VÝVOJ ANTIBIOTICKÉ CITLIVOSTI U ENTEROBAKTERIÍ Z POŠEVNÍCH STĚRŮ

Transkript

1 Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta VÝVOJ ANTIBIOTICKÉ CITLIVOSTI U ENTEROBAKTERIÍ Z POŠEVNÍCH STĚRŮ Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Ondřej Zahradníček Autorka: Aneta Zapletalová Brno, duben 2010

2 Jméno a příjmení autora: Aneta Zapletalová Název bakalářské práce: Vývoj antibiotické citlivosti u enterobakterií z poševních stěrů Pracoviště: Mikrobiologický ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Ondřej Zahradníček Rok obhajoby bakalářské práce: 2010 Souhrn: Cílem naší práce bylo zjistit, zda se nějakým zásadním způsobem vyvíjela rezistence poševních kmenů Escherichia coli na antibiotika, na která je tato bakterie běţně zkoumána na Mikrobiologickém ústavu FN USA. Pouţili jsme 201 vzorků od 193 pacientek a výsledek byl negativní, coţ znamená, ţe úroveň antibiotické rezistence u poševních kmenů Escherichia coli v období let 2007 aţ 2010 významně nestoupl. Klíčová slova: enterobakterie, Escherichia coli, záněty pochvy, vývoj antibiotické citlivosti Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Ondřeje Zahradníčka a uvedla v seznamu literatury všechny pouţité literární a odborné zdroje. V Brně dne

4 Prostřednictvím této stránky bych ráda poděkovala zejména vedoucímu mé bakalářské práce MUDr. Ondřeji Zahradníčkovi, a to za velkou pomoc při řešení jakýchkoli problému spjatých s touto prací, za milé jednání, přizpůsobivost a v neposlední řadě za cenné rady při psaní jak teoretické tak praktické části této bakalářské práce. Také děkuji všem pracovníkům Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice U Svaté Anny v Brně za vstřícné chování.

5 Obsah: 1. Úvod Cíl práce Obecná charakteristika enterobakterií Klasifikace Morfologie Biochemické vlastnosti Antigenní struktura O-antigeny H-antigeny K-antigeny Patogenita Laboratorní diagnostika Mikroskopie Kultivace Biochemická identifikace Zjišťování citlivosti na antibiotika Onemocnění u člověka Terapie Escherichia coli Obecné vlastnosti Morfologie a biochemie Patogenita Patogenita ve střevě Patogenita mimo střevo Antibiotika a citlivost bakterií na ně Obecné vlastnosti antimikrobiálních látek Stanovení citlivosti na antimikrobiální látky Kvalitativní testy Kvantitativní testy Zjišťování faktorů rezistence Genotypové metody zjišťování citlivosti/rezistence Záněty pochvy Význam a charakteristika poševních zánětů... 31

6 5.1.1 Mikroflóra pochvy Fyziologie poševního ekosystému Poševní infekce, jejich diagnostika a léčba Typy poševních infekcí Diagnostika Léčba Bakteriální kolpitida Klinický obraz Diagnostika Terapie Charakteristika práce v laboratoři STD (MÚ FNUSA) Odběr, transport a příjem materiálu Vyšetření sexuálně přenosných chorob (STD) Opatření pro nepracovní dny Validace zkoušky Provedení zkoušky Očkování půd vzorek z půdy AMIES Očkování půd CAT SWAB Kultivace půd Sklíčko Odečet výsledků Interpretace Materiály, metody a soubor pacientek Materiály ke kultivaci Escherichia coli na STD Chemikálie Přístroje a pomocná zařízení Metody ke kultivaci Escherichia coli na STD Stanovení citlivosti Escherichia coli k antibiotikům Principy zkoušek Chemikálie a spotřební materiál Přístroje a pomocná zařízení Postup zkoušek Odečet výsledků LIS Medlab Soubor pacientek Charakteristika odesílajících pracovišť... 49

7 7.5.2 Rozdělení souboru dle diagnóz Charakteristika souboru z hlediska nálezů dalších patogenů Výsledky Vlastní porovnání citlivosti kmenů Escherichia coli Další poznatky v souvislosti s analýzou souboru Diskuse Závěr Použitá a doporučená literatura... 60

