Imunohematologie a vyšetřovací metody v imunohematologii. Sláviková M., Holusková I., Galuszková D. Transfuzní oddělení FN Olomouc

Transkript

1 Imunohematologie a vyšetřovací metody v imunohematologii Sláviková M., Holusková I., Galuszková D. Transfuzní oddělení FN Olomouc

2 Co je imunohematologie? Základní kámen transfuzní medicíny a všech ostatních oborů používajících transfuzní substituční léčbu Co vyšetřuje imunohematologie? antigeny a protilátky související s procesy (aktivace komplementu, hemolýza) Proč se tato vyšetření dělají: aby se zabránilo nežádoucím účinkům transfuze (potransfuzní hemolytické reakce, aloimunizace) aby se prokázaly a léčily protilátkami způsobené patologické stavy nesouvisející s transfuzí (např. AIHA)

3 Co je krevní skupina? Definice: vrozený znak na povrchu erytrocytů, detekovatelný specifickou protilátkou Nevyskytuje se pouze na erytrocytech výskyt i na jiných buňkách (např. trombocyty)

4 Antigenní systémy na erytrocytech Známo více než 300 antigenů 30 antigenních systémů Antigeny na erytrocytech mohou být řazeny mezi: Proteiny Glykoproteiny (protilátky rozeznávají primárně polypeptidový řetězec) Glykoproteiny (protilátky rozeznávají primárně karbohydrátový region) Glykolipidy (protilátky rozpoznávají část karbohydrátu)

5 Antigenní systémy na erytrocytech

6 Cukry - glykosylující membránové proteiny a lipidy (Glyko) Proteiny Receptory/adhez.molekuly??? Membránový transport Enzymy Regulace komplementu

7

8 Klasifikace antigenních systémů Antigeny na erytrocytech řadíme, do některé ze 4 skupin: 1. Krevně skupinový systém skládá se z antigenů, které jsou kódovány jedním genovým lokusem 2. Kolekce serologicky, biochemicky nebo geneticky podobné antigeny, které nesplňují zařazení do krevně skupinových systémů 3. Série 700 antigeny s nízkou frekvencí výskytu 4. Série 900 antigeny s vysokou frekvencí výskytu

9 Terminologie a klasifikace ISBT klasifikace erytrocytárních skupinových systémů No. System name System symbol Gene name(s)* Chromosomal location CD numbers 001 AB0 AB0 AB0 9q MNS MNS GYPA, GYPB, GYPE 4q31.21 CD235

10 Skupinové systémy na erytrocytech AB0 MNS P Rh LUTHERAN KELL LEWIS DUFFY KIDD DIEGO Yt Xg SCIANNA DOMBROCK COLTON LANDSTEINER-WIENER CHIDO/RODGERS H Kx GERBICH CROMER KNOPS INDIAN Ok RAPH JOHN MILTON HAGEN I GLOBOSIDE GILL Rh-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN

11 Krevně skupinové kolekce (200) AKTUÁLNÍ KOLEKCE 205: COST 207: Ii 208: Er 209: GLOB 210: Le c ; Le d 212: VEL ZASTARALÉ KOLEKCE 201 Gerbich 202 Cromer 203 Indian 204 Auberger 206 Gregory 211 Wright

12 Antigeny s nízkou frekvencí výskytu (série 700) BATTY CHRISTIANSEN BILES BOX TORKILDSEN PETERS REID JENSEN LIVESAY MILNE

13 Antigeny s vysokou frekvencí výskytu (série 901) LANGERIES AUGUST Jr a EMM ANTON

14 Krevně skupinové systémy: AB0 systém Rh systém Kell systém

15 AB0 systém Historická fakta: První krevně skupinový systém objevený u člověka Nezávisle na sobě jej objevili Landsteiner (1901), Janský (1907) a Moss (1910) V roce 1902 Descatello a Sturli prokázali čtvrtou skupinu, ve které byly krvinky aglutinovány séry všech ostatních skupin. Tato skupina byla nazvána AB. To, že Landsteiner neurčil čtvrtou základní krevní skupinu, bylo zřejmě způsobeno tím, že žádná z jeho vyšetřovaných osob neměla tuto krevní skupinu (Daniels, 2002). K. Landsteiner J. Janský W. L. Moss

16 AB0 antigeny

17 Frekvence výskytu krevní skupiny AB0 Frekvence výskytu AB0 v ČR: A 41% B 18% AB 9% 0 32% Střední Evropa: A 48 % B 9% AB 4% 0 39%

18 Chybění H antigenu Velmi vzácné Příčina: absence enzymu H - transferáza Úplná deficience H antigenu: BOMBAY (0 h fenotyp); hh gene Částečná deficience H antigenu: PARABOMBAY; Hh gen Jedinci s 0 h mají silné anti-h, -A a -B protilátky v jejich séru. Transfuze pouze erytrocyty 0 h.

19 Podskupiny antigenu A (A 1 a A 2 ) Detekce za pomoci lektinu z Dolichos biflorus nebo monoklonálního anti-a 1 reagentu detekce podskupiny A 1 Velmi vzácené varianty: slabé A ( včetně A 3, A m, A x, A bantu, A el and A end )

20 Slabé B a AB Weak B Slabé reakce s anti-b séry Podskupiny B se vyskytují v populaci s vysokým výskytem krevní skupiny B (Afrika, Čína) Získané B Enzymové defekty enzymů U infekcí GIT Polyaglutinabilita erytrocytů Weak AB Velmi vzácné může se vyskytovat u získaného B antigenu

21 AB0 systém u novorozenců Anti A, anti B u novorozenců detekujeme až ve 3 6 měsíci po expozici antigenům z vnějšího prostředí Protilátky anti A a anti B detekované u novorozenců jsou třídy IgG (přenos přes placentu od matky)

22 Klinický význam AB0 systému Klinický význam pro transfuze Univerzální dárce krve Dárce krevní skupiny 0 (lépe 0 RhD negativní) Univerzální příjemce Příjemce s krevní skupinou AB

23 Rh systém Po AB0 systému druhý nejdůležitější antigenní systém r objeven Landsteinerem a Wienerem Zahrnuje 50 antigenů mezi než se řadí antigeny: D, C, c, E, e RhD gen produkuje antigen D RhCE gen produkuje antigen CE

24 Klinický význam Rh systému Aloprotilátky anti-d, anti-e, anti-e, Anti-C, anti-c jsou třídy IgG KLINICKY VÝZNAMNÉ RhD antigen nejsilnější imunogenní antigen

25 Kell systém Antigeny: K Kell (POZOR! Po antigenu RhD druhý nejsilněji imunogenní antigen! k Cellano KLINICKÝ VÝZNAM: Protilátky třídy IgG KLINICKY VÝZNAMNÉ Ve srovnání s protilátkami z jiných systému působí destrukci prekurzorů erytrocytů, které rozkládají nízká hladina bilirubinu

26 Biologické (netransfuzní) aspekty krevních skupin Onkologie mnoho prací korelujících AB0 a různé malignity statistická nerovnováha převaha skupiny A nad 0: Ca slinných žláz 1.64, Ca ovaria 1.28, Ca žaludku 1.22, Ca kolorektální 1.11 nové antigeny na nádorových buňkách (T, Tn, sialyl-le(x), A-like zeslabení až ztráta A a nebo B antigenů na erytrocytech někdy předchází projev akutní leukemie

27 Biologické (netransfuzní) aspekty krevních skupin Koagulace mnoho prací korelujících AB0 a koagulaci skupina 0 má vyšší sklon ke krvácení než A např. rel.incidence 0:A u krvácejících gastroduod. vředů je 1.5 skupina A má vyšší tendenci k trombóze než 0 např. rel.incidence A:0 trombózy u žen, beroucích PAC je 3.1 dárci KS A mají statisticky vyšší hodnoty f.viii než dárci 0

28 Biologické (netransfuzní) aspekty krevních skupin Infekce mnoho prací korelujících krevní skupiny a infekce rozdílné frekvence AB0 skupin ve světě jsou vysvětlovány vlivem pandemií moru a neštovic cholera, TBC častěji u skupiny 0 lepra častěji u A a B gonorrhoea, Strept.pneum., E.coli častěji u B malárie rezistence u Duffy(null) proto v africké populaci vyselektován tento fenotyp /jinde naprosto raritní/

29 Vyšetřovací metody v imunohematologii erytrocytů SEROLOGICKÉ TESTY Detekce protilátek v séru Detekce erytrocytárních antigenů (fenotyp) DNA TECHNIKY Stanovení genotypu

30 Faktory ovlivňující sílu reakce antigen-protilátka TEPLOTA Protilátky způsobující destrukci erytrocytů in vivo reakční optimum při 37 C IONTOVÁ SÍLA LISS (Low Ionic Strenght Saline) ph KVANTITATINÍ ZASTOUPENÍ ANTIGENU NA POVRCHU ERYTROCYTŮ

31 Jak vyšetřujeme antigeny erytrocytů a protilátky proti nim? Dobré zprávy: erytrocyty jsou červené (odpadá barvení, značení aj.) principy testů jsou jednoduché standardizovaná komerční diagnostika (monoklonální protilátky) usnadňují detekci antigenů Špatné zprávy: antigenů erytrocytů je hodně (více než 200, řazeny do zatím známých 29 systémů, několika kolekcí a individuálně (LFA a HFA) některé důležité antigeny mají variantní a slabé formy protilátky mohou být velmi slabé diagnostické erytrocyty jsou obtížně standardizovatelné

32 Serologické testy SOLNÝ TEST Reakční prostředí = fyziologický roztok Detekce protilátek třídy IgM COOMBSŮV TEST Detekce protilátek třídy IgG Reakce s AGH (ANTIGLOBULINUM HUMANUM) = anti-igg + antic3d PŘÍMÝ COOMBSŮV TEST NEPŘÍMÝ COOMBSŮV TEST ENZYMOVÉ TESTY

33 Reakce antigenu s protilátkou Erytrocyt s antigenem Protilátka proti antigenu - vazba na erytrocyt - aglutinace erytrocytů - ev. aktivace komplementu

34 Přímá aglutinace erytrocytů Průkaz protilátek třídy IgM nebo komplemetem senzibilizovaných erytrocytů in vivo

35 Nepřímý antiglobulinový test Průkaz protilátek třídy IgG KLINICKY VÝZNAMNÉ PROTILÁTKY Použití polyspecifického AGH (ANTIGLOBULINUM HUMANUM) anti-igg; anti-c3d Inkubace při 37 C NEPODKROČITELNÉ MINIMUM!!!

36 Nepřímý antiglobulinový test - princip Sérum se specifickou protilátkou + reagentem promytí

37 Nepřímý antiglobulinový test test-princip Přidané AGH podporuje aglutinaci erytrocytů

38 Enzymové testy Často používané v serologii krevních skupin DOPLŇKOVÉ TESTY PROTEÁZY (BROMELIN, FICIN, PAPAIN) štěpí specificky peptidovou vazbu TRYPSIN, CHYMOTRYPSIN více specifičtější NEURAMINIDÁZY štěpí zbytky kys. sialilové Erytrocyty upravené za pomoci enzymu používány v imunohematologii ke screeningu protilátek a také k jejich následné identifikaci Záchyt aloprotilátek z Rh systému event. rozlišení aloprotilátek ve směsi (enzym-senzitivní antigeny)

39 Enzymový test-princip

40 Enzymový test-princip

41 Sklíčková metoda

42 Zkumavková technika

43 Mirkotitrační plotna

44 Automatizace provozu na TO FNOL

45 Prováděná imunohematologická vyšetření na TO FNOL Předtransfuzní vyšetření Přešetření potransfuzní reakce Kompletní imunohematologické vyšetření Prenatální vyšetření Diagnostika hemolytického onemocnění plodu/novorozence

46 tepelná Specifická aloprotilátka chladová Autoprotilátková reakce Specifická autoprotilátka tepelná chladová Pozitivní protilátkový nález Chladové protilátky PAT pozitvní + autoprotilátky Nespecifické autoprotilátky

47 Předtransfúzní vyšetření Definice Zahrnuje soubor organizačních opatření, laboratorních zkoušek a kontrol prováděných před podáním transfuzních přípravků nebo v situaci, kdy je jejich podání pravděpodobné.

48 Vzorek + žádanka o TP 6 ml K 3 EDTA

49 Typy požadavků Plánovaný požadavek - obvykle na následující den Statim - vyšetření je prováděno mimo rutinní provoz laboratoří, přípravek je vydán do 2 hodin od doručení vzorku na TO Vitální indikace - přípravek je vydán bez testu slučitelnosti (univerzální dárce, popř. stejnoskupinová krev, pokud je k dispozici dřívější vyšetření)

50 Předtransfúzní vyšetření Příjem krevního vzorku + Žádanka o transfúzní přípravky Vyšetření KS AB0 a Rh systému Negativní screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek Výběr vhodného transfúzního přípravku Zkouška kompatibility negativní Výsledek: vydání kompatibilního transfúzního přípravku

51 Předtransfúzní vyšetření - pozitivní protilátkový nález Příjem krevního vzorku + Žádanka o transfúzní přípravky Vyšetření KS AB0 a Rh systému Pozitivní screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek Identifikace nepravidelných antierytrocytárních protilátek Typování relevantních antigenů na erytrocytech pacienta Výběr vhodného transfúzního přípravku Provedení zkoušky kompatibility Výsledek - kompatibilní Výsledek inkompatibilní

52 Interpretace výsledků Kompatibilní erytrocytární transfúzní přípravek: kompatibilita (shoda) transfúzního přípravku (erytrocyty dárce) se sérem příjemce (pacienta) Kompatibilita v AB0 a RhD systému!! Inkompatibilní erytrocytární transfúzní přípravek: inkompatiblita mezi erytrocyty dárce a sérem příjemce Příčiny inkompatibility: - Autoprotilátková reakce - AIHA: INKOMPATIBILNÍ x VITÁLNÍ INDIKACE

53 Specifická aloprotilátka/-ky Specifická aloprotilátka/-ky (tepelná/chladová) - Jasně určená specifita aloprotilátky - Vybrat erytrocytární TP bez přítomnosti antigenu specifické aloprotilátky Klinická závažnost protilátek proti erytrocytům Sepcifita Rh protilátky tky Kell protilátky tky Duffy protilátky tky Kidd protilátky tky Anti-S, -s Anti-A1, A1, -P1, -N Anti-M M (chladové povahy) Anti-M M (reagující při i 37 C) Anti-Le a, -Le Anti-Le b Le a+b Klinická záva važnost ANO ANO ANO ANO ANO VZÁCN CNĚ VZÁCN CNĚ NĚKDY ANO VZÁCN CNĚ NE

54 Platnost předtransfúzního vyšetření 72 hodin od odběru vzorku (vzhledem k riziku možné imunizace) V případě dokřížení dalšího TP lze použít jen 48 starý krevní vzorek (vzorek starší než 48 hodin nemusí poskytnout validní výsledek na sloupcové aglutinaci)

55 Výdej požadovaných transfúzních přípravků Expedice vydává na základě požadavku kliniky transfúzní přípravky pracovníkovi, který doručí žádanku na výdej transfúzního přípravku Pro transport jednotlivých přípravků musí být použit termobox CAVE: pro různé typy přípravků je nutno použít různé termoboxy!!!

56 Kompletní imunohematologické vyšetření Kompletní imunohematologické vyšetření je indikováno v případě klinického podezření na diagnózu AIHA (autoimunní hemolytická anemie), dále je toto vyšetření prováděno na doporučení lékaře TO FNOL ( např. při nálezu pozitivity PAT a autoprotilátek).

57 Kompletní imunohematologické vyšetření - princip Základní princip: Imunohematologická laboratorní diagnostika autoimunitní hemolytické anemie se skládá z těchto laboratorních vyšetření: Screening nepravidelných tepelných(chladových) antierytrocytárních protilátek a autoprotilátek Přímý antiglobulinový test na průkaz vazby antierytrocytární autoprotilátky na vlastní erytrocyty pacienta Eluční test z erytrocytů pacienta Průkaz volné antierytrocytární protilátky a určení její specifity tzv. autoabsorpční test

58 Prenatální vyšetření Perinatální vyšetření lze rozdělit na: Vyšetření před porodem (prenatální, antenatální vyšetření) Vyšetření po porodu (postnatální vyšetření) Přešetřujeme: AB0 RhD (pozor D weak/variant- imunoprofylaxe matky) Screening nepravidelných tepelných antierytrocytárních protilátek a autoprotilátek Idnetifikace + stanovení titru

59 Prenatální vyšetření - význam Smyslem souboru perinatálních imunohematologických vyšetření je včasné odhalení fetomaternální inkompatibility, která představuje rizikový faktor pro zdravý vývoj plodu a novorozence a může vyústit v závažné klinické postižení, kterým je hemolytické onemocnění novorozence. V krajních případech může vést až ke vzniku fetálního hydropsu a intrauterinní smrti plodu. Včasná a přesná diagnostika je proto nezbytně nutná pro volbu optimální terapeutické strategie.

60 Účel prenatálního a postnatálního vyšetření CÍL: prevence HON ÚČEL: určení potenciálně rizikových těhotných z hlediska HON

61 Hemolytické onemocnění plodu/novorozence Patří mezi závažné stavy v perinatologickém období Potupy pro prenatální a postnatální vyšetření jsou v ČR jsou nejednotné Nutno zavést jednotný algoritmus pro přešetřování imunohematologického testování v těhotenství a po porodu

62 Erytrocytární aloimunizace v těhotenství Aloimunizace matky Transplacentární přenos protilátek do fetálního krevního řečiště Imunní destrukce senzibilizovaných krevních buněk Klinická manifestace fetální cytopenie

63 Klinicky významné protilátky Anti-D, -c, -K, -E, -C, -e, -Ce, -ce, -Fy(a), -Jk(a) Anti-A, anti-b Těhotné s prokázanými klinicky významnými protilátkami by měly být sledovány ve speciálním režimu optimálně definovaném konsensuálním názorem příslušných odborných společností.

64 Klinicky nevýznamné protilátky Anti-P1, -Le(a), -Le(b), -H, -I, -HI, -N, - Lutheran Protilátky reagující s celým panelem diagnostických erytrocytů i s vlastními erytrocyty (panspecifické protilátky) Chladové protilátky Protilátky reagující pouze v enzymových testech

65 Zvažovat individuálně Anti-S, -s, -M, -Cw, -Ex, -Fy(b), -k, - Kp(a,b), -Js(a,b), -PP1Pk, -U, Jk(b), - Tj(a), -Yt(a), -LW, -Diego /Di(b)/, - Gerbich, -Wr(a), -Jr(a)

66 DĚKUJI ZA POZORNOST