Masarykova univerzita. Lékařská fakulta ESCHERICHIA COLI O157 JAKO PŮVODCE ZOONÓZ A JEJÍ PREVALENCE U LOVNÉ ZVĚŘE.

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta ESCHERICHIA COLI O157 JAKO PŮVODCE ZOONÓZ A JEJÍ PREVALENCE U LOVNÉ ZVĚŘE Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jana Juránková, Ph.D. Autor: Tomáš Mati Brno, duben 2014

2 Jméno a příjmení autora: Tomáš Mati Název bakalářské práce: Escherichia coli O157 jako původce zoonóz a její prevalence u lovné zvěře Pracoviště: Akreditovaná zkušební laboratoř Vojenského veterinárního ústavu Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jana Juránková, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2014 Souhrn: Escherichia coli O157 je vysoce patogenním sérotypem enterohemoragické E. coli (EHEC). Escherichia coli O157 po kolonizaci GIT produkuje shiga-like toxin (verotoxin), způsobující hemoragickou kolitidu, která nejčastěji u dětí může vést až ke vzniku hemolyticko-uremického syndromu. Přirozeným rezervoárem této bakterie je zažívací trakt Tura domácího (Bos taurus), odkud se může dostávat do živočišných produktů nebo fekální kontaminací do pitné vody, které poté slouží jako vektor šíření nákazy. Tato bakterie se také sporadicky vyskytuje a byla izolována od jiných živočišných druhů. Klíčová slova: Escherichia coli O157, Hemolyticko-uremický syndrom, lovná zvěř, zoonóza, Vojenský výcvikový prostor Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně pod vedením MUDr. Jany Juránkové, Ph.D. a uvedl v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne...

4 Cíl práce: Cílem mé bakalářské práce je zjistit kolonizaci GIT volně žijící lovné zvěře ve Vojenských výcvikových prostorech kmenem Escherichia coli O157. Hypotéza: Kolonizace lovné zvěře Escherichia coli O157 ve Vojenských výcvikových prostorech je vyšší, než je udáváno v literatuře a mohla by být potenciálním zdrojem infekcí lidí.

5 Poděkování: Chtěl bych poděkovat MUDr. Janě Juránkové, Ph.D. za cenné rady, ochotu a také trpělivost, kterou prokázala při vedení mé bakalářské práce. A také panu podplukovníkovi MVDr. Vladimíru Žákovčíkovi za možnost použít výsledků získaných ze vzorků vyšetřených Vojenským veterinárním ústavem.

6 OBSAH: 1. Seznam použitých zkratek Úvod TEORETICKÁ ČÁST Rod Escherichia Escherichia coli Morfologie Přirozené životní prostředí Biochemické vlastnosti Antigenní struktura O-antigeny H-antigeny K-antigeny F-antigeny Diagnostika Prevence, terapie a rezistence k ATB Patogenní kmeny Escherichia coli Kmeny extraintestinálně patogenní Uropatogenní Escherichia coli Bakterie Escherichia coli způsobující neonatální meningitidu Kmeny intestinálně patogenní Enteropatogenní Escherichia coli Enterotoxigenní Escherichia coli Enteroinvazivní Escherichia coli Enteroagregativní Escherichia coli Difuzně adherentní Escherichia coli Enterohemoragické Escherichia coli Escherichia coli O

7 6.1 Epidemiologie a prevence Patogenita a faktory virulence Diagnostika Onemocnění vyvolané shiga-like toxigenními Escherichia coli O Hemoragická kolitida Trombotická trombocytopenická purpura Hemolyticko-uremický syndrom Klinický nález Morfologické změny Extrarenální postižení Terapie Pozdní následky EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Materiál Metodika Odběr vzorku a transport Používaná kultivační média Amiesovo transportní médium s aktivním uhlím ASAP agar Endův agar Krevní agar MacConkeyův agar Živný agar Přístroje a pomůcky Sérologické a biochemické reakce Latexová aglutinace Biochemické testy Pracovní postup

8 10. Výsledky Diskuze Závěr

9 1. Seznam použitých zkratek ASAP ATB camp CDC cgmp CNS CT-SMAC ČIA DAEC DAF DNA EAggEC EHEC EIEC ELISA EPEC ETEC ExPEC GIT GUD HACCP HCl - AES Laboratoire Salmonella Agar Plate - antibiotika - cyklický adenosin monofosfát - Centers for Disease Control and Prevention - cyklický guanosin monofosfát - centrální nervový systém - sorbitol MacConkeyův agar s cefiximem a teluričitanem draselným - Český Institut pro Akreditaci - difusně adherentní Escherichia coli - decay-accelerating factor - deoxyribonukleová kyselina - enteroagregativní Escherichia coli - enterohemoragická Escherichia coli - enteroinvazivní Escherichia coli - enzyme-linked immuno sorbent assay - enteropatogenní Escherichia coli - enterotoxigenní Escherichia coli - extraintestinálně patogenní Escherichia coli - gastrointestinální trakt - β-glukuronidáza - Hazard Analysis Critical Control Point (systém kritických kontrolních bodů) - kyselina chlorovodíková

10 HUS KCN LEE LT NAD PCR RIA RNA SMAC SOR ST STEC Stx SZÚ-CHPŘ TTP UPEC VTEC VVP WHO - hemolyticko-uremický syndrom - kyanid draselný - Locus of Enterocyte Effacement - termolabilní enterotoxin - nikotinamin adenin dinukleotid - polymerázová řetězová reakce - radioimunoanalýza - ribonukleová kyselina - sorbitol MacConkeyův agar - sorbitol - termostabilní enterotoxin - shiga-like toxigenní Escherichia coli - Shiga-like toxin - Státní zdravotní ústav Centrum hygieny potravinových řetězců - trombotická trombocytopenická purpura - uropatogenní Escherichia coli - verotoxigenní Escherichia coli - Vojenský výcvikový prostor - World Health Oraganization (světová zdravotnická organizace)

11 2. Úvod Escherichia coli O157 je významným patogenním kmenem způsobujícím převážně u malých dětí závažné střevní onemocnění - hemoragickou kolitidu, která se může rozvinout až v hemolyticko-uremický syndrom s následným poškozením ledvin nebo smrtí pacienta (Karpíšková, 2011). Onemocnění je problémem ve vyspělých zemích a vzniká v souvislosti s konzumací kontaminovaných potravin. Špatně tepelně opracovaným masem, nepasterizovaným mlékem nebo syrovou zeleninou, k jejímuž zavlažování byla použita voda kontaminovaná zvířecími výkaly (Drápal aj. 2004). Poprvé byla tato bakterie izolována CDC v roce 1975 v USA, ale až v roce 1982 byla potvrzena jako příčina průjmového onemocnění ve státech Michigan a Oregon vzniklého po konzumaci kontaminovaných hamburgerů (Riley aj. 1983). Významným rezervoárem Escherichia coli O157 je zejména GIT hovězího dobytka s frekvencí výskytu 0,15 až 4 % a dalších zvířat. V České republice byl sledován výskyt ve výkalech skotu (pozitivní nález u 6,2 % vzorků od býků nad 600 kg a 59,6 % od býků 100 až 200 kg) a ve filtrech z mléčnic zemědělských podniků (pozitivní nález u 2,7 % vzorků). Mezi lety 1999 až 2003 proběhla studie na SZÚ-CHPŘ v Brně zaměřená na výskyt E. coli O157 v potravinách, při němž bylo vyšetřeno 1380 vzorků a u žádného z nich nebyl potvrzen nález tohoto agens (Drápal aj. 2004). Zahraniční studie udávají nosičství v GIT u divoce žijících přežvýkavců se signifikantním výskytem u jelena běloocasého (Odocoileus virginianus), jelena lesního (Cervus elaphus) a dále u prasete divokého (Sus scrofa) a sporadickým výskytem u jiných divokých zvířat (Ferens a Hovde 2011)

12 TEORETICKÁ ČÁST 3. Rod Escherichia Rod Escherichia je součástí čeledi Enterobacteriaceae, která taxonomicky spadá pod řád Enterobacteriales třídy Gammaproteobacteria kmene Proteobacteria. Rod Escherichia stejně jako ostatní rody v této čeledi mají stavbu buněčné stěny gramnegativního typu. Bakterie toho rodu jsou většinou pohyblivé a biochemicky značně aktivní. Některé nepohyblivé laktóza negativní kmeny Escherichia coli mohou být biochemicky obtížně odlišitelné od rodu Shigella. Stejně jako ostatní rody čeledi netvoří spory ani cysty a jsou oxidáza negativní. Výjimku v čeledi tvoří rod Plesiomonas, který je oxidáza pozitivní. Jsou fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní s optimální teplotou růstu při 37 C a krátkou generační dobou (Sedláček, 2007). Nejznámějším a nejdůležitějším zástupcem rodu Escherichia je bakterie Escherichia coli. Mimo této bakterie obsahuje rod Escherichia i jiné druhy, které se vzácně vyskytují v ranách u lidí (Escherichia hermannii a Escherichia vulneris) nebo v jejich GIT (Escherichia fergusonii) (Votava aj. 2007). Z fylogenetických studií a výsledků DNA-DNA hybridizace vyplynulo, že E. hermannii a E. vulneris jsou pravděpodobně příbuzné citrobakterům a E. fergusonii je nepatogenní zástupce E. coli. Nejnověji popsaným druhem je Escherichia albertii izolovaná ze stolice dětí s průjmovým onemocněním. Původně byly k rodu řazeny také Escherichia adecarboxylata a Escherichia blattae. Ty však byly k rodu přiřazeny chybně a později byly překlasifikovány jako Leclercia adecarboxylata a Shimwellia blattae. Aplikací molekulárně biologických metod bylo zjištěno, že všechny čtyři druhy rodu Shigella jsou geneticky příbuzné s Escherichia coli a měly by tedy být jedním druhem. Podle hypotézy Georgiadese a Raoulta se bakterie řazené do rodu Shigella vyvinuly z Escherichia coli za pomoci plazmidů nesoucích kritické geny a masivní delecí genů, která vedla ke zvýšení virulence (Sedláček, 2011)

13 4. Escherichia coli Bakterii Escherichia coli poprvé izoloval v roce 1885 rakouský dětský lékař Theodor Escherich a pojmenoval ji jako Bacterium coli commune. O deset let později ji jako Bacillus coli popsal německý botanik W. Migula. Roku 1919 byla tato bakterie podle svého objevitele pojmenována jako Escherichia coli (Sedláček, 2011). Escherichia coli slouží jako modelový organismus. Byla na ní prokázána replikace DNA. Do jejího genomu jsou vkládány cizí geny pro tvorbu různých látek. Například lidský inzulin nebo interferon a antigeny jiných bakterií, jejichž přítomnosti na bakterii je využito k tvorbě rekombinantních vakcín. Escherichia coli se běžně vyskytuje jako součást střevní mikroflóry u lidí. Ve střevě působí symbioticky, svým růstem a tvorbou kolicinů brání množení patogenních mikroorganismů a přímo se podílí na tvorbě vitamínu K. Escherichia coli se také vyskytuje ve velkém počtu různých patogenních kmenů, které se řadí do dvou velkých skupin podle místa jejich působení a to na kmeny patogenně působící intestinálně a extraintestinálně (Votava aj. 2003). Escherichia coli je spolu s bakteriemi rodů Bifidobacterium, Lactobacillus nebo Enterococcus využívána také jako probiotický mikroorganismus. Kmen používaný k tomuto účelu má jedinečnou vlastnost v podobě neschopnosti tvorby fimbrií. Bez jejichž přítomnosti není schopen adherovat k buňkám střevní sliznice. Spolu s tím se vykazuje vysokou genetickou stabilitou a avirulencí. Tento probiotický kmen byl izolován roku 1917 od vojáka bojujícího v 1. světové válce a byl pojmenován jako E. coli Nissle 1917 (Klaban, 2011). 4.1 Morfologie Bakterie Escherichia coli jsou rovné fakultativně anaerobní gramnegativní tyčinky vyskytující se samostatně nebo v párech (Obr. 1) se šířkou 1,1 1,5 μm a délkou 2,0 6,0 μm (Holt, 1994). Mohou mít pouzdro, které je tvořeno polysacharidy a je typické zejména pro kmeny způsobující infekce močového ústrojí (Greenwood aj. 1999). Většinou jsou pohyblivé s bičíky vyskytujícími se po celém povrchu těla. Jsou chemoorganotrofní (získávání energie oxidací organických látek) s respiračním i fermentačním (oxidační proces, při kterém je zdrojem elektronů jiná organická molekula nikoliv kyslík) druhem metabolismu a optimální teplotou růstu při 37 C (Holt, 1994, Votava aj. 2005). Růstové rozmezí teplot je mezi C a některé kmeny mohou přežívat i 15 minut při teplotě 60 C nebo po

14 dobu 60 minut při 55 C (Greenwood aj. 1999). Mimo to byly popsány kmeny schopné růstu při teplotách pohybujících se okolo 7,5 C nebo při teplotách dosahujících 49 C (Brenner aj. 2005). Bakterie E. coli mohou růst na pevných površích v podobě biofilmu. Tato schopnost je dána přítomností bičíků, membránového proteinu Ag43, konjugačních fimbrií I. typu, curli a kolanové kyseliny (Madsen, 2008). Curli jsou proteiny extracelulární matrix. Tyto proteiny jsou zapojeny do tvorby biofilmu tak, že dávají bakterii schopnost přilnout k povrchu jiných buněk a poté agregovat. Zároveň jsou důležitým faktorem virulence umožňujícím komunikaci s množstvím hostitelských proteinů a tím usnadňují průnik bakterií do hostitele (Dueholm aj. 2012). Na živných agarech vyrostou bakterie E. coli do 18 hodin v bezbarvých hladkých koloniích o průměru 2 3 mm (Obr. 2). Na krevním agaru může být kolem kolonií přítomna hemolýza (Obr. 3). Na MacConkeyově agaru rostou v rudě zbarvených koloniích (Obr. 4) (Greenwood aj. 1999). Na Endově agaru v purpurově zbarvených koloniích s difuzí zbarvení do okolí kolonie a často typickým kovovým leskem (Obr. 5). Za ideálních podmínek trvá generační doba 20 minut (Votava aj. 2003). Kultury vyrostlé na pevných agarech mají charakteristický fekální zápach. V bujónu roste E. coli v podobě homogenního zákalu s možnou tvorbou sedimentu (Dubos aj. 1967). 4.2 Přirozené životní prostředí Přirozeným životním prostředím bakterie Escherichia coli je hlavně tlusté a v menší míře i tenké střevo savců. S rovnoměrným zastoupením u masožravců, všežravců i býložravců (Quinn aj. 1999). Její podíl na bakteriální populaci přítomné v GIT je ale pouze 0,1 % (Prescott aj. 1996). Kmeny kolonizující GIT jsou velmi rozmanité, mohou být pouze komenzály nebo mít různé kombinace faktorů virulence, pomocí kterých patogenně působí intestinálně i extraintestinálně (Greenwood aj. 1999). Již Theodor Escherich v 19. Století prokázal, že mekonium je sterilní a ke kolonizaci GIT kojence dochází mezi 3 24 hodinami po porodu z vnějšího prostředí (Shulman aj. 2007). Bakterie E. coli se mohou spolu s fekáliemi dostat do vody, ve které jsou schopny přežít i několik týdnů a slouží jako indikátor její fekální kontaminace (Bednář aj. 1996)

15 4.3 Biochemické vlastnosti Až na výjimky všechny kmeny Escherichia coli fermentují laktózu za vývoje plynu do hodin a to až při teplotách do 44 C. Fermentují manitol a sorbitol, produkují enzym β-galaktosidázu (ONPG). Tvoří indol a nerostou v KCN (Greenwood aj. 1999). Jsou oxidáza negativní a tvoří enzym katalázu (Holt aj. 1994). Neprodukují enzym ureázu ani sirovodík (Quinn aj. 1999). Zbylé biochemické vlastnosti jsou shrnuty v Tab. 1. Test E. coli Test E. coli lysin dekarboxyláza ornitin dekarboxyláza arginin dihydroláza fermentace glukózy fermentace adonitolu fermentace arabitolu fermentace celobiózy + d d fermentace dulcitolu fermentace glycerolu fermentace rafinózy fermentace salicinu fermentace melibiózy fermentace malonátu fermentace acetátu + většina kmenů pozitivních, - většina kmenů negativních, d některé kmeny pozitivní Tab. 1 (zdroj: Brenner aj. 2005, Greenwood aj. 1999) d + d d Antigenní struktura O-antigeny Somatický (tělový) O-antigen je endotoxický lipopolysacharid nacházející se u gramnegativních bakterií vázaný na povrch cytoplazmatické membrány, kterou stabilizuje. Jako antigen je termostabilní, zachovává si antigenní vlastnosti i po projití varem. Je hlavním povrchovým antigenem, jenž slouží k sérotypizaci bakteriálního kmene. Molekula lipopolysacharidu je složena z lipidu A zakotveného v cytoplazmatické membráně

16 a O-specifického polysacharidu, který směřuje ven z membrány. O-antigen je tvořen komplexem oligosacharidových podjednotek, stavba tohoto komplexu má souvislost s virulencí kmene. Tento lipopolysacharid vykazuje klasické vlastnosti endotoxinu. Má pyrogenní a letální toxicitu, schopnost vyvolat akutní hypoglykémii, DIC, hypotenzi a také aktivovat komplement alternativní drahou (Votava aj. 2005). O-specifický polysacharid je u bakterií Escherichia coli neutrální nebo kyselý, kdy kyselou složkou většinou bývá kyselina hexuronová. Mezi jednotlivými antigeny dochází ke zkříženým reakcím a to jak mezi antigeny jednotlivých kmenů E. coli, tak i s O-antigeny jiných rodů (Greenwood aj 1999). V současnosti jsou podle O-antigenu popsány sérotypy Escherichia coli O1 až O173 (výjimkou jsou sérotypy O31, O47, O67, O72, O93, O94 a O122, které byly odstraněny), dále jsou zde řazeny sérotypy provizorně značené jako OX3 a OX7, které by měly získat označení O174 a O175. A také se zkoumá šest sérotypů zastupujících kmeny EHEC (STEC, VTEC), které by měly obdržet označení O176 až O181 (Brenner aj. 2005) H-antigeny Flagelární (bičíkové) H-antigeny jsou tvořeny polymerizovanou bílkovinou flagelinem a vyskytují se u pohyblivých kmenů Escherichia coli (Votava aj. 2005). H-antigeny jsou jednou ze tří hlavních skupin antigenů (O, H, K-antigeny), na jejichž základě dochází k sérotypizaci jednotlivých kmenů. Popsáno bylo 56 H-antigenů (z nichž H13 a H22 byly odstraněny a H50 stažen, protože je totožný s antigenem H10). Stejně jako u O-antigenů i mezi H-antigeny dochází ke zkříženým reakcím (Brenner aj. 2005) K-antigeny Kapsulární (pouzderné) K-antigeny jsou polysacharidy chránící bakterii před fagocytózou a infekcí bakteriofágy. Jde o důležitý faktor virulence, protože svou hydrofilní povahou umožňuje bakterii uniknout z objetí panožek fagocytu. A chrání bakterii před účinky komplementu (Votava aj. 2005). V současnosti rozeznáváme 60 K-antigenů (číslování není postupné). K-antigeny bakterií Escherichia coli se dělí do dvou odlišných skupin na antigeny I. a II. skupiny. Antigeny I

17 skupiny mají vysokou molekulovou hmotnost (>100 kda) a vyskytují se pouze u kmenů séroskupiny O8, O9, O20 a O101 u nichž jsou exprimovány jak při 18 tak i 37 C. Tato skupina se dále na základě přítomnosti aminocukrů na polysacharidovém řetězci rozděluje na I.A skupinu (nemá aminocukr) a I.B skupinu (má aminocukr). Polysacharid skupiny I.A je strukturální identitou podobný antigenům Klebsiella spp., zatímco skupina I.B nemá podobnost s žádnou jinou bakterií. Části některých polysacharidů antigenní skupiny I. jsou připojeny k jádru lipidu A a mohou se chovat jako somatické O-antigeny. Z tohoto důvodu byl antigen K84 původně chybně určen jako somatický antigen O93. Antigeny II. skupiny mají nízkou molekulovou hmotnost (50 kda) a vyskytují se především u kmenů O-antigenních séroskupin spojovaných s extraintestinálními onemocněními. Mnoho polysacharidů u antigenů II. skupiny je strukturálně podobných nebo téměř totožných s grampozitivními bakteriemi. Antigeny této skupiny se vzájemně velice liší ve složení a strukturálních vlastnostech a mohou se dále dělit do podskupin na základě svých kyselýchsložek. 20 až 50 % jejich polysacharidových řetězců je vázáno na fosfolipidy (Brenner aj. 2005) F-antigeny F-antigeny (fimbriální) jsou proteiny fungující jako adheziny umožňující některým kmenům Escherichia coli přilnout ke střevním buňkám (enterocytům) a kolonizovat tak tenké střevo (Quinn aj. 1999). Jedná se o antigeny K88 a K99, které účinkují jako faktory virulence u enterotoxigenních kmenů E. coli patogenních pro novorozená selata, telata a jehňata. U lidských kmenů jsou známy pod názvem kolonizační faktor I a II (Votava aj. 2005). Tyto antigeny jsou vláknité bílkoviny připomínající fimbrie. Při přítomnosti u kmenů způsobujících uroinfekce jsou příčinou hemaglutinace rezistentní k manóze a rozdělují se podle své specifity k receptorům, kdy například P-fimbrie se specificky vážou na P receptory skupinového antigenu lidských erytrocytů a uroepiteliálních buněk (Greenwood aj. 1999)

18 4.5 Diagnostika Odebrané vzorky se pro mikroskopické vyšetření barví Gramovou metodou a kultivují na vhodných kultivačních půdách. Například na Endově půdě (typický kovový lesk). Izolované bakterie je poté nutné identifikovat biochemickými testy a provést vyšetření jejich citlivosti k antibiotikům. V případě, že je podezření na urogenitální infekci, je kultivace semikvantitativní a při akutních infekcích se bakterie E. coli nalézají v téměř čistých kulturách s koncentrací buněk vyšší než 10 5 v 1 ml moči (Greenwood aj. 1999, Votava aj. 2003). V případech, kdy je podezření, že onemocnění je způsobeno patogenními kmeny bakterií E. coli, a nebo pokud se jedná o nález ve stolici novorozenců a kojenců, je nutné provést antigenní analýzu aglutinačními reakcemi s polyvalentními a monovalentními séry (Greenwood aj. 1999, Votava aj. 2003). Při průkazu kmenů ETEC je důležitá také detekce termolabilního (LT) a termostabilního (ST) enterotoxinu. Pro průkaz LT existuje celá řada imunologických metod. Jde o ELISA nebo RIA metody prováděné v mikrotitračních destičkách se spektrofotometrickým hodnocením. Precipitační test, který lze provést přímo na koloniích vyrostlých na speciálním agaru a lze také použít stafylokokový konglutinační test nebo latexový aglutinační test. Průkaz ST je možný pomocí ELISA metody využívající monoklonální protilátku. Tuto protilátku se podařilo připravit až po navázání toxinu na hovězí sérový albumin, protože samotný toxin není imunogenní. Možná je také detekce genů pro produkci toxinů použitím DNA sond. Těmito biotinem značenými sondami lze detekovat ETEC kmeny jak ve stolici, tak i v potravinách a vodě (Greenwood aj. 1999). 4.6 Prevence, terapie a rezistence k ATB Všeobecně nejdůležitější a zároveň nejúčinnější opatření při prevenci onemocnění způsobených bakteriemi E. coli je zabránění kontaktu s těmito patogenními agens. Jedině striktní hygienou lze zabránit šíření těchto onemocnění. Mezi kojenci v nemocnicích a ústavech se přenos děje mezi pacienty a to většinou rukama personálu nebo kontaminovanou kojeneckou stravou. Při léčbě enteritid je důležitá včasná náprava vodní bilance a s ní i elektrolytů aby se předešlo rozvoji těžkého onemocnění s fatálními důsledky (Greenwood aj. 1999)

19 Jako možná obrana proti enteritidám se jeví případná vakcinace. Po veterinární medicíně byla připravena také vakcína určená k užití u lidí. Tato vakcína je vyrobena ze synteticky připraveného termostabilního toxinu (ST) navázaného na netoxickou podjednotku B termolabilního toxinu (LT). U dobrovolníků vedlo podání této vakcíny ke vzestupu hladiny antitoxinu v séru a aspirátu z jejuna (Greenwood aj. 1999). V zemích s nízkou úrovní hygieny je nejvýznamnějším zdrojem infekcí GIT způsobených bakteriemi Escherichia coli kontaminovaná voda a potraviny. Při cestě do těchto zemí je nutné dbát na vhodný výběr místa ke stravování s doporučením konzumovat pouze vařená jídla a balenou vodu. Především v tropických oblastech je vhodné preventivní užívání ATB ke snížení výskytu průjmu. Avšak užívání antibiotické profylaxe je právem kritizováno z důvodu vzniku a šíření rezistence u enteropatogenních bakterií (Greenwood aj. 1999). Bakterie Escherichia coli jsou citlivé k celé řadě antibiotik (Tab. 2). Stejně jako jiné gramnegativní bakterie jsou ale přirozeně rezistentní vůči hydrofobním antibiotikům jako jsou: makrolidy (Erythromycin, azithromycin, clarithromycin), novobiocin (aminokumarinová ATB), rifamycin (ansamycinová ATB), aktinomycin D (polypeptidová ATB) a kyselině fusidové. Důvodem odolnosti k těmto antibiotikům je struktura vnější membrány s nízkou propustností k lipofilním látkám a v některých případech také synergický účinek mechanismů aktivního efluxu. Stejně tak jsou bakterie E. coli rezistentní k betalaktamovému ATB benzylpenicilinu (Penicilin G) (Brenner aj. 2005, Greenwood aj. 1999). ampicilin (betalaktamová ATB) cefalosporiny (betalaktamová ATB) tetracyklin (tetracykliny) streptomycin (aminoglykosidy) chloramfenikol (amfenikoly) kanamycin (aminoglykosidy) gentamycin (aminoglykosidy) amikacin (aminoglykosidy) trimetoprim (sulfonamidy a pyrimidiny) sulfonamidy (sulfonamidy a pyrimidiny) polymyxiny (polypeptidová ATB) Tab. 2 (zdroj: Greenwood aj. 1999)

20 U bakterií E. coli však často dochází k získání plazmidu nesoucího geny rezistence k jednomu nebo více antibiotikům. Byly izolovány kmeny se získanou rezistencí k aminoglykosidům, betalaktamovým ATB, chloramfenikolu, sulfonamidům, tetracyklinu i trimetoprimu. Rezistence k trimetoprimu a cefalexinu (cefalosporin) se vyskytují již spíše vzácně, oproti tomu rezistence k ampicilinu, tetracyklinu, streptomycinu a sulfonamidům je poměrně častá. Takto získaná rezistence se může projevovat čtyřmi různými mechanizmy: změnou cílového místa, enzymatickou detoxikací antibiotika, jeho sníženým ukládáním nebo odkloněním antibiotikem poškozeného/blokovaného kroku. První tři jmenované mechanizmy bývají zprostředkovány získáním plazmidu s potřebnými geny, případně chromosomální mutací. Čtvrtý mechanizmus lze primárně přičíst k přenosu genů rezistence plazmidem nebo pomocí transpozonu (Brenner aj. 2005, Greenwood aj. 1999). Transpozony (pohyblivé sekvence) jsou úseky DNA, které mohou být přemístěny z jednoho místa na molekule DNA do druhého a které u bakterií nesou geny pro rezistenci na antibiotika (Nečas aj. 2000). Sledováním vývoje rezistence u invazivních kmenů bakterií E. coli se od roku 2001 zabývají laboratoře, které jsou v rámci České republiky zapojené do projektu European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net). Jedná se o dlouhodobý projekt celoevropské úrovně pro sledování antibiotické rezistence u invazivních izolátů bakterií, jehož cílem je shromažďovat srovnatelné a validní údaje o rezistenci využitelné pro zdravotnictví účastnících se zemí (Urbášková, 2008)

21 5. Patogenní kmeny Escherichia coli Klasifikace jednotlivých patogenních kmenů není zcela jednotná. Někteří autoři uvádějí i více skupin například nekrotoxigenní Escherichia coli (NTEC) nebo hemolytické kmeny E. coli spojené s průjmy, které se nazývají DHEC (zkratka z anglického názvu diarrhea-associated hemolytic E. coli). Z epidemiologického hlediska se bakterie Escherichia coli přenáší fekálně orální cestou a jejich výskyt v potravinách hlavně v rozvojových zemích je poměrně běžný (Votava aj. 2003). Infekce vyvolané bakteriemi E. coli mohou být endogenního nebo exogenního původu. Hlavními původci extraintestinálních onemocnění jsou bakterie endogenního původu, které jsou za normálních okolností přirozenou bakteriální mikroflórou daného jedince. Zatímco původci intestinálních onemocnění jsou obvykle původu exogenního (Songer aj. 2005). 5.1 Kmeny extraintestinálně patogenní ExPEC jsou kmeny, u nichž byly prokázány extraintestinální faktory virulence nebo u nichž byla na vhodném zvířecím modelu prokázána zvýšená virulence. K těmto kmenům se řadí omezený počet O:K:H sérotypů, které disponují P a S-fimbriemi, sideroferony (např. aerobaktin), O-antigeny, tvorbou toxinů (často hemolyzinu) a tvorbou pouzdra umožňující vyhnout se hostitelským obranným mechanismům. Infekce způsobené ExPEC kmeny jsou běžné u všech věkových skupin a vyskytují se na téměř jakémkoli místě. Nejčastěji se jedná o infekce urogenitálního traktu v rozsahu od nekomplikovaných infekcí až po invazivní pyelonefritidu a dále o neonatální meningitidu a sepsi. Tato patogenní skupina je epidemiologicky i fylogeneticky odlišná jak od kmenů komenzálních tak intestinálně patogenních (Brenner aj. 2005) Uropatogenní Escherichia coli Escherichia coli je nejčastějším původcem infekcí urogenitálního traktu. Z ambulantních provozů tvoří až 80% všech izolovaných kmenů. Ne všechny bakterie Escherichia coli vyvolávající urogenitální infekci musí být kmeny UPEC (Votava aj. 2003). UPEC kmeny jsou charakterizovány řadou faktorů virulence, které společně hrají roli v jejich patogenitě. Geny těchto faktorů jsou lokalizovány na tzv. ostrovech patogenity,

22 ty se mohou často zcela ztratit, případně může dojít k jejich zdvojení nebo amplifikaci. Mnoho UPEC kmenů produkuje toxiny způsobující hemolýzu erytrocytů, tímto toxinem bývá nejčastěji hemolyzin. Produkce hemolyzinu se projeví vznikem zóny hemolýzy kolem kolonií rostoucích na krevním agaru již po 3 až 4 hodinách inkubace. Mimoto většina kmenů také má na svém povrchu P-fimbrie (typu F7 až F16) nebo S-fimbrie. Nejběžnější UPEC izoláty jsou se somatickými O-antigeny (O1, O2, O4, O6, O7, O18ac, O75,O15, O16) v kombinaci s omezeným počtem kapsulárních K-antigenů (K1, K2, K3, K5, K12 a K13). Nejčastěji izolované sérotypy skládající se z těchto antigenů jsou uvedeny v Tab. 3 (Brenner aj. 2005). sérotyp O1:K1:H7 O2:K1:H4 O4:K12:H1 O4:K12:H5 O6:K2:H1 O6:K5:H1 O6:K13:H1 O16:K1:H6 O18ac:K5:H7 Tab. 3 (zdroj: Brenner aj. 2005) Oproti kmenům ETEC prevalence UPEC kmenů kolísá s geografickou polohou a ke kolonizaci tlustého střeva těmito kmeny dochází konzumací kontaminované potravy. U predisponovaných osob poté může dojít ke vniku urogenitální infekce. Ty se častěji vyskytují u žen, přičemž příčinou je kratší a širší uretra, která usnadňuje průnik bakterií do močového měchýře. Vysoký výskyt těchto infekcí u těhotných žen může být navíc i z důvodu zpomalení odtoku moči, způsobeným hormonálními změnami a zvýšením tlaku vyvíjeného na močové ústrojí. Zpomalení odtoku moči je predispozičním faktorem pro obě pohlaví. Nejčastější příčinou je zúžení uretry, z důvodu přítomnosti močových kamenů, funkční poruchou, vrozenou malformací a u mužů zvětšením prostaty. Riziko infekce zvyšují také invazivní zákroky (katetrizace a cystoskopie), kterými mohou být bakterie zaneseny do urogenitálního traktu (Greenwood aj. 1999) Bakterie Escherichia coli způsobující neonatální meningitidu Escherichia coli je nejčastěji izolovanou gramnegativní bakterií způsobující bakteriální neonatální meningitidu. Předtím, než dojde k invazivní infekci, je nutné, aby

23 došlo k přilnutí bakterií k buněčnému povrchu epiteliálních buněk. To je umožněno pomocí S-fimbrií. S-fimbrie se vážou na glykoproteiny, které se nacházejí na povrchu buněk sliznice a obsahují sialovou kyselinu (Schroten aj. 1992). Kmeny bakterií Escherichia coli způsobující neonatální meningitidu jsou nejčastěji spojovány se sérotypy O1, O6, O7 a O18ac jejichž kapsulární antigen K1 je shodný s kapsulárním antigenem bakterií Neisseria meningitidis typ B. Časté jsou také kmeny sérotypu O83:K1, které se ale zřejmě vyskytují pouze v Evropě. Nejčastěji běžně izolované kmeny jsou sérotypu O18ac:K1:H7 na jejichž povrchu se nacházejí S-fimbrie (Brenner aj. 2005). 5.2 Kmeny intestinálně patogenní Enteropatogenní Escherichia coli Kmeny EPEC způsobují novorozenecké průjmy, při kterých dochází k velmi rychlé dehydrataci organismu. Nebyla u nich prokázána tvorba toxinů a u větších dětí nebo dospělých osob již žádné onemocnění nevyvolávají. Jejich patogenní účinek je dán poškozením epiteliálního povrchu střeva, vzniklé těsným přilnutím bakterie k povrchu enterocytu při kterém dochází k destrukci mikroklků (Klaban, 2011). Klíčovým faktorem hrajícím roli v tomto přilnutí je intimin (adhesin). Bakterie také produkují signální proteiny, které po vstupu do enterocytu zprostředkují tvorbu aktinových filament, na niž se bakterie E. coli usadí (Obr. 6) (Songer aj. 2005). V elektronovém mikroskopu lze pozorovat, že bakterie těsně přiléhající k povrchu enterocytu jsou obklopeny knoflíkovitými výběžky (,,podstavci ) vybíhajícími z povrchu enterocytů. Místem patogenního působení EPEC je při novorozeneckém průjmu horní část tenkého střeva (Greenwood aj. 1999). Sérotypy řadící se podle přítomnosti somatického O- a flagelárního H-antigenu mezi kmeny EPEC jsou uvedeny v Tab. 4. Nově k nim také přibyly sérotypy O103 (H2), O145 (H45, H-), O157 (H8, H16, H45) (Brenner aj. 2005)

24 O-antigeny H-antigeny O26 H-, H11 O55 H-, H6, H7 O86 H-, H8, H34 O88 H-, H25 O111 H-, H2, H7, H12 O114 H-, H2 O119 H-, H2, H6 O125 H-, H6 O126 H-, H2, H21, H27 O127 H-, H6, H21, H40 O128 H-, H2, H7, H12 O142 H-, H6, H34 O158 H-, H23 Tab. 4 (zdroj: Brenner aj. 2005) Výskyt infekcí způsobených kmeny EPEC je dnes ve vyspělých zemích s dobrou úrovní hygieny velmi nízký. Ve vyspělých zemích konkrétně ve Velké Británii a USA proběhlo od roku 1971 několik epidemií. Tyto epidemie byly vyvolané kmeny se stejnými faktory virulence, jako mají původci sporadických případů onemocnění. Sporadická onemocnění mají vrchol výskytu v letních měsících. V zemích se špatnou nebo žádnou úrovní hygieny jsou tyto kmeny stále nebezpečné a běžně se objevují sporadické infekce nebo epidemie v domácnostech a nemocnicích. (Greenwood aj. 1999). Kmeny EPEC bývají běžně izolovány od různých zvířat. Prasete divokého, jelena lesního, kozy domácí, ovce domácí, drůbeže, potkanů, krys a hlavně od tura domácího, který je pro tyto bakterie přirozeným rezervoárem (Hubálek, 2000) Enterotoxigenní Escherichia coli Místem působení kmenů ETEC je tenké střevo kdy se pomocí fimbrií vážou na povrch enterocytu a produkují jeden nebo více enterotoxinů. Vazba na enterocyt je umožněna přítomností tzv. antigenního faktoru kolonizace (CFA). Enterotoxiny jsou dva, termolabilní enterotoxin (LT) a termostabilní enterotoxin (ST) s rychlejším nástupem účinku. Termolabilní enterotoxin je blízce příbuzný toxinu bakterií Vibrio cholerae, jedná se o proteinový komplex skládající se z jedné podjednotky A (molekulová hmotnost kolem 25 kda) a pěti podjednotek B (molekulová hmotnost 11,5 kda). Podjednotkami B dochází k vazbě na enterocyt (pomocí gangliosidů GM1 a GD1b) a po projití cytoplazmatickou membránou katalyzuje podjednotka

25 A aktivaci adenylátcyklázy závislé na NAD, tím dojde ke zvýšení koncentrace camp. Zvýšená koncentrace camp má dvojí účinek, inhibuje absorpci sodíku a spolu s ním i chloridů a vody ze střeva a zároveň také zvyšuje sekreci sodíku, který s sebou strhává chloridové ionty a vodu zpět do střeva. Výsledkem tohoto působení je vznik masivního vodnatého průjmu. Termolabilní enterotoxin je lokalizován na plazmidu a vyskytuje se jak u kmenů izolovaných od lidí, tak i zvířat. U některých kmenů se může objevit i produkce termolabilního toxinu LT-II s velmi podobným biologickým účinkem, ale nereagujícím se specifickým sérem v neutralizačním nebo imunodifuzním testu. Termostabilní enterotoxin má na rozdíl od termolabilního enterotoxinu malou molekulovou hmotnost a nízkou imunogenitu. Existují dvě třídy tohoto toxinu označované jako ST-I a ST-II (STa a STb). Toxin ST-I účinkuje tak, že aktivuje guanylátcyklázu, čímž dochází ke zvýšení koncentrace cgmp v buňce. Přilnutí a tvorbu toxinů ukazuje Obr. 7. Gen pro ST-I je lokalizován na plazmidu. Tento plazmid může nést geny jak pro tvorbu ST-I tak LT nebo také pro adhesivní faktory případně rezistenci k ATB. ST-I a ST-II se vzájemně liší svou biologickou účinností a nerozpustností v metanolu (Greenwood aj. 1999, Kaper aj. 2004). Dalšími faktory virulence jsou hlavně fimbriální adhesiny K88, K89, 987P, F41, F1845 v Tab. 5 jsou shrnuty jednotlivé sérotypy a adhesiny s jejich výskytem u domestikovaných zvířat (Songer aj. 2005). Fimbriální adhesiny zvířecí hostitel sérotypy K88 (F4) prase O8, O141, O147, O149 K99 (F5) prase, tele, jehně O8, O9, O20, O P (F6) prase O9, O20, O141 F41 prase, tele O9, O101 F18 prase O138, O139, O141 F1845 tele O101 Tab. 5 (zdroj: Songer aj. 2005) Turisté, kteří jedou do rozvojových zemí a začnou se živit místní stravou, jsou velmi brzy kolonizováni místním kmenem ETEC. To se projeví vznikem cestovatelského průjmu (Votava aj. 2003). Cestovatelský průjem je onemocnění rozšířené po celém světě, ale nejčastěji postihuje osoby cestující z oblastí s dobrou hygienou a mírným podnebím do oblastí s nízkou úrovní hygieny a teplým klimatem. Cestovatelský průjem trvá krátkou dobu, začíná náhle častou stolicí a doprovázen je nauzeou, zvracením a křečemi v břiše. Průjmová onemocnění vyvolaná kmeny ETEC jsou v zemích třetího světa hlavní příčinou úmrtí dětí do pěti let věku. V nejtěžších případech mohou tato onemocnění připomínat

26 choleru. Při šíření infekcí v těchto zemích pravděpodobně hrají důležitou roli lidské a zvířecí výkaly v žumpách a odpadních vodách (Greenwood aj. 1999). Přehled všech sérotypů, které se podle O-, H- a K-antigenů řadí mezi kmeny ETEC je uveden v Tab. 6. O-antigen (K):H-antigen O-antigen (K):H-antigen O? H2, H10, H28, K39:H32 O78 H-, K2:H11, H12 O6 H-, K15:H16 O85 H7 O7 H-, H18 O86 H2 O8 K47:H-, K25:H9, K40:H9, K87:H19,H10 O88 H25 O9 H-, K9, K84:H2 O105 H? O11 H27 O114 H-, H21 O15 H11, H15, H45 O115 H-, H21, H40, H51 O17 K23:H45, H18 O119 H6 O20 H-, H30 O126 H-, H9, H12 O21 H21 O128 H7, H12, H19, H21 O25 H-, K7:H42, H16 O133 H16 O27 H7, H20, H27 O138 K81 O29 H? O139 H28 O48 H26 O141 H-, H4 O55 H7, H20, H27 O147 H? O56 H- O148 H28 O63 H12, H30 O149 H4, H10, H19 O64 H- O153 H10 O65 H12, H30 H-, H4, H5, H12, H20 O159 O71 H36 H21, H27, H34, H37 O73 H45 O166 H27 O77 H45 O167 H5 Tab. 6 (zdroj: Brenner aj. 2005) Enteroinvazivní Escherichia coli Místem působení kmenů EIEC je tlusté střevo, kde podobně jako bakterie rodu Shigella pronikají do buněk epitelu a poté se množí. Bakteriím pomáhá při průchodu horními částmi GIT lipopolysacharidové pouzdro, díky kterému odolávají účinku kyselého ph žaludku, působení žlučových kyselin a hormonů pankreatu. Invazivní schopnosti jsou dány proteiny vnější membrány, které jsou sice v tenkém střevě štěpeny enzymy pankreatu, ale v tlustém střevě opět syntetizovány. Protože musí bakterie v tlustém střevě soutěžit o zdroj uhlíku

27 se zbývající mikroflórou, dochází ke vzniku selekčního tlaku na zachování těchto invazivních schopností, které jim umožňují získat nevyčerpatelný intracelulární zdroj uhlíku v podobě glukózy pocházející z krevního oběhu. Průnik bakterií probíhá nejprve pomocí glukosidáz produkovaných normální mikroflórou, která jim pomáhá při průchodu hlenovou vrstvou. Poté se bakterie přichytí na povrch buněk a navodí endocytózu, aniž by došlo k poškození cytoplazmatické membrány. Tím vznikají vakuoly, ve kterých bakterie krátce zůstávají. Po lýze vakuol bakterie v hostitelské buňce inhibují proteosyntézu, aniž by došlo k přerušení transportu glukózy a aminokyselin, jež bakterie využívají ke svému množení. Kmeny postrádající schopnost lyzovat tyto vakuoly nejsou schopny pronikat do sousedních buněk. Přichycení a patogenní působení kmenů EIEC je na Obr. 8 (Greenwood aj. 1999). Virulence kmenů EIEC je stejně jako u bakterií rodu Shigella dána geny lokalizovanými jak na chromozomu, tak na plazmidech. Geny pro expresi bílkovin vnější membrány spojené s invazivitou a geny potřebné pro jejich zakomponování do buněčné membrány jsou lokalizovány na jediném velkém plazmidu (velikost 140 MDa). Stejně tak jsou na plazmidu lokalizovány i geny nutné pro únik z endocytární vakuoly a pro proniknutí do sousedních buněk. Faktory virulence jako je pouzderný lipopolysacharid a systém vazby železa aerobaktinem jsou dány geny lokalizovanými na chromozomu (Greenwood aj. 1999). U kmenů EIEC zřejmě neexistuje lidský ani zvířecí rezervoár. Tyto kmeny způsobují v oblastech se špatnou úrovní hygieny asi 5 % všech průjmových onemocnění. Hromadně se mohou vyskytovat ve školách nebo sociálních ústavech. Zdrojem infekce jsou kontaminované potraviny nebo může k přenosu dojít i z jednoho člověka na druhého. Nejčastějším sérotypem je O124, zbylé sérotypy jsou uvedeny v Tab. 7 (Greenwood aj. 1999)

28 O-antigeny Enteroagregativní Escherichia coli H-antigeny O28 H- O29 H- O112 H- O115 H- O121 H- O135 H- O136 H- O143 H- O144 H-, H25 O152 H- O159 H2 O164 H- O167 H-, H4, H5 O173 H- Tab. 7 (zdroj: Brenner aj. 2005) Bakterie Escherichia coli spojené s patogenním působením u lidí a řazené do skupiny EAggEC mají společné, že nevylučují termolabilní ani termostabilní enterotoxin a na HEp 2 buňkách vzájemnou adhezí vytvářejí prostorovou konfiguraci nazývanou,,stacked-brick (skládání cihel). Tato vzájemná adheze buněk je umožněna pomocí agregativně adherentních fimbrií (AAFs). K infekci dochází kolonizací střevní sliznice a to převážně tlustého střeva s následnou sekrecí enterotoxinů (Shigella enterotoxin 1 způsobující sekreci iontů) a cytotoxinů (Pet cytotoxin, také způsobující sekreci iontů). Způsob uchycení a patogenní působení je na Obr. 9. Při studiích prováděných na lidských střevních explantátech (tkáně pěstované v umělých podmínkách mimo organizmus) se ukázalo, že kmeny EAggEC způsobují mírné, ale zásadní poškození sliznice. Podobné drobné zánětlivé změny jsou pozorovány i na zvířecích modelech. Nejvážnějším histopatologickým nálezem na zvířecích modelech je tvorba silné vrstvy autoagregovaných bakterií přilnutých k povrchu sliznice. Tyto studie prokázaly, že některé kmeny jsou v omezené míře schopny invazivního růstu (Kaper aj. 2004). Při studiích provedených na zdravých dobrovolnících se ukázalo, že EAggEC způsobují průjem, barborygmii a křeče. Epidemiologické studie zjistily, že EAggEC mohou být příčinou cestovatelských průjmů. Kmeny EAggEC byly spojeny se vznikem akutních i chronických průjmů, břišní kolikou v Německu a také se čtyřmi propuknutími gastroenteritidy ve Velké

29 Británii. Sérotypy nejčastěji spojené s výskytem onemocnění připisovaným enteroagregativním E. coli jsou uvedeny v Tab. 8 (Brenner aj. 2005). Mezi EAggEC kmeny se řadí také Escherichia coli O104:H4, která byla původcem epidemie v Německu v roce Tato epidemie probíhala jako gastroenteritida, kdy u části pacientů (22 %) došlo k rozvoji HUS. Zdrojem patogenity tohoto kmene byla přítomnost genů pro tvorbu shiga-like toxinů (SLT-I, SLT-II) doplněná o tvorbu širokospektrých betalaktamáz. Rozvoj HUS při kolonizaci E. coli O104:H4 byl atypicky mnohem častější u dospělých osob (88 %) a nikoliv u dětí jako tomu bývá u HUS, jehož vznik má souvislost s kolonizací kmeny EHEC. Důvodem toho může být odlišná citlivost dětí a dospělých k adhezivním a kolonizačním vlastnostem tohoto kmene (Frank aj. 2011, Scheutz aj. 2011). O-antigeny H-antigeny O3 H2 O15 H18 O44 H-, H18 O86 H- O111 H12, H21 O125 H9, H21 Tab. 8 (zdroj: Brenner aj. 2005) Difuzně adherentní Escherichia coli DAEC kmeny mají tzv. afa operon, jehož nejdůležitějšími produkty spojenými s patogenním působením jsou AfaD invazin, který je u všech stejný a AfaE adhesin, který je velice variabilní avšak vždy se váže na hostitelský protein DAF (Votava aj. 2003). DAF nebo také CD55 je protein nacházející se zejména na epiteliálních buňkách, který plní úlohu regulátoru aktivace komplementu. Jedním z adhesinů využívajícím DAF je fimbriální adhesin F1845, který produkuju přibližně 75 % DAEC kmenů (Obr. 10) (Kaper aj. 2004, Tieng aj. 2002). Podle několika studií se tyto kmeny podílejí na vzniku průjmových onemocnění u dětí starších 12 měsíců (Nataro aj. 1998, Scaletsky aj. 2002). Také je možné, že infekce kmeny DAEC má prozánětlivý účinek a tento efekt by mohl hrát roli při vzniku autoimunitních zánětlivých onemocnění střev, jako je například Crohnova choroba (Kaper aj. 2004, Tieng aj. 2002)

30 5.2.6 Enterohemoragické Escherichia coli Kmeny EHEC získaly své jméno podle schopnosti vyvolat onemocnění projevující se jako těžký průjem s hemoragií, které může přejít až v systémovou infekci a vznik HUS. Také se můžeme setkat s pojmenováním těchto kmenů E. coli jako VTEC nebo STEC. Starší označení VTEC bylo těmto bakteriím dáno na základě jejich toxického působení na buňky Vero. Název STEC znamená, že tyto kmeny bakterií produkují toxin strukturou se velmi podobající toxinu, který je produkován bakteriemi rodu Shigella (Votava aj. 2003). Také se uvádí, že EHEC jsou pouze podskupinou STEC bakteriálních kmenů způsobující hemoragickou kolitidu (Schulze aj. 2006, Brenner aj. 2005). Tuto podskupinu od ostatních bakterií STEC odlišuje přítomnost LEE ostrova patogenity. Kmeny STEC které nemají LEE nebývají dávány do souvislosti se vznikem onemocnění u lidí (Kaper aj. 2004). LEE je úsek DNA v genomu jak EHEC tak EPEC bakterií, na kterém jsou lokalizovány geny pro tvorbu proteinů vnější membrány (intimin, Esp, Tir) sloužící jako faktory virulence (Elliott aj. 2000) Bakterie EHEC kmenů se váží na enterocyty a ničí mikroklky téměř stejným způsobem jako kmeny EPEC, ale kromě toho ještě produkují Shiga-like toxin (dříve Vero-toxin), který poškozuje sousední buňky a vstupuje do krevního oběhu, kde má systémový účinek (Obr. 11). Shiga-like toxin se takto nazývá z důvodu, že je biologicky, fyzikálně a antigenitou podobný shiga-toxinu bakterií Shigella dysenteriae typu I. Shiga-like toxiny (SLT nebo Stx) jsou dvojího druhu SLT-I (Stx1) a SLT-II (Stx2) který byl poprvé nalezen u sérotypu O157. Vzájemně se liší tím, že SLT-I je možné neutralizovat antisérem proti shiga-toxinu. Oba druhy toxinu jsou složeny z podjednotky A a B. Zatímco podjednotka A má biologický účinek, podjednotka B zprostředkovává specifickou vazbu na receptor a následný transport toxinu do buňky. Cílem působení toxinu je ribosomální RNA což způsobuje inhibici proteosyntézy s následnou apoptózu buňky. Kromě tohoto pro patogenitu nejdůležitějšího toxinu produkují bakterie kmenů EHEC celou řadu dalších toxinů a efektorů, jejichž přehled je uveden v Tab. 9. K dalším faktorům virulence patří také adheziny (Intimin, Paa, ToxB, Efa-1/LifA, Saa, OmpA a Long Polar Fimbrie neboli LPF), flagelární H-antigeny (flagellin) a somatické O-antigeny (lipopolysacharid). (Greenwood aj. 1999, Kaper aj. 2004, Songer aj. 2005) Produkce SLT je u některých kmenů řízena geny které jsou neseny fágem. Tyto geny byly z fágu pomnoženého na Escherichia coli O26 a O157 klonovány na kmen Escherichia coli

31 K12 a tím mohly být připraveny DNA sondy pro shiga-like toxin. Nejcitlivější k účinkům toxinu jsou aktivně se množící buňky, a protože při HUS je hlavní nález poškození kapilár ledvin, jsou pravděpodobně hlavním místem účinku buňky endotelu cév (Greenwood aj. 1999). Sérotypů řadících se k STEC (VTEC) je okolo 400. Mezi nejčastěji se vyskytujícími původci onemocnění jsou podle přítomnosti H- i O-antigenu sérotypy O157:H-, O157:H7 a poté podle O-antigenu patřící do skupiny souhrnně označované jako non-o157 sérotypy O26, O103, O111 a O145. Studie probíhající v Evropě ukazují, že non-o157 EHEC kmeny se objevují jako původci HUS se zvyšující se frekvencí a také jsou mnohem častěji nalézány u dětí s průjmovým onemocněním (Brenner aj. 2005). toxin třída toxinu cíl působení aktivita/efekt Ureáza ABC podjednotka močovina EspP autotransporter? Cycleinhibiting faktor (Cif)? štěpení močoviny na NH3 a CO2 štěpení koagulačního faktoru V inhibice mitózy v G2/M fázi EspF? uvolnění těsných spojů a spuštění apoptózy EspH efektor III. Typu formování filapodií a? podstavcové formace narušení potenciálu Map mitochondrie mitochondriální membrány Tir Nck destrukce mikroklků SteE efektor II. typu inhibitor C1-esterázy narušení kaskády aktivace komplementu Ehx RTX toxiny erytrocyty lýza buněk LifA/Efa lymfocyty Tab. 9 (zdroj: Kaper aj. 2004) inhibice aktivace lymfocytů a adheze Kmeny EHEC (VTEC, STEC) mají zvířecí rezervoár v hovězím dobytku (platí pro sérotypy O157). Stejně jako u infekcí způsobených kmeny EIEC jsou i v případě EHEC významným zdrojem nákazy potraviny. Infekce se vyskytují sporadicky v domovech důchodců a jeslích, kdy nejzávažnější klinické projevy má onemocnění právě u dětí a starších osob (Greenwood aj. 1999)

32 6. Escherichia coli O157 Shiga-like toxigenní kmeny bakterií Escherichia coli O157 způsobující vznik hemoragické kolitidy a HUS se vyskytují ve dvou sérotypových variantách, které se však vzájemně liší svými biochemickými vlastnostmi a přítomností flagelárního H-antigenu. Zatímco E. coli O157:H7 je sorbitol negativní (SOR-), glukuronidáza negativní (GUD-) a díky přítomnosti H-antigenu pohyblivá. E. coli O157:H- oproti tomu je sorbitol pozitivní (SOR+), glukuronidáza pozitivní (GUD+) a není pohyblivá (Friedrich aj. 2007). Evoluční analýzy ukázaly, že oba tyto kmeny vznikly několika přechodnými stupni z netoxigenního předchůdce a to enteropatogenní E. coli O55:H7. Tento kmen ve svém genomu obsahuje LEE ostrov patogenity, je SOR+ a GUD+. Prvním krokem při změně je pravděpodobně pomocí transdukce získání schopnosti tvorby shiga-like toxinu II. Výsledkem této změny je vznik shiga-like toxigenní E. coli O55:H7. V následujícím kroku je získání velkého plazmidu (po157), způsobující změnu somatického O-antigenu z O55 na O157. Další změny již dávají vzniknout těmto dvěma biochemicky odlišným kmenům. První z nich vzniká po mutaci ve flagelárním operonu, čímž dochází ke ztrátě pohybu a vzniku E. coli O157:H-. Druhý vzniká ztrátou schopnosti fermentovat sorbitol se současným získáním schopnosti tvorby shiga-like toxinu I. Pokud poté dojde k mutační inaktivaci genu uida, vzniká typický kmen E. coli O157:H7, který je SOR- a GUD- (Feng aj. 1998, Wick aj. 2005). Tyto dva sérotypy bakterií Escherichia coli jsou nově zařazeny podle vyhlášky č. 74 novelizující vyhlášku č. 474/2002 Sb., kterou se provádí zákon č. 281/2002 Sb., jež v České republice nabyla účinnosti dne spolu s dalšími shiga-like toxin produkujícími bakteriemi vyvolávajícími průjmy, hemoragické kolitidy a HUS zařazeny do seznamu vysoce rizikových biologických agens a toxinů. A to do podskupiny uvádějící bakterie řadící se mezi lidské patogeny a původce zoonóz. V tomto seznamu jsou zařazeny také genetické elementy a geneticky modifikované organismy obsahující sekvence nukleových kyselin souvisejících s patogenitou nebo kódujících toxiny produkované STEC kmeny (shiga-like toxiny nebo proteiny jemu podobné se schopností inaktivace ribozomů). Podle výše jmenovaného zákona je možno nakládat s těmito bakteriemi, včetně částí jejich genomu souvisejících s patogenitou nebo tvorbou shiga-like toxinů, pouze na základě povolení od Státního úřadu pro jadernou bezpečnost (Sbírka zákonů č. 74/2013)

33 Termín zoonóza byl definován WHO v roce 1959 a od té doby se jeho definice nezměnila (Hubálek 2000). Tato definice říká, že zoonózy jsou nemoci přirozeně přenosné mezi obratlovci a lidmi (WHO Tech. Rep. Ser. 169, 1959). 6.1 Epidemiologie a prevence Bakterie Escherichia coli sérotypu O157:H7 jsou zoopatogenním kmenem zodpovědným za většinu těžkých případů onemocnění způsobených EHEC kmeny. Protože jejich přirozeným rezervoárem je převážně GIT hovězího dobytka nebo jiných přežvýkavců, je zde podezření, že jde o hlavní zdroj EHEC. Propuknutí onemocnění často bylo spojeno s konzumací nedovařeného hovězího masa nebo nepasterizovaných mléčných výrobků (Ferens a Hovde 2011). Ke kontaminaci masa dochází prostřednictvím fekálního kontaktu v průběhu porážky dobytka. Fekálním kontaktem se mohou bakterie dostat také do mléka během jeho získávání (Drápal aj. 2004). Jako vehikulum přenosu byla také popsána zelenina a ovoce kontaminované fekáliemi hovězího dobytka (Bláhová aj. 2000). Nebo také kontaminovaná a chlorováním nedostatečně ošetřená pitná voda (Swerdlow aj. 1992). Riziko nákazy bakteriemi E. coli O157:H7 je dáno také nízkou infekční dávkou, kdy k vyvolání onemocnění stačí pouze 100 a méně bakterií (Drápal aj. 2004, Votava aj. 2003). S ohledem na takto nízkou infekční dávku je podobně jako u bakterií rodu Shigella možný interpersonální fekálně-orální přenos mezi osobami, které jsou v těsném kontaktu a mající nesprávné hygienické návyky. Příkladem mohou být děti v předškolních zařízeních (Bláhová aj. 2000). V případě sérotypu O157:H- byla onemocnění, která propukla v Německu a České republice, spojena s konzumací potravin obsahujících syrové hovězí maso nebo zahrnující přímý kontakt se zvířaty vylučujícími bakterie ve svých výkalech. Způsob přenosu přímým kontaktem se zvířaty naznačuje, že infekční dávka může být velmi nízká stejně jako u E. coli O157:H7. I přes tato zjištění zůstává vehikulum a cesta přenosu bakterií neznámá. Bakterie byla izolována pouze z hovězího dobytka a poníků, ale už ne od zbytku domestikovaných nebo divokých zvířat, která byla identifikována jako rezervoáry E. coli O157:H7. To vede k domněnce, že bakterie může být adaptována na lidské střevo a jejím rezervoárem by stejně jako u EPEC kmenů mohl být člověk (Karch a Bielaszewska 2001). Počátky onemocnění způsobených E. coli O157 se projevují obvykle za 3 až 9 dní. Onemocnění může trvat od několika dní až po několik týdnů. Doba trvání je závislá

34 na vnímavosti daného jedince a velikosti infekční dávky. Onemocnění vyvolané infekcí bakteriemi E. coli O157 jsou hemoragická kolitida, TTP a HUS. U některých lidí bylo také popsáno i bezpříznakové nosičství bakterií E. coli O157 (Drápal aj. 2004). Pokud porovnáme výskyt onemocnění vzhledem k věku, zjistíme, že k rozvoji HUS dochází zejména u dětí do pěti někdy také uváděno do 10 let věku a starších lidí (Drápal aj. 2004, Kumar aj. 2012). Při studiích tepelné inaktivace se prokázalo, že bakterie E. coli O157:H7 jsou citlivější k záhřevu, než typické bakterie rodu Salmonella. To znamená, že tepelné ošetření k likvidaci salmonel je stejně účinné i na E. coli O157:H7. Tolerance ke kuchyňské soli a dusitanům je ale oproti salmonelám zřejmě vyšší, protože byl zaznamenán jejich růst ještě při 6,5% koncentraci soli. Citlivost k chlorování je stejná jak u salmonel, tak E. coli O157:H7. Jejich tolerance k zevním vlivům pravděpodobně nebude příliš odlišná od nepatogenních kmenů E. coli. Bylo také zjištěno, že bakterie E. coli O157:H7 rostly v mediích okyselených kyselinou mléčnou při ph 5,4 a kyselinou chlorovodíkovou dokonce až při ph 4,5. To vede k závěru, že E. coli O157:H7 může v kyselých nebo fermentovaných potravinách přežívat dlouhou dobu (Drápal aj. 2004). V prevenci onemocnění je s ohledem k přirozenému rezervoáru a zdrojům nákazy nutno zahrnout důsledné uplatňování systému kritických kontrolních bodů (HACCP) ve stravovacích službách a při výrobě potravin. Je také vhodné potraviny živočišného původu dostatečně tepelně zpracovat a to působením teploty C po dobu nejméně dvou minut. Syrové nebo nedostatečně tepelně ošetřené maso spolu s nepasterizovaným mlékem nekonzumovat vůbec. V případě masa je vhodné zabránit množení bakterií jeho skladováním při teplotách do 7 C. A také dbát na to, aby nedošlo k rekontaminaci hotových potravin a produktů nástroji a vybavením použitých při zpracování a přípravě syrových potravin živočišného původu. Je také nutné, aby při pěstování ovoce a zeleniny nebyla k zavlažování používána voda kontaminovaná fekáliemi a před konzumací bylo ovoce i zelenina důkladně omyto pitnou vodou (Drápal aj. 2004). 6.2 Patogenita a faktory virulence Kmeny E. coli O157 jsou vysoce patogenní a jejich virulence nemá souvislost jen s jedním konkrétním genem nebo genovým produktem, ale je dána multifaktoriálně. To má za následek široké spektrum virulence i uvnitř samotného sérotypu O157. Nejdůležitějšími faktory

35 virulence jsou produkce intiminu a shiga-like toxinů, především shiga-like toxinu 2, který je primárně zodpovědný za vznik HUS (Bavaro 2009, Law 2000). Tento shiga-like toxin není stejnorodý a nachází se v několika subtypech, kdy pravděpodobně nejčastější subtyp tohoto toxinu vedoucí ke vzniku HUS je Stx2c. Tento toxin se pomocí své B podjednotky váže na Gb3 (globotriaosylceramide) receptory lokalizované na buněčné membráně eukaryotických buněk. Jakmile dojde k navázání toxinu je pomocí endocytózy transportován do buňky, odkud se může dále dostávat do krevního řečiště. Krevním řečištěm se tento toxin dostává do drobných cév ledvin a k jejich endoteliálním buňkám, na které má 1000x vyšší cytotoxický účinek než shiga-like toxin 1 (Bavaro 2009, Law 2000). Intimin je adhezin kódovaný genem eae, který se nachází na LEE. Na tomto segmentu DNA se také nachází další geny hrající roli v patogenitě kmenů E. coli O157. Důležité jsou zejména geny kódující proteiny EspA a Tir (translocated intimin receptor), které umožňují adhezi k hostitelské buňce pomocí intiminu. Protein EspA vytváří v cytoplazmatické membráně strukturu, skrze kterou prochází protein Tir do hostitelské buňky, kde je fosforylován a následně zabudován do membrány, aby zde sloužil jako receptor pro intimin (Law 2000). Důležitým faktorem virulence je také schopnost bakterií E. coli O157 přežít při nízkém ph. Bakterie mají tuto schopnost díky několika mechanizmům. Jsou to kyselinou indukovaný oxidační systém, kyselinou indukovaný arginin-dependentní systém a kyselinou indukovaný glutamát-dependentní systém. Tyto mechanizmy umožňují bakteriím přežít při ph nižším než 2,5 a to déle než 2 hodiny. Schopnost přežít v prostředí s takto nízkým ph je pravděpodobně důvodem nízké infekční dávky a také příčina toho, že k nákaze může dojít vypitím kontaminované vody, kdy bakterie nejsou v žaludku chráněny před působením HCl složkami potravy (Law 2000). K dalším faktorům virulence majících roli v patogenitě E. coli O157 jsou enterohemolyzin (Ehx), extracelulární serinová proteáza (EspP), enzym kataláza-peroxidáza, enteroagregativní teplotně stabilní toxin, clostridium difficile-like toxin a schopnost utilizovat hemoglobin. Enterohemolyzin je charakterizován tvorbou malé zkalené zóny hemolýzy po hodinové inkubaci na krevním agaru. Enterohemolyzin je součástí skupiny RTX toxinů (repeats in toxin), jeho tvorba je kódována genem přítomným na plazmidu po157 a proto může být jeho tvorba užitečným ukazatelem upozorňujícím na kmeny produkující shiga-like

36 toxiny. Extracelulární serinová proteáza funguje jako autotrasporter, to znamená, že si zprostředkovává vlastní sekreci skrze vnější membránu. Tato proteáza má proteolytickou aktivitu jen proti malému spektru látek a jednou z nich je koagulační faktor V. Enzym kataláza-peroxidáza umožňuje bakteriím detoxikovat cytotoxické oxidační produkty, které vznikají v průběhu oxidačního vzplanutí makrofágů a neutrofilů. Schopnost utilizovat hemoglobin je důležitá, protože bakteriím umožňuje využití hemoglobinu jako zdroje železa a tím stimulovat svůj růst a další produkci toxinů (Law 2000). 6.3 Diagnostika Diagnostika infekce je komplikovaná, protože v průběhu nemoci dochází ke snižování počtu bakterií a to tak, že v případě již rozvinutého HUS je jejich počet ve střevě již tak nízký, že je obtížné je detekovat klasickými kultivačními postupy. Proto je pro úspěšnou diagnostiku nutný odběr stolice co nejdříve po vzniku onemocnění. Pro diagnostiku jsou k dispozici tři možnosti průkazu (Bláhová aj. 2000). První je přímý průkaz antigenu O157 ve stolici pacienta a to pomocí komerčně vyráběných setů založených na principu ELISA metod, latex aglutinace nebo pomocí PCR. Tyto postupy umožňují zachytit jak E. coli O157:H7 tak O157:H- (Bláhová aj. 2000). Druhou možností je sérologický průkaz infekce pomocí detekce specifických protilátek metodou ELISA, který je užitečný především u pacientů s HUS, u nichž by již pomocí klasických kultivačních metod mohl být průkaz bakterií E. coli negativní. Již v době prvních příznaků HUS je titr protilátek vysoký a vzhledem k nízkému počtu bakterií je průkaz infekce bakteriemi E. coli O157 u pacientů s HUS touto metodou daleko citlivější. Průkaz je založen na detekci IgM protilátek anti-o157, namířených proti lipopolysacharidu O157 (Bláhová aj. 2000). Poslední možností je průkaz bakterií E. coli O157 klasickými kultivačními metodami. Médiem používaným pro jejich záchyt je SMAC agar ve kterém je laktóza nahrazena sorbitolem. Bakterie E. coli O157:H7 na této půdě rostou z důvodu neschopnosti fermentovat sorbitol v bezbarvých koloniích, zatímco většina ostatních kmenů E. coli v koloniích růžových. Z důvodu zvýšení selektivity je do tohoto agaru přidáváno ještě ATB cefixim a teluričitan draselný, které inhibují růst zbylé střevní flóry. Tento agar se poté označuje jako CT-SMAC. Jak již bylo uvedeno, protože množství bakterií při rozvinutém HUS je velmi nízké, využívá se pro zvýšení citlivosti imunomagnetické separace. Dochází k pomnožení

37 vzorku v tekuté půdě s následnou inkubací s paramagnetickými částicemi potaženými protilátkou proti lipopolysacharidu O157. Tyto částice jsou následně magneticky separovány a vykultivovány na SMAC nebo CT-SMAC agar. Postupem využívajícím imunomagnetickou separací dochází k záchytu bakterií, i když jejich množství nepřesahuje hodnotu 10 2 v 1 gramu stolice. Bez použití imunomagnetické separace je nutný počet bakterií alespoň 10 7 v 1 gramu stolice. Všechny suspektní kolonie rostoucí na těchto agarech musí být potvrzeny biochemickým testem jako bakterie Escherichia coli a následně u nich musí být latex aglutinační reakcí potvrzena přítomnost somatického antigenu O157. Takto izolované a identifikované bakterie E. coli O157:H7 musí být dále vyšetřeny metodou PCR na přítomnost stx genů kódujících produkci shiga-like toxinů (Bláhová aj. 2000, Schmidt aj. 1999). Problémem při použití selektivních půd SMAC, CT-SMAC je, že nedochází k záchytu bakterií E. coli O157:H-, které rostou spolu s nepatogenními E. coli na SMAC agaru v růžových koloniích a na agaru CT-SMAC je dokonce jejich růst inhibován vysokou koncentrací kalium teluritu (Bláhová aj. 2000, Schmidt aj. 1999). Pro průkaz bakterií E. coli O157 v potravinách jsou v současnosti v České republice platné dvě normy. V nové normě platné od je průkaz bakterií E. coli O157 založen na jejich detekci pomocí metody PCR (ČSN P CEN ISO/TS 13136). Ve starší normě platící od je průkaz této bakterie založen na kultivaci a imunomagnetické separaci stejně jako je tomu v případě průkazu E. coli O157 v klinických vzorcích. Tak jako klinický vzorek jsou i vzorky potravin pomnoženy v tekuté půdě spolu s imunomagnetickými částicemi. Po hodinové inkubaci při 41,5 C dochází k zakoncentrování a separaci částic. Takto získané částice jsou poté inokulovány (50μl) na půdu CT-SMAC a jinou selektivně diagnostickou půdu pro E. coli O157. Tyto půdy inkubujeme hodin při 37 C a suspektní kolonie rostoucí na těchto půdách jsou identifikovány pomocí biochemických testů a sérologických reakcí se specifickým antisérem proti E. coli O157. Pokud dojde k nálezu kolonií E. coli O157 je nezbytné je odeslat k další identifikaci do referenční laboratoře (ČSN EN ISO 16654)

38 7. Onemocnění vyvolané shiga-like toxigenními Escherichia coli O Hemoragická kolitida Místem postižení GIT při hemoragické kolitidě, jejímž původcem je Escherichia coli O157 je tlusté střevo. Typickými příznaky jsou silná bolest břicha obvykle bez zvracení a časté nucení na stolici s nedostatečným vyprázdněním a přítomnost krve ve stolici. Důležité také je, že u hemoragické kolitidy způsobené kmeny E. coli O157 není zpravidla jako příznak horečka, mohou se pouze objevit teploty pohybující se do 38 C. Tak jako u jiných průjmových onemocnění se může mezi klinickými příznaky objevit bolest hlavy, svalů nebo kloubů. Nejvýraznější klinický obraz je převážně u dětí. U 5 7 % případů může dojít ke vzniku velmi závažného klinického stavu s nutností hospitalizace pacienta a v případě, že dojde až k rozvoji HUS skončit i jeho smrtí (Ambrožová, 2010, Marejková aj. 2009). Nejčastěji se vyskytující komplikací tak je dehydratace, která může být doprovázena i renální insuficiencí. Při hodnocení dehydratace se sleduje hydratace sliznic, kožní turgor a množství moče. V případě těžké dehydratace se může objevit hypotenze, tachykardie až šokový stav s poruchami vědomí. Při dehydrataci někdy doprovázenou dysbalancí minerálů je třeba pacienty hospitalizovat. Hospitalizováni by měly být i pacienti s nedostatečným příjmem potravy a pacienti imunodeficitní. Imunodeficitní pacienti s hemoragickou kolitidou způsobenou E. coli O157 jsou více ohroženi vznikem systémové formy onemocnění v podobě HUS (Ambrožová, 2010). Léčba je symptomatická. Nejvíce je třeba dbát na rehydrataci se zohledněním ztrát tekutin. Pro jejich doplnění se doporučuje černý čaj a nesycené minerální vody případně komerčně vyráběné perorální rehydratační roztoky. V případě těžké dehydratace nebo nízkého příjmu tekutin se přistupuje k rehydrataci intravenózní. Dalším krokem při léčbě je dieta s omezením tuků doplněna o podání nespecifických protiprůjmových prostředků v podobě adsorbencií (Smecta, aktivní uhlí). Možné je také podání probiotik nebo střevních dezinficiens jako je například Endiaron (Ambrožová, 2010). Antibiotická terapie není doporučována z důvodu uvolnění toxinů z bakterií, čímž může dojít ke zvýšení rizika vzniku HUS (Ambrožová, 2010, Votava aj. 2003). Podávání antibiotika trimetoprimu dokonce může způsobovat, že bakterie kmene E. coli O157:H7-38 -

39 zvyšují svoji produkci shiga-like toxinu. Také se nedoporučuje používat léky pro ovlivnění motility střeva (Bláhová aj. 2000). 7.2 Trombotická trombocytopenická purpura TTP vzniká při nákaze E. coli O157 jen zřídka a to typicky u dospělých osob. Symptomy provázející TTP jsou velice podobné HUS, ale přidává se k nim ještě horečka a poruchy CNS (Drápal aj. 2004). TTP je stejně jako HUS řazena mezi mikroangiopatické anémie. V případě propuknutí TTP se jedná o závažné generalizované postižení cirkulace krve, při kterém dochází k poškození orgánů a v neléčených případech vede ke smrti pacienta. Co se klinického obrazu týče, mimo již jmenovanou horečku a neurologické příznaky, je pacient anemický s možnou přítomností žloutenky. V případech kdy dojde k výraznému snížení počtu trombocytů, se mohou objevit i krvácivé projevy v podobě trombocytopenické purpury. Relativně rychle se také může projevit renální případně multiorgánové selhání vedoucí ke smrti pacienta (Pecka, 2004, Penka aj. 2011). Při laboratorní diagnostice je nalézána vysoká hladina laktátdehydrogenázy, volného hemoglobinu a snížený haptoglobin. Tyto parametry slouží pro průkaz intravaskulární hemolýzy. Obvykle se objevuje leukocytóza s neutrofilií a trombocytopenie různého stupně. Důležitá je také přítomnost schistocytů. Schistocyty jsou útržky erytrocytů často ve tvaru prasklé vaječné skořápky nebo helmice vznikající přetržením erytrocytů na fibrinových vláknech (Pecka, 2006, Penka aj. 2011). Vzhledem k tomu, že je TTP život ohrožující onemocnění, je nutné zahájit léčbu okamžitě a to provedením vysokoobjemové výměnné plazmaferézy a podáváním mražené plazmy. Také je nutné odstranění příčiny vzniku onemocnění, v tomto případě bakterií Escherichia coli O157 (Pecka, 2004, Penka aj. 2011). Po zavedení léčby výměnnou plazmaferézou došlo k významnému snížení úmrtnosti z původních více než 90 % na dnešních %, avšak i tato hodnota je stále vysoká (Elliott a Nichols 2001)

40 7.3 Hemolyticko-uremický syndrom Klinický nález Před rozvinutím HUS je charakteristickým příznakem hemoragická kolitida doprovázena celou řadou jiných nespecifických gastrointestinálních příznaků obvykle trvajících 4 až 6 dní, po kterých může následovat i krátké bezpříznakové období. Pro plně rozvinutý HUS je charakteristická náhle vzniklá anémie projevující se nápadnou bledostí případně i dušností. Stejně jako v případě TTP je možná přítomnost žloutenky nebo krvácivých projevů zvláště patrných na kůži v podobě petechií nebo krvácení po aplikaci injekcí. Mezi renálními příznaky se objevuje mikro či makrohematurie, proteinurie s oligurií až anurií, jež v další fázi onemocnění přechází v polyurii. Oligurie způsobuje zadržování tekutin projevující se vznikem otoků a vysokým krevním tlakem. Současně je také přítomna urémie a v případě, že se objeví zánět myokardu nebo perikardu může dojít k srdečnímu selhání. Délka trvání oligurie spolu s vysokým krevním tlakem jsou ukazateli závažnosti onemocnění. U více než 50 % pacientů se objevují neurologické potíže způsobené urémií, nízkou koncentrací sodíku, působením samotného toxinu nebo krvácením do CNS vzniklého účinkem toxinu. V důsledku poškození drobných cév také může dojít ke vzniku pankreatitidy nebo diabetu. Případně se může také objevit asi u 40 % pacientů hepatocelulární postižení a jen velmi vzácně (1% nebo méně) se může objevit postižení plic, srdce, svalů, sítnice, příušní žlázy (Bláhová aj. 2000). V laboratorním nálezu se objevuje již zmiňovaná nízká koncentrace sodíku, vysoká koncentrace draslíku (mohou být i v rozmezí normy), nízká koncentrace vápníku, vysoké triacylglyceroly, nízký albumin a glukóza, mírně zvýšené transaminázy a metabolická acidóza. Také jsou nalézány nízké hodnoty hemoglobinu a téměř nedetekovatelný haptoglobin, častá je také vysoká koncentrace nekonjugovaného bilirubinu. V krevním obraze je stejně jako u TTP přítomnost schistocytů a trombocytopenie (většinou x10 9 /l). V případech kdy nedochází k anurii je v moči nález hematurie a proteinurie (Bláhová aj. 2000)

41 7.3.2 Morfologické změny Morfologické změny můžeme sledovat nejčastěji v případech, kdy došlo k úmrtí pacienta, mikroskopické pak i v případě provedení biopsie. Vznikají v důsledku působení toxinu na endotel kapilár ledvinné kůry s následnou aktivací řady vazoaktivních faktorů. Jsou to stejné změny jako ty, které vznikají při TTP (u TTP není patogenetický mechanizmus zcela objasněn). Liší se tím, že v případě TTP jsou mnohem podstatnější extrarenální projevy onemocnění (Bláhová aj. 2000). Makroskopicky jsou ledviny zduřelé, prosáklé s tečkovitými hemoragiemi na povrchu. Mikroskopicky je charakter nálezu velice variabilní, kdy záleží na více faktorech, jako je doba trvání onemocnění, jeho intenzita, rozsah a místo postižení cév. Často dochází k nálezu tzv. bezkrevných glomerulů, kdy zduřením endotelu cév došlo k zúžení nebo i uzavření průsvitu kapilár. Také bývá nalézáno velké množství neutrálních lipidů ve stěně arteriol a glomerulů. To je dáno působením toxinu, který po zničení endotelu dovoluje prosakování lipidů do cévní stěny. V tubulech se nacházejí četné hyalinní válce a erytrocyty. Ke změnám vzhledu cév zpravidla nedochází, někdy může být patrné zduření endotelu a rozšíření subendoteliálního prostoru (Bláhová aj. 2000). V případech extrarenálního postižení jsou morfologické změny často patrné ve sliznici tlustého střeva. Nejdůležitější je edém s prokrvácením jak sliznice tak submukózy. Také je nalézáno poškození drobných cév způsobené zduřením endotelu nebo tromby (Bláhová aj. 2000) Extrarenální postižení K extrarenálnímu postižení dochází následkem vzniku trombotické mikroangiopatie, která zapříčiní vznik ischemického postižení až nekrózy. Trombotická mikroangiopatie způsobuje poškození střev a to především tlustého střeva. Také může způsobit vznik endokrinní i exokrinní insuficience pankreatu. Míru jeho postižení nám signalizuje hladina sérové amylázy a lipázy. Jelikož je při selhávání ledvin vylučování těchto hormonů sníženo, je jejich hladina vyšší a na poškození pankreatu ukazuje až čtyřnásobný vzestup hodnot (Bláhová aj. 2000)

42 Hepatomegalie se zvýšením koncentrace transamináz je stálým nálezem v akutních fázích HUS, toto jaterní poškození je výsledkem ložiskových ischemických změn. Postižení žlučníku není časté (Bláhová aj. 2000). Postižení CNS objevující se až u 1/3 pacientů a které má projevy encefalopatie je způsobeno účinkem toxinů, otokem mozku, trombotickou mikroangiopatií a také z metabolických příčin (nízká koncentrace sodíku a vápníku doprovázena vysokou koncentrací urey, kreatininu a kyseliny močové). Důležitým terapeutickým opatřením při postižení CNS je korekce nízkých hodnot sodíku a hyperhydratace, zavedení oxygenoterapie, udržování normálních hodnot hematokritu a také kontrola hypertenze. Včasné zavedení umělé plicní ventilace a podávání antikonvulziv (léčba křečí) je důležité jako prevence postižení CNS (Bláhová aj. 2000). Mezi postiženími dalších orgánů se objevuje kardiomyopatie a trombotická mikroangiopatie retiny a optického nervu. Postižení kůže se omezuje většinou jen na petechie a purpuru, vzácný je výskyt nekrotických vředů. Stejně tak bývají jen zřídka postihovány plíce, parotické žlázy, nadledviny, štítná žláza nebo ovária (Bláhová aj. 2000) Terapie S ohledem na to, že pacienti jsou oliguričtí případně anuričtí a dochází u nich ke vzniku edémů je nutné expanzi extracelulární tekutiny a nízkou koncentraci sodíku minimalizovat dosažením negativní sodíkové a vodní bilance (hyperhydrataci je často nutné řešit dialýzou). Nízká koncentrace vápníku se řeší jeho perorálním podáváním. V případech mírného zvýšení koncentrace draslíku je třeba zamezit jeho příjem nebo podávat přípravky na bázi kyseliny polystyrensulfonové (tzv. iontoměniče). Při vysokých koncentracích je třeba dialyzační léčby, aby se předešlo poruchám myokardu. Z pohledu účinnosti je lepší použití hemodialýzy než dialýzy peritoneální. Volba dialýzy je dána i věkem pacienta. U kojenců a batolat se, pokud k tomu nejsou překážky (revize dutiny břišní), preferuje vzhledem k šetrnějšímu provedení peritoneální dialýza, zatímco u starší dětí a adolescentů se častěji provádí hemodialýza. Další indikací k dialýze je také vysoká koncentrace močoviny (urey), způsobená poruchou renálních funkcí, katabolizmem a reabsorpcí krve z GIT. Možné je také provedení jiných očišťovacích metod jako je hemofiltrace, hemodiafiltrace nebo plazmaferéza (Bláhová aj. 2000)

43 Nízké hodnoty hemoglobinu a hematokritu jsou korigovány podáváním erytrocytární masy nebo promytých erytrocytů. Indikací k podání jsou hodnoty hemoglobinu u dětí pod hodnoty 70 až 60 g/l. V případech, kdy trombocytopenie dosahuje extrémních hodnot je vhodné podání trombocytárního náplavu (Bláhová aj. 2000). Protože až u 50 % pacientů je přítomnost hypertenze, je vhodné provádět její monitorování a v případech, kdy hodnoty systolického tlaku přesáhnou 95. percentil je nutné zahájit léčbu antihypertenzivy (nifedipinem, metyldopa). Pokud se po akutní fázi onemocnění stavy hypertenze opakují, podávají se antihypertenziva dlouhodobě, také lze podávat perorálně ACE-inhibitory (Bláhová aj. 2000). Křeče vyskytující se až u 40 % pacientů je třeba léčit podáváním diazepamu. Křeče jsou způsobené nízkou koncentrací sodíku, otokem mozku, působením toxinu případně strukturálním postižením CNS (Bláhová aj. 2000). Vzhledem k tomu, že kalorické zajištění zlepšuje pozdní prognózu, ale GIT potíže jsou překážkou při příjmu stravy, je nutné zavést parenterální výživu (Bláhová aj. 2000) Pozdní následky Úmrtnost při HUS způsobené shiga-like toxigenními kmeny nepřesahuje 5 %. Poměrně často dochází ke vzniku pozdních následků, jejichž závažnost je dána věkem pacientů, při kterém došlo k propuknutí nemoci a také tím, jestli se v průběhu nemoci objevily příznaky postižení CNS. U pacientů, kteří onemocněli do dvou let věku, bylo po kontrole provedené s časovým odstupem plně zdrávo 69 %, u starších pacientů už to bylo pouze 20 %. Reziduální renální symptomy pak u mladších pacientů přetrvaly u 21 %, zatímco u starších až u 46 %. Navíc ve skupině starších pacientů jich 35 % vykazovalo chronickou renální nedostatečnost/selhání, případně podstupovali dialýzu nebo transplantaci. Nalezeny také byly imunologické změny a to u 20 % pacientů ze skupin s reziduálními renálními symptomy a chronickou renální nedostatečností. Vzhledem k těmto zjištěním je nutné konstatovat, že i přes úspěšnou léčbu HUS s následným uzdravením se u velkého procenta pacientů za delší časový úsek (někdy i více než 10 let) objevuje vysoká prevalence renálního postižení (Bláhová aj. 2000)

44 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 8. Materiál Materiálem použitým k diagnostice bakterií Escherichia coli O157 byl rektální výtěr provedený sterilním vatovým tampónem, který byl poté transportován do laboratoře v Amiesově transportní půdě. Odběru vzorků probíhaly v letech 2009, 2010, 2011 a 2013 ve vojenských výcvikových prostorech (dále jen VVP). Konkrétně se jednalo o VVP Libavá (2009), nacházející se severovýchodně od města Olomouc, VVP Boletice (2010), ležící v jižních Čechách směrem na západ od Českého Krumlova, VVP Březina, dříve Dědice (2011), který se nalézá směrem na sever od města Vyškov a jako poslední VVP Hradiště, dříve Doupov (2013), který leží v Čechách jižně od města Kadaň. Vzorky byly odebírány od těchto zvířat z řádu Sudokopytníků (Artiodactyla): Prase divoké (Sus scrofa), Daněk evropský (Dama dama), Jelen lesní (Cervus elaphus), Jelen sika (Cervus nippon), Snec obený (Capreolus capreolus) a Muflon (Ovis musimon). Jsou to zvířata volně žijící v těchto čtyřech lokalitách, která jsou zde běžně lovena. Tím dochází k jejich přímému kontaktu s lidmi ať už v průběhu zpracování nebo při následné konzumaci vzniklých živočišných produktů. To bylo také důvodem, proč byla zvolena jako vhodná skupina pro zjištění prevalence bakterií Escherichia coli O157, pro kterou je rezervoárem Tur domácí (Bos taurus), jenž patří do stejného řádu savců a žije ve stejných oblastech. Stručná charakteristika jednotlivých druhů je uvedena v následujících odstavcích. Prase divoké (Sus scrofa) jde o všežravce žijícího ve velké části Evropy a Asie a který může dosáhnout hmotnosti až 200 kg. Je rezervoárem patogenních bakterií Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira pomona, Streptococcus suis. Dále byly izolovány také bakterie: Bacillus anthracis, Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Salmonella enteritidis, Yersinia enterocolitica a také kmeny enteropatogenních Escherichia coli (Bouchner aj. 1991, Hubálek, 2000). Daněk evropský (Dama dama) jedná se o druh sudokopytníka původem z oblasti středozemního moře a jihozápadní Asie, který je uměle vysazen v oborách ve střední Evropě. Je to býložravec dosahující hmotnosti do 100 kg. Od tohoto druhu byly izolovány patogenní

45 bakterie: Bacillus anthracis, Yersinia pseudotuberculosis, Brucella abortus, Mycobacterium paratuberculosis (Bouchner aj. 1991, Hubálek, 2000). Jelen lesní (Cervus elaphus) jako druh obývá značnou část Evropy, Asie a severní Ameriky. Jde o býložravce, kdy někteří jedinci mohou dosáhnout hmotnosti až 350 kg. Mezi izolovanými patogenními bakteriemi jsou: Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis, Brucella abortus, Yersinia pseudotuberculosis a enteropatogenní Escherichia coli (Bouchner aj. 1991, Hubálek, 2000). Jelen sika (Cervus nippon) jedná se o druh původem z jihovýchodní Asie a Japonska, který byl v průběhu 20. století vysazen v oborách na území České republiky. Je to býložravec, který dosahuje hmotnosti od 20 do 80 kg. Od toho druhu jelena byla z patogenních bakterií izolována jen Yersinia pseudotuberculosis (Bouchner aj. 1991, Hubálek, 2000). Srnec obecný (Capreolus capreolus) jde o nejmenšího zástupce jelenovitých v Evropě, žije téměř v celé Evropě a Asii. Je to býložravec s hmotností do 30 kg. Patogenní bakterie z nich izolované jsou: Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis, Clostridium tetani, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Yersinia enterocolitica (Bouchner aj. 1991, Hubálek, 2000) Muflon (Ovis musimon) jedná se o druh s původním místem výskytu v horách Korsiky a Sardinie odkud byl posléze uměle vysazen do obor v České republice. Je to býložravec. Největší jedinci mohou dosáhnout hmotnosti až 65 kg. Z patogenních bakterií bylo izolováno jen Mycobacterium paratuberculosis (Bouchner aj. 1991, Hubálek, 2000)

46 9. Metodika 9.1 Odběr vzorku a transport K odběru vzorků byly použity sterilní výtěrové tampóny, které jsou v průběhu transportu umístěny v Amiesově transportním médiu s aktivním uhlím. Toto je dodáváno výrobcem jako již hotová odběrová sada (Obr. 12), kterou skladujeme tak, aby nebyla vystavena přímému působení slunečního světla a při teplotě 5 25 C do data exspirace (obě informace jsou uvedené na obalu). Odběr vzorků byl proveden veterinárním lékařem přítomným při honu jako výtěr z rekta před vyvržením odstřelené zvěře. Takto odebrané vzorky byly poté odebírajícím lékařem do 48 hodin a při teplotě 5 25 C transportovány do laboratoře. Čas a teplota při transportu je dána informacemi od výrobce, který udává, že po dobu 48 hodin nedochází ke kvalitativním změnám u odebraných vzorků. V průběhu transportu vzorků bylo dbáno na to, aby nedošlo k jejich vystavení přímému slunečnímu záření nebo zmrznutí, což by vedlo k jejich znehodnocení. V laboratoři jsou poté vzorky předány laboratornímu personálu spolu s řádně vyplněnou žádankou. Příjem žádanky společně se vzorkem je potvrzen vysokoškolským pracovníkem jeho podpisem na žádanku spolu s datem a časem příjmu. Takto přijaté vzorky jsou zapsány do laboratorního systému a poté zpracovány. Výše popsaný postup příjmu vzorků je dán příručkou kvality, která je schválena jako dokument českým institutem pro akreditaci (ČIA). 9.2 Používaná kultivační média Kultivační půdy použité pro izolaci Escherichia coli O157 jsou komerčně vyráběné půdy a jsou buď již od výrobce připravené k přímému použití (amiesovo transportní médium, ASAP agar) nebo dodávané v dehydratované podobě (Krevní agar, Endův agar, MacConkeyův agar, živný agar). Dehydratované půdy je třeba před jejich vlastním použitím zpracovat (rozvaření v destilované vodě, sterilizace, doplnění o suplementy) a následně je vylévat do komerčně vyráběných sterilních plastových Petriho misek nebo do v laboratoři sterilizovaných skleněných Petriho misek

47 Všechny kultivační půdy, které jsou vyráběny z dehydratovaných základů v laboratoři, musí být zkontrolovány na přítomnost bakteriální kontaminace a také musí být pomocí sbírkových kmenů provedena jejich jakostní kontrola Amiesovo transportní médium s aktivním uhlím Amiesovo transportní médium je asi nejvhodnějším transportním médiem, které lze použít k transportu vzorků do mikrobiologické laboratoře. A to hlavně z důvodu, že v tomto médiu při pokojové teplotě přežívají po dobu téměř 72 hodin až 3/4 bakteriálních kmenů. Médium je vhodné i k transportu anaerobních bakterií, které jsou velmi choulostivé (Votava, 2000). Složení (g/l): NaCl 3,0 KCl 0,20 CaCl2 0,10 MgCl2 0,10 KH2PO3 0,20 Na2HPO3 1,15 Thioglykolát sodný 1,00 Aktivní uhlí 10,00 Agar 7,50 (zdroj: ASAP agar ASAP agar je kultivační půda předem připravena k použití, kterou vyrábí francouzská firma AES Laboratoire. Zkratka ASAP znamená AES Laboratoire Salmonella Agar Plate z čehož vyplývá, že půda je primárně určena pro izolaci bakterií rodu Salmonella. Jde o chromogenní půdu určenou pro potravinářskou, klinickou a veterinární medicínu. Půda se skladuje při teplotě 2 8 C do data exspirace (oba údaje jsou uvedeny na obalu). Tato

48 půda je podle výrobce ve shodě s normou EN a ISO K barevnému rozlišení kolonií různých druhů bakterií dochází na základě detekce C8-esterázy a Beta-glukosidázy. Barvy kolonií jednotlivých druhů bakterií a bakterie, jejichž růst je na půdě inhibován, jsou uvedeny v Tab. 10. Salmonella spp. růžové až purpurové kolonie Klebsiella spp. modré až modrozelené kolonie Enterobacter spp. modré až modrozelené kolonie Serratia spp. modrofialové kolonie Escherichia coli bílé kolonie Citrobacter spp. bílé kolonie Proteus spp. hnědé kolonie Shigella spp. bílé kolonie Morganella morganii bílé kolonie Vibrio cholerae bílé kolonie Yersinia enterocolitica Inhibice růstu Providencia spp. Inhibice růstu Pseudomonas spp. Inhibice růstu Tab. 10 (zdroj: AES Laboratoire) Endův agar Vzhledem ke skutečnosti, že Endův agar vyrábí celá řada firem a existují jeho různé modifikace lišící se složením, je vhodné uvést, že pro diagnostiku byl použit Endův agar (M029) od firmy HiMedia. Endův agar je kultivační půda vhodná pro detekci koliformních bakterií nebo ostatních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. Tato půda byla původně vyvinuta pro rozlišení bakterií fermentujích laktózu od bakterií laktózu nefermentujících. Často bývá používána pro mikrobiologické testování pitné a odpadní vody, mléčných produktů a potravin. Endův agar obsahuje Na2SO3 a bazický fuchsin, které způsobují inhibici růstu grampozitivních bakterií. Koliformní bakterie fermentující laktózu produkují kyseliny a aldehydy, ty uvolňují fuchsin z fuchsin-siřičitanového komplexu, který koloniím těchto bakterií dává typickou červenou barvu. V případě bakterií E. coli je tato reakce velmi výrazná z důvodu vystavení vykrystalizovaného fuchsinu na povrchu kolonií, což dává těmto koloniím nazelenalý kovový lesk (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, 1998)

49 Příprava a složení (g/l): Masový pepton 10,00 Laktóza 10,00 K2HPO3 3,50 Na2SO3 2,50 Bazický fuchsin 0,50 Agar 15,00 ph (při 25 C) 7,5±0,2 Navážku 41,5 g základu (M029) rozpustíme v 1000 ml destilované vody. Takto připravenou směs vaříme do doby úplného rozpuštění. Poté ji sterilizujeme v autoklávu po dobu 15 minut při teplotě 121 C. Směs se nechá v temnu mírně zchladnout, důkladně se promíchá a vylévá do sterilních Petriho misek. Takto předpřipravené médium lze skladovat při teplotě 2 8 C tak, aby nedošlo k jeho vyschnutí. Důležitou podmínkou při skladování je uchovávat předpřipravené půdy v temnu, aby nedošlo k jejich fotooxidaci (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, 1998). V průběhu přípravy je nutné mít na zřeteli, že bazický fuchsin je potenciálním karcinogenem a proto je třeba se vyvarovat vdechnutí prachu dehydratované směsi a také zamezit kontaktu agaru s kůží (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, 1998) Krevní agar Krevní agar je půda, která bývá často považována za půdu základní, ale s ohledem na možnost diagnostikovat z ní schopnost bakterií produkovat hemolyziny, ji lze považovat za půdu diagnostickou. Krevní agar je možné využít při diagnostice většiny vzorků, protože z důvodu jeho obohacení plnou krví a nikoli jen čistými erytrocyty obsahuje i malé množství krevního séra. Díky tomu má vysokou výživovou hodnotu a dobře na něm roste naprostá většina lékařsky důležitých bakterií (Votava, 2000). Jako základ pro krevní agar byl použit Columbia Blood Agar Base (M144) od firmy HiMedia. Tuto směs lze použít také pro přípravu čokoládového agaru nebo po přidání suplementů selektivních a identifikačních agarů. Speciální pepton obsažený v tomto základu

50 podporuje růst jak nenáročných, tak i náročných druhů bakterií. Tento agarový základ také podporuje typickou morfologii kolonií, zlepšuje produkci pigmentů a pomáhá zvýrazňovat jejich případnou hemolýzu (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, 1998). Příprava a složení (g/l): Pepton, speciál 23,00 Kukuřičný škrob 1,00 NaCl 5,00 Agar 15,00 ph (při 25 C) 7,3±0,2 Navážku 44,0 g základu (M144) rozpustíme v 1000 ml destilované vody. Takto připravenou směs vaříme do doby úplného rozpuštění. Poté ji sterilizujeme v autoklávu po dobu 15 minut při teplotě 121 C. Vysterilizovanou půdu je třeba zchladit na teplotu C tak, aby mohly být přidány složky, u kterých by vlivem vysoké teploty došlo k jejich degradaci. V tomto případě je k základu asepticky přidáno 5% sterilní na pokojovou teplotu vytemperované defibrinované beraní krve (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, 1998). K ochlazení půdy před přidáním beraní krve je vhodné použití vodní lázně s nastavenou teplotou v požadovaném rozmezí. Tím je dosaženo rovnoměrného ochlazení celé směsi tak, aby nedocházelo ke vzniku shluků vysráženého agaru. Je ale důležité dbát na neporušení obalu a tím i sterility připravené půdy. V případě krevního agaru je kromě kontroly jakosti a sterility již hotových půd v Petriho miskách nutné také provést kontrolu sterility dodávané krve. Kontrolu provádíme přidáním asi 4 5 ml krve z každé lahve ke sterilnímu agarovému základu a inkubujeme v termostatu při 37 C do druhého dne (Votava, 2000) MacConkeyův agar Agar je vyráběn v různých modifikacích lišících se svým složením. Pro diagnostiku bakterií Escherichia coli O157 byl použit MacConkeyův agar bez krystalové violeti s obsahem 1,2 % agaru (M008B) od firmy HiMedia

51 MacConkeyův agar je selektivní a diferenciální kultivační půdou pro kultivaci střevních mikroorganismů z celé řady klinických vzorků. Agar je také doporučen pro mikrobiologické testování potravin a přímou inokulaci vzorků vody pro zjištění počtu koliformních bakterií. Lze jej také použít pro testování mléka a mléčných produktů. Médium obsahuje krystalovou violeť a žlučové soli, které fungují jako inhibitory růstu pro většinu grampozitivních bakterií. Laktóza obsažená v agaru umožňuje rozlišení bakteriálních kolonií na základě schopnosti bakterií fermentovat laktózu. Bakterie Escherichia coli mají schopnost fermentovat laktózu, proto na tomto agaru rostou v červeno-růžových koloniích (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, 1998). Příprava a složení (g/l) Masový pepton 17,00 Proteosový pepton 3,00 Laktóza 10,00 Žlučové soli 1,50 NaCl 5,00 Neutrální červeň 0,03 Agar 12,00 ph (při 25 C) 7,1±0,2 Navážku 48,5 g základu (M008B) rozpustíme v 1000 ml destilované vody. Tuto směs zahříváme až k varu a poté mírným promícháním dojde k úplnému rozpuštění dehydratované směsi. Tu následně sterilizujeme v autoklávu při teplotě 121 C po dobu 15 minut. Je třeba se vyvarovat přehřátí směsi a po proběhlé sterilizaci ji ochladit na teplotu C (stejně jako u krevního agaru je vhodné použít vodní lázeň) a vylévat ji do sterilních Petriho misek. Hotové kultivační půdy skladujeme v temnu při teplotě 2 8 C tak, aby nedošlo k jejich vyschnutí. Než lze připravenou půdu použít k inokulaci, je třeba, aby byl její povrch suchý Živný agar Jako základ pro přípravu živného agaru byl použit Nutrient Agar ph 7,0 (M561A) od firmy HiMedia

52 Tento agar může být použit jako základní kultivační médium pro udržování nebo ke kontrole čistoty izolovaných populací před jejich biochemickým nebo sérologickým testováním. Agar může být buď použit jako šikmý agar nebo na Petriho miskách pro rutinní práci s kultivačně nenáročnými bakteriemi (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, 1998). Příprava a složení (g/l) Masový pepton 5,00 Hovězí extrakt 3,00 Agar 15,00 ph (při 25 C) 7,0±0,2 Navážku 23,0 g základu (M561A) rozpustíme v 1000 ml destilované vody. Takto připravenou směs vaříme do doby úplného rozpuštění. Poté ji sterilizujeme v autoklávu po dobu 15 minut při teplotě 121 C. Takto připravený agar skladujeme při teplotě 2 8 C tak, aby nedošlo k jeho vyschnutí (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, 1998). 9.3 Přístroje a pomůcky Z přístrojového vybavení je pro zpracování vzorků nutné mít v laboratoři k dispozici autokláv, termostat, vodní lázeň a Densi-la-metr. Autokláv (Obr. 13) je přístroj používaný ke sterilizaci rozvařených kultivačních půd před jejich vyléváním do Petriho misek. Ke sterilizaci dochází pomocí působení 121 C horké vodní páry po dobu 15 minut. Protože autokláv je vodní tlakovou nádobou, je nutné, aby personál, který s ním pracuje, byl proškolen pro práci s tlakovými nádobami. Vodní lázeň se používá k ochlazení vysterilizované kultivační půdy na teplotu vhodnou k vylévání do Petriho misek. Použita byla vodní lázeň od firmy Memmert (Obr. 14) s nastavenou teplotou 47,5 C. Lázeň nemá aktivní míchání náplně, je opatřena víkem z důvodu zábrany odpařování vody a má nastavitelnou teplotu v rozsahu od 10 do 95 C (MEMMERT, 2003). Termostat (inkubátor) umožňuje inkubaci kultivačních půd při stanovené teplotě s rozmezím ±0,5 C. Použit byl INCUCELL 111 (Obr. 15) o objemu 111 litrů udržující požadovanou teplotu ve stanoveném rozmezí s odchylkou pod 0,5 C. Termostat nemá aktivní

53 cirkulaci vnitřního prostředí a je ho možné nastavit na teplotu od 5,0 do 99,9 C. Protože není vybaven aktivním chlazením, je nutné, aby nastavená teplota nebyla nižší než teplota prostředí. Termostat byl s ohledem na požadovanou teplotu inkubace udávanou metodikou a výrobci biochemických testů nastaven na teplotu 37 C (BMT MEDICAL TECHNOLOGY S.R.O., 2014). Densi-la-metr (Obr. 16) je přístroj, který umožňuje stanovit hustotu připravené bakteriální suspenze, tím dochází ke standardizaci bakteriálního inokula, nutného pro správné provedení biochemického testu. Principem stanovení je měření optické absorbance při vlnové délce 525 nm. Přístroj měřenou hodnotu absorbance udává přímo v jednotkách McFarland (McFarlandovy zákalové stupnice), jeho měřící rozsah je od hodnot 0,3 do 10,0 McF s maximální odchylkou ±0,3 McF. Celková doba měření je cca 1 sekunda a minimální množství vzorku pro měření jsou 2 ml. Hodnoty McFarland udávají množství bakterií v jednom mililitru inokula, kdy například hodnota 1,0 stupeň McF odpovídá množství 300x10 6 bakterií/ml (BioMérieux, 2003a, Erba Group, 2014). Z pomůcek je potřeba mít v laboratoři skleněné zkumavky a baňky o vhodném objemu, sterilní jednorázové Pasteurovy pipety nebo kalibrovanou mikropipetu (Obr. 17) s jednorázovými špičkami o potřebném objemu ( µl), sterilní plastové Petriho misky a jednorázové inokulační kličky (Obr. 18). 9.4 Sérologické a biochemické reakce Latexová aglutinace Latexová aglutinace je sérologickou reakcí použitou při průkazu bakterií Escherichia coli O157. Jde o aglutinaci na nosičích, kdy jako nosič je použita latexová částice, na jejíž povrch byla nanesena protilátka koloidního charakteru (Votava aj. 2000). V tomto případě se jedná o protilátku namířenou proti somatickému antigenu O157. Pro průkaz tohoto byla použita diagnostická souprava E. coli O157 Latex Test od firmy Oxoid. V E. coli O157 Latex Testu je použito králičí protilátky proti somatickému antigenu O157 s vysokou citlivostí i specifitou a výrobce udává, že citlivost testu je 100 % s 99% specifitou. Součástí soupravy je návod, pozitivní a negativní kontrola, testovací latex, kontrolní latex (pro vyloučení falešně pozitivních reakcí) a papírové kartičky s předtištěnými políčky pro provedení testu. Diagnostická souprava se ve shodě s údaji výrobce uvedenými na obalu skladuje při teplotě

54 2 8 C do data exspirace a před samotným použitím je třeba ji nechat vytemperovat na pokojovou teplotu. Dalším materiálem nutným pro provedení testu jsou sterilní inokulační kličky, Pasteurova pipeta nebo mikropipeta a sterilizovaný fyziologický roztok o koncentraci NaCl 0,85 % nebo také roztok, jehož koncentrace NaCl nepřesahuje hodnotu 1,3 % (OXOID, 2005, Post, 1998) Postup provedení: 1. Na papírovou kartičku si lihovým fixem poznačíme k jednotlivým kruhovým políčkům polohu pozitivní, negativní kontroly a jednotlivých vzorků. 2. Do políčka označeného jako negativní a pozitivní kontrola dáme jednu kapku patřičného typu kontroly vytemperované na pokojovou teplotu (kontroly jsou popsány symboly + a na obalu a zároveň barevně odlišeny pomocí uzávěru lahvičky). Do políček označených čísly vzorků dáme pomocí Pasteurovy pipety nebo mikropipety jednu kapku na pokojovou teplotu vytemperovaného fyziologického roztoku. 3. Inokulační kličkou naneseme jednu kolonii ze suspektní bakteriální kultury do políčka, jemně ji rozetřeme a promícháme s kapkou fyziologického roztoku tak, aby vznikla homogenní suspenze. 4. Ke kapkám nanesených kontrol a stejně tak ke vzniklým bakteriálním suspenzím přidáme jednu kapku testovacího latexu. Poté pomocí inokulační kličky promícháme vzniklou směs. 5. Za pomoci krouživého pohybu odečítáme pozitivní a negativní reakce. Pozitivní reakce se projeví vznikem viditelných vysrážených vloček latexových částic (Obr. 18). 6. U pozitivních reakcí provedeme postup ještě jednou, ale místo testovacího latexu přidáme jednu kapku kontrolního latexu. Pozitivní vzorky jsou vyřazeny jako negativní protože se jedná o auto-aglutinační kmeny. Vyhodnocení pozitivní a negativní reakce provádí vysokoškolský pracovník nebo zkušený laborant za dohledu tohoto pracovníka. Provedení reakce s kontrolním latexem by mělo být podle návodu výrobce současně s testovacím latexem, avšak z důvodu úspory času a materiálu byl tento krok v průběhu testování vzorků prováděn jen u pozitivních kmenů, aby nedošlo ke vzniku falešně pozitivních výsledků

55 9.4.2 Biochemické testy Biochemických testů se využívá k biochemické identifikaci bakterií. K identifikaci je třeba dostatečného počtu reakcí tak, aby došlo k vzájemnému rozlišení jednotlivých bakteriálních rodů a druhů. Pro diagnostickou praxi se počet těchto reakcí pohybuje od 8 do 24. Pro správné provedení a tím i identifikaci je nutné získat čistou bakteriální kulturu izolací z primokultivace. Čistou kulturou se rozumí homogenní množina bakterií jednoho rodu a druhu nebo sérotypu. Je to nutné z důvodu, aby nedošlo ke zkreslení výsledků, chybnému určení biochemických vlastností a tím špatné identifikaci bakterie. Z takovéto kultury je třeba připravit suspenzi ve fyziologickém roztoku o doporučené hustotě, tu měříme přímo v jednotkách McFarland. Připravenou suspenzi očkujeme do řady kultivačních půd, které po vhodné době kultivace změní svou barvu a tím signalizují biochemickou aktivitu testovaných bakterií. K některým půdám je nutné pro vizualizaci přidat reagenční činidla (Obr. 20). V současnosti jsou jednotlivé reakce testovány v jamkách mikrotitračních destiček, kdy každá jamka je označena třípísmennou zkratkou, které symbolizují buď fermentaci jednoho druhu substrátu (cukru), tvorbu některého enzymu nebo produkci chemické sloučeniny (např. sirovodík) (Votava aj. 2000). Pro diagnostiku byly použity komerční biochemické testy a to ENTEROtest 24 od firmy Erba Lachema a RapiD 20 E, který vyrábí firma biomérieux. O druhu použitého testu pro identifikaci rozhoduje buď dostupnost jednotlivého typu v laboratoři, nebo vysokoškolský pracovník provádějící odečítání. ENTEROtest 24 je test určený pro identifikaci bakterií z čeledi Enterobacteriaceae pomocí dvacetičtyř biochemických testů (Obr. 21). Testy jsou skladovány při teplotě 2 8 C před použitím je vytemperujeme na pokojovou teplotu. Jednotlivé testy jsou v jamkách mikrotitrační destičky seřazeny do tří řad po osmi jamkách. Validitu každé nové šarže testů je třeba potvrdit pomocí výrobcem určených sbírkových kmenů. Ke každému prováděnému testu děláme kontrolu čistoty připraveného inokula. To provedeme tak, že inokulační kličkou provedeme roztěr na krevní nebo živný agar a společně s testem vyhodnotíme druhý den čistotu připravené suspenze. Společně s testem se také vyplní papírový záznamník (Obr. 22), na který se druhý den označují pozitivní a negativní reakce (Erba Lachema, 2011)

56 Postup provedení: 1. Do sterilní skleněné zkumavky dáme cca 3 ml sterilního fyziologického roztoku (0,85% NaCl) a inokulační kličkou naneseme na vnitřní stěnu zkumavky několik kolonií z čisté kultury. Jemně rozetřeme po stěně a poté promícháme s fyziologickým roztokem. Hodnotu zákalu suspenze kontrolujeme Densi-la-metrem tak, aby bylo dosaženo požadované hodnoty 1,0 stupně McFarland (Obr. 23). 2. V dalším kroku naneseme 100 µl inokula do každé jamky mikrotitrační destičky (každá sada 24 testů je popsána číslem vzorku). K nanesení inokula použijeme sterilní Pasteurovy pipety nebo mikropipety se sterilní špičkou o požadovaném objemu. 3. Prvních šest jamek testu v poloze H1 až C1 zakapeme dvěma kapkami parafínového oleje a současně pomocí inokulační kličky přeneseme část zbývající suspenze na zvolený agar pro kontrolu čistoty. 4. Mikrotitrační destičku zakryjeme víkem, vložíme do sáčku, aby se zabránilo odpařování vody z jamek destičky, a spolu s agarem ji vložíme na 24 hodin při 37 C do termostatu. 5. Po 24 hodinách zkontrolujeme čistotu inokula na agaru a zakapeme jamky destičky určenými činidly. Test Indol (IND, poloha H1) dvěma kapkami činidla pro indol a test Acetoin (VPT, poloha H3) jednou kapkou z činidel VPT I, VPT II poté necháme ještě 30 minut inkubovat při 37 C. Nakonec přidáme jednu kapku činidla PHE do testu pro Fenylalanin (PHE, poloha H2). 6. V následujícím kroku porovnáme barvu jednotlivých reakcí se srovnávací stupnicí (tabulka pro interpretace reakcí) a výsledky poznačíme do papírového záznamníku. Protože každé políčko má svou hodnotu, sečteme hodnoty v jednotlivých sloupcích, čímž získáme číselný kód, který odečteme z diagnostického seznamu pro ENTEROtest 24 nebo zadáme výsledky reakcí do identifikačního programu. RapiD 20 E je test určený k identifikaci bakterií z čeledi Enterobacteriaceae během 4 až 4 a půl hodiny. Testy se skladují při teplotě 2 8 C a před použitím je třeba je vytemperovat na pokojovou teplotu. Jednotlivé testy nejsou jako v předchozím případě v jamkách mikrotitrační destičky, ale v plastových zkumavkách s číškou zatavených do jednoho testovacího proužku (Obr. 24). I u tohoto testu je třeba každou šarži ověřit pomocí

57 výrobcem určených sbírkových kmenů. Součástí balení je také ampule s fyziologickým roztokem (0,85% NaCl) a inkubační box, který zajišťuje konstantní vlhkost po celou dobu inkubace. Tak jako u předchozího testu vyplňujeme papírový záznamník (Obr. 25) pro hodnocení reakcí (BioMérieux, 2003b). U tohoto testu byla také provedena kontrola čistoty inokul, ale její odečtení je možné až po 18 hodinové inkubaci při 37 C. Postup provedení: 1. Do inkubačního boxu přidáme vodu a na její prodlouženou patku zaznamenáme číslo vzorku, poté do něj vložíme testovací proužek. 2. Otevřeme ampuli s fyziologickým roztokem (je možné použít fyziologický roztok připravený v laboratoři) a pomocí inokulační kličky rozetřeme několik kolonií po stěně ampule a promícháme s fyziologickým roztokem, tak aby došlo ke vzniku suspenze o hodnotě zákalu 0,5 stupně McFarland. (kontrolujeme pomocí Densi-la-metru). 3. Suspenzi nanášíme do zkumavek testovacího proužku tak aby nedošlo k tvorbě bublin. K nanesení používáme Pasteurovu pipetu nebo mikropipetu. Pro test CIT (citrát) se plní zkumavka a spodní část číšky. U ostatních zkumavek plníme pouze zkumavku (v obou případech asi 50 µl). Je třeba dbát na přesnost plnění, protože odchylka by mohla způsobit vznik chybných výsledků. 4. Zkumavky u podtržených testů (LDC Lysin dekarboxyláza, ODC Ornithin dekarboxyláza, URE ureáza) zakapeme parafínovým olejem tak, aby se zcela zabránilo kontaktu obsahu se vzduchem. Box překryjeme víkem a dáme inkubovat na 4 až 4 a půl hodiny při 36 ± 2 C. 5. Po uplynutí inkubační doby přidáme k testům příslušná činidla. Pro test VP (Acetoin) přidáme 1 kapku činidla VP 1 a VP 2 (v případě pozitivity dojde ke změně barvy do 10 minut), k testu IND (Indol) 2 kapky činidla JAMES. 6. Během čekání na test VP provedeme test na cytochrom-oxidázu (Obr. 26), jehož výsledek je třeba zaznamenat do záznamníku. Poté inkubační proužek odečteme za pomoci odečítací tabulky a získaný číselný kód porovnáme s databází na webových stránkách výrobce. Test pro stanovení tvorby enzymu cytochrom-oxidázy má podobu proužku, na který naneseme inokulační kličkou jednu kolonii, tu rozetřeme a pozitivní reakce se projeví změnou

58 barvy. Test skladujeme podle doporučení výrobce obvykle v rozmezí 2 8 C do data exspirace. 9.5 Pracovní postup Do laboratoře řádně přijatý vzorek (zapsaný do laboratorního systému a řádně označený) se nanese na kultivační půdy ASAP agar a Endův agar. Místo Endova agaru můžeme použít i MacConkeyův agar. Výběr kultivační půdy závisí na dostupnosti půdy nebo na rozhodnutí vysokoškolského pracovníka. Nanesení vzorku na kultivační půdu se provede tak, že se tampón, kterým byl odebrán vzorek, vyjme z Amiesova transportního média a rozetře na obě kultivační půdy podle schématu č. 1. Tampónem vytvoříme inokulační čáru (označena A) při její tvorbě je třeba dbát na to, aby došlo ke kontaktu celé plochy tampónu s půdou, toho dosáhneme tím, že v průběhu otírání tampónem otáčíme. Poté pomocí inokulační kličky rozočkováváme inokulační čáru pomocí jednotlivých tahů (označeno B) tak, aby došlo ke snížení původní koncentrace bakterií, kterou lze předpokládat v místě inokulační čáry. Pro každou sérii tahů je třeba použít nové inokulační kličky. Na závěr provedeme opět novou kličkou vlnovku (označena C), kterou pokryjeme zbývající plochu půdy. Vlnovku vytvoříme opatrně, aby nedošlo k protnutí čar vytvořených dříve. Při správném postupu vyrostou v závěrečné vlnovce druhý den jednotlivé kolonie bakterií, se kterými je možné dále pracovat. V průběhu práce s inokulační kličkou dbáme na to, aby nedošlo k poškození plochy kultivační půdy (Vojenský veterinární ústav, 2009). Schéma č

59 Důležité opatření při práci se vzorky a kultivačními půdami je, že v průběhu práce s nimi nesmí být otevřena okna. V případě, že je v místnosti umístěna klimatizace, musí být v průběhu práce vypnuta a personál při práci nesmí mluvit. Tato opatření jsou nutná k tomu, aby nedošlo ke kontaminaci kultivačních půd bakteriemi, které nepochází z odebraného vzorku. Také je třeba dbát o to, aby do kontaktu s kultivační půdou přišel jen tampón se vzorkem a sterilní inokulační kličky (Vojenský veterinární ústav, 2009). Když jsou všechny vzorky naneseny a rozočkovány na kultivační půdy, jsou vloženy do termostatu nastaveného na 37 C, při které jsou kultivovány po dobu hodin. Následující den vysokoškolský pracovník provede vyhodnocení nálezu (zaznamená ho do protokolu) a určí suspektní kolonie. Suspektní kolonie jsou na ASAP agaru bílé barvy (Obr. 27), MacConkeyho agaru růžovo-červené s difuzní zónou (Obr. 4) a na Endově agaru růžovo-červené s kovovým leskem (Obr. 5). Ty jsou poté inokulační kličkou přeneseny na Krevní případně Živný agar, aby byla získána čistá kultura. Volba půdy je opět dána její dostupností v laboratoři nebo rozhodnutím odečítajícího pracovníka. Kličkou nabereme bakteriální kolonii a vytvoříme na čisté půdě inokulační čáru úplně stejným způsobem a za dodržení stejných zásad jako v případě tampónu. Kultivační půdy jsou poté opět inkubovány při 37 C po dobu hodin (Vojenský veterinární ústav, 2009). Po inkubační době jsou z takto vyizolovaných čistých bakteriálních kultur vybrány kolonie, se kterými je proveden test přítomnosti somatického antigenu O157 pomocí latexové aglutinace. V případě, že je výsledek latexové aglutinace pozitivní, je z takové kultury proveden také biochemický test. V případě, že je biochemickým testem bakterie identifikována jako Escherichia coli, je tento výsledek zapsán do protokolu. Pokud jsou vzorky pozitivní na přítomnost antigenu O157 a následně potvrzeny biochemickým testem jako Escherichia coli, je výsledek považován za průkaz přítomnosti bakterií Escherichia coli O157 v odebraném vzorku. Výsledky vyšetření jsou po ukončení vyšetřování zapsány do laboratorního systému (Vojenský veterinární ústav, 2009). Celý výše popsaný postup při průkazu bakterií Escherichia coli ve vzorku je shrnut na následující stránce ve schématu č

60 ASAP agar + Endův agar (MacConkeyův agar) hod. 37 ± 1 C Suspektní kolonie Krevní agar (Živný agar) hod. 37 ± 1 C Izolované kolonie latexová aglutinace Schéma č. 2 Pozitivní aglutinace biochemický test

61 10. Výsledky V roce 2013 proběhl odběr vzorků ve VVP Hradiště. V tomto prostoru bylo odebráno nejmenší množství vzorků a to devadesát, z nichž dvacet pět (téměř jedna třetina) pocházela od zvířat chovaných v oborách (jelen sika, muflon), u nichž nebyla zjištěna přítomnost bakterie Escherichia coli O157. Proto i přes vysokou prevalenci v populaci srnce obecného, téměř čtvrtina odebraných vzorků, je celková prevalence vztažená k počtu všech odebraných vzorků pouze necelých 8 %, to je nejméně ze všech VVP. Prevalence v populacích prasete divokého a jelena lesního se pohybovala v rozmezí 5 až 7 % (Tab. 11). Prase divoké (Sus scrofa) Jelen lesní (Cervus elaphus) Srnec obecný (Capreolus capreolus) Jelen sika (Cervus nippon) Tab. 11 Výsledky vyšetření z VVP Hradiště Při pohledu na data, jež jsou uvedena v grafu č. 1, je patrné, že nejvíce odebraných vzorků ve VVP Hradiště bylo od prasete divokého, konkrétně jde o třicet vzorků, ale pozitivní nález byl pouze u dvou. Nejvyšší počet pozitivních vzorků byl u srnce obecného, jednalo se o čtyři pozitivní vzorky při celkovém počtu osmnácti odebraných. To je jen o jeden odebraný vzorek více než u jelena lesního, kdy pozitivní nález byl pouze jednoho vzorku. Oproti tomu počet vzorků pocházejících od jelena siky byl dvacet čtyři, z nichž nebyl pozitivní na přítomnost Escherichia coli O157 žádný. VVP Hradiště 2013 počet vzorků pozitivní negativní celkem , , , pozitivita v % Muflon (Ovis musimon) Celkový počet vzorků ,

62 počet vzorků VVP Hradiště pozitivní celkem Prase divoké (Sus scrofa) Jelen lesní (Cervus elaphus) 4 Srnec obecný (Capreolus capreolus) 0 0 Jelen sika (Cervus nippon) 1 Muflon (Ovis musimon) Graf č. 1 Přehled celkového počtu a počtu pozitivních vzorků od jednotlivých druhů z VVP Hradiště. Odběry vzorků ve VVP Březina probíhaly v roce 2011 a co do celkového počtu odebraných vzorků je jejich počet druhý nejvyšší, konkrétně se jedná o sto padesát odebraných vzorků od čtyř druhů a u dvou vzorků nebyl druh zvířete uveden na žádance. Z těchto dvou vzorků byl jeden pozitivní. Nejvyšší prevalence byla stejně jako ve VVP Hradiště u srnce obecného a to necelých 19 %. U prasete divokého se prevalence pohybovala pod hodnotou 4 % a u jelena lesního okolo 10 %. U daňka evropského, který je stejně jako muflon a jelen sika chován v oboře, nebyl žádný vzorek pozitivní na přítomnost bakterie Escherichia coli O157. Celkově byla tato bakterie nalezena u více než 13 % odebraných vzorků (Tab. 12). Prase divoké (Sus scrofa) Jelen lesní (Cervus elaphus) Srnec obecný (Capreolus capreolus) Daněk evropský (Dama dama) VVP Březina 2011 počet vzorků pozitivní negativní celkem , , , pozitivita v % Bez identifikace ,00 Celkový počet vzorků ,16 Tab. 12 Výsledky vyšetření z VVP Březina

63 počet vzorků Z grafu č. 2 je na první pohled patrné, že nejvyšší počet pozitivních vzorků (čtrnáct) pocházel od srnce obecného. Od tohoto druhu byla téměř polovina (sedmdesát čtyři) z celkového počtu všech odebraných vzorků ve VVP Březina. Druhý nejvyšší počet pozitivních vzorků byl u jelena lesního a to čtyři, od tohoto byl také druhý nejvyšší počet odebraných vzorků a to třicet devět. Jeden pozitivní vzorek byl pak nalezen u prasete divokého, od kterého bylo odebráno dvacet devět vzorků a dva vzorky, z nichž jeden byl pozitivní, nemohly být identifikovány z důvodu neuvedení druhu odebírajícím lékařem VVP Březina 2011 pozitivní celkem Prase divoké (Sus scrofa) 4 Jelen lesní (Cervus elaphus) 14 Srnec obecný (Capreolus capreolus) Daněk evropský (Dama dama) 2 Bez identifikace Graf č. 2 Přehled celkového počtu a počtu pozitivních vzorků od jednotlivých druhů z VVP Březina. Ve VVP Boletice byl celkový počet odebraných vzorků sto osmnáct se zjištěnou celkovou prevalencí bakterie Escherichia coli O157 bez rozdělení podle živočišných druhů téměř 30 %. Odběry vzorků probíhaly v roce 2010 a lednu Jedná se o jediný VVP, kde nebyl žádný vzorek pocházející od zvěře žijící v oborách. Nejvyšší výskyt pozitivních vzorků byl zjištěn u populace srnce obecného a to 70 %. U zbylých dvou druhů (jelen lesní, prase divoké) byla prevalence v rozmezí od 20 do 30 % (Tab. 13). Prase divoké (Sus scrofa) Jelen lesní (Cervus elaphus) VVP Boletice 2010 počet vzorků pozitivní negativní celkem Tab. 13 Výsledky vyšetření z VVP Boletice pozitivita v % , ,09 Srnec obecný (Capreolus capreolus) ,00 Celkový počet vzorků ,66

64 počet vzorků Při pohledu na graf č. 3 je patrné, že počet odebraných vzorků byl nejnižší u srnce obecného a to pouze deset, z nichž pozitivní na přítomnost bakterie Escherichia coli O157 bylo sedm vzorků. Zatímco od jelena lesního bylo odebráno padesát pět vzorků, z toho pozitivních bylo šestnáct. O dva vzorky méně, tedy celkem padesát tři, bylo odebráno od prasete divokého, z nich bylo dvanáct pozitivních na přítomnost bakterie Escherichia coli O157. VVP Boletice pozitivní celkem Prase divoké (Sus scrofa) Jelen lesní (Cervus elaphus) Srnec obecný (Capreolus capreolus) Graf č. 3 Přehled celkového počtu a počtu pozitivních vzorků od jednotlivých druhů z VVP Boletice. V roce 2009 probíhal odběr vzorků ve VVP Libavá. Tyto vzorky, pocházely podobně jako v případě VVP Hradiště od pěti rozdílných druhů, kdy dva z nich jsou chovány v oborách. Z VVP Libavá byl jediný pozitivní vzorek na přítomnost bakterie Escherichia coli O157 odebraný od zvířete chovaného v oboře, a to u muflona. Prevalence bakterie Escherichia coli O157 u muflona, který je chován v oboře, byla více než 33 %. To ale bylo zřejmě způsobeno nedostatečným počtem odebraných vzorků od tohoto druhu. Byly odebrány pouze tři vzorky. Z ostatních druhů byla nejvyšší prevalence zjištěna v populaci prasete divokého a to přes 20 %. V populaci jelena lesního se pohybovala v rozmezí 12 až 13 % a srnec obecný byl pozitivní na přítomnost bakterie Escherichia coli O157 jen u necelých 6 %. Ve VVP Libavá byl odebrán nejvyšší počet vzorků ze všech VVP, konkrétně šlo o sto osmdesát vzorků. Z tohoto počtu vzorků byla nakonec bakterie Escherichia coli O157 nalezena u více než 13%. (Tab. 14)

65 počet vzorků VVP Libavá 2009 počet vzorků pozitivní negativní celkem pozitivita v % Prase divoké (Sus scrofa) Jelen lesní (Cervus elaphus) Srnec obecný (Capreolus capreolus) Daněk evropský (Dama dama) , , , Muflon (Ovis musimon) ,33 Celkový počet vzorků ,33 Tab. 14 Výsledky vyšetření z VVP Libavá Při pohledu na graf č. 4 zjistíme, že nejvyšší počet vzorků byl odebrán od jelena lesního a to osmdesát osm, z nichž byla u jedenácti z nich nalezena bakterie Escherichia coli O157. O jeden pozitivní vzorek méně bylo získáno od prasete divokého, šlo o deset z celkového počtu čtyřiceti osmi odebraných. Dále byly dva vzorky pozitivní také u srnce obecného, kdy celkový počet odebraných vzorků byl třicet šest. A celkem pět vzorků pocházelo od daňka evropského a tři od muflona, kdy přítomnost bakterie Escherichia coli O157 byla potvrzena u jednoho z nich. VVP Libavá pozitivní 88 celkem Prase divoké (Sus scrofa) Jelen lesní (Cervus elaphus) Srnec obecný (Capreolus capreolus) Daněk evropský (Dama dama) Muflon (Ovis musimon) Graf č. 4 Přehled celkového počtu a počtu pozitivních vzorků od jednotlivých druhů z VVP Libavá

66 Muflon (Ovis musimon) 4 (0,7%) Daněk evropský (Dama dama) 13 (2,4%) Bez identifikace 2 (0,4%) Jelen Sika (Cervus nippon) 24 (4,4%) Prase divoké (Sus scrofa) 160 (29,6%) Srnec obecný (Capreolus capreolus) 138 (25,6%) Jelen lesní (Cervus elaphus) 199 (36,9%) Graf č. 5 Počet odebraných vzorků jednotlivých druhů včetně jejich podílu na celkovém počtu v procentech. Z grafu č. 5 je možné vyčíst, že z celkového počtu odebraných vzorků ve všech VVP (celkem jde o pět set čtyřicet vzorků) byl podíl jiných druhů zvířat než jelena lesního, prasete divokého a srnce obecného nižší než 10 %. Nejpočetnější skupinou byl jelen lesní, od kterého pocházelo sto devadesát devět vzorků (36,9 % z celkového počtu) po něm následovalo prase divoké se sto šedesáti odebranými vzorky (29,6 % z celkového počtu) a srnec obecný kdy bylo odebráno sto třicet osm vzorků (25,6 % z celkového počtu). V grafu č. 6 se uvádí, že prase divoké mělo celkový pozitivní nález bakterie Escherichia coli O157 v 16,6 % odebraných vzorků, jelen lesní v 16,1 % odebraných vzorků, srnec obecný v 19,6 % odebraných vzorků a muflon v 25 % odebraných vzorků (při počtu pouze čtyř odebraných vzorků). U zbylých dvou druhů nebyl nalezen žádný pozitivní vzorek, a proto v grafu nejsou uvedeny