Speciální mikrobiologie

Transkript

1 Speciální mikrobiologie Bacillus cereus Charakteristika Bacillus cereus patří do rodu Bacillus, čeledi Bacillaceae. Je významným původcem kažení potravin, zejména mléčných výrobků (např. sladké srážení mléka, hořknutí smetany). Vzhledem k produkci termorezistentních spor se podílí na kažení pasterovaných, příp. sterilizovaných výrobků. Kažení potravin je umožněno díky produkci celé řady enzymů, schopných degradovat jejich základní složky. Jedná se o proteázy (degradace kaseinu a želatinu), amylázu (hydrolýza škrobu), lecitinázu, sfingomyelinázu a fosfolipázu (degradace fosfolipidů) a lipázy (degradace triacylglyceridů). Morfologie jedná se o fakultativně anaerobní, sporotvornou, grampozitivní tyčinku, pohyblivou díky přítomnosti peritrichálních bičíků. Velikost vegetativních buněk je v průměru 1 x 3 7 µm, buňky se vyskytují ojediněle nebo v řetízcích. Vegetativní buňky B. cereus tvoří vždy jednu endosporu, která má oválný až cylindrický tvar, je umístěna centrálně či subterminálně a nezvětšuje průměr buňky (tzv. nezduřuje buňku). Sporulace probíhá pouze za přítomnosti kyslíku, protože energii pro sporulaci získává bakterie oxidací zásobních lipidů z cytoplazmy (poly-ß-hydroxymáselná kyselina). Faktory virulence B. cereus je producentem řady toxinů a enzymů. Jedná se zejména o emetický toxin, diarhogenní enterotoxiny, hemolysiny (typ I, II a III), dva typy fosfolipázy C, sfingomyelinázu a enzymy s proteolytickou, lipolytickou a amylolytickou aktivitou (ty se uplatňují při kažení potravin). Emetický toxin (cereulid) je termostabilní polypeptid (121 C po 90 minut), aktivní v širokém rozmezí ph 2 11 a odolný vůči působení proteolytických enzymů. Maximální produkce cereulidu je pozorována během stacionární fáze růstu bakterií v potravině a může být vázána na sporulaci. B. cereus produkuje tři základní diarhogenní enterotoxiny: hemolysin BL, nehemolytický enterotoxin a cytotoxin K. Nově byly izolovány i enterotoxin BceT a enterotoxin FM. Diarhogenní enterotoxiny jsou termolabilní proteiny citlivé k proteolytickým enzymům. Jsou produkovány během pozdní exponenciální a na začátku stacionární fáze růstu při množení bakterií ve střevě. Významným faktorem virulence je hemolyzin BL, který se skládá ze tří komponent (B, L 1 a L 2 ), má hemolytickou, cytotoxickou a dermonekrotickou aktivitu a zvyšuje permeabilitu cév. Cytotoxin K je zodpovědný za nekrotickou enteritidu doprovázenou krvavým průjmem.

2 Výskyt B. cereus je ubikvitární mikroorganismus, jeho spory se běžně nachází v půdě, prachu, příp. i ve vodě. Často kontaminuje mléko, maso a potraviny rostlinného původu. Spory B. cereus se běžně vyskytují v prostředí a často kontaminují potraviny. Bakterie je také běžnou součástí střevní mikroflory člověka. K alimentárním otravám dochází po pomnožení bakterií v potravinách na množství přibližně 10 7 buněk v gramu (v případě dětí 10 5 v gramu). Kultivace růstové optimum pro vegetativní buňky B. cereus je C, maximum C, při teplotách pod 10 C se obvykle nemnoží. Výjimku tvoří psychrotrofní kmeny, které se množí i při teplotě 4 C, tyto kmeny jsou často izolovány z mléčných výrobků. Vegetativní buňky jsou běžně devitalizovány pasterací či podobných tepelným ošetřením. B. cereus roste v rozmezí ph 4,3 9,3. Minimální aktivita vody pro růst a množení je 0,92 0,95. B. cereus je schopen růstu v prostředí s maximálním přídavkem 7 % NaCl. Na krevním agaru vytváří různě širokou zónu β hemolýzy. B. cereus nezkvašuje manitol, VP-test je pozitivní, utilizuje citráty, ale ne močovinu, většina kmenů redukuje nitráty. Ke tvorbě spor sporulaci, dochází obvykle na konci exponenciální a začátkem stacionární fáze růstu, za příznivých podmínek trvá hodin. Ke sporulaci nedochází za nízkých teplot. Klíčení spor germinace, je rychlejší než sporulace a je závislá na teplotě, při optimální teplotě trvá asi 1 hodinu. K aktivaci germinace spor dochází záhřevem na pasterační teploty (72 85 C). Termorezistence spor B. cereus je v porovnání s ostatními druhy rodu Bacillus relativně nízká, u mezofilních kmenů je D 100 = 0,3 10 minut, u psychrotrofních kmenů D 90 = 2 9 minut. UHT ošetření spory B. cereus obvykle spolehlivě ničí. Emetický toxin je termostabilní, odolává záhřevu 121 C po dobu 90 minut. Aktivitu si zachovává při ph 2 11, je odolný vůči působení proteolytických enzymů (pepsin, trypsin). Diarhogenní enterotoxiny jsou stabilní při ph 4 11, jsou termolabilní účinně jsou inaktivovány teplotou 56 C za dobu 5 minut. Proteolytické enzymy je štěpí. Většina psychrotrofních kmenů je schopna produkovat toxiny i při teplotě 4 C, ale až po dlouhé době (více než 21 dní). Patogenita konzumace potravin kontaminovaných bakteriemi B. cereus může vyústit ve 2 různé formy alimentárního onemocnění emetický a diarhogenní syndrom. Emetický syndrom je alimentární intoxikace, vzniká po konzumaci potravin obsahujících vyprodukovaný emetický toxin. Toxická dávka je přibližně 30 μg na kg živé hmotnosti. Toxin cereulid se váže na receptory nervus vagus v žaludku a indukuje zvracení. V některých případech může také způsobit selhání jater jako následek degenerace hepatocytů. Typické symptomy nauzea a zvracení, objevují se za 1 6 hodin

3 po konzumaci kontaminované potraviny a nepřetrvávají obvykle déle než 24 hodin, poté onemocnění spontánně odezní. Průběh onemocnění připomíná stafylokokovou enterotoxikózu. Diarhogenní enterotoxiny jsou produkovány po kolonizaci bakterií v tenkém střevě. Pokud dojde k produkci enterotoxinů v potravině, obvykle jsou inaktivovány nízkým ph a účinkem proteolytických enzymů v žaludku. Předpokládá se, že enterotoxiny vyvolávají průjem v důsledku tvorby transmembránových pórů v membráně enterocytů, což má za následek ztráty Na +, Cl - a H 2 O z epiteliálních buněk. Diarhogenní syndrom se objevuje 8 16 hodin po konzumaci kontaminované potraviny. Mezi klinické příznaky patří vodnatý průjem, nauzea a abdominální bolesti, příležitostně se může objevit i zvracení. Potíže přetrvávají hodin, potom spontánně odezní. Vzácně může Bacillus cereus způsobit u oslabených osob infekci ran, sepsi, endokarditidu, meningitidu, infekci gastrointestinálního traktu, apod. Po poranění oka může vyvolat endoftalmitidu, která může vyústit v rozpuštění oční koule (působením proteolytických enzymů). Riziková potravina emetický syndrom: konzumace potravin obsahujících škrob - těstovin, rýže, vařených brambor, dále masa (hovězí, vepřové), mléčných pudinků a kojenecké výživy. Diarhogenní syndrom: konzumace masa a masných výrobků, ryb, omáček, zeleniny (např. kukuřice), mléčných výrobků. Diagnostika jedná se o kultivačně nenáročnou bakterii. Na běžných půdách tvoří velké (3-8 mm) "plstnaté" kolonie s nepravidelnými okraji, na krevním agaru se zónou β hemolýzy. Pro stanovení B. cereus se používají živná média obsahující selektivní složky inhibující růst doprovodných mikroorganismů (např. zvýšená koncentrace NaCl, polymyxin B), diagnostickou složkou je obvykle vaječný žloutek (precipitace v důsledku lecitinázové aktivity) a manitol, který B. cereus nefermentuje. Pro stanovení spor je nutná tepelná inaktivace vegetativních buněk ve vzorku (80 C po 10 minut). Konfirmace se provádí na základě posouzení hemolýzy, pomocí PCR. Pro izolaci B. cereus z potravin se používá MYP agar (Mannitol Yolk polymyxine agar) dle ČSN EN ISO Na této půdě roste B. cereus ve velkých suchých drsných koloniích s nepravidelnými okraji, růžové barvy (negativní manitol), obklopených růžovou zónou precipitace (lecitinázová aktivita). Dále je možné použít Polymyxin Egg Yolk Mannitol Bromthymol agar (PEMBA), kde roste B. cereus v modrých koloniích opět obklopených zónou precipitace (lecitinázová aktivita). Pro stanovení lze použít chromogenní agary (Compass Bacillus cereus agar). Průkaz toxinů k detekci přítomnosti diarhogenních enterotoxinů B. cereus lze využít komerčně dostupné kity

4 na bázi imunochemických metod (ELISA) nebo reverzní pasivní latexovou aglutinaci. Pro detekci emetického toxinu se používají metody využívající tkáňové kultury či biologický pokus. Terapie B. cereus je přirozeně rezistentní k penicilinům díky produkci ß-laktamázy. Většinou postačí rehydratace a symptomatická léčba, k léčbě invazivních onemocnění se používají linkosamidy, aminoglykosidy, polypeptidy. V případě postižení oka podáváme klindamycin s gentamicinem. Preventivní opatření vhodné skladování uvařených potravin (při teplotách, které neumožňují vyklíčení spor, a to pod 4 C nebo nad 60 C) při následném podávání tepelně upravené potraviny se doporučuje její důkladné prohřátí nad teplotu 75 C při ohřevu v mikrovlnné troubě je vhodné potravinu během ohřevu promíchat. Růst B. cereus na Bacillus cereus Selective Agar B. cereus: zóna β hemolýzy na krevním agaru

5 Růst B. cereus na Bacillus cereus PEMBA agaru Růst B. cereus na MYP agaru mg=cm0617&sec= Dokument byl vytvořen: :02:09 Zdroj: