH OBJEKTŮ MICROSCOPY OF TIME VARIABLE BIOLOGIC OBJECTS DIZERTAČNÍ PRÁCE DOCTORAL THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR ŠKOLITEL SPECIALISTA CO-SUPERVISOR Ing. HANA UHLÍŘOVÁ doc. RNDr. RADIM CHMELÍK, Ph.D. MUDr. PAVEL VESELÝ, CSc. Ústav molekulární genetiky AV ČR Institute of Molecular Genetics, AS CR BRNO 2010

2 Abstrakt Předmětem disertační práce je využití transmisního digitálního holografického mikroskopu (DHM) navrženého a zkonstruovaného v Laboratoři optické mikroskopie na ÚFI VUT v Brně pro výzkum dynamiky živých buněk. První část práce se zabývá teoretickým popisem vlastností zobrazení mikroskopu v závislosti na koherenci osvětlení doplněným experimenty s modelovým a reálným biologickým vzorkem. V další části jsou popsány konstrukční změny a inovace mikroskopu a jeho vybavení, které umožnily využívání mikroskopu pro pozorování živých buněk. V experimentální části byla vypracována metodika přípravy a pozorování živých buněk pro DHM, která byla ověřena při zobrazení dynamiky buněčné apoptózy indukované cytostatikem cis-platinou. Byla zkoumána také dynamika živých buněk při standardních podmínkách a za působení deprivačního stimulu. Pro vyhodnocení kvantitativních změn rozmístění buněčné hmoty během experimentů byla vytvořena metoda zpracování holograficky rekonstruované fáze nazvaná dynamické fázové diference. Touto metodou byly odhaleny různé vzorce chování rakovinových buněk během specifické reakce v závislosti na typu buněk, stupni jejich malignity a hustotě porostu. Pro kvantitativní analýzu fázového zobrazení z DHM byla navržena vhodná statistická charakteristika a způsob interpretace naměřených dat, které byly úspěšně aplikovány při porovnání vnitrobuněčného pohybu dvou typů rakovinových buněk rodičovské a dceřiné linie. Na základě uvedeného zpracování pozorování byly stanoveny hypotézy o mechanismu reakce nádorových buněk na nepříznivé životní podmínky. V závěru práce jsou shrnuty poznatky a doporučení pro konstrukci a aplikace nové generace transmisního DHM. Abstract The subject of the PhD thesis is the application of a transmission digital holographic microscope (DHM) which was designed and constructed in the Laboratory of optical microscopy at the IPE BUT for the research of live cells dynamics. First part of the work is concerned with theoretical description of the microscope imaging properties dependent on the coherence of illumination. It is supplemented with experiments of imaging of a model and a real biological specimen. The following part describes construction modifications and innovations of the microscope and its equipment that enabled the utilization of the microscope for live cells observations. In the experimental part the methodology of live cells preparation and DHM imaging was worked out. The methodology was verified by the observation of cell dynamics during an apoptosis induced by the cytostaticum cis-platinum. Further experiments examined the dynamics of live cells in standard conditions and during a deprivation stimulus. A novel method of holographically reconstructed phase, named dynamic phase differences, was set up to evaluate quantitative changes of cell mass distribution during the experiments. Depending on the degree of malignancy and density of cell outgrowth, various schemes of cancer cells behaviour during a specific reaction were revealed using this method. For the quantitative analysis of the DHM phase imaging, a suitable statistical characteristic and an interpretation of the measured data were proposed. Both of them were successfully applied for the comparison of cell motility of two cell types: parental and progeny cell lines. On the basis of the proposed processing, hypotheses describing the reaction mechanism of tumour cells to stress life conditions were established. In the conclusions we summarize our findings and suggestions for the construction and the applications of a new generation of the transmission DHM.

3 Klíčová slova Digitální holografická mikroskopie, nízká koherence, zobrazování živých buněk, suchá hmota buňky, dynamické fázové diference, apoptóza. Keywords Digital holographic microscopy, low coherence, live cell imaging, cell dry mass, dynamic phase differences, apoptosis. UHLÍŘOVÁ H. Mikroskopie časově proměnných biologických objektů. Brno, s. Dizertační práce. Vysoké učení technické v Brně, Fakulta strojního inženýrství, Vedoucí dizertační práce doc. RNDr. Radim Chmelík, Ph.D.

4 Prohlašuji, že jsem předloženou práci vypracovala v celém rozsahu samostatně pod vedením doc. RNDr. Radima Chmelíka, Ph.D. a MUDr. Pavla Veselého, CSc., a že veškeré podklady, ze kterých jsem čerpala, jsou uvedeny v seznamu literatury. Ing. Hana Uhlířová

5 Na tomto místě děkuji doc. RNDr. Radimu Chmelíkovi, Ph.D za vedení dizertační práce, nesčetné konzultace a pomoc při řešení úkolů. Dále děkuji MUDr. Pavlu Veselému, CSc. (Ústav molekulární genetiky AV ČR, Praha) za vedení biologické části práce, neustálou motivaci a pracovní nasazení. Děkuji také RNDr. Janu Brábkovi,Ph.D. a RNDr. Danielu Röselovi, Ph.D. (oba Katedra buněčné a molekulární biologie, Př.f. UK, Praha), Ing. Martinu Antošovi, Ph.D, Ing. Pavlu Kolmanovi, Ing. Lukáši Kvasnicovi a Ing. Tomáši Zikmundovi za spolupráci. V neposlední řadě děkuji svému manželovi Vojtovi za jeho trpělivost, laskavost, pomoc a pochopení a rodičům za stálou podporu. Ing. Hana Uhlířová

6

7 Obsah 1 Úvod Historický přehled transmisní interferenční mikroskopie Současný stav Motivace a cíle práce Transmisní DHM Schéma transmisního DHM Justáž transmisního DHM Nastavení mikroskopu pro pozorování Konstrukční úpravy mikroskopu Vytápění mikroskopu a komora Osový posuv v referenční větvi Stolek a posuv objektu Dorazy stolku Systém regulace časové a prostorové koherence osvětlení Stacionární pozorovací komůrky Průtokové pozorovací komůrky Teoretický rozbor vlivu koherence osvětlení Vliv koherence osvětlení na vlastnosti zobrazení Časová koherence osvětlení Prostorová koherence osvětlení Vliv velikosti zdroje na kontrast interferenčních proužků Experimenty se změnou koherence světla Modelový experiment Zobrazení buněk v rozptylujícím médiu Pozorování buněk v opalescentním médiu Význam kvantitativního fázového kontrastu buňky Vztah indexu lomu a hustoty Význam kvantitativní fáze buňky Zpracování a vyhodnocení obrazu Základní úpravy kvantitativní fáze Dynamické fázové diference

8 OBSAH 7.3 Statistické vyhodnocení DPD Rozlišení DHM Experimenty s buňkami Standardní příprava vybavení pro pozorování Reakce nádorových buněk G3S2 na cispt Reakce buněk na energetickou a nutriční deprivaci Zobrazení v Zernikově fázovém kontrastu Zobrazení v DHM Závěr Porovnání motility cytoskeletonu dvou typů buněk Motilita za standardních podmínek Motilita při externím stimulu Závěr Testování průtokových komůrek Závěr 61 Dodatek: Biologické pracoviště 64 Seznam použitých symbolů 64 Literatura 68 8

9 Kapitola 1 Úvod 1.1. Historický přehled transmisní interferenční mikroskopie Snaha o aplikaci interferenční mikroskopie v biologii nebo medicíně byla jistě inspirována možností zobrazit transparentní preparáty. Skutečnost, že některé objekty jsou okem či mikroskopem dobře patrné, zatímco jiné velmi těžko, vedla k rozdělení objektů z optického hlediska na amplitudové a fázové. Zatímco amplitudové objekty mění amplitudu procházejícího světla, fázové objekty mění jeho fázi. Jakýkoliv detektor (oko, kamera, fotografická deska) je citlivý vůči změnám intenzity (tedy kvadrátu modulu amplitudy), což způsobí, že amplitudové objekty mají přirozený kontrast, zatímco fázové nikoliv. V polovině 17. století si poprvé Robert Hook všimnul barevných proužků [1], které byly později identifikovány jako interference jev, který potvrzuje vlnovou podstatu světla a je ovlivněn fází světla. Od té doby uplynulo přes 200 let, než byl využit potenciál transmisních interferenčních mikroskopů pro zviditelnění fázových objektů. Transmisní interferenční mikroskopie mohla být již od roku 1907, kdy byly vyvinuty tkáňové kultury, používána pro studium buněk. V této době ale převládly jiné zobrazovací techniky, jako je metoda světlého a temného pole, v kombinaci s fixováním a barvením buněk. Podle [2] byla interferenční mikroskopie poprvé aplikována na živé buňky až po roce Mezi tím Zernike vyvinul fázový kontrast a tato metoda zviditelňování fázových diferencí ovlivněním fáze části světla difraktovaného vzorkem se stala až do dnešní doby nejběžněji používanou metodou pro pozorování nebarvených buněk. Byla také vyvinuta metoda diferenciálního interferenčního kontrastu. Tyto dvě techniky tvořily dominantní nástroj pro výzkum transparentních objektů, zatímco interferenční mikroskopie se uplatňovala spíše pro mikro-interferometrii v reflexní verzi. Je nutno poznamenat, že jedna verze reflexního mikroskopu dosáhla také širokého uplatnění v buněčné biologii, a to interferenční mikroskop vyvinutý roku 1964 Curtisem [3] pro studium kontaktů buněk se substrátem [4], [5]. Do poloviny 20. století nebyla v buněčné biologii transmisní interferenční mikroskopie využívána jako metoda interferometrická. Skutečnost, že jako jediná umožňovala nejen zobrazit, ale také změřit rozdíl optické dráhy (OPD) indukovaný vzorkem, nebyla doceněna, protože nebyla známa vhodná interpretace této měřitelné veličiny. V roce 1952 přišel Barer [6] s výkladem buňkou indukovaným OPD. Jeho práce zvýšily popularitu transmisní interferenční mikroskopie, což mělo za následek některé důležité objevy v 50. a 60 letech v buněčné biologii [7], [8]. Nicméně po této aplikaci nastal další úpadek připisovaný komplikovanosti zařízení a jejich vysoké pořizovací ceně [2]. Transmisní interferenční mikroskopy se přestaly vyrábět. Obnovený zájem o tento typ mikroskopů se objevuje na přelomu století při pátrání po nekon- 9

10 1.2. SOUČASNÝ STAV venčních zobrazovacích technikách. Mikroskopy jsou zaváděny pod názvem digitální holografické mikroskopy (DHM), protože jejich zobrazení umožňuje rekonstrukci jak fáze, tak i intenzity. Práci s těmito mikroskopy značně usnadnil především rozvoj počítačové a digitální techniky. Dokonce se znovu objevuje jejich komerční produkce (firma Lyncée tec). V dnešní době existují transmisní DHM pro různé biologické aplikace, ale zůstávají v několika výzkumných laboratořích a v běžné biomedicíncké praxi se stále nevyužívají Současný stav V současné době mají transmisní digitální holografické mikroskopy obvykle optické schéma odpovídající Machovu-Zehnderovu interferometru. Některé holografické systémy využívají osové holografie, a vyžadují tedy záznam více interferogramů pro jedinou rekonstrukci [1], [9]. Tyto techniky, označované jako phase shifting či phase stepping, nejsou vhodné pro zobrazování rychle se měnících objektů a nejsou příliš odolné vůči změnám teploty a vibracím. Ostatní holografické systémy používají tak zvanou mimoosovou holografii, která umožňuje rekonstrukci obrazové vlny z jediného hologramu [10], [11]. Tyto techniky, ač náročnější na rozlišení detekčního zařízení, jsou běžnější díky své rychlosti a obecně menší citlivosti na změny zobrazovacích podmínek v čase. Stávající DHM se liší také charakterem použitého osvětlení. Koherentní zdroje světla jsou často nahrazovány nízkokoheretními, a to ze dvou hlavních důvodů: 1) jsou potlačeny nežádoucí interference v systému, takže výsledný obraz není znehodnocen koherenčním šumem [12], a 2) zobrazení má konfokální charakter, vytváří se optické řezy. To znamená, že vícenásobně rozptýlené světlo se nepodílí na vzniku obrazu [13], [14], [15], [16]. Na druhé straně koherenční délka vymezuje oblast numerického přeostřování [12], tj. oblast, ve které lze vypočítat zobrazení šířením vlny zaznamenané v jiné rovině. Doposud se v mimoosových systémech používalo většinou koherentního osvětlení [17], [18], [19], zatímco nízkokoherentního světla se používlo především v osových systémech [13], [14], [15], [16]. Existují i mikroskopy s mimoosovým uspořádáním a nízkokoherentním osvětlením [20], zde však je oblast interference omezena časovou koherencí zdroje [21], kterou tudíž nelze příliš omezovat. Prvním systematickým zkoumáním buněk interferenčním mikroskopem byla práce G. A. Dunna, A. F. Browna a D. Zichy, kteří nejen buňky zobrazili, ale využili i kvantitativního fázového kontrastu k dalšímu zpracování a vyhodnocení pohybu a tvaru buněk [22], [23], [24]. Digitální holografická mikroskopie je v současnosti využívána v biologii buněk nejčastěji pro tyto typy experimentů: zjištění integrálního indexu lomu buněk, např. [25], [26], možnost rekonstrukce 3D oblasti z jednoho hologramu at již pro doostření preparátu během pozorování [17] nebo pro automatickou objemovou identifikaci objektů [27], [28], [16], [29], porovnání změny kvantitativní fáze buněk při aplikaci externího stimulu, jako např. efekt trypsinu [30], hypertonického nebo hypotonického prostředí [15], toxinu Latrunculinu [19] nebo laserových nůžek [31]. 10

11 1.3. MOTIVACE A CÍLE PRÁCE Digitální holografická mikroskopie byla použita také například pro optickou tomografii [32], pro výzkum fluktuace membrány erytrocytů [33], určování počtu buněk [34], rozpoznávání kmenových buněk [35] nebo vizualizaci krevních buněk pulce in vivo [36] Motivace a cíle práce V Laboratoři optické mikroskopie na FSI VUT v Brně byl vyvinut transmisní DHM, který se v počátečních aplikacích ukázal být vhodným nástrojem pro zobrazování buněk. Mikroskop umožňuje kvantitativní zobrazení fázového rozdílu mezi referenční a předmětovou vlnou (dále jen kvantitativní fáze), které oproti metodě klasického Zernikova fázového kontrastu nebo diferenciálního interferenčního kontrastu vypovídá o skutečném rozmístění suché hmoty buňky [37]. Fázi v tomto DHM lze zaznamenávat s vysokou vzorkovací frekvencí (12 Hz), a monitorovat tak dynamické děje v buňce. Proto bylo uplatnění mikroskopu směřováno především k časosběrným záznamům reakcí živých buněk na vnější podněty. Navíc je tento mikroskop navržen tak, že v mimoosovém uspořádání umožňuje použít světlo mnohem nižší koherence než u ostatních v aplikacích známých a používaných systémů, což dává předpoklad pro zobrazování preparátů v silně rozptylujících prostředích. Intenzita osvětlení živých preparátů při použití nízkokoherentního světla může být velmi nízká, a metoda se stává neinvazivní, což je výhoda oproti používané technice fluorescenčního barvení buněk. Cílem doktorské práce bylo využití techniky zobrazování digitálním holografickým mikroskopem při pozorování dynamiky živých buněk. Jednalo se tedy o využití především kvantitativní fáze zobrazeného preparátu a využití vlastností zobrazení s nízkokoherentním osvětlením. Experimentální činnost měla vést k vývoji metodiky justáže mikroskopu, přípravy vzorků a pozorování mikroskopem. Na základě provedených experimentů měla být také vyvinuta metodika zpracování obrazu a analýza významu kvantitativní fáze živých buněk. Dalším cílem bylo zkoumání teoretických i experimentálních aspektů holografického zobrazení v závislosti na koherenčních vlastnostech použitého osvětlení. V rámci doktorské práce se předpokládaly změny a inovace mikroskopu a jeho vybavení a dále přizpůsobení přístroje pro biomedicínský výzkum a později praxi. Byly nutné také úpravy a vývoj softwaru pro zpracování dat z DHM. 11

12 Kapitola 2 Transmisní DHM 2.1. Schéma transmisního DHM Obrázek 2.1: Schéma DHM, který je předmětem práce. Symboly Z 1 Z 5 označují zrcátka, IF interferenční filtr, O osvětlovací objektiv, K 1, K 2 kondenzory a O 1, O 2 objektivy. Jedná se o achromatický interferometr Machova-Zehnderova typu [38], [39], obr Optické 12

13 2.2. JUSTÁŽ TRANSMISNÍHO DHM schéma mikroskopu je odvozeno od reflexní verze digitálního holografického mikroskopu publikovaného pod názvem Parallel-mode confocal microscope [40]. Zdrojem světla je halogenová lampa. Osvětlovací soustava byla navržena na principu Köhlerova osvětlení, takže osvětlovací čočka (O) zobrazí zdroj do přední 1 ohniskové roviny objektivů K 1 a K 2, které slouží jako kondenzory, a tím je zajištěno rovnoměrné osvětlení předmětu a referenčního objektu. Děličem svazku světla je lineární fázová difrakční mřížka, na níž svazek difraktuje a zrcátky se vybírá +1. a 1. difrakční řád tvořící svazky referenční a předmětové větve. Prostorová frekvence difrakční mřížky f = 70mm 1 byla zvolena tak, aby difrakční a interferenční úhly svazků byly malé. Není tedy potřeba použít spojovacího členu a interferenční obrazec je lokalizovaný ve výstupní rovině mikroskopu (dále jen výstupní rovina). Zároveň ale musí být splněna holografická podmínka, která říká, že prostorová frekvence interferenčních proužků musí být alespoň 3 vetší než maximální prostorová frekvence, kterou přenesou objektivy ([41], str. 23). Svazek předmětové větve je z difrakční mřížky zrcátky směrován do kondenzoru K 2. Pak prochází předmětem, na který je zaostřen objektiv O 2. Tento objektiv zobrazí předmět do výstupní roviny, kde se protínají svazky z obou větví a interferují. Referenční větev má stejnou konstrukci až na to, že mezi kondenzorem K 1 a objektivem O 1 není předmět, ale pouze referenční objekt. V našem případě je předmětem komůrka s buňkami naplněná médiem a v referenční větvi je pouze komůrka s médiem. Rozdíl optických drah svazků je tedy v ideálním případě způsoben pouze průchodem světla buňkami. Za výstupní rovinou je umístěn výstupní objektiv, který zobrazuje hologram na čip CCD kamery. Jeho funkcí je zvětšit interferenční obrazec, aby bylo splněno kritérium prostorové vzorkovací frekvence kamery. V tomto achromatickém mikroskopu je úhel mezi osou svazku +1. a 1. difrakčního řádu stejný jako úhel, pod kterým tyto svazky interferují, a to pro každou vlnovou délku (úhly α 0 pro větší vlnovou délku a úhly α pro menší vlnovou délku v obrázku 2.1). Ve výstupní rovině tedy tvoří světlo všech vlnových délek hologramy se stejnou prostorovou frekvencí interferenčních proužků. V tomto smyslu tedy velikost oblasti interference není omezena časovou koherencí osvětlení Justáž transmisního DHM Justáž mikroskopu provádíme s laserovou diodou vyzařující na centrální vlnové délce 2 λ 0 = 650 nm. Nastavení osvětlení probíhá nejdříve bez osvětlovací čočky O. Orientace optických prvků a osy mikroskopu v osvětlovací části odpovídá schématu na obrázku 2.1. Diodu umístíme tak, aby stopa svazku procházela vodorovně středem otvoru pro uchycení osvětlení a po odrazu na zrcátku Z 1 směřovala doprostřed difrakční mřížky. Správný směr svazku kontrolujeme podle stopy nultého difrakčního řádu odraženého od mřížky, která musí po odrazu na zrcátku Z 1 v rovině otvoru pro uchycení osvětlení splynout se stopou paprsku vycházejícího z diody. Dále je nutné nastavit zrcátka Z 2 a Z 3 v obou větvích tak, aby svazky, které procházejí dírami pro kondenzory, procházely středem děr a zároveň kolmo na rovinu dosedů objektivů O 1 a O 2. Položíme rovinné zrcadlo na dosedovou plochu těchto objektivů a obě díry pro kondenzory K 1 a K 2 zacloníme clonkou s kruhovým otvorem uprostřed díry pro kondenzor. Otvor ve clonce slouží k centrování svazku. Šrouby S 1 S 4 (obr. 2.2) naklápíme zrcátka Z 2 a Z 3 tak, aby svazek v obou větvích procházel právě otvory v clonkách. Kontrolou kolmosti svazku vůči dosedovým plochám 1 Přední je míněno ve směru chodu paprsků. 2 Jako centrální budeme nadále vždy označovat tuto vlnovou délku. 13

14 2.2. JUSTÁŽ TRANSMISNÍHO DHM Obrázek 2.2: DHM s vyznačením justážních prvků. Tento mikroskop je k dispozici v Laboratoři optické mikroskopie na ÚFI VUT v Brně. objektivů je stopa světla odraženého zrcadlem položeným na dosedací plochu objektivů, která musí projít zpět otvory ve clonkách. Poté našroubujeme objektivy O 1 a O 2 a zkontrolujeme, zda stopa světla dopadá do jejich středu. Objektivy opět odšroubujeme. Poté je potřeba nastavit pomocí šroubů S 5 S 8 zrcátka Z 4 a Z 5 tak, aby se paprsky z obou větví setkávaly v ose mikroskopu ve výstupní rovině. Tato kontrola proběhne ztotožněním stopy světla se záměrným křížem matnice vložené do výstupní roviny, jejíž poloha vzhledem ke konstrukčním prvkům mikroskopu je zakreslena na obrázku 2.3. Při nastavování polohy zrcátek Z 4 a Z 5 je potřeba dbát na to, aby se stopy světla s rostoucí vzdáleností od výstupní roviny rozbíhaly vodorovně a symetricky vůči ose mikroskopu. Poté našroubujeme kondenzory K 1 a K 2 a pokud se stopa světla na matnici odchýlí z centra záměrného kříže, doladíme její polohu šrouby S 9 S 12, které posouvají s celými kondenzory. Následuje opět kontrola symetrie rozbíhavosti paprsků za výstupní rovinou. Našroubujeme objektivy O 1, O 2 a zkontrolujeme průchod paprsků jejich středy. Poté vložíme osvětlovací čočku, která zajišt uje Köhlerovo osvětlení, do vzdálenosti asi 116 mm od roviny clonek osvětlení. Do příslušné roviny vložíme clonky osvětlení a jemnými posuvy vystředíme clonku s vybraným průměrem tak, aby střed osvětlovacího paprsku procházel clonkou. Za výstupní rovinu našroubujeme výstupní objektiv, aby vzdálenost jeho dosedací plochy od výstupní roviny mikroskopu byla 53 mm. Našroubujeme také kameru dosedací plochou do vzdálenosti 197 mm od výstupní roviny. Tímto je dokončeno základní nastavení mikroskopu a dále při běžném používání 14

15 2.3. NASTAVENÍ MIKROSKOPU PRO POZOROVÁNÍ Obrázek 2.3: Poloha osy mikroskopu ve výstupní rovině, kde se protínají svazky světla z obou větví, vzhledem ke konstrukčním prvkům mikroskopu. Na obrázku vpravo je pohled směrem od kamery. Rozměry jsou uvedeny v milimetrech. mikroskopu již nepoužíváme šrouby S 1 S 4 a S 9 S Nastavení mikroskopu pro pozorování Před započetím série pozorování je vhodné provést následující nastavení mikroskopu s krycími skly. Do obou větví vložíme na stolek preparátu krycí sklíčko, protože používané objektivy jsou korigované právě na krycí sklíčko. Spustíme program ide2, který slouží k vyčítání obrazu z kamery a zobrazování holografických rekonstrukcí. Zakryjeme předmětovou větev vsunutím clonky do otvoru před kondenzor K 2 a posuvem P 1 (obr. 2.2), který posouvá oběma kondenzory v ose z (osa mikroskopu), zaostříme v rovině čipu kamery difrakční mřížku. Rovina difrakční mřížky, rovina preparátu, výstupní rovina mikroskopu a rovina čipu kamery jsou opticky sdružené roviny. Po zaostření difrakční mřížky v referenční větvi odkryjeme předmětovou větev a posuvem P 2, který pohybuje jen objektivem v předmětové větvi, doostříme difrakční mřížku i v této větvi. Poté šrouby S 5 S 8 sesadíme obrazy mřížek na sebe. Je vhodné nastavit těmito šrouby střed zobrazení difrakční mřížky do středu zorného pole. Dále ovládáme délku předmětové větve šroubem S 13 a při jeho otáčení zároveň korigujeme vzájemnou polohu obrazů mřížek v obou větvích (S 7 a S 8 ) tak dlouho, až nastavíme kontrastní interferenční proužky v celém zorném poli. Oblast největšího kontrastu interferenčních proužků kontrolujeme podle nejsvětlejší oblasti v online holografické rekonstrukci intenzity. Po tomto základním nastavení vyměníme krycí sklíčko za preparát v předmětové větvi a referenční komůrku v referenční větvi. Je potřeba opět doostřit mřížku v obou větvích a sesadit její obrazy na sebe. Při použití objektivů 20, které mají pracovní vzdálenost 1 mm je většinou nutné v závislosti na výšce použité komůrky rozostřit nejdříve preparát pohybem stolku k objektivům a pak teprve doostřit mřížku, aby nedošlo ke kontaktu frontálních čoček kondenzorů s preparátem. Je potřeba doladit také délku předmětové větve vůči referenční (S 13 ), než je nalezena oblast největšího kontrastu interferenčních proužků. Jelikož jsou na difrakční mřížce defekty v podobě vrypů a prachu, je nutné obraz mřížky na kameře rozostřit, což mikroskop dovoluje společným posuvem obou kondenzorů (P 1 ). Je vhodné rozostřit pohybem kondenzorů směrem od roviny preparátu pro zvětšení předmětového prostoru v ose z. Po tomto rozostření je opět nutné doladit interferenci pomocí S 7 a S 8 podle rekonstruované intenzity. Poté doostříme preparát posuvem stolku P 3. Tento postup opakujeme po každé výměně pozorovaného preparátu. 15

16 Kapitola 3 Konstrukční úpravy mikroskopu 3.1. Vytápění mikroskopu a komora Z požadavků dlouhodobého mikroskopického pozorování živých buněk savců a stability zaostření mikroskopu vyplývají vysoké nároky na stabilizaci teploty v oblasti vzorku na 37,0 C. Proto jsme navrhli dvojí systém vytápění. 1. Celý prostor okolo mikroskopu je vytápěn na teplotu přibližně 35 C. Pro tepelnou izolaci vytápěného prostoru jsme zkonstruovali komoru z izolačního komůrkového plexiskla. Topení je realizováno umístěním série rezistorů do drážek vyvrtaných do spodní stěny betonového kvádru o rozměrech mm 3 s mramorovou povrchovou úpravou. Jsou použity paralelně tři sekce po šesti rezistorech v sérii. Každý odpor v sérii má hodnotu 120 Ω. Výkon topení celkem činí 222W. Kvádr je umístěn do komory, a na něj je postaven mikroskop. Vytápění je regulováno digitálním termostatem Dixell XR10C (s ON/OFF regulací). Do obvodu je také připojena pojistka s nastavitelnou maximální teplotou. Vytápění celého prostoru je nutné pro temperaci všech mikroskopových komponent, především objektivů. Vytápěná komora sloužila také pro několikadenní přechovávání živých buněk. 2. Část stolku, na které leží vzorek, je vytápěna na teplotu 37,0 C. Pro tento účel byla navržena a zkonstruována duralová topná vložka ve tvaru mezikruží, která byla v konečné fázi vložena do stolku a zaaretována šrouby. Přenos tepla je realizován odporovým vodičem opředeným izolací (měrný odpor 6Ω/m, délka 2,4 m, průměr 0,3 mm), který je navinut na vybrání ve vložce. Proud procházející vodičem je regulován PID regulátorem Technologic TLK 38, který umožňuje přesnější stabilizaci teploty na základě automatického výpočtu parametrů při PID regulaci. Do vložky je provrtán otvor, do něhož je až k povrchu stolku zavedeno polovodičové NTC čidlo. Systém regulace je schopen udržovat teplotu v místě vzorku s přesností na desetinu C, což je plně vyhovující Osový posuv v referenční větvi Pozorováním preparátu ve větší hloubce média při použití neimerzních objektivů se projeví otvorová vada. Pokud je v obou větvích zaostřeno do stejné hloubky, malé otvorové vady kondenzorů se při rekonstrukci hologramu eliminují. Jestliže pozorovaný objekt příliš nerozptyluje světlo, částečně se eliminují také otvorové vady objektivů. Proto bylo třeba zkonstruovat separátní posuv v osovém směru pouze v jedné z větví. Dalším důvodem byla snaha o zajištění maximální možné optické ekvivalence obou větví. Tyto požadavky byly realizovány duralovou 16

17 3.3. STOLEK A POSUV OBJEKTU vložkou tvaru mezikruží (obr. 3.1) s jemným vnějším závitem a protikusem, jež byly vsazeny do stolku v referenční části mikroskopu, a protikus byl zaaretován šrouby. Šroubováním vložky je možné lokálně zvýšit nebo snížit rovinu stolku v referenční větvi tak, aby byla vzdálena od frontální čočky objektivu na jednotky mikrometrů stejně, jako je vzdálena rovina stolku od frontální čočky příslušného objektivu v objektové větvi. V takovém případě lze předpokládat dobrou eliminaci otvorové vady a optickou ekvivalenci větví. Obrázek 3.1: Stolek s posuvem, držákem vzorku, vložkou pro osový posuv a s topnou vložkou Stolek a posuv objektu Z důvodů umístění posuvné a topné vložky bylo třeba zkonstruovat nový stolek pro preparát. Pohyb preparátu v osách x,y bývá realizován třemi způsoby: 1. stolek má posuv v jedné ose (např. x) a vzorkem je posouváno v druhé ose (např. y), 2. stolek má posuvy v obou osách (x a y) a vzorkem není posouváno, 3. stolek je bez posuvu a vzorkem je posouváno v obou osách x a y. DHM je pro biologická pozorování používán v invertované verzi, takže objektivy procházejí stolkem, frontální čočkou až do úrovně roviny stolku. Tím znemožňují větší posuvy stolku. Proto pro návrh stolku byla zvolena třetí varianta, stolek pevný. Posuv vzorku byl realizován tak, že ke stolku byl připevněn mikrometrický posuv firmy Thorlabs s pohyblivostí v obou osách. Byl zkonstruován držák vzorku s pružným raménkem a připevněn k tomuto posuvu. Vzorek tedy leží na topné vložce a je posouván držákem (obr. 3.1) Dorazy stolku Pro vymezení prostoru při ostření vertikálními posuvy stolku byly zkonstruovány dorazy pro horní a spodní polohu, které zabraňují kontaktu vzorku s frontálními čočkami objektivů a kondenzorů Systém regulace časové a prostorové koherence osvětlení Pro experimenty využívající různé časové a prostorové koherence světla byl vyvinut systém regulace koherence. Časová koherence osvětlení byla omezována vsunutím barevných filtrů s různou 17

18 3.6. STACIONÁRNÍ POZOROVACÍ KOMŮRKY pološířkou spektrální propustnosti (od 10 nm až po bílé světlo). Pro regulaci prostorové koherence osvětlení byly vytvořeny kruhové clonky o průměrech od (0,3 4,0)mm a jejich držák s hrubým posuvem pro výměnu clonek a jemným posuvem pro jejich vystředění Stacionární pozorovací komůrky Pozorovací komůrky slouží pro umístění preparátu. Byly navrženy tak, aby imitovaly životní podmínky buněk v Petriho miskách a zároveň vyhovovaly podmínkám zobrazení objektivy. Maximální velikost komůrek je omezena geometrií mikroskopu: laterálně rozchodem referenční a objektové větve a axiálně pracovní vzdáleností objektivů (pro objektivy 10 /0, 25 jsme používali komůrky vysoké 0,8 mm, pro objektivy 20 /0,40 komůrky vysoké maximálně 0,5 mm). Pevnou část komůrky tvoří krycí sklíčko (průměr 22 mm) připevněné silikonem k nerezovému mezikruží (vnější průměr 22 mm, vnitřní průměr 15 mm), které vymezuje buňkám životní prostor. Silikon vyhovuje podmínkám netoxičnosti a je odolný vůči alkoholu a vyživovacímu médiu buněk. V této části komůrky jsou po jeho sterilizaci kultivovány buňky. Pro pozorování je komůrka uzavřena dalším krycím sklíčkem o stejných rozměrech a spoj je utěsněn vakuovou vazelínou Průtokové pozorovací komůrky Existují dva hlavní důvody pro přechod od stacionárních k průtokovým pozorovacím komůrkám: 1. možnost okamžitého snímání reakce po aplikaci vnějšího stimulu v podobě účinné látky, popřípadě záznam už během podávání látky, 2. možnost snímání stejného zorného pole před a po reakci, které zaručí přesnost určení účinků látky vzhledem k původnímu stavu pozorovaných buněk. Obrázek 3.2: Průtoková komůrka. Průtokové komůrky byly konstruovány pro pozorování s objektivy 10 /0,25, které poskytly dostatečný prostor mezi preparátem a kondenzorem. Později byly zakoupeny objektivy 20 /0, 40 LWD, které byly použity jako kondenzory v kombinaci s objektivy 20 /0, 40. Tato kombinace umožnila použití průtokových komůrek při zobrazení s větším zvětšením. Stávající průtokovou komůrku tvoří válec o vnějším průměru 25mm, a výšce 4 mm. Do něj byl vyvrtán otvor ve tvaru kosočtverce s hlavními osami o délce 18,5 mm a 13,5mm s delší osou ve směru proudění. Tento tvar napomáhá laminárnímu průtoku kapaliny komůrkou. K podstavám válce jsou z obou stran nalepena silikonem krycí sklíčka o tloušt ce 0,17 mm a průměru 25 mm. Do vrcholů kosočtverce ve směru delší poloosy byly vytvořeny dva otvory o průměru 1,5 mm pro 18

19 3.7. PRŮTOKOVÉ POZOROVACÍ KOMŮRKY zavedení jehly, z nichž jeden byl vyvrtán ve výšce 2 mm a druhý byl vybroušen na povrchu válce. Tento otvor je odtokový a je umístěn na povrchu komůrky, aby jím odcházely vzduchové bubliny a také aby bylo možné uchytit komůrku stávajícím posuvným systémem (viz odstavec 3.3). Do otvorů jsou zasunuty jehly o vnějším průměru 1,3 mm a vnitřním 1,2 mm s obroušeným hrotem a jsou v dírách utěsněny silikonem. Na jehly jsou navlečeny těsnící teflonové hadičky a na ně silikonové hadičky o vnitřním průměru 1,5 mm. Na přívodní hadičku je napojená jehla o stejných rozměrech a na ni injekční stříkačka, kterou je realizována výměna kapaliny v komůrce. Odvodní hadička vede do odpadní nádoby. Odvod je realizován pouze vytlačením příchozí tekutinou. Před jehlu přívodní hadičky je zapojen uzávěr, který brání pohybu kapaliny v přívodní hadičce a vzniku bublin. Do horní stěny kosočtverce byly vybroušeny zářezy sloužící jako pasti pro vzduchové bubliny, které se tak drží na kraji zorného pole. 19

20 Kapitola 4 Teoretický rozbor vlivu koherence osvětlení 4.1. Vliv koherence osvětlení na vlastnosti zobrazení Redukcí prostorové koherence osvětlení se holografické zobrazení přibližuje zobrazení konfokálnímu [40], [42]. Zobrazení obecně je za předpokladu lineárního a prostorově invariantního systému [43] charakterizováno impulsovou odezvou h zobrazovacího systému. Impulsová odezva konfokálního mikroskopu je součinem dvou impulsových odezev h = h 1 h 2, z nichž jedna přísluší zobrazení bodového zdroje na objekt (h 1 ) a druhá zobrazení bodu v objektu na detektor (h 2 ) [42]. Hlavními znaky konfokálního zobrazení jsou [42]: a) Vyšší rozlišení: jelikož impulsová odezva je součinem dvou impulzových odezev (h 1 h 2 ), pološířka funkce, která ji popisuje, je menší, než by byla pološířka funkce h 1 nebo h 2 odpovídající klasickému mikroskopu a rozlišení konfokálního mikroskopu je tak větší. b) Potlačení rozptýleného světla: rozptylující materiál umístěný do dráhy zobrazovacích paprsků, který rozšíří pouze jednu z impulsových odezev, nezpůsobí rozšíření h oproti zaostřenému obrazu klasickým mikroskopem rozlišení je stejné jako rozlišení dané užší impulsovou odezvou. Tato vlastnost umožňuje zobrazení pod rozptylující vrstvou. c) Hloubková diskriminace: signál rozostřeného objektu velmi rychle klesá k nule s rostoucím rozostřením. Potlačení rozptýleného světla a hloubková diskriminace mají za následek vytváření optických řezů objektem. Impulsová odezva holografického zobrazení při osvětlení plošným tedy prostorově nekoherentním zdrojem je popsána také součinem dvou impulsových odezev h 1 h 2, kde h 1 přísluší optické soustavě v objektové větvi, h 2 optické soustavě ve větvi referenční a značí komplexní sdružení [39]. Skutečnost, že holografické zobrazení charakterizuje součin dvou impulsových odezev má stejné důsledky na zobrazení (a c) jako u zobrazení konfokálního. Plné využití prostorově nebo časově nekoherentního světla v holografickém zobrazení vyžaduje použití tzv. achromatického interferometru. Tuto podmínku většinou splňují mřížkové interferometry [38], [39]. Vlivem disperze světla na difrakční mřížce je časově nekoherentní zdroj 20

21 4.2. ČASOVÁ KOHERENCE OSVĚTLENÍ z pohledu objektu prostorově rozložen na zdroje monochromatické. Redukovaná časová koherence je tedy mřížkou převedena na redukovanou prostorovou koherenci s důsledky a c na zobrazení. Redukce časové a zároveň prostorové koherence osvětlení má za následek další zjemnění optických řezů, které mohou být tenčí než v mikroskopu konfokálním. Ukazuje se dokonce, že osové rozlišení holografického zobrazení dané omezením časové a zároveň prostorové koherence světla je větší, než rozlišení dané superpozicí vlivu pouze časové a pouze prostorové koherence [44]. Proto je výhodné mít DHM s časově i prostorově nekoherentním světlem. Jelikož charakter zobrazení úzce souvisí s koherenčními vlastnostmi osvětlení, v následujících dvou odstavcích odhadneme charakteristiky časové a prostorové koherence, koherenční délku L k a koherenční šířku D k, které budou plně popisovat charakter osvětlení z hlediska koherenčních vlastností Časová koherence osvětlení DHM působí vzhledem k disperzi světla na mřížce jako spektrální filtr, jelikož pupily kondenzorů vymezují spektrální pásmo světla, které kondenzory projde. Spektrální hustota intenzity světla prošlého mikroskopem je tedy obecně jiná než spektrální hustota intenzity zdroje. Navíc vzhledem k prostorové nekoherenci zdroje se spektrální hustota intenzity interferujícího světla, tedy světla vytvářejícího obraz, liší od spektrální hustoty intenzity světla prošlého mikroskopem. V tomto odstavci je odvozeno, jak závisí spektrální hustota intenzity interferujícího světla na velikosti zdroje, tedy potažmo na jeho prostorové koherenci. Obrázek 4.1: Schéma průchodu světla pupilami kondenzorů (PK) pro centrální vlnovou délku λ 0 a a obecnou vlnovou délku λ 1, b obecnou vlnovou délku λ 2, přičemž λ 0 > λ 1 > λ 2. Díky tomu, že je mikroskop achromatický, je možné pro zobrazení použít světlo libovolné 21

22 4.2. ČASOVÁ KOHERENCE OSVĚTLENÍ koherenční délky, které projde mikroskopem a interferuje ve výstupní rovině. Pro zkoumání vlivu koherence osvětlení na zobrazení byl vytvořen systém regulace jak časové, tak i prostorové koherence. Časovou koherenci osvětlení lze regulovat vsouváním různých interferenčních filtrů s danou pološířkou spektrální propustnosti za zdroj světla. Pro regulaci prostorové koherence byly vyrobeny kruhové clonky o průměrech od 0,3 do 3 mm a jejich držák s jemnými posuvy pro vystředění clonky a s hrubým posuvem pro výměnu clonek. Osvětlovací soustava je tedy složena z halogenové lampy, matnice, clonky o zvoleném průměru a popřípadě z filtru s danou pološířkou spektrální propustnosti. Halogenovou lampu můžeme považovat za časově i prostorově nekoherentní zdroj. Ukazuje se, že koherenční délka prostorově nekoherentního světla podílejícího se na zobrazení je v DHM určena spektrálním složením světla zdroje, prostorovou frekvencí difrakční mřížky a velikostí pupily kondenzoru, popřípadě velikostí zdroje. Představme si, že plošný zdroj bílého světla spektrálně rozložíme na zdroje vyzařující na jednotlivých vlnových délkách. Zdroje však nadále zůstávají plošné a můžeme je považovat za prostorově nekoherentní, nebot velikost koherenčních plošek zobrazených do předních ohniskových rovin kondenzorů je menší, než je příčná rozlišovací schopnost kondenzorů ([45], str. 14). Předpokládáme, že pupily kondenzorů (PK v obr. 4.1) jsou umístěny v jejich přední ohniskové rovině. Zdroj, vyzařující na centrální vlnové délce λ 0, se zobrazí po difrakci na mřížce do pupil kondenzorů tak, že střed zobrazeného zdroje S 0 je totožný se středem pupil S (obr. 4.1). Zdroj vyzařující na menší vlnové délce λ 1 < λ 0 (obr. 4.1a) se zobrazí do roviny pupil kondenzorů tak, že jeho střed S 1 je posunutý směrem k ose mikroskopu o vzdálenost danou prostorovou frekvencí difrakční mřížky a rozdílem vlnových délek λ 0 λ 1. Pupilou tedy prochází pouze část zobrazení zdroje vlnové délky λ 1, a to v každé z větví jiná část. Jelikož se jedná o prostorově nekoherentní zdroj, ve výstupní rovině interferuje světlo z obou větví pocházející pouze ze stejného bodu zdroje. Body zdroje přispívající k interferenci jsou omezeny pupilami v obou větvích a tvoří efektivní plochu zdroje (průnik šrafovaných ploch v obr. 4.1a). Čím je větší rozdíl λ 0 λ 1, tím menší je efektivní plocha. Světlo vlnové délky, pro kterou se střed zdroje zobrazí na okraj pupily (obr. 4.1b), se již nepodílí na interferenci, i když mikroskopem prochází. Efektivní plocha zdroje je tedy dána prostorovou frekvencí difrakční mřížky, velikostí pupil kondenzorů a vlnovou délkou. Na obrázku 4.2 je spektrofotometrem naměřená spektrální hustota intenzity světla halogenové žárovky, zatímco na obrázku 4.3 je naměřená spektrální hustota intenzity světla prošlého mikroskopem, ve které se uplatní efekt spektrální filtrace světla difraktovaného na mřížce a omezeného pupilami kondenzorů. Obrázek 4.4 ukazuje vypočtenou závislost relativní efektivní plochy zdroje na vlnové délce pro různé průměry zobrazení zdroje omezeného clonkou v předních ohniskových rovinách kondenzorů. Zdroj se zobrazí do předních ohniskových rovin kondenzorů 2 zvětšený. Z obrázku je vidět, jak je spektrální šířka interferujícího světla ovlivňována velikostí zdroje. Spektrální hustotu intenzity zdroje v tomto případě musí nahradit korigovaná spektrální hustota intenzity pro danou velikost zdroje, která je součinem spektrální hustoty intenzity světla zdroje na obrázku 4.2 a relativní efektivní plochy na obrázku 4.4. Z této funkce (obr. 4.5) můžeme odhadnout efektivní koherenční délku interferujícího světla podle obvyklého vztahu L k = λ 2 λ, (4.1) 22

23 4.2. ČASOVÁ KOHERENCE OSVĚTLENÍ kde λ je střední vlnová délka a λ je pološířka korigované spektrální hustoty intenzity světla. Obrázek 4.2: Spektrální hustota intenzity světla halogenové lampy naměřená spektrofotometrem. Obrázek 4.3: Naměřená spektrální hustota intenzity světla halogenové lampy prošlého mikroskopem. 23

24 4.3. PROSTOROVÁ KOHERENCE OSVĚTLENÍ Obrázek 4.4: Závislost relativní efektivní plochy zdroje na vlnové délce pro dané průměry zobrazení zdroje v předních ohniskových rovinách kondenzorů. Obrázek 4.5: Korigovaná spektrální hustota intenzity světla pro dané průměry zobrazení zdroje v předních ohniskových rovinách kondenzorů Prostorová koherence osvětlení Koherenční šířku D k světla v předmětové rovině pro střední vlnovou délku λ a poloměr R c zobrazení zdroje v přední ohniskové rovině kondenzoru odhadneme podle vztahů odvozených 24

25 4.4. VLIV VELIKOSTI ZDROJE NA KONTRAST INTERFERENČNÍCH PROUŽKŮ pro Köhlerovo osvětlení a kvazimonochromatické světlo ([46], str. 526) u 12 = 2π λ µ(p 1,P 2 ) = 2J 1(u 12 ), (4.2) u 12 (x 1 x 2 ) 2 + (y 1 y 2 ) 2 n c sin θ c. (4.3) Odhad provádíme pro spektrálně úzké, kvazimonochromatické světlo, tudíž komplexní stupeň koherence je γ(p1,p2, τ) µ(p1,p2), kde τ vyjadřuje časové posunutí ([46], str. 508). Body označené P 1,P 2 se nacházejí v předmětové rovině o souřadnicích x,y, J 1 je Besselova funkce prvního druhu řádu 1, λ je střední vlnová délka a n c je index lomu prostředí mezi kondenzorem a předmětem. V našem případě n c = 1. Proměnná θ c označuje úhel mezi optickou osou a paprskem vycházejícím z krajního bodu zobrazení zdroje směřovaným kondenzorem do ohniska. Z průběhu funkce µ vyplývá, že pro u 12 = 1,22π je µ = 0 (např. [46], str. 397). Dosadímeli hodnotu u 12 = 1,22π do rovnice (4.3), můžeme odhadnout vzdálenost dvou bodů D k = (x1 x 2 ) 2 + (y 1 y 2 ) 2, kterými prochází již vzájemně nekoherentní světlo. Tato vzdálenost určuje průměr oblasti, ve které je světlo ještě prostorově koherentní a považujeme ji za koherenční šířku osvětlení v předmětové rovině. Platí tedy Ze sinové podmínky (např. [46], str.168) vyplývá, že u 12 = 1,22 = 2π λ D k sin θ c. (4.4) sin θ c = R p R c sin θ p, (4.5) kde R p je poloměr pupily kondenzoru a θ p je úhel mezi optickou osou a paprskem procházejícím krajním bodem pupily směřovaným kondenzorem do ohniska. Dosadíme-li (4.5) do (4.4), dostaneme po úpravě výsledný vztah pro odhad koherenční šířky světla v předmětové rovině DHM D k = 0,61 λ sin θ p R p R c. (4.6) 4.4. Vliv velikosti zdroje na kontrast interferenčních proužků Úvahy a výpočty v následujícím odstavci se týkají velikosti zorného pole u DHM, které je mimo jiné omezeno velikostí oblasti kontrastních interferenčních proužků. Odstavec se zaměřuje na jeden z faktorů ovlivňujících kontrast interferenčních proužků, a tím je velikost plošného, prostorově nekoherentního zdroje. Je zde popsáno, jak se mění interferenční struktura v závislosti na poloze svítícího bodu v plošném zdroji ve dvou na sebe kolmých osách. Interferenční struktura ve výstupní rovině mikroskopu je za podmínky prostorově nekoherentního osvětlení rovna součtu intenzit interferenčních obrazců od jednotlivých bodů efektivní plochy zdroje. Tento obrazec je vlastně řezem interferenčních ploch výstupní rovinou. Interferenčními plochami jsou rotační hyperboloidy s osou rotace procházející zobrazeními bodu zdroje v předních ohniskových rovinách objektivů předmětové a referenční větve. Rovina zdroje je sdruženou rovinou k předním ohniskovým rovinám objektivů, ve kterých předpokládáme, že jsou umístěny pupily objektivů. Zdroj je tedy zobrazen do předních ohniskových rovin objektivů předmětové a referenční větve a jeho zobrazení je omezeno velikostí pupil nebo clonkou zdroje. 25

26 4.4. VLIV VELIKOSTI ZDROJE NA KONTRAST INTERFERENČNÍCH PROUŽKŮ Obrázek 4.6: Prostor od předních ohniskových rovin objektivů předmětové a referenční větve po výstupní rovinu mikroskopu. Zabývejme se interferenční strukturou v závislosti na poloze bodu zobrazení zdroje v pupilách objektivů. Na obrázku 4.6 je znázorněn prostor od pupil objektivů až k výstupní rovině mikroskopu. Uvažujme monochromatický, plošný, tedy prostorově nekoherentní zdroj, vyzařující na centrální vlnové délce. Souřadnicový systém umístíme tak, že počátek 0 je v průsečíku spojnice zobrazení středových bodů tohoto zdroje (do středů pupil) v obou větvích a osy mikroskopu. Tato osa je zároveň souřadnicovou osou z. Zavedeme také další dva souřadnicové systémy příslušné ohniskovým rovinám objektivů v předmětové (x 1,y 1 ) a referenční (x 2,y 2 ) větvi, jejichž počátek je ve středu pupil. Osa z 1, resp. z 2 je totožná s optickou osou předmětové, resp. referenční větve a svírá s osou mikroskopu úhel α 0 resp. α 0 daný jako α 0 =arcsin(λ 0 f), kde f je prostorová frekvence difrakční mřížky. Porovnejme odchylky mezi interferenčními obrazci, které jsou vytvořeny různými body zob- 26

27 4.4. VLIV VELIKOSTI ZDROJE NA KONTRAST INTERFERENČNÍCH PROUŽKŮ Obrázek 4.7: Průběh interferenčních maxim v okolí výstupní roviny v řezu rovinou x = 0. razení zdroje. Uvažujme nejprve změnu interferenční struktury při změně polohy bodu zobrazení v pupile v ose y 1 resp. y 2. Názorněji tuto situaci nahlédneme na obr. 4.7, který je řezem prostoru v obr. 4.6 rovinou x = 0. Nahrad me řezy ohniskových rovin oblouky jedné kružnice κ se středem S, který tvoří průsečík osy z s výstupní rovinou a poloměr kružnice je l, l = SA 1 = SA 2. Ohniskové roviny tvoří v řezu tečny k této kružnici. Interferenční maxima pro středový bod zdroje zobrazený do středů pupil jako A 1 a A 2 vytvoří hyperboly s ohnisky v těchto bodech. Průsečíky hyperbol s výstupní rovinou lokalizují interferenční maxima hologramu. Uvažujme dále body B 1, B 2, které jsou zobrazeními obecného bodu zdroje a leží v naší aproximaci na kružnici κ. Interference světla z těchto dvou bodů opět vytvoří maxima v místech průběhu hyperbol (čárkované v obr. 4.7), které budou ovšem otočeny okolo středu S o úhel τ odpovídající úhlové vzdálenosti bodů A 1, B 1, resp. A 2, B 2. Důsledkem je rozdíl polohy interferenčních maxim ve výstupní rovině ve směru osy y a následná ztráta kontrastu interferenčních proužků s rostoucí vzdáleností od osy z. Změnu polohy interferenčních maxim ve výstupní rovině udávají průsečíky různě natočených hyperbol o úhel příslušný úhlové vzdálenosti daného bodu od středu pupily. Interferenční struktura je součtem dílčích interferenčních obrazců natočených o úhel τ v rozsahu od τ max po τ max, kde τ max je úhlová vzdálenost odpovídající poloměru pupily R p : τ max R p l. (4.7) Dále zkoumejme průběh interferenčních proužků při změně polohy bodu v pupile v ose x 1, resp. x 2 v obrázku 4.6. Tentokrát situaci nahlédneme v řezu prostoru výstupní rovinou (tedy z = z G = l cos α 0 v obr. 4.6). Interferenční proužky jsou opět řezem hyperboloidů výstupní rovinou a tvoří hyperboly symetrické podél osy rovnoběžné s osou y o různých souřadnicích x (obr. 4.8). Středové body pupil vytvoří hyperboly symetrické podle osy y (černě v obr. 4.8). Body posunuté od středu o x vytvoří hyperboly posunuté vůči středovým také o x (čárkované 27

28 4.4. VLIV VELIKOSTI ZDROJE NA KONTRAST INTERFERENČNÍCH PROUŽKŮ hyperboly). Výsledný interferenční obrazec v zorném poli výstupní roviny je součtem různě posunutých hyperbol pro x od R p do R p, kde R p je poloměr pupily nebo zobrazení clonky, pokud je jeho poloměr menší než poloměr pupily. Na obrázku 4.8 jsou znázorněny tři sady interferenčních proužků pro středový bod a body posunuté o x a x. Z obrázku je vidět, že kontrast interferenčních proužků je tedy omezen i ve směru osy x, a to v důsledku skládání vůči sobě posunutých hyperbol. Obrázek 4.8: Interferenční maxima v řezu výstupní rovinou. Pro výpočet interferenční struktury ve výstupní rovině přejdeme k vlnové optice. Uvažujme obecný bod zdroje A, který se zobrazí do jedné z větví mikroskopu jako A 1 a do druhé jako A 2 (obr. 4.6). Z těchto dvou bodů vycházejí divergentní kulové vlny popsané vztahy u 1 = exp(ikr 1) r 1 exp( iωt), u 2 = exp(ikr 2) r 2 exp( iωt), (4.8) kde i označuje imaginární jednotku, k vlnové číslo (k = 2π/λ ) a r 1, resp. r 2 jsou vzdálenosti obecného bodu G ve výstupní rovině od bodu A 1, resp. A 2 (obr. 4.6). Předpokládáme, že amplituda obou vln v bodech A 1 a A 2 je stejná a položíme ji rovnu 1. Časovou závislost vlny charakterizuje fázor exp( iωt), kde ω je úhlová frekvence vlny. Při interferenci vlnění nedochází ke změnám frekvence, takže tento fázor nebudeme nadále psát. Intenzita světla vlny v bodě G je dána vztahem I = u 1 + u 2 2 = u 1 u 1 + u 2 u 2 + u 1 u 2 + u 1u 2 = 1 r 2 1 Vzdálenosti r 1 a r 2 určíme z obrázku 4.6 jako + 1 r r 1 r 2 cos [k(r 1 r 2 )]. (4.9) 28

29 4.4. VLIV VELIKOSTI ZDROJE NA KONTRAST INTERFERENČNÍCH PROUŽKŮ r 1 = (x G x A1 ) 2 + (y G y A1 ) 2 + (z G z A1 ) 2, r 2 = (x G x A2 ) 2 + (y G y A2 ) 2 + (z G z A2 ) 2, (4.10) kde x A1, y A1, z A1, x A2, y A2 a z A2 jsou souřadnice v systému x, y, z. Polohu bodu A 1, resp. A 2 vyjádříme polárními souřadnicemi ξ a ϕ ve výstupních pupilách. Předpokládáme, že oba body leží ve stejném místě pupily a popisujeme je tedy stejnými veličinami ξ a ϕ. Pro bod A 1 platí: Pro bod A 2 platí: x A1 = x 1A1 = ξ cos ϕ, y A1 = d 2 + y 1A 1 cos α 0 = d 2 + ξ sin ϕ cos α 0, z A1 = y 1A1 sin α 0 = ξ sin ϕ sin α 0. (4.11) x A2 = x 2A2 = ξ cos ϕ, y A2 = d 2 + y 2A 2 cos α 0 = d 2 + ξ sin ϕ cos α 0, z A2 = y 2A2 sin α 0 = ξ sin ϕ sin α 0. (4.12) Po dosazení rovnic (4.11) a (4.12) do rovnic (4.10) dostáváme: r 1 = r 2 = (x G ξ cos ϕ) 2 + (y G ξ sin ϕ cos α 0 d 2 )2 + (z G ξ sin ϕ sin α 0 ) 2, (x G ξ cos ϕ) 2 + (y G ξ sin ϕ cos α 0 + d 2 )2 + (z G + ξ sin ϕ sin α 0 ) 2. (4.13) Výslednou intenzitu ve výstupní rovině získáme dosazením rovnic (4.13) do (4.9) a integrací přes ξ a ϕ: I = R p 2π 0 { 1 ξ r r2 2 0 Kontrast interferenčních proužků je dán vztahem ([46], str. 267) + 2 } cos [k(r 1 r 2 )] dϕ dξ. (4.14) r 1 r 2 V = I max I min I max + I min, (4.15) kde I max je lokální maximum intenzity interferenčních proužků v rozmezí jedné periody a I min je lokální minimum. Pokud V 0, 75, jedná se o výborný kontrast interferenčních proužků. Tento údaj budeme brát jako kritérium pro určení maximální velikosti zorného pole. Parametry výpočtu: prostorová frekvence difrakční mřížky f = 70mm 1 vlnová délka λ = λ 0 = mm poloměr pupil R p = 4mm vzdálenost přední ohniskové roviny od roviny výstupní l = 150mm 29

30 4.4. VLIV VELIKOSTI ZDROJE NA KONTRAST INTERFERENČNÍCH PROUŽKŮ Numerickým výpočtem podle vztahů (4.14) a (4.15) jsme zjistili, že pro dané parametry poklesne kontrast interferenčních proužků ve výstupní rovině pro x = 0 na V = 0,75 ve vzdálenosti y = 3,0mm. Pokud bychom vycházeli z této hodnoty a zvolili velikost pole 6,0 6,0mm 2 na okraji zorného pole, tedy pro x = 3,0mm a y = 3,0mm, by poklesl kontrast na V = 0, 57. Hodnoty pro V > 0,50 považujeme ještě za dobrý kontrast. Pokud bychom vyžadovali výborný kontrast přes celé zorné pole, jeho velikost by musela být maximálně 5, 1 5,1mm 2, pokud uvažujeme případ čtvercového pole. Použijeme-li v achromatickém interferometru širokospektrální zdroj světla, každá vlnová délka vytvoří příslušnou interferenční strukturu stejnou, jako vytvoří centrální vlnová délka (nebereme-li v úvahu amplitudy vln). Pro obecnou vlnovou délku je ovšem efektivní plocha zdroje menší, tudíž pokles kontrastu interferenčních proužků směrem ke krajům pole bude také pozvolnější, a to tím víc, čím vzdálenější je daná vlnová délka od centrální až po mezní vlnovou délku, která bude interferovat (viz obr. 4.5). Dá se tedy předpokládat, že při použití zdroje světla o nenulové spektrální šířce bude zorné pole s kontrastními interferenčními proužky ještě větší. Z výpočtů vyplývá, že interferenční pole ve výstupní rovině je v případě ideálního nastavení mikroskopu omezeno pouze velikostí difrakční mřížky, která je 3 3 mm 2. Tyto výpočty lze také použít při návrhu další generace DHM. 30

31 Kapitola 5 Experimenty se změnou koherence světla 5.1. Modelový experiment Na základě závěrů uvedených v odstavci 4.1 jsme testovali předpokládané vlastnosti zobrazení na modelovém vzorku krycího sklíčka CELLocate (Eppendorf) s povrchovým profilem. Objekt jsme zobrazili bez difuzoru a s difuzorem koherentním a nízkokoherentním světlem. Zdrojem koherentního světla byl He-Ne laser se střední vlnovou délkou λ = 632,8nm, koherenční délkou L k > 10 cm, prostorově koherentní. Zdrojem nízkokoherentního světla byla halogenová lampa, za niž byl zařazen interferenční filtr se střední vlnovou délkou λ = 650nm a s pološířkou spektrální propustnosti λ = 10nm. Koherenční délka takto vzniklého osvětlení byla L k = 42µm a koherenční šířka D k = 991nm. Difuzor tvořila 2µm silná fólie. Cílem pozorování bylo porovnat, jak koherence světla a přítomnost difuzního materiálu ovlivní zobrazení ve světlém poli a holografické zobrazení. Zobrazení ve světlém poli bylo vytvořené zacloněním referenční větve v DHM. V každé sérii obrázků je zobrazen objekt ve světlém poli, jeho hologram a dále intenzita a kvantitativní fáze, obě numericky rekonstruované z hologramu. Nejdříve jsme pozorovali objekt bez difuzoru s nízkokoherentním osvětlením. Objekt byl patrný ve všech snímcích (obr. 5.1). Poté jsme přikryli vzorek difuzorem. Ačkoli ve světlém poli ani v hologramu není objekt patrný, intenzitní a fázová rekonstrukce z hologramu je difuzorem téměř nezměněna (obr. 5.2). Následně jsme zaměnili zdroj za koherentní, difuzor stále přikrýval vzorek. Všechny snímky jsou znehodnoceny koherenční zrnitostí (obr. 5.3), která je důsledkem interference koherentního světla rozptýleného v difuzoru a na nečistotách v optickém systému. V posledním kroku jsme odkryli vzorek (obr. 5.4). Ačkoli je na obrázku zřetelná Fresnelova difrakce na objektu v důsledku mírného rozostření, ve všech snímcích jsou obrysy objektu rozeznatelné. Kvantitativní průběh fáze pozorovaný se světlem nízké koherence se při vložení difuzoru také příliš nemění, jak je patrné z řezů provedených přibližně ve stejném místě vzorku (obr. 5.5). Fáze φ je zde přepočítaná na výšku v podle vztahu φ = 2πv n, (5.1) λ kde λ je příslušná střední vlnová délka a n = 0,5 je rozdíl indexů lomu vzduchu a skla. Přibližně jsme určili výšku naměřenou jednotlivými způsoby. V nízkokoherentním světle (obr. 5.5 a,b) vidíme tvarovou i výškovou shodu profilu v případě pozorování s difuzorem a bez difuzoru, 31

32 5.1. MODELOVÝ EXPERIMENT v koherentním světle nikoli (obr. 5.5 c,d). Obrázek 5.1: Zobrazení sklíčka CELLocate bez difuzoru světlem nízké koherence v různých módech. Parametry osvětlení: λ = 650nm, L k = 42µm, D k = 991nm. Objektivy 20 /0,40. Obrázek 5.2: Zobrazení sklíčka CELLocate s difuzorem světlem nízké koherence v různých módech. Parametry osvětlení: λ = 650nm, L k = 42µm, D k = 991nm. Objektivy 20 /0,40. 32

33 5.1. MODELOVÝ EXPERIMENT Obrázek 5.3: Zobrazení sklíčka CELLocate s difuzorem koherentním světlem v různých módech. Parametry osvětlení: λ = 632,8nm, L k > 10 cm, prostorově koherentní. Objektivy 20 /0,40. Obrázek 5.4: Zobrazení sklíčka CELLocate bez difuzoru koherentním světlem v různých módech. Parametry osvětlení: λ = 632,8nm, L k > 10 cm, prostorově koherentní. Objektivy 20 /0,40. 33

34 5.2. ZOBRAZENÍ BUNĚK V ROZPTYLUJÍCÍM MÉDIU Obrázek 5.5: Řezy fázovým zobrazením sklíčka CELLocate: a světlo nízké koherence bez difuzoru; b světlo nízké koherence s difuzorem; c koherentní světlo bez difuzoru; d koherentní světlo s difuzorem. Tento experiment potvrdil, že snížení prostorové a časové koherence má za následek vyšší potlačení koherenční zrnitosti a světla rozptýleného v optickém systému mimo rovinu zaostření Zobrazení buněk v rozptylujícím médiu V biologii a medicíně se často vyskytují preparáty, ze kterých není možné vytvořit tenký řez, nebo jsou součástí tkání. Takové vzorky pak silně rozptylují světlo a to znesnadňuje jejich pozorování. V odstavci 5.1 bylo ukázáno, jak ovlivňuje redukce koherence osvětlení v DHM tvorbu obrazu v rozptylujícím prostředí. Proto bylo předmětem dalších experimentů sledování vlivu změny časové i prostorové koherence osvětlení na výsledné zobrazení buněk pod silně rozptylující vrstvou simulující tkáň. Zobrazili jsme fixované nádorové buňky v rozptylujícím médiu v DHM světlem o třech 34

35 5.2. ZOBRAZENÍ BUNĚK V ROZPTYLUJÍCÍM MÉDIU různých koherenčních délkách a šířkách. Médium bylo tvořené polystyrénovými kuličkami o průměru 356 nm rozptýlenými v minimálním množství vody. Nejvyšší možná hustota rozptylujícího média je omezena nutností sjednotit optické délky předmětové a referenční větve při justáži mikroskopu, která vyžaduje možnost zaostřit v obou větvích na totožné místo difrakční mřížky. Toto je v praxi realizováno zaostřením na vryp nebo prachovou částici na povrchu aktivní vrstvy mřížky. Pokud je médium natolik husté, že tato místa v předmětové větvi nezobrazíme, nelze reprodukovatelně docílit interference předmětové a referenční vlny ve výstupní rovině. Obrázek 5.6: Zobrazení buněk pod rozptylující vrstvou polystyrénových kuliček rozptýlených v médiu světlem s λ = 650 nm o koherenční délce a šířce a L k = 3µm, D k = 2, 6 µm; b L k = 8 µm, D k = 7,9µm; c L k = 42 µm, D k = 21,1µm;. V prvním řádku jsou zobrazeny rekonstruované amplitudy, v druhém rekonstruované fáze s naznačením řezu procházejícího přes zobrazení buněk a ve třetím řádku jsou vykresleny tyto řezy. Objektivy 10 /0,25. 35

36 5.3. POZOROVÁNÍ BUNĚK V OPALESCENTNÍM MÉDIU Buňky byly pozorovány přes rozptylující vrstvu média, které vyplnilo komůrku o tloušt ce 0,8mm. Na obrázcích 5.6 jsou v prvním řádku zobrazeny rekonstruované amplitudy, v druhém rekonstruované kvantitativní fáze s naznačením řezu procházejícího přes buňky a ve třetím řádku jsou tyto řezy vykresleny. V prvním případě (obr. 5.6a) byl zdroj bílého světla omezen clonkou o průměru 2,4mm a za ni byl umístěn neutrální filtr. Tak bylo vytvořeno osvětlení s koherenční šířkou D k = 2,6µm. Koherenční délka osvětlení spočtená jako L k = λ 2 / λ byla 3µm. Hodnota λ byla pološířka maxima korigované spektrální hustoty intenzity dle obrázku 4.5 a střední vlnová délka λ = 650 nm. V druhém případě (obr. 5.6b) byl stejný zdroj omezen clonkou o průměru 0,8mm a za ni byl umístěn neutrální filtr. Tak bylo vytvořeno osvětlení s koherenční šířkou D k = 7,9µm. Koherenční délka tohoto osvětlení byla L k = 8µm. V posledním případě (obr. 5.6c) byl stejný zdroj omezen clonkou o průměru 0,3 mm a za clonku byl zařazen interferenční filtr s λ = 650nm a pološířkou spektrální propustnosti λ = 10 nm. Tak bylo dosaženo koherenční šířky D k = 21,1µm a koherenční délky osvětlení L k = 42 µm. Je zřejmé, že v amplitudových zobrazeních jsou buňky jen těžko postřehnutelné a kvalita obrazu se rapidně zhoršuje při přechodu ke světlu vyšší koherence. Ve fázových zobrazeních jsou buňky poměrně dobře patrné. V řezech provedených rekonstruovanou kvantitativní fází je zjevný efekt zvyšování koherence na zobrazení. Světlo s větší koherenční délkou a šířkou rozptýlené na kuličkách interferuje a vytváří strukturu koherenční zrnitosti, která znehodnocuje jak amplitudové, tak fázové zobrazení. V řezech se projeví jako aditivní šum. V případech nižší koherence se interference světla různých vlnových délek a z různých bodů zdroje navzájem eliminují a vliv rozptýleného světla je potlačen Pozorování buněk v opalescentním médiu Zvýšené schopnosti zobrazit objekty v rozptylujících prostředích může být využito například při pozorování buněk v opalescentním prostředí. Porovnali jsme zobrazení buněk ve směsi Ovosanu (směs média a lipidů) v DHM a klasickém Zernikově fázovém kontrastu. Porovnáním jsme zjistili, že rozptylem světla v prostředí mimo preparát je chod paprsků světla natolik narušený, že zobrazení metodou klasického Zernikova fázového kontrastu je velmi blízké obyčejnému zobrazení ve světlém poli, které je pro zobrazení buněk nevhodné. Již při koncentraci lipidů v médiu 0,3% byly v klasickém fázovém kontrastu buňky nepozorovatelné. Při zobrazení v DHM byly patrné nejen buňky, ale i jejich detaily (viz obr. 5.7). Parametry osvětlení v DHM, D k = 21,1µm a L k = 42µm, byly kompromisem mezi použitelností mikroskopu ve smyslu naladění interference a schopností zobrazit preparát v rozptylujícím prostředí potlačením rozptýleného světla. Na obrázku 5.7 jsou zobrazeny v horním řádku rekonstruované amplitudy a ve spodním řádku rekonstruované fáze buněk v Ovosanu o koncentraci 0,3% a na začátku pozorování a b po 14,5 hodinách. Z obrázků je dobře patrná změna tvaru a morfologie buněk způsobena pobytem v tomto médiu. Při pozorování v opalescentních médiích se obecně vyskytuje problém, který znemožňuje navázání fáze. Na okrajích drobných rozptylujících částic v komůrce preparátu dochází k silnému lomu či odrazu světla, který následně vede k potlačení interferenčního jevu v daném místě. Důsledkem je nulová intenzita zobrazení v těchto místech a nedefinovaná fáze, takže je nutné 36

37 5.3. POZOROVÁNÍ BUNĚK V OPALESCENTNÍM MÉDIU Obrázek 5.7: Buňky v opalescentním médiu zobrazené v DHM při osvětlení s parametry D k = 21,1µm, L k = 42µm. V horním řádku je rekonstruovaná amplituda a v dolním řádku rekonstruovaná fáze buněk v Ovosanu o koncentraci 0, 3% a na počátku pozorování a b po 14,5 hodinách. Objektivy 20 /0,40. tyto oblasti vyřadit z rekonstrukce nebo je vhodně nahradit. Touto částí zpracování obrazu jsem se ve své práci nezabývala. 37

38 Kapitola 6 Význam kvantitativního fázového kontrastu buňky Cílem následující kapitoly je shrnout poznatky, které přisoudí fázovému zobrazení buňky z holografického mikroskopu význam zobrazení rozložení její suché hmoty a vysvětluje, co pojem suchá hmota buňky zahrnuje. K tomuto účelu nejdříve odvodíme, jak souvisí index lomu buňky s koncentrací její suché hmoty (odstavec 6.1) a na základě této souvislosti odvodíme, že plošná hustota suché hmoty je přímo úměrná kvantitativní fázi z DHM (odstavec 6.2) Vztah indexu lomu a hustoty Rozdíl optické dráhy δ vlny způsobený průchodem látkou vůči vlně procházející vzduchem závisí na jejím indexu lomu n látky. Index lomu látky je funkcí její hustoty ρ, což vyjadřuje Lorentzův- Lorenzův vztah, ze kterého plyne ([46], str. 88) kde n 2 1 M n ρ = R, (6.1) R = 4π 3 N mp, (6.2) N m je Avogadrova konstanta, p je střední polarizovatelnost molekuly a M je hmotnost molekuly. Vztah (6.1) můžeme přepsat do tvaru n + 1 n (n 1)M ρ = R. (6.3) V rozsahu indexů lomu většiny známých tekutin n = (1,3;1,6) se první zlomek rovnice (6.3) mění pouze v rozsahu hodnot (0, 6233; 0, 5702). Pro tekutiny tedy můžeme vztah (6.3) nahradit výrazem n 1 = η, (6.4) ρ kde η je konstanta závisející na R a M [37]. Experimentálně byl tento vztah ověřen v [47]. Ukázalo se, že R a tedy i n úzce souvisí s objemem atomů a také s meziatomovými vazbami v molekule. Všechny organické látky jsou převážně tvořeny atomy uhlíku, vodíku, dusíku a kyslíku a typy vazeb v různých organických látkách jsou tedy převážně stejné. Za těchto podmínek můžeme předpokládat malé rozdíly v jejich refraktivních vlastnostech. 38

39 6.1. VZTAH INDEXU LOMU A HUSTOTY V případě extrémně velkých molekul, jako jsou proteiny, dokonce poměrně značné variace v jejich složení neovlivní výrazně jejich index lomu. Výjimkou jsou pigmentové proteiny, ve kterých se vyskytují vícenásobné vazby, které sice zvyšují hodnotu R, ale to se projeví především v ultrafialovém světle. Lze tedy říci, že ve viditelné oblasti světelného spektra je možné předpokládat stejný index lomu pro všechny proteiny [37]. Buňku lze považovat za roztok proteinů, jehož hustota lineárně závisí na koncentraci proteinů, což je dokázáno např. v [48], [49], [50]. Vyjádříme tedy hustotu buňky B obecně jako kde a a b jsou konstanty a C je koncentrace proteinů v buňce. Dosazením (6.5) do výrazu (6.4) a jeho úpravou dostaneme B = a + bc, (6.5) n B = 1 + ηa+ ηb C, (6.6) }{{}}{{} K α s kde n B je index lomu buňky. Pro zjednodušení vztahu 6.6 zavedeme konstanty K a α s, takže n B = K + α s C. (6.7) Pokud C = 0, nahlédneme, že K vyjadřuje index lomu tekutiny, ve které jsou proteiny rozpuštěny, tedy index lomu rozpouštědla, n R. Můžeme tedy psát n B n R = α s C. (6.8) Koncentrace C roztoku je obvykle měřena v jednotkách g/100 ml =g/100 cm 3 a konstanta α s, uváděná většinou v jednotkách 100ml/g =100cm 3 /g, je známa jako specifický refraktivní přírůstek. Hodnoty α s byly zkoumány pro různé proteiny rozpustné ve vodě (např. [5], [37]) 1. Bylo zjištěno, že se příliš neliší a pohybují se v rozsahu (0, ,00192) 100ml/g [37]. Faktory ovlivňující hodnotu α s Zabývejme se změnami hodnot α s v závislosti na změně experimentálních podmínek. 1. ph roztoku Hodnoty α s nejsou výrazně ovlivněny změnou ph roztoku ani koncentrací solí v roztoku [37]. 2. Teplota Vlivem změny teploty na α s se zabývá článek [50]. Bylo zjištěno, že při poklesu teploty z 25 C na 5 C hodnota α s pro zkoumaný protein, kterým byl lidský albumin, vzrostla z 0, ml/g na 0, ml/g, což není příliš výrazná změna. Jiné publikace změnu α s vlivem teploty nepotvrdily. 1 V publikacích bývá specifický refraktivní přírůstek označován jako α. 39

40 6.2. VÝZNAM KVANTITATIVNÍ FÁZE BUŇKY 3. Vlnová délka Vliv vlnové délky na α s byl zkoumán v maximálním rozsahu od 366nm do 656 nm a může být ve viditelné části spektra vyjádřen vztahem [50] ( α s,λ = α s,578 0, ) 104 Λ 2, (6.9) kde Λ je bezrozměrná hodnota vlnové délky v nanometrech a α s,578 je hodnota specifického refraktivního přírůstku pro vlnovou délku 578 nm, pro kterou bylo provedeno velké množství měření [50]. Hodnoty α s jsou většinou uváděny pro zelené nebo žluté světlo. 4. Index lomu rozpouštědla Parametr α s se jistě mění pro rozpouštědla o různých indexech lomu. Jelikož rozpouštědla v buňkách mají velmi podobný index lomu, nehraje tento fakt roli, pokud se nejedná o komponenty rozpustné v nevodnatých médiích nebo ve velmi koncentrovaných roztocích soli. 5. Látky neproteinové povahy v buňce Co se týče lipidů a sacharidů přítomných v buňce, jsou většinou vázány na proteiny do komplexů tzv. lipoproteinů a glykoproteinů, jejichž α s je velmi blízké samotným proteinům. Specifický refraktivní přírůstek nukleových kyselin, aminokyselin a ostatních komponent buňky neproteinové povahy je také velmi blízký proteinům. Z uvedených výzkumů vyplývá, že hodnota α s pro vodné roztoky proteinů je přibližně konstantou nehledě na typ proteinu a na vliv faktorů 1 5. Cílem úvah je určit hodnotu α s pro protoplazmu 2 živé buňky, což je komplexní sloučenina proteinů, cukrů, tuků a výše zmíněných komponent neproteinové povahy rozpuštěných ve vodě. Není sice možné přesně určit hodnotu α s protoplazmy již z toho důvodu, že se bude zřejmě pro různé typy buněk do jisté míry lišit. U téměř všech typů buněk jsou ale hlavní pevnou organickou složkou protoplazmy proteiny a alespoň část sacharidů a tuků je přítomna ve formě komplexů s proteiny. Obecně se tedy uvažuje střední hodnota α s pro protoplazmu 0, ml/g [37]. To je o něco nižší střední hodnota než pro většinu roztoků proteinů, protože bere v úvahu vliv lipidů a sacharidů. Podle [37] není pravděpodobné, že by se tento odhad lišil od skutečné hodnoty o více než 5%, ale je třeba brát v úvahu předpoklady, které byly pro tuto teorii stanoveny Význam kvantitativní fáze buňky Rozdíl optických drah δ indukovaný buňkou, který naměříme interferenčním mikroskopem je v případě ideálního zobrazení definován vztahem δ(x,y) = [n B (x,y, z) n M ]dz, (6.10) kde x, y označují souřadnice kolmé na optickou osu objektivu předmětové větve, z je souřadnice ve směru optické osy a n B, n M jsou příslušné indexy lomu buňky a média. Médium je označení pro okolní prostředí buňky. Dále předpokládáme, že v předmětové větvi DHM je buňka v médiu a v referenční větvi je opticky totožný předmět, ale bez buňky. 2 Protoplazma je metabolicky aktivní živá hmota vyplňující vnitřní část buňky. 40

41 6.2. VÝZNAM KVANTITATIVNÍ FÁZE BUŇKY Jestliže C ve vztahu (6.8) je uvedeno v jednotkách g/100 ml, zavedeme C tak, že [C ] =g/ml. Potom (6.8) lze přepsat do tvaru n B (x,y, z) = n R + 100α s C (x,y, z). (6.11) Jelikož médium je velmi příbuzné rozpouštědlu v buňce, můžeme mu přisoudit stejný index lomu, tedy n M = n R. (6.12) Vezmeme-li v úvahu tento fakt a dosadíme-li rovnici (6.11) do rovnice (6.10), dostaneme δ(x, y) = 100α s C (x,y, z) dz. (6.13) Jestliže C udává koncentraci, tj. množství suché hmoty buňky v gramech na mililitr, pak celkovou suchou hmotu buňky W v gramech udává integrál přes objem buňky V. W = C (x,y, z) dxdy dz. (6.14) Integrujeme-li (6.13) přes plochu průmětu buňky S do roviny x,y, obdržíme S δ(x,y) dxdy = 100α s V V C (x, y, z) dxdy dz, (6.15) kde integrál na pravé straně je roven W. Po dosazení (6.14) do (6.15) vyjádříme suchou hmotu buňky jako W = 1 δ(x, y) dx dy. (6.16) 100α s S Rozdíl fáze předmětové a referenční vlny φ(x,y) získaný rekonstrukcí hologramu definujeme jako φ(x,y) = kδ(x, y) = 2π δ(x,y), (6.17) λ kde k je vlnové číslo. Vztah mezi pozorovanou fází a suchou hmotou buňky můžeme pomocí vztahu (6.17) vyjádřit jako λ W = φ(x, y) dx dy. (6.18) 200πα s S Ze vztahu (6.18) je zřejmé, že pozorovaná fáze buňky v DHM je úměrná plošné hustotě její suché hmoty. Při přechodu na diskrétní rozložení fáze způsobené digitalizací obrazu můžeme psát λ W(i, j) = φ(i, j) dxdy, (6.19) 200πα s S i,j kde i a j určují polohu pixelu ve fázovém zobrazení, W(i, j) označuje suchou hmotu odpovídající ploše buňky zobrazené na obrazový pixel i,j a S i,j označuje plochu daného pixelu, přes kterou integrujeme. V digitálním zobrazení je fáze φ(i, j) považována za konstantní na ploše pixelu fázového zobrazení. Protože každému pixelu zobrazení odpovídá stejná plocha průmětu preparátu do 41

42 6.2. VÝZNAM KVANTITATIVNÍ FÁZE BUŇKY roviny x, y, kterou označíme S, fáze φ(i, j) buňky na ploše odpovídající ploše průmětu do jednoho pixelu je přímo úměrná suché hmotě buňky W(i,j), tedy W(i,j) = λ S 200πα s φ(i,j). (6.20) Suchou hmotu tvoří látky jako proteiny, cukry, tuky a jejich sloučeniny, nukleové kyseliny a aminokyseliny, které jsou nositelem životních procesů v buňce. Změny suché hmoty odhalují dynamiku těchto procesů a vypovídají o dějích odehrávajících se jak na povrchu tak i uvnitř buňky. Právě tyto pochody sledujeme, pozorujeme-li obrazovou fázi z DHM a její dynamiku. 42

43 Kapitola 7 Zpracování a vyhodnocení obrazu Z holografického zobrazení lze numericky rekonstruovat celou předmětovou vlnu, tedy její intenzitu i fázi. Rekonstrukce je prováděna pomocí fourierovských metod a je popsána v [41], str Základní úpravy kvantitativní fáze V holografickém zobrazení fáze je oproti jiným fázovým zobrazením (klasický Zernikův fázový kontrast, DIC) úroveň šedé v obrazu lineárně úměrná fázi, proto holografické zobrazení fáze můžeme označit jako kvantitativní fázový kontrast. Jak bylo ukázáno v odstavci 6.2, kvantitativní fáze buňky je přímo úměrná plošné hustotě její suché hmoty. Proto jsme se zabývali v analýze experimentálních dat především kvantitativní fází. První úpravou fáze v případě, že rozsah hodnot fáze je větší než 2π, je její navázání ([41], str. 25). Odstraníme fázové skoky a rozšíříme obor hodnot fáze z intervalu 0,2π) na 0,m, kde kladné číslo m > 2π reprezentuje maximální hodnotu fáze předmětové vlny. Po této úpravě získáme obraz fáze předmětové vlny, který je součtem fázového posuvu v preparátu a fázových aberací vzniklých průchodem vlny mikroskopem, popřípadě nepřesností při automatickém určování nosné frekvence interferenčních proužků při rekonstrukci obrazu. Tyto aberace se projevují modulací, popřípadě nakloněním fázového zobrazení preparátu. Pro jejich eliminaci rekonstruujeme zobrazení fáze pouze aberací bez preparátu a to odečítáme od zobrazení fáze s preparátem. V našem případě je fázovým zobrazením preparátu rekonstruovaná fáze komůrky s buňkami a médiem a zobrazením aberací je rekonstruovaná fáze komůrky s médiem bez buněk, tzv. pozadí. Ukázalo se, že pozadí se během experimentů mění. To může být způsobeno například nestabilitou justážních prvků, vyrovnáváním teploty preparátu s okolím nebo lokálními změnami indexu lomu média v důsledku metabolizmu buněk. Jelikož posuv preparátu není automatizovaný, nelze provádět referenční snímky pozadí během pozorování. Po ukončení pozorování jsou proto operátorem v každém obrázku fáze označeny obdélníkové oblasti, ve kterých se nevyskytují buňky a těmi je proložena plocha, která aproximuje pozadí. Tato plocha je od daného fázového snímku odečtena. Bylo otestováno (Ing. Tomáš Zikmund), že pro nejlepší eliminaci aberací pozadí je vhodná polynomiální plocha 3. stupně. Koeficienty polynomů jsou počítány pro každý obrázek zvlášt. Tato operace klade nároky na vzhled preparátu v tom smyslu, že v zorném poli se musí vyskytovat oblasti bez buněk umožňující jednoznačné proložení aberační plochy. Nelze tedy 43

44 7.2. DYNAMICKÉ FÁZOVÉ DIFERENCE provádět korekci pro souvislou vrstvu buněk. Při popsané korekci obrazu fáze probíhá lokalizace oblastí pozadí pouze v prvním ze snímků časosběrné série pozorování, v ostatních snímcích je poloha a velikost vybraných oblastí stejná. Automatická kontrola oblastí vůči přítomnosti buňky není zajištěna. Nesprávná korekce se projeví při vizuální kontrole korigovaných snímků a výběr oblastí je nutné opakovat. Rozsah hodnot fáze je v důsledku šumu a navazování fáze v každém snímku jiný. V důsledku toho má průměrná hodnota fáze pozadí v každém snímku jinou hodnotu. Pro prohlížení časosběrné série po sobě následujících snímků je nutné hladině pozadí přiřadit stejnou hodnotu fáze ve všech snímcích. K tomuto účelu se určí průměrná hodnota výřezu pozadí φp, q v oblasti bez buněk ve stejném místě každého snímku q a ta je odečtena od fáze každého pixelu φ q (i,j), kde i,j udávají polohu pixelu v obraze. Tím je hladina fáze pozadí vyrovnána na stejnou hodnotu. Poté se odečte absolutní minimum hodnot fáze všech snímků φ q, min (i,j) < 0, čímž je dosaženo rozsahu oboru hodnot upravené fáze Φ q 0,m a, kde m a je absolutní maximum hodnot fáze všech snímků. Φ q (i,j) = [φ q (i,j) φ p, q ] φ q, min (i, j). (7.1) Těmito úpravami je zajištěno maximální osové rozlišení změn fáze preparátu v čase. V upraveném zobrazení fáze Φ je možné provést prahování buněk a pozadí. Z obdélníkového výřezu umístěného do pozadí obrazu fáze s buňkami se určí průměrná hodnota Φ p, q v každém ze snímků. Prahování probíhá následovně: pokud Φ q (i,j) Φ p, q, pak Φ q (i,j) = 0, (7.2) pokud Φ q (i,j) > Φ p, q, pak Φ q (i,j) = Φ q (i,j) Φ p, q. (7.3) 7.2. Dynamické fázové diference Pro využití kvantitativní informace, kterou poskytuje fázová rekonstrukce z DHM, má význam jak její hodnota vůči nulové fázi definované v místech, kde fáze předmětové a referenční vlny mají stejnou hodnotu, tak také relativní hodnota fáze vůči fázi v jiných časových okamžicích během pozorování. Ačkoli jsme se v kapitole 6 zabývali významem hodnoty fáze buňky teoreticky, experimentálně jsme se zaměřili pouze na význam relativních hodnot, tedy změn fáze v čase. Pro zviditelnění změn rozložení suché hmoty buňky během pozorování byla vyvinuta metoda dynamických fázových diferencí (DPD). Tato metoda je založena na odlišném zobrazení kladných a záporných rozdílů kvantitativní fáze dvou snímků Φ D pořízených v různých časech pozorování. Pokud Φ D > 0, jedná se o přírůstek suché hmoty buňky a je znázorněn v obrázku DPD červenou barvou tak, že jas barvy odpovídá hodnotě Φ D. Hodnoty Φ D < 0 vyjadřují úbytek suché hmoty, jsou označeny ve stejném obrázku DPD zelenou barvou a jas barvy odpovídá hodnotě Φ D. Pro Φ D = 0 je jas barvy nulový (černá). DPD můžeme vypočítat jako rozdíl po sobě následujících snímků fáze, což nazveme jako postupné DPD Φ D1, q (i, j) = Φ q+1 (i,j) Φ q (i, j), q = 1,2,...,w 1, (7.4) kde w je počet snímků. DPD můžeme ale spočítat i jako rozdíl příslušného a počátečního snímku, což nazveme DPD vzhledem k počátku Φ D2, q (i,j) = Φ q (i,j) Φ 1 (i, j), q = 1,2,...,w. (7.5) 44

45 7.3. STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ DPD Odečtení dvou obrazů kvantitativní fáze a odlišné označení kladných a záporných diferencí bylo navrženo již G. A. Dunnem v [22]. Inovace této metody spočívá především ve vyšším časovém rozlišení metody, které je využito při promítnutí po sobě následujících Φ D, q. Tímto způsobem lze vizuálně i elektronicky vyhodnotit okamžité změny rozmístění suché hmoty buňky během reakce (postupné DPD) nebo vývoj reakce (DPD vzhledem k počátku). Vizualizace dynamických fázových diferencí a jejich barevné označení umožňuje zvýraznit pohyby drobných částí buňky, které jsou pouhým pozorováním kvantitativní fáze velmi těžko postřehnutelné. Tato skutečnost je demonstrována na obrázku 7.1. Zatímco rozdíl rozložení hmoty mezi obrázky 7.1a a 7.1b v časech t a t+25s je těžko postřehnutelný, DPD na obrázku 7.1c dává jasnou představu o tom, k jakým změnám v časovém intervalu 25 sekund došlo. Obrázek 7.1: Kvantitativní fáze buňky v časech t na obrázku a, t + 25s na obrázku b a DPD mezi těmito snímky na obrázku c. Je zřejmé, že DPD zvýrazní změny rozložení suché hmoty buňky. Další možností zobrazení je kombinace fázových diferencí s intenzitou (modrá barva). To se ale neukazuje příliš výhodné, protože intenzita je mnohem více poznamenána šumem než fáze Statistické vyhodnocení DPD Obrázek DPD ukazuje suchou hmotu buňky, která se přemístila ve zvoleném časovém intervalu. Této informace lze využít při posuzování míry pohyblivosti buňky, a to jak při přesouvání z místa na místo migraci, tak i při vnitrobuněčném pohybu, který má vyšší frekvenci. Zaměřili jsme se na statistické vyhodnocení vnitrobuněčného pohybu. K tomu bylo navrženo následující zpracování kvantitativní fáze. V každém snímku q byla nejdříve spočtena suma kladných DPD A q v celém obrázku N M N M A q = Φ D1, q (i,j) = [Φ q+1 (i,j) Φ q (i,j)] pro Φ D1, q (i,j) > 0, (7.6) i=1 j=1 i=1 j=1 kde N a M jsou rozměry obrázku v pixelech. Hodnota A q je celková kladná změna fáze v obrázku q za daný časový interval. Tato hodnota je úměrná celkové hmotě A W, q, která se přemístila v daném časovém intervalu: A W, q = λ S N M Φ D1, q (i,j), (7.7) 100α2π i=1 j=1 45

46 7.4. ROZLIŠENÍ DHM kde S je plocha preparátu připadajícího na pixel zobrazení. Sledovaná veličina musí být nezávislá na počtu buněk v zorném poli nebo na jejich velikosti. Proto zavedeme normováním A q veličinu B q B q = A q N M Φ q+1 (i,j) i=1 j=1 = 100α2π λ S A W, q N M Φ q+1 (i,j) i=1 j=1 = N M [Φ q+1 (i,j) Φ q (i, j)] i=1 j=1, (7.8) N M Φ q+1 (i,j) i=1 j=1 což vyjadřuje normované množství suché hmoty, která se přemístila v daném časovém intervalu. Tato charakteristika nebere v úvahu fakt, že některé části buněk se pohybují více než jiné části. Vyjadřuje celkový přesun suché hmoty vztažený na jednotku suché hmoty Rozlišení DHM Příčné rozlišení Příčné rozlišení DHM je stejně jako u konvenčního mikroskopu omezeno difrakcí světla na apertuře objektivu. Rozlišení závisí na numerické apertuře NA použitých objektivů a vlnové délce: = 0,61λ NA. (7.9) Pro objektivy 10 /0, 25 a vlnovou délku 650 nm je = 1,59 µm, pro objektivy 20 /0,40 a tutéž vlnovou délku je = 0, 99 µm. Podélné rozlišení Osové rozlišení kvantitativní fáze v holografickém mikroskopu (tj. rozlišení při měření rozdílu optických drah) je dáno rozptylem hodnot kvantitativní fáze vlivem šumu. Z ([51], str. 63) plyne, že hodnoty fáze pozorované za týchž experimentálních podmínek v jednom pixelu v různých snímcích nebo ve vybraných pixelech v jednom snímku v oblasti s konstantním fázovým posunem podléhají normálnímu rozdělení. Provedli jsme měření hodnot fáze ve vybraném pixelu ve 100 snímcích z časového intervalu 8,3 minut. Rozptyl těchto hodnot byl průměrně 4, rad, což odpovídá rozdílu optických drah 0,005 nm. 46

47 Kapitola 8 Experimenty s buňkami Po úpravách mikroskopu popsaných v kapitole 3 a po vybudování biologického pracoviště popsaného v dodatku jsme přistoupili k experimentům s živými buňkami. Odstavec 8.3 popisuje experiment reakce buněk na toxickou látku cis-platinu. V odstavci 8.2 je uvedeno pozorování odezvy různých typů rakovinových buněk různě hustého porostu na energetickou a nutriční deprivaci. Odstavec 8.4 popisuje experiment porovnání motility dvou typů příbuzných buněk za standardních podmínek a za působení externího stimulu. Přehled buněk použitých v experimentech LF lidské normální podkožní fibroblasty, K2 plným označením LW13K2; krysí nádorové embryonální fibroblasty, A3 plným označením A337/311RP; krysí nádorové buňky, které byly in vivo selektovány z L13K2 na metastatický potenciál do plic [52] projevující se vysokým výskytem metastáz ( %)[53], RsK4 krysí nádorové buňky odvozené ze spontánně in vitro neoplasticky transformovaných K2 supertransformací virem Rousova sarkomu [54], EM-G3 lidské nádorové buňky z prsního karcinomu [55], G3S2 lidské nádorové buňky odvozené z buněk EM-G3 neoplastickou progresí, HaCaT lidské keratinocyty spontánně transformované in vitro. Parametry použitého osvětlení: λ = 650nm, L k = 42µm, D k = 21, 1 µm Standardní příprava vybavení pro pozorování Pro přípravu vzorků byl zaveden následující postup. Sterilizace krycích sklíček Kruhová krycí sklíčka byla odmaštěna vodou s detergentem, opláchnuta čistou a poté deionizovanou vodou. Následně byla ostříknuta ethylalkoholem (96%) a ponořena do misky s ethylalkoholem alespoň na 15 minut. Po vyjmutí byla umístěna ještě alespoň na dalších 10 minut do misky s novým ethylalkoholem (96%). Poté byla ve flow-boxu opálena z jedné strany nad plamenem. 47

48 Příprava stacionárních komůrek pro pozorování 8.2. REAKCE NÁDOROVÝCH BUNĚK G3S2 NA CISPT Nerezová mezikruží byla odmaštěna vodou s detergentem, opláchnuta čistou vodou a ponořena na 10 minut do ethylalkoholu. Poté bylo k mezikruží silikonem (Loctite 5366) přilepeno sterilní krycí sklíčko a ponecháno 24 hodin pro vytvrzení silikonu. Před aplikací buněk byly takto připravené komůrky opláchnuty vodou s detergentem, čistou vodou, vodou pro tkáňové kultury a ethylalkoholem. Při opětovném použití komůrek byly zbytky buněk odstraněny kartáčkem a vodou s detergentem a celý proces sterilizace alkoholem bez opálení byl opakován. Takto připravené polotovary komůrek byly umístěny do Petriho misek a na ně byly nasazeny buňky. Před pozorováním bylo z Petriho misek odsáto médium, komůrky byly naplněny novým médiem a uzavřeny sterilním krycím sklíčkem s utěsněním vakuovou vazelínou. Příprava průtokových komůrek pro pozorování Nerezová mezikruží byla očištěna jako v případě stacionárních komůrek a z obou stran byla silikonem přilepena sterilní krycí sklíčka. Přívodní a odvodní jehly byly vysterilizovány v ethanolu a silikonem přilepeny do otvorů v mezikruží. Komůrky byly před aplikací buněk propláchnuty chemikáliemi v následujícím pořadí: trypsin 1. stupeň oddělení zbytků buněk od kultivačního povrchu, EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid) 2. stupeň porušení kontaktů buněk s neživým okolím, sterilní H 2 O pro tkáňové kultury výplach buněk a jejich zbytků, ethylalkohol (minimální koncentrace 70%) sterilizace prostředí, sterilní H 2 O pro tkáňové kultury opláchnutí alkoholu, PBS (phosphate buffered saline) příprava prostředí pro nasazení buněk. Každý výplach je potřeba provádět objemem tekutiny rovným šestinásobku objemu komůrky. Po těchto procedurách byla do komůrek vstříknuta suspenze buněk v médiu Reakce nádorových buněk G3S2 na cispt Jedním z prvních experimentů s živými buňkami, kterým byl analyzován potenciál kvantitativního fázového kontrastu byl časosběrný záznam reakce nádorových buněk G3S2 na cytostatikum cis-platinu (cispt). Reakce se projevuje postupným nástupem programové buněčné smrti, apoptózy, která je charakteristická prudkými změnami distribuce hmoty. Proto jsme zvolili právě tento buněčný proces pro porovnání zobrazení v DHM se zobrazením v klasickém Zernikově fázovém kontrastu. V tomto experimentu jsme mimo jiné testovali vlastnosti mikroskopu a jeho příslušenství při dlouhodobém pozorování. Celková doba snímání byla tři dny. Příprava buněk Čerstvě připravené suspenze buněk byly nasazeny do Petriho misek (o průměru 35mm) s 15 ml standardního kultivačního média a inkubovány za teploty 37 C a zvýšené vlhkosti po dobu 48

49 8.2. REAKCE NÁDOROVÝCH BUNĚK G3S2 NA CISPT dvou dnů. Pro experimenty v DHM byly do Petriho misek přidány spodní části stacionárních komůrek. Před pozorováním bylo médium odsáto a buňky byly 1 opláchnuty médiem bez fenolové červeně (FČ). K buňkám bylo pro pozorování přidáno médium bez FČ s minimálním terapeutickým množstvím cispt. Pro referenční pozorování v klasickém fázovém kontrastu byly buňky ponechány přímo v Petriho miskách a pro DHM byly buňky uzavřeny do stacionárních pozorovacích komůrek. Pozorování Nejdříve byl několikrát proveden experiment v klasickém Zernikově fázovém kontrastu (obr. 8.1), který ukázal indukci apoptózy přibližně s frekvencí mitotické aktivity. Při použití minimální toxické dávky došlo totiž k tomu, že buňky, které neprocházely buněčným cyklem dělení, na cispt nereagovaly, zatím co u těch, které procházely buněčným cyklem namísto rozdělení buňky, nastala apoptóza. Poté bylo provedeno pozorování v DHM. Byla zachycena apoptóza (obr. 8.2) a její zobrazení v kvantitativním fázovém kontrastu bylo porovnáno se zobrazením v klasickém fázovém kontrastu. I když záběry z klasického fázového kontrastu působí dojmem, že mají vyšší příčné rozlišení a větší kontrast, ve skutečnosti obsahují artefakty, které nevypovídají o skutečném rozložení hmoty. Je to především díky halo efektům, které vznikají v místech velkých změn optické tloušt ky preparátu. Po apoptóze se dokonce vytvářejí shluky s takovým gradientem optické tloušt ky, že se v zobrazení klasickým fázovým kontrastem objevují skoky fáze. Naproti tomu kvantitativní fázový kontrast po navázání žádné skoky fáze neobsahuje a stupně šedi fázového zobrazení jsou úměrné rozdílu optických drah indukovaných buňkami. Obrázek 8.1: Apoptotická smrt buňky indukovaná cispt v klasickém Zernikově fázovém kontrastu. Objektivy 10 /0,25. Průběh apoptózy se vyznačuje několika stadii. Počáteční stadium je velice rychlé stažení buňky, následuje rozprsknutí okrajových částí. V této fázi buňka nějakou dobu setrvá. Posledním stadiem apoptózy je nafouknutí okrajových částí buňky vytvoří se jeden nebo více puchýřů, které za určitý čas splasknou. Nabízí se otázka, jakým mechanismem dojde k jejich splasknutí. Uchová si buňka svůj obsah nebo praskne a vyvrhne jej? Pokud se buněčný obsah dostane opravdu mimo buňku, jaké je jeho složení? Toto mohou být signifikantní ukazatele pro indukci apoptózy či jiné buněčné smrti. 49

50 8.2. REAKCE NÁDOROVÝCH BUNĚK G3S2 NA CISPT Obrázek 8.2: Kvantitativní fáze apoptotické buňky v DHM. Objektivy 10 /0, 25. Obrázek 8.3: 3D vizualizace kvantitativní fáze apoptotické buňky v DHM. Objektivy 10 /0, 25. Obrázek 8.4: Zobrazení posledního stadia apoptózy v módu DPD vzhledem k počátku. Obrázky a e jsou příslušné obrázkům 8.3. Objektivy 10 /0,25. 50

51 8.3. REAKCE BUNĚK NA ENERGETICKOU A NUTRIČNÍ DEPRIVACI V odpovědích na tyto otázky je přínosem mód dynamických fázových diferencí. Na obrázku 8.3 je série snímků demonstrujících průběh kvantitativní fáze posledního stadia apoptózy. V buňce tedy proběhlo rychlé stažení a rozprsknutí a nyní je zobrazen proces nafouknutí puchýřů a následného splasknutí v pohledu z vhodného úhlu. Na obrázku 8.4 je výřez stejné scény zaznamenán pomocí dynamických fázových diferencí vzhledem k počátku. Do obrázků jsou přidány kontury, které spojují místa se stejnou hodnotou fáze. Vnější kontura každé buňky označuje přibližně její hranice. Vizuální analýza zobrazení ukazuje, že buňka zřejmě svůj obsah opravdu vyvrhne, na což se dá usoudit z přechodu pevného, konturou obepnutého kulatého tvaru puchýřku (obr. 8.4d) poměrně rychle na nejednoznačný, širší útvar (obr. 8.4e). Přírůstky suché hmoty reprezentované červenou barvou se objeví mimo buňku ohraničenou konturou, tudíž puchýř zřejmě praskl a buňka vyvrhla svůj obsah ven. Nárůst suché hmoty mimo buňku ukazuje na to, že vyvržená hmota buňky je hustší než samotné médium obklopující buňku. Potvrzení této hypotézy je možné pomocí výpočtů celkové suché hmoty uvnitř buňky během experimentu Reakce buněk na energetickou a nutriční deprivaci Motivace experimentů akutní nutriční a energetické deprivace vycházela z klinické praxe. Pacient vyléčený z rakovinového onemocnění úspěšně prodělanou operací, ozařováním nebo chemoterapií se jeví jako zdravý. Tento stav může být v budoucnu porušen externím stimulem, například silně stresovou situací, při které se rakovinové bujení opět projeví. Vyvstává tedy otázka, jestli rakovinové buňky mají nějaké mechanismy umožňující jejich přežití v silně nepříznivých podmínkách a jejich následné znovuobnovení. Proto jsme se zaměřili na experiment modelující tyto podmínky in vitro. Vytvořili jsme energeticky a nutričně deprivační prostředí použitím PBS (phosphate buffered saline) namísto standardního média. Stanovili jsme soubor buněk s reprezentanty od normálních (zdravých) buněk (LF), přes nádorové nemetastazující (K2, RsK4, G3) až po vysoce metastazující buňky (A3, G3S2) pro typ buněk mesenchymální (fibroblasty) a epiteliální (prsní). Chování buněk bylo také zkoumáno v závislosti na hustotě porostu ve dvou typech: řídký a polohustý. Základní rámec experimentů tvořil test přežití buněk v deprivačním médiu, jehož kritériem byla alespoň jedna přeživší buňka schopná dělení. Toto měření bylo provedeno na spolupracujícím pracovišti v laboratoři Buněčné biologie a kultivace kůže, FNKV v Praze časosběrným záznamem technikou klasického Zernikova fázového kontrastu Zobrazení v Zernikově fázovém kontrastu Příprava buněk Čerstvě připravené suspenze buněk byly nasazeny do Petriho misek o průměru 35 mm. Byly použity dvě hustoty nasazení buněk: přibližně buněk/cm 2 pro řídký a 10 4 buněk/cm 2 pro polohustý porost kultivačního povrchu. Po dvou dnech ve standardním kultivačním médiu bylo médium odstraněno a buňky byly 2 opláchnuty PBS. Poté bylo přidáno 5 ml PBS a buňky byly inkubovány za teploty 37 C a zvýšené vlhkosti. Buňky byly pozorovány v kultivačních lahvičkách s prodyšným uzávěrem s filtrací. 51

52 8.3. REAKCE BUNĚK NA ENERGETICKOU A NUTRIČNÍ DEPRIVACI Obrázek 8.5: Registrace reakce buněk od počátku působení PBS po buněčnou smrt. Klasický fázový kontrast, objektiv 10 /0, 25 Ph. A: Lidské podkožní fibroblasty LF. V obrázcích jsou uvedeny doby působení PBS. Obrázek d ukazuje nekrotickou smrt buňky po 18 hodinách. B: Krysí nádorové buňky A3. Obrázek d ukazuje onkotickou smrt po 24 hodinách. 52

53 8.3. REAKCE BUNĚK NA ENERGETICKOU A NUTRIČNÍ DEPRIVACI Řídké Hustota buněk Polohusté Doba působení PBS [h] Buňky RsK A K2 + + G3S2 NT + + NT + + EM-G3 NT Tabulka 8.1: Test přežití buněk. Význam symbolů: + přežití buněk a dělení; destrukce buněk; NT nebylo testováno. Pozorování Pro všechna pozorování klasickým fázovým kontrastem byl použit mikroskop Nikon Diaphot 300, digitální kamera a software UniBrain. Obrázek 8.5 demonstruje reakci dvou typů buněk v klasickém fázovém kontrastu. V části A je vidět mechanismus porušení kontaktů buněk normálních lidských fibroblastů s kultivačním povrchem, po kterém následuje rychlé stažení buněk ke skupině s vyšší hustotou a c. Na obrázku d je vidět jejich nekrotická smrt po 18 hodinách v PBS. Nekróza se projevuje typickým rozpadem buněk. V části B jsou zobrazeny buňky A3 v rychlé reakci na místě a c. Obrázek d registruje onkotickou smrt po 24 hodinách v PBS. Onkóza je proces podobný nekróze, ale předchází jí obrana buňky ve formě puchýřů, buňka déle odolává. V tabulce 8.1 je zaznamenána doba života všech nádorových typů buněk ve dvou koncentracích. Jako nejodolnější se projevily silně invazivní buňky G3S2 jak v řídkém, tak v polohustém porostu. V polohustém porostu přežily dokonce 60 hodin. Odolnost buněk klesala s klesající invazivitou buněk od G3S2 přes EM-G3, A3, RsK4 po K Zobrazení v DHM Příprava buněk Buňky byly pěstovány stejně jako pro pozorování v klasickém fázovém kontrastu na spolupracujícím pracovišti. Před jejich transportem do Laboratoře optické mikroskopie na ÚFI bylo standardní médium nahrazeno totožným médiem, ale bez fenolové červeně (FČ). Po převozu byly buňky ihned umístěny do vyhřívaného boxu a ponechány alespoň hodinu pro stabilizaci před pozorováním. Buňky byly 1 opláchnuty standardním médiem bez FČ a pak uzavřeny do komůrky s totožným médiem. Bylo provedeno referenční pozorování alespoň 20 minut ve standardních podmínkách. Poté byly komůrky otevřeny, buňky opláchnuty 2 v PBS a opět uzavřeny avšak s PBS. Byla pozorována jejich reakce na nutriční šok alespoň 45 minut. Poté byly opět komůrky otevřeny, buňky 1 opláchnuty standardním médiem bez FČ a nakonec uzavřeny se standardním médiem bez FČ. Byla pozorována jejich rekonvalescenční schopnost. 53

54 8.3. REAKCE BUNĚK NA ENERGETICKOU A NUTRIČNÍ DEPRIVACI Pozorování Na obrázcích jsou zobrazeny 4 typy buněk. Obrázky a c zobrazují vždy počáteční stav, tedy situaci asi po pěti minutách po první aplikaci PBS. Jedná se o amplitudu, fázi a 3D vizualizaci fáze, jejímž hodnotám (v radiánech) je pro lepší prostorovou orientaci přiřazena barevná škála. Další dva řádky d h charakterizují preparát v určitém stadiu během reakce. Obrázky postupně znázorňují d rekonstruovanou intenzitu, e rekonstruovanou fázi a f dynamické fázové diference. Jak do obrázku fáze (e), tak DPD (f) byly pro lepší orientaci přidány vrstevnicové kontury spojující hodnoty stejné fáze. Na obrázku g jsou separátně zobrazeny úbytky suché hmoty buňky a na obrázku h přírůstky. Hodnotám je přiřazena barevná škála pro lepší kvantitativní představu. Obrázek 8.6 demonstruje normální řídké fibroblasty v páté (a c) a v třinácté (d h) minutě reakce na PBS. Buňky LF vykazují ztrátu kontaktů s kultivačním povrchem začínající v nejdelších lamelách a v okrajových částech celého těla. To je patrné v obrázku 8.6f ze zeleného zabarvení u krajů buňky. Reakce se projevuje masivní rozdrobenou vnitrobuněčnou aktivitou, kterou jasně zobrazují červeno-zelené body uvnitř buněk. Na obrázku 8.7 jsou husté buňky K2 v páté (a c) a v osmé (d h) minutě reakce. Jejich oddělování od kultivačního povrchu je ve velké míře rovnoměrné (rovnoměrnost zelené a červené barvy v obrázku 8.7f) a polarizované (jedna část buňky je přichycená a druhá se odděluje), ale s malou aktivitou v centru buňky. Obrázek 8.6: Řídké LF buňky zobrazené v DHM v 5. minutě: a intenzita, b fáze, c 3D vizualizace fáze; a 13. minutě: d intenzita, e fáze, f DPD, g úbytky suché hmoty buňky a h přírůstky suché hmoty buňky. Objektivy 10 /0,25. 54

55 8.3. REAKCE BUNĚK NA ENERGETICKOU A NUTRIČNÍ DEPRIVACI Obrázek 8.7: Husté K2 buňky zobrazené v DHM v 5. minutě: a intenzita, b fáze, c 3D vizualizace fáze; a 8. minutě: d intenzita, e fáze, f DPD, g úbytky suché hmoty buňky a h přírůstky suché hmoty buňky. Objektivy 10 /0,25. Obrázek 8.8: Řídké A3 buňky zobrazené v DHM v 5. minutě: a intenzita, b fáze, c 3D vizualizace fáze; a 22. minutě: d intenzita, e fáze, f DPD, g úbytky suché hmoty buňky a h přírůstky suché hmoty buňky. Objektivy 10 /0,25. 55

56 8.3. REAKCE BUNĚK NA ENERGETICKOU A NUTRIČNÍ DEPRIVACI Obrázek 8.9: Husté G3S2 buňky zobrazené v DHM v 5. minutě: a intenzita, b fáze, c 3D vizualizace fáze; a 10. minutě: d intenzita, e fáze, f DPD, g úbytky suché hmoty buňky a h přírůstky suché hmoty buňky. Objektivy 10 /0,25. Obrázek 8.8 zachycuje stadium reakce řídkých buněk A3 v páté (a c) a dvacáté druhé (d h) minutě. Oddělování buněk je silně polarizované a pohyb vnitrobuněčné hmoty kompaktní až do zakulaceného tvaru, ve kterém buňky odolávají nepříznivým podmínkám velmi dlouho. Vytvářejí tenké výběžky, které jsou zapojeny do jejich rychlého nahodilého pohybu. Reakce hustých buněk G3S2 je zachycena na obrázku 8.9. Obrázky a c ukazují buňky v páté minutě a obrázky d h v desáté minutě. Prvním jevem je plynulé rozpojení mezibuněčných kontaktů. Stahování buněk je nepolarizované, rovnoměrně po celém okraji buňky. Objevuje se i jistá nerovnoměrná aktivita v centru buňky (obr. 8.8h nevyváženost pohybu hmoty centra) Závěr Popsaný experiment ukázal, že odolnost buněk vůči stresovým podmínkám je podmíněna jak vnitřními faktory, do kterých patří typ buňky (epiteliální vs. mesenchymální), stupeň malignity a hustota porostu buněk. Samostatné buňky jsou citlivější a reagují rychleji než buňky s větším množstvím mezibuněčných kontaktů. U nejcitlivějších buněk (normální fibroblasty) se projevila nekróza, zatímco u odolnějších buněk A3 onkóza. Programová buněčná smrt, apoptóza, nebyla pozorována. Mód fázových diferencí v DHM zvýraznil některé buněčné reakce, které by byly při zkoumání jednotlivých snímků velmi těžko postřehnutelné. Byly odhaleny rozdíly ve vnitrobuněčné motilitě nádorových buněk různé malignity během reakce na PBS od normálních fibroblastů (LF, obr. 8.6), přes nádorové nemetastazující fibroblasty (K2, obr. 8.7) k silně metastazujícím fibroblastům (A3, obr. 8.8). Normální fibroblasty se projevovaly rozdrobeným pohybem suché hmoty ve střední oblasti buňky, nemetastazující fibroblasty vykazovaly převážně polarizovaný, 56

57 8.4. POROVNÁNÍ MOTILITY CYTOSKELETONU DVOU TYPŮ BUNĚK tedy směrový pohyb a metastazující fibroblasty se projevovaly kompaktním přesunem buněčné hmoty. Vzorce chování G3S2, které jsou nejodolnější vůči daným stresovým podmínkám, se podobaly reakcím buněk A3 s malými lokalizovanými změnami v rozložení hmoty v buňce. Zdá se také, že je obecným pravidlem, že polarizované buňky (mesenchymální, s jednou osou delší než druhou) vykazují polarizovanou aktivitu při stahování, zatímco nepolarizované buňky (epiteliální) projevují nepolarizovanou aktivitu. Takže typ reakce odpovídá morfotypu buňky. Podobnost v kompaktnosti motility vnitřní buněčné hmoty mezi G3S2 a A3 buňkami odkrytá v DHM se jeví ve shodě s patologickou klasifikací epitelio-mesenchymální přeměny buněk pokročilého karcinomu na sarkomový morfotyp. Tyto výsledky jsou publikovány v [56] Porovnání motility cytoskeletonu dvou typů buněk U nádorových buněk je zásadním faktorem pro tvorbu metastáz invazivita buněk. Analýza invazivního módu daného typu buněk je určující pro stanovení efektivní léčby. V publikaci [57] byl zkoumán invazivní mechanismus dvou typů příbuzných buněk: nemetastazujících buněk typu fibroblastů K2 a vysoce metastazujících buněk A3, které byly odvozeny od K2. Jedná se o matečnou a dceřinou linii, tedy buňky blízce příbuzné, ale s velmi odlišnou schopností indukce metastáz. Proto je tento model atraktivní pro in vitro studium metastatické transformace. Jeden z detekovaných rozdílů ve vlastnostech těchto dvou typů buněk byl v dynamice cytoskeletonu. Dynamika cytoskeletonu byla kvantifikována pomocí kuliček navázaných na cytoskeleton (nanoscale particle tracking [58]) jako kvadrát změny polohy kuličky za jednu sekundu. Tato proměnná D byla experimentálně stanovena 2,5 větší pro buňky A3 v porovnání s K Motilita za standardních podmínek Časosběrný záznam kvantitativní fáze v DHM a především dynamické fázové diference zobrazují dynamiku suché hmoty buňky, tedy mimo jiné jejího cytoskeletonu. Pokusili jsme se tedy porovnat pohyblivost cytoskeletonu stejného sarkomového modelu buněk právě touto metodou. Použili jsme statistické zpracování naměřených dat popsané v odstavci 7.3. Dynamika cytoskeletonu popsaná pomocí D v [57] byla určena z velkého počtu kuliček (547 pro K2 a 748 pro A3), přičemž hustota kuliček byla asi 1 kulička na 1,5 buňky. Z toho vyplývá, že statistika byla provedena z přibližně 360 buněk K2 a 500 buněk A3. Doba trvání experimentu byla krátká, pouze 5 minut, pro omezení vlivu přemístění kuliček v důsledku migrace buněk. Charakteristika D tedy vyjadřuje především míru vnitřního přemíst ování hmoty cytoskeletonu. Jelikož v podmínkách naší laboratoře je provádění experimentů s velkým množstvím buněk komplikované a není možné zaručit stejné podmínky pro buňky v rámci různých transportů nakultivovaných buněk, vyhodnocovali jsme delší série pozorování menšího počtu buněk. Omezení vlivu migrace jsme zajistili pouze vizuálním výběrem. Buňky byly kultivovány stejně jako v odstavci 8.3 a pozorovány ve standardním médiu bez fenolové červeně s označením F10. Ze sérií fázových rekonstrukcí pohybujících se buněk byly vizuálně vybrány části, ve kterých se buňka nepřemíst ovala. Délka pozorování se pohybovala od 17 minut až po hodinu s intervalem snímkování 5 sekund. Pro každou sérii pozorování byly spočteny hodnoty B q definované jako normovaná suchá hmota buňky, která se přesune v daném intervalu příslušném snímkům q a q+1 (viz odstavec 7.3). 57

58 8.4. POROVNÁNÍ MOTILITY CYTOSKELETONU DVOU TYPŮ BUNĚK Obrázek 8.10: Rozložení B q s vyznačeným mediánem Me v jedné sérii pozorování. Příklad rozložení B q v sérii snímků s intervalem mezi snímky 5 sekund je na obrázku Je vidět, že hodnoty kolísají okolo střední hodnoty, která představuje průměrné množství pohybující se suché hmoty pro dané pozorování. Tato statistika je zatížena jak aditivním, tak impulzním šumem. Impulzní šum v tomto případě představuje nesprávné hodnoty B q způsobené především nestejnou hladinou pozadí fáze a vede při dalším zpracování statistiky k závažným chybám 2. druhu. Provedli jsme proto jeho filtraci, ve které jsme nahradili hodnoty ležící mimo interval Me ǫ,me+ǫ, hodnotou Me, přičemž Me je medián a ǫ je experimentálně stanovená hodnota. Aditivní šum bychom odstranili průměrováním, avšak vzhledem k malému počtu naměřených dat jsme aditivní šum nefiltrovali. Takto získané hodnoty z různých pozorování daného typu buňky tvoří soubor realizací náhodné proměnné B q. Pro porovnání rozložení B q byl sestaven histogram (obr. 8.11) z 1309 hodnot zaznamenávající pohyb 3 buněk K2 a 2 buněk A3. Z histogramu na obrázku 8.11 je patrné, že rozložení množství pohybující se hmoty u A3 je nerovnoměrné, méně se podobá normálnímu rozložení a zasahuje do vyšších hodnot než u K Motilita při externím stimulu Vzhledem k experimentálním výsledkům popsaným v odstavci 8.3 jsme provedli analýzu množství pohybující se suché hmoty buněk K2 a A3 při slabě deprivačním stimulu médiem F0 ochuzeným o živiny a při následné rekonvalescenci opět v plnohodnotném standardním médiu F10. Nejdříve bylo provedeno referenční pozorování buněk ve standardním médiu po dobu 30 minut. Poté byly komůrky otevřeny, buňky 2 opláchnuty médiem F0 a uzavřeny s F0. Reakce na slabě deprivační médium byla filmována po 15 minutách, které byly stanoveny jako čas odpovídající spotřebování zásobních živin a energie buněk. V tomto stavu byly buňky pozorovány 58

59 8.4. POROVNÁNÍ MOTILITY CYTOSKELETONU DVOU TYPŮ BUNĚK dalších 30 minut. Histogram rozložení pohybující se hmoty vytvořený ze 777 realizací náhodné proměnné B reprezentující pohyb 2 buněk K2 a 2 buněk A3 je na obrázku Poté byly komůrky opět otevřeny a médium bylo vyměněno za standardní. Po stabilizačním intervalu 15 minut byly buňky filmovány další půl hodiny. Histogram rozložení pohybující se suché hmoty v rekonvalescenční fázi tvořený 824 realizacemi náhodné proměnné B zahrnující pohyb 3 buněk K2 a 2 buněk A3 je na obrázku Obrázek 8.11: Histogram normovaného množství pohyblivé suché hmoty pro buňky K2 a A3 v médiu F10. Obrázek 8.12: Histogram normovaného množství pohyblivé suché hmoty pro buňky K2 a A3 ve slabě deprivačním médiu F0. Obrázek 8.13: Histogram normovaného množství pohyblivé suché hmoty pro buňky K2 a A3 při rekonvalescenci v médiu F10. Z obrázků je patrné, že při deprivační reakci invazivní buňky A3 reagovaly poměrně velkým snížením pohyblivosti, zatímco jedna z buněk K2 byla vybuzena k pohyblivosti 59