8 Použité zkratky: MIC minimální inhibiční koncentrace MBC minimální baktericidní koncentrace MH agar Muellerův-Hintonové agar MOP mikrobiální obraz poševní ATB antibiotikum STD sexuálně přenosné choroby SOP standardní operační postup LIS laboratorní informační systém KA Krevní agar ENDO Endova půda Č3 Čokoládový agar bez antibiotik GC Čokoládový agar s antibiotiky SABA šikmý Sabouraudův agar s antibiotiky GVA půda pro diagnostiku G. vaginalis VLA VL-agar SAGB selektivní bujon pro screening S. agalactiae G gramnegativní G+ grampozitivní NaCl chlorid sodný PC počítač NRL Národní referenční laboratoř MÚ Mikrobiologický ústav FNUSA Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně SZÚ Státní zdravotní ústav JIP jednotka intenzivní péče ARO anesteziologicko-resuscitační oddělení IMC infekce močových cest DCM dolní cesty močové HCM horní cesty močové DC desoxycholát-citrátový agar XLD agar s xylózou, lyzinem a deoxycholátem MAL agar pro salmonely L + laktóza pozitivní L laktóza negativní

9 KO SONO IMC HIV CAT URUR MYHO krevní obraz sonografie (ultrazvuk) infekce močových cest z angl. Human Immunodeficiency Virus, virus lidské imunitní nedostatečnosti Candida and Trichomonas (transportní půda pro diagnostiku kvasinek a trichomonád) půda pro Ureaplasma urealyticum půda pro Mycoplasma hominis

10 1. Úvod Enterobacteriaceae je čeleď řazená mezi nejdůleţitější gramnegativní tyčinky. Za normálních okolností se vyskytují ve střevě člověka, kde jsou patogenní pouze v případě přemnoţení, nebo pokud se jedná o některého z primárních patogenů, např. salmonelu. Stejně jako i jiné bakterie je můţeme rozdělit na primárně patogenní, potenciálně patogenní a nepatogenní bakterie. Nepatogenní bakterie se v organismu adaptují a nevyvolávají ţádné infekce, naopak mu pomáhají zabezpečovat různé funkce. Potenciální patogeny se mohou uplatnit jako původci onemocnění zejména v případě, ţe jedinec má imunitní systém v nějakém směru dysfunkční nebo defektní, ale také v případě, ţe se ocitnou mimo místo svého normálního výskytu, tj. střevo. Primárně patogenní mikroorganismy se mohou stát původci infekčních chorob i v případě osob s normální imunitou, a to zpravidla přímo ve střevě. V rámci této práce nás zajímá především potenciálně patogenní bakterie Escherichia coli, která je ve svém přirozeném prostředí, ve střevě, velice zdraví prospěšná. V pochvě však můţe být nebezpečným patogenem, byť i tam můţe jít o pouhou kolonizaci. V současné době je k dispozici mnoho moderních metod, které umějí izolované mikroby přesně identifikovat. Escherichia coli, která je běţným způsobem v laboratoří STD vykultivována z poševních výtěrů a identifikována, je dále podrobena testu citlivosti na antibiotika. Zpravidla se jedná o základní sestavu sedmi antibiotik, výjimečně doplněnou o další antibiotika. 1.1 Cíl práce V současné době u Escherichia coli (a samozřejmě nejen u ní) přibývá rezistence na různá antibiotika či skupiny antibiotik. Vývoj rezistence je intenzivně sledován zejména u závaţných kmenů z hemokultur či ran a obecně u závaţných pacientů, hospitalizovaných na odděleních ARO, chirurgiích či různých jednotkách intenzivní péče. Trochu stranou přitom zůstávají kmeny poševní, zřejmě proto, ţe jimi způsobené infekce jsou zřídka ţivot ohroţující. To však neznamená, ţe by nebyly významné, třeba i proto, ţe i pouhé poševní nosičství se můţe stát zdrojem další (třeba i endogenní) infekce. Cílem této práce je proto zjistit, zda se nějakým zásadním způsobem vyvíjela rezistence poševních kmenů Escherichia coli na antibiotika, na která je tato bakterie běţně zkoumána na Mikrobiologickém ústavu FN USA a která jsou také běţně pouţívána k léčbě. Výsledky budou vyuţity v rámci poradenské činnosti ohledně antibiotické terapie. 10

11 2. Obecná charakteristika enterobakterií 2.1 Klasifikace Enterobakterie řadíme do čeledi Enterobactericeae, která zahrnuje gramnegativní nesporulující fakultativně anaerobní tyčinky. Většina z těchto bakterií je schopná pohybu, a to pomocí peritrichálních bičíků. Název této třídy lze odvodit od řeckého enteron střevo, coţ naznačuje, ţe právě střevo je nejpřirozenějším ţivotním prostředím pro většinu enterobakterií, a to střevo nejen člověka, ale i jiných obratlovců. Mezi enterobakterie patří i bakterie, která má velký význam nejen v klinické mikrobiologii, ale i v jiných mikrobiologických oborech (například jako modelový organismus), druh Escherichia coli. Enterobakterie se běţně vyskytují volně v prostředí a jsou rozšířeny na celém světě, nacházejí se v půdě, ovoci, zelenině, vodě, kvetoucích rostlinách, zrnech i stromech, ale také na tělech ţivočichů, a to i bezobratlých (například hmyzu). Mnoho druhů je patogenních pro člověka, ale také pro zvířata, hmyz i rostliny. V jejich patogenitě existují značné rozdíly. Většina enterobakterií roste na jednoduchých kultivačních půdách, mají jak fermentativní, tak i respiratorní typ metabolismu. Při fermentaci často tvoří plyn a ze sacharidů kyseliny. Jsou kataláza pozitivní a (s výjimkou rodu Plesiomonas) oxidáza negativní. Patří mezi mezofilní bakterie, rostou v teplotním rozmezí zhruba mezi C, optimální teplotou je 37 C. Netvoří endospory ani cysty. V dnešní době je charakteristika a dělení enterobakterií zaloţena na fenotypickém a genotypickém základě. Například bakterie nefermentující laktózu byly zařazeny do rodů Salmonella a Shigella. V současné době došlo k mnoha taxonomickým změnám u enterobakterií, popsány byly nové rody a řada dalších druhů. V čeledi Enterobactericiae je nyní vytvořeno 42 rodů (Bergey's manual 2001), kromě výše jmenovaných, jsou významné rody např. Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter, Morganella, Plesiomonas, Yersinia, Proteus, aj. Fenotypem nejblíţe enterobakteriím jsou členové čeledí Vibrionaceae a Pasteurellaceae, ale také jiné, tzv. nefermentující tyčky, jejichţ metabolismus je pouze respiratorní. Pro přehlednost klasifikace přikládám tabulku taxonomické hierarchie enterobakterií. Doména: Bacterie (Bacteria) Kmen: Proteobacteria Třída: Gamma Proteobacteria Řád: Enterobacteriales Čeleď: Enterobacteriaceae Tabulka č. 1: Vědecká klasifikace enterobakterií, Zdroj : Sedláček,

12 2.2 Morfologie Tato skupina gramnegativních tyčinek bakterie, jejichţ buňky jsou cca 0,6 µm široké a 2 aţ 3 µm dlouhé, některé rody však mohou vytvářet i delší vláknité formy (u všech rodů se také vyskytují vláknité formy za určitých okolností, např. v přítomnosti betalaktamového antibiotika). Na druhou stranu mohou být také krátké aţ kokobacilární. Všechny rody kromě rodů Klebsiella a Shigella, ale také druhu Yersinia pestis, jsou pohyblivé. Jejich bičíky jsou umístěny peritrichálně. Na svém povrchu mají enterobakterie různé typy fimbrií. Jedny z nich jsou ve velkém počtu zastoupeny na povrchu buňky a zprostředkovávají adhezi na druhou hostitelskou buňku. Druhé, které se nazývají sex pili, se nacházejí na bakteriální buňce v menším počtu a umoţňují vazbu při konjugaci mezi donorem a recipientem. Některé druhy mohou tvořit pouzdra. Morfologicky se enterobakterie nejenţe velice málo liší od sebe navzájem, ale také jsou podobné jiným gramnegativním tyčinkám, coţ výrazně sniţuje důleţitost studování jejich morfologie v diagnostice. Obrázek č. 1: Escherichia coli pod elektronovým mikroskopem Zdroj : Amstelveenweb, Biochemické vlastnosti Jak uţ bylo zmíněno v úvodu této kapitoly, enterobakterie jsou většinou kataláza pozitivní a oxidáza negativní. Biochemicky jsou značně aktivní, převládajícím typem metabolismu je fermentace. Tím je můţeme odlišit od nefermentujících tyčinek, které 12

13 zpravidla nefermentují cukry, zejména glukózu. Také mezidruhově se eneterobakterie mohou lišit svými biochemickými vlastnostmi, např. parazitické druhy (shigely, salmonely) jsou ve většině případů méně aktivní, saprofytické naopak aktivnější. Některé enterobakterie jsou schopné vázat molekulární dusík (N 2 ). Této schopnosti však vyuţívají pouze v nouzi a pro klinickou mikrobiologii jde o bezvýznamnou vlastnost. 2.4 Antigenní struktura Charakteristickou sloţkou všech enterobakterií je lipopolisacharidový komplex (endotoxin). Skládá se z hydrofilní polysacharidové komponenty, která je tvořena O specifickým polysacharidem spojeným s korovým oligosacharidem a hydrofobním lipidem A, který je zodpovědný za účinek endotoxinu. (Bednář 1996) O-antigeny Enterobakterie mají tři základní typy antigenů, a to O, H a K, a další typy. Původ jména těchto antigenů pochází z německého ohne Hauch (vysvětlení viz dále u H antigenů). Také se jim říká tělové antigeny. Umoţňují serotypizaci v rámci rodu, existuje velký počet O-specifických řetězců, lišících se od sebe svým sloţením. Jsou termostabilní a jejich vlastnosti jim zůstanou i při vaření. Jednotlivé antigenní typy této skupiny se zpravidla značí čísly (např. O55, O111 apod.). (Votava 2003) H-antigeny Původ jména H-antigenů pochází z německého der Hauch, jelikoţ povlak pohyblivých proteů na agaru připomínal zadýchané sklo. Patří mezi antigeny bičíkové a vyskytují se pouze u pohyblivých druhů enterobakterií. Jsou proteinové povahy, konkrétně jsou tvořeny bílkovinou flagelinem. Antigeny této skupiny se obvykle značí malými písmeny (např. m). K-antigeny Jsou kyselé povahy, mají prokazatelnou úlohu v patogenitě. Polysacharidové K-antigeny jsou antigeny pouzdra, mohou se uplatnit jako faktory virulence, ale v rámci diagnostiky jsou relativně málo významné. sliznic. Polypeptidické K-antigeny, nebo-li také fimbriální antigeny se účastní na kolonizaci 13

14 Obrázek č. 2: Lipopolysacharidový komplex Zdroj: Microbiology, Patogenita Mezi nejdůleţitější faktory patogenity enterobakterií se řadí tzv. lipopolysacharidproteinový komplex, fimbrie, cytotoxiny a enterotoxiny. Některé druhy enterobakterií mají komplex faktorů patogenity umoţňující jejich průnik přes sliznici. Můţeme je označit jako skupinu invazivních druhů (např. yersinie a salmonely). Jiné druhy, které postrádají tento komplex, se mnoţí jen v epitelárních buňkách a nepronikají tak do větší hloubky (sem patří např. shigely). Endotoxin se uplatňuje aţ při samotném rozpadu bakterie. V jiných případech se mohou některé druhy, které jsou vybaveny fimbriemi a dalšími adheziny, navázat na povrch buněk a poté produkovat cytokiny. 2.6 Laboratorní diagnostika K vyšetření na průkaz enterobakterií se zasílá nejen stolice, ale také moč, duodenální šťáva, krev, likvor, hnis, kloubní punktát, poševní stěry. Odolnost vůči zevním vlivům se u různých druhů enterobakterií liší. Některé jsou výrazně vázány na střevo (Enterobacter), jiné můţeme nalézt i mimo střevo (Klebsiella) a další jsou ţivotu přizpůsobeny lépe jinde neţ ve střevě (Serratia) Mikroskopie Jak jiţ bylo zmíněno v úvodu kapitoly, mikroskopické vyšetření enterobakterií nemá pro laboratorní diagnostiku příliš velký význam. Můţe však mít význam diferenciálně diagnostický v rámci prvotního rozlišení. V Gramově barvení jsou ovšem enterobakterie morfologicky nerozlišitelné např. od pseudomonád. 14

15 2.6.2 Kultivace Laboratorní diagnostika enterobakterií je zaloţena zejména na kultivačním průkazu s pomocí půd jak diagnostických, tak selektivních. Existuje např. mnoho půd určených k diagnostice salmonel (agar DC, XLD, MAL aj.). V poslední době vyuţívají zejména bohatší a větší laboratoře chromogenní agary, v nichţ je chromogenní substance vázána na specifický substrát mikroby, které substrát štěpí, přitom vpravují chromogen do buňky, takţe pak rostou v barevných koloniích. (Votava a kol., 2003) Jsou poměrně nenáročné, rostou na většině půd, mimo jiné na Endu a MH agaru. Z klinicky významných bakterií rostou na Endu jen enterobakterie, gramnegativní nefermentující tyčky a příslušníci čeledi Vibrionaceae. Ostatní dvě skupiny můţeme od enterobakterií rozlišit pomocí biochemických testů. Čeleď Vibrionaceae má narozdíl od enterobakterií pozitivní oxidázu a nefermentující zase nefermentují glukózu. Endova půda slouţí v případě enterobakterií také k orientačnímu rozlišení obligátních patogenů (většinou L-) a potenciálních patogenů (zpravidla L+). To se ovšem týká především patogenity ve střevě, nikoli mimo střevo. Obrázek č. 3: Klebsiella pneumonie na Endově agaru Zdroj: FVL, praktika z veterinární mikrobiologie, Biochemická identifikace Enterobakterie vykazují velmi pestrou biochemickou aktivitu. Biochemických testů se vyuţívá k identifikaci podezřelých kolonií. Nejčastěji se pouţívají ty nejjednodušší, které představují kombinované diagnostické půdy (agar podle Hajny, biochemický klín). V poslední době jsou mnohé z biochemických testů automatizovány, buďto interpretace výsledků nebo i čtení vlastního testu. 15

16 Mezi základní biochemické aktivity enterobakterií patří schopnost fermentace glukózy, pozitivní katalázová reakce, negativní oxidázová reakce (jak jiţ bylo řečeno, výjimku tvoří teprve nedávno k enterobakteriím přiřazený rod Plesiomonas) a schopnost redukce nitrátů na nitrity. Dobrým pomocníkem při určení některých vlastností je Švejcarova plotna, která slouţí k identifikaci bakterií neštěpících laktózu. Jelikoţ bakterie, které laktosu štěpí, zbarví celou Endovu půdu, nelze poté hodnotit štěpení manitolu a sacharózy. Fermentaci glukózy lze dokázat pomocí Hajnovy půdy, která po kultivaci zůstává celá červená, vůbec nezmění barvu. K podrobnější analýze lze pouţít kombinované biochemické testy, v našich podmínkách nejčastěji ENTEROtest 16 nebo ENTEROtest 24 firmy Pliva-Lachema. Obrázek č. 4: Výsledky oxidázového testu Zdroj: Atlas, Medmicro, Zjišťování citlivosti na antibiotika Důleţitou součástí diagnostiky enterobakterií je také zjišťování citlivosti na antibiotika. Citlivost se však zásadně neurčuje u kmenů ze stolice, jelikoţ aţ na výjimky je pouţití antibiotik v tomto případě kontraindikováno, protoţe prodluţuje dysmikrobii a tím i dobu vylučování patogena ze střeva. Určuje se tedy zejména u kmenů izolovaných z jiných materiálů, coţ je nejčastěji moč, ale mohou to být také např. poševní výtěry, materiál z dýchacích cest, z ran, hemokultury, mozkomíšního moku apod. 2.7 Onemocnění u člověka Enterobakterie jsou schopné vyvolat onemocnění epidemického, ale i endemického charakteru, zejména v rozvojových zemích, kde se vyskytuje různě kontaminovaná potrava a voda. Přenos infekce se uskutečňuje nejčastěji fekálně orální cestou, ale také přes předměty či kapénkovou cestou vzduchem na kratší vzdálenosti. 16

17 Primárně patogenní druhy vyvolávají klasická onemocnění s typickým průběhem (břišní tyfus, bacilární úplavice). Podmíněně patogenní druhy se zpravidla v zaţívacím traktu uplatňují jen výjimečně, při hrubém porušení ekologie střevní flory. Vyvolávají onemocnění především močového traktu (Escherichia coli, Proteus, Klebsiella), sepse (Proteus, Serratia), meningitidy (Escherichia coli, Klebsiella). (Bednář 1996) Infekce mohou být exogenní (například z kontaminované potravy) nebo endogenní, coţ jsou infekce přímo ze zaţívacího traktu. Zvláštním případem exogenních infekcí jsou infekce iatrogenní, kdy se enterobakterie dostávají do těla při lékařském zákroku (instrumentálním vyšetření či chirurgickém výkonu). U novorozenců, kojenců a také u starých osob jsou časté sepse, které jsou způsobené enterobakteriemi. K nejzávaţnějším stavům, které enterobakterie mohou způsobit, patří meningitidy, rizikové zejména u kojenců a novorozenců Terapie Jak uţ bylo řečeno, antibiotika se pouţívají zpravidla jen u infekcí lokalizovaných mimo střevo. Příčinou je zejména skutečnost, ţe antibiotika zpravidla nepůsobí pouze na patogena, ale také na běţnou floru. U střevních infekcí se při léčbě zabýváme zejména léčbou příznaků. Při velkých ztrátách tekutin z příčiny průjmů je důleţitá zejména rehydratace a podání aktivního uhlí k adsorpci případných toxických substancí, případné téţ pouţití tzv. střevních dezinficiencií (např. Endiaron). Infekce lokalizované mimo střevo se léčí pomocí antibiotik. Příklad moţných sestav pro antibiotickou léčbu uvádí tabulka. PRVNÍ ŘADA (pro nekomplikované infekce citlivými kmeny) Ampicilin, cefalotin, chloramfenikol, gentamicin, ciprofloxacin, ko-trimoxazol PRVNÍ ŘADA V PŘÍPADĚ MOČOVÝCH INFEKCÍ Ampicilin, cefalexin, tetracyklin, nitrofurantoin, ofloxacin, kys. oxolinová, kotrimoxazol DRUHÁ ŘADA (pro středně těţké infekce a pro kmeny rezistentní na ATB první řady) Cefuroxim, cefotaxim, ceftazidim, aztreonam, amoxicilin + klavulanát, kolistin TŘETÍ ŘADA (rezervní antibiotika pro velmi závaţné infekce polyrezistentními, zpravidla nemocničními kmeny) Netilmicin, amikacin, piperacilin, piperacilin + tazobaktam, cefepim, imipenem Tabulka č. 2: Příklad konkrétních sestav antibiotik Zdroj: Votava,

18 Velmi závaţným problémem je produkce tzv. širokospektrých beta-laktamáz (ESBL, z anglického Extended specter beta lactamase). Tyto beta-laktamázy odolávají i antibiotikům chráněným např. kyselinou klavulánovou nebo sulbaktamem. V Brně jsou nejčastějšími producenty ESBL kmeny Klebsiella pneumoniae. (Votava a kol., 2003) 18

19 3. Escherichia coli 3.1 Obecné vlastnosti Kmeny Escherichia coli jsou nejčetnějšími bakteriemi střevní flory člověka, ale i zvířat. Escherichia coli je běţný komenzál tlustého střeva, nachází se zejména v dolní části ilea všech teplokrevných ţivočichů. Dostává se tam jiţ v prvních několika dnech po narození. Kmeny Escherichia coli jsou velmi rozmanité vzhledem k hostiteli. Některé mohou být čistě komenzální, jiné zase mají různé faktory virulence v různých kombinacích, působí jako specifické patogeny nejen ve střevě, ale i mimo střevo, nejběţněji v močovém ústrojí. Fekálním znečištěním se escherichie dostávají aţ do vody, kde přeţívají aţ několik týdnů. Pouţívají se jako indikátor fekální kontaminace pitné vody. 3.2 Morfologie a biochemie Escherichia coli je rovná gramnegativní tyčinka, která se vyskytuje jak jednotlivě, tak i ve dvojicích, některé kmeny z klinického materiálu tvoří pouzdra. Pro Escherichia coli je typické, ţe je to bakterie velká asi jednu setinu lidské buňky, coţ znamená, ţe je 1 3 µm dlouhá a asi 1 µm široká. Bakterie je mnohem jednodušší buňkou neţ ta lidská, skládá se z vnějšího obalu, tzv. buněčné membrány, a uvnitř je tekutina, která se nazývá cytoplasma a obsahuje především vodu a elektrolyty. Escherichie mají