SUMMARY OF RESEARCH ACTIVITIES ON THE PROJECTS OF LEAGUE AGAINST CANCER PRAGUE IN LABORATORY OF METALLOMICS AND NANOTECHNOLOGIES.

Transkript

1 1 SUMMARY OF RESEARCH ACTIVITIES ON THE PROJECTS OF LEAGUE AGAINST CANCER PRAGUE IN LABORATORY OF METALLOMICS AND NANOTECHNOLOGIES Ondřej Zítka

2 Liga proti rakovině (LPR) /League against cancer/ 2 Nonprofit organization established in 199, by prof. Zdeněk Dientstbier 12 Activities for the main aim decreasing of mortality caused by cancer i Czech Republic: Prevention for cancer diseases Day against cancer, Antismoking programs, Exhibitions, Symposium for World Cancer Day Improoving of the quality of life of oncopatients Acces to the informations about the illnes and the consultations (cancer telephone line), Recondition stay, financial support to oncology centres Support of oncology research and instrumental equipment of oncology workplaces

3 European union context - Europe against cancer 3 Between years 1986 the establishing countries of Europen union made a program Europe against cancer which has been covered by Association of European Leagues (ECL). The number of member of ECL was groving after The Iron curtain fall. Program Europe angainst cancer influenced an incidence and contributed to decrease of come types of cancer. Against the assumed numbers ther was decrease about 92. of death cases in EU (concerning mainly the cancer of lungs and stomach). Based on the results of this activities there was published New codex of prevention in 3 in Brusels.

4 History of our LPR projects Studium hladiny metalothioneinu u pacientů se zhoubnými nádory a zdravých dobrovolníků (René Kizek) 8 - Bioanalytické možnosti monitorování oxidačního stresu u pacientů se zhoubnými nádory (René Kizek) 1 - Sarkosin, α-metylacyl-coa racemáza, prostatický specifický antigen a metalothionein jako nádorové markery u karcinomu prostaty, studie na nádorových buněčných liniích (Vojtěch Adam) 11 - Význam zinku v nádorových onemocněních. Studium distribuce zinku v proteomu buněčných linií a krevního séra (Soňa Křížková) 12 - Moderní nástroje zobrazování cíleného transportu protinádorových léčiv (Markéta Vaculovičová) 13 - Sledování interakce protinádorového léčiva doxorubicinu s aminokyselinami (Ondřej Zítka) 14 - Kombinovaná terapie karcinomu plic využívající chytrých nanotechnologií (Zbyněk Heger) 15 - Plošný screening hladiny sarkosinu v moči a jeho využitelnost pro včasnou diagnostiku nádorů prostaty (Zbyněk Heger)

5 6 Studium hladiny metalothioneinu u pacientů se zhoubnými nádory a zdravých dobrovolníků VA Stand VA Trace Analyzer Zpracování dat (b) Měřící elektronika (a) Vyhodnocení dat (c) 3 cysteinylová skupina doména těžký kov doména Lokalizace: Laryngx Věk: 61 let Pohlaví: muž Lokalizace: Orofaryngx Věk: 63 let Pohlaví: muž Lokalizace: Laryngx Věk: 52 let Pohlaví: muž Lokalizace: Laryngx Věk: 73 let Pohlaví: žena 3 na RS 2 Co E / V cat1 cat2 Koncentrace MT (µm) Četnost výskytu (n) o-52 o Průměrné obsahy metalothioneinu u pacientů se zhoubnými nádory v oblasti hlavy a krku Průměrný pás souboru pod 5 do 5 do 15 do do 45 nad 45 Koncentrace MT (µm) o-143 o-89 r-12 o-26 o-173 o-138 o-35 o-159 o-164 Analyzovaný vzorek nádorové tkáně o-38 o-63 o-81 o-128 o-146 t-151 o-44 o-17 o-19 o-64 o-147 o-149 o-99 r-19 r-21 o-78 o-152 r-17

6 8 Bioanalytické možnosti monitorování oxidačního stresu u pacientů se zhoubnými nádory 6.no data available

7 1 - Sarkosin, α-metylacyl-coa racemáza, prostatický specifický antigen a metalothionein jako nádorové markery u karcinomu prostaty, studie na nádorových buněčných liniích 7 46 vybráno * 6 kontrol málo-diferencovaný acinární adenokarcinom prostaty středně-diferencovaný acinární adenokarcinom prostaty acinární adenokarcinom prostaty zdraví muži n =, věk 62.5 ± 8.3, 2 kuřáci, 1 bývalý kuřák, 1 PSA fyziologická, 5 PSA šedá zóna, 5 PSA patologická n = 14, věk 63.1 ± 4.1, 1 kuřáci, 2 bývalý kuřák, 5 PSA fyziologická, 5 PSA šedá zóna, 4 PSA patologická n = 12, věk 63.8 ± 7.4, 3 kuřáci, 2 bývalý kuřák, 3 PSA fyziologická, 6 PSA šedá zóna, 3 PSA patologická n = 6, věk 56.7 ± 5.3, kuřáci, 6 PSA fyziologická málo-diferencovaný acinární adenokarcinom prostaty středně-diferencovaný acinární adenokarcinom prostaty acinární adenokarcinom prostaty Komorbidity: HN 9, HLP 4, ISCH 1, Glaucoma, DM, PAD, Žádné komorbidity 4 Komorbidity: HN 8, HLP 4, ISCH 1, Glaucoma 1, DM, PAD 1, Žádné komorbidity 2 Komorbidity: HN 7, HLP 3, ISCH 1, Glaucoma 1, DM, PAD 1, Žádné komorbidity 1 *6 pacientů bylo ze studie vyřazeno z důvodu nedostatečných informací HLP Hyperlipidemie, HN Hypertenze, IHD - Ischemická choroba srdeční, DM - Diabetes mellitus, PUD Žaludeční vřed, PAD - Onemocnění periferních tepen, ICHDK Okluzivní onemocnění periferních tepen

8 MT (µm) tpsa (ng/ml) tpsa (ng/ml) 1 - Sarkosin, α-metylacyl-coa racemáza, prostatický specifický antigen a metalothionein jako nádorové markery u karcinomu prostaty, studie na nádorových buněčných liniích 8 16 A C 12 8 pacienti B kontrola pacienti kontrola.5 kontrola pacienti MT (µm)

9 A B Význam zinku v nádorových onemocněních. Studium distribuce zinku v proteomu buněčných linií a krevního séra 9 kda Mr NBHR HL MB OS ES NF NB 75 5 kda Mr NBHR HL MB OS ES NF NB C Vlevo: Distribuce volného Zn 2+ (a-e) a thiolových sloučenin (f-j) v liniích PNT1A (A) a 22RVl (B). Nahoře: Stanovení exprese MT1A (A) a MT2A (B) v liniích PNT1A a PC3 kultivovaných po dobu 24 h v přítomnoti,, 5, 75 a 1 µm Zn 2+ pomocí real-time RT- PCR. Celková hladina MT transkriptů v buňkách vystavených µm Zn 2+ (C), relativní hladiny transkriptů MT1A a MT2A v buňkách vystavených µm Zn 2+ (D). Obsah MT v buňkách stanovený pomocí elektrochemie (E) a pomocí western-blotu (F). 37 Vlevo: Reprezentativní a) western-bloty b) ilustrující okem pozorovatelné c) rozdíly mezi jednotlivými diagnosami NBHR neuroblastom HR, HL Hodgkinův lymfom, B meduloblastom, OS osteosarkom, ES Ewingův sarkom, NF Fig.4 Examples of decision trees created from data representing aggregated characteristics of nefroblastom, NB neuroblastoma (A). Typická membrána s náhodně the brightness curves of studied samples. Western blotting was applied to produce two 15 ditribuovanými vzorky (B). Příklady převedení obrazové informace do brightness curves for each sample one resulted from incubation with anti-mt and the grafu, 1 other with kde anti na Zn ose chicken x je primary molekulová antibody. hmotnost Those coefficients a na ose y appearing intenzita in the jasu nodes (C). of Nahoře: the tree Příklady with prefix rozhodovacích Zn correspond to stromů anti-zn vytvořených incubation, the z analyzovaných remaining coefficients dat ilustrující odlišení skupiny correspond blastomu to a treatment Ewingova with sarkomu. anti-mt. : A) Left: Representative western-blot of the blood serum samples with anti-mt antibody, right: Výzkum v oblasti studia role zinku v nádorových onemocněních a jeho distribuce v proteomu je rozvíjející se oblastí bioanalytické chemie. Studovali vliv zinku na buněčné linie karcinomu prostaty a distribuci zinku v proteinech krevního séra. Ve srovnání s kontrolními buněčnými liniemi vykazovaly nádorové linie odlišnou distribuci zinku a thiolových sloučenin a v závislosti na expozici Zn 2+ vykazovaly odlišnou expresi MT a pro- a antiapoptotických faktorů. V případě analýzy séra pacientů se solidními nádory dětského věku jsme zjistili, že elektroforetické profily MT a zinkových proteinů jsou odlišné od séra zdravých jedinců a tyto změny je možné detekovat pomocí automatizované analýzy.

10 5 12 -Moderní nástroje zobrazování cíleného transportu protinádorových léčiv A A) Schéma sestavy pro fluorescenční zobrazování ex vivo perfundovaného potkaního srdce (1 kyslík, 2 Tyrodův roztok, 3 termostat, 4 peristaltická pumpa, 5 stojánek pro uchycení srdce, 6 potkaní srdce, 7 vysoce-citlivý fluorescenční detektor, tělo In vivo fluorescenčního zobrazovacího přístroje B ohřívaný a okysličený Tyrodův roztok In vivo fotografie (proložení X-ray a fluorescenční fotografie) perfundovaného potkaního srdce peristaltická pumpa Z důvodu relativně vysoké toxicity cytostatických léčiv, vedoucí k závažným vedlejším účinkům, je vysoká snaha nalézt metody a postupy snižující negativní dopady na organismus pacienta při současném zachování terapeutického účinku. Jedním ze způsobů dosažení tohoto požadavku je mimo jiné využití nanotransportérů prezentovaných v této práci. Díky nim je transport léčiva šetrnější a nežádoucí vliv na zdravou tkáň je omezen. V této práci bylo ukázáno, že jak bílkovinný transportér apoferritin, tak fospolipidové přenašeče lipozomy Dokáží efektivně enkapsulovat vybrané cytostatikum a cíleně jej uvolnit v požadovaném místě působení.

11 13 - Sledování interakce protinádorového léčiva doxorubicinu s aminokyselinami 11 C B 3 2 b 1 5 Concenctration of doxorubicin [μg.ml-1] 1 5 Liposome Liposome Lipo 1 +SDS * Lipo 1 * Lipo 9 +SDS * 12.5 Lipo 9 * E a liposome 1 Tisíce * liposome 9 Lipo 8 +SDS 4 liposome 8 Cholesterol Concentration doxorubicine [µg.ml-1] 5 Phospholipid bilayer Fluorescence intensity [13a.u.] D Average concentration of cholesterol [mmol.l-1] Doxorubicin Lipo 8 A Liposome 1 With SDS 12,5 5 12,5 5 Concenctration of doxorubicin [μg.ml-1]

12 14 - Kombinovaná terapie karcinomu plic využívající chytrých nanotechnologií 12 Vytvoření stealth PEG-MWCNT modifikovaných VP16 a fosforothioátovými antisense oligodeoxynukleotidy (duplex se start kodonem mrna apoptózu inhibující proteinu Bcl-2), Komparace vlivu na SCLC a NSCLC (karcinom plic) NSCLC vysoce chemoresistentní linie (chemoresistence z velké míry závislá právě na Bcl-2) Aplikace SCLC Kintetika uvolňování antisense a VP16 v PBS a acetátovém pufru Aplikace NSCLC

13 Plošný screening hladiny sarkosinu v moči a jeho využitelnost pro včasnou diagnostiku nádorů prostaty Dovybavení laboratorního vybavení Investiční náklady - část na pořízení majetku AAA-5 s VIS a fluorescenčním detektorem Agilent Studium nízkomolekulárních metabolitů v moči pacientů s nádorovými onemocněními prostaty

14 Acknowledgement 6 grant agency Liga proti rakovině Praha colleagues from Laboratory of Metallomics and Nanotechnologies.

15 Thank you for your attention 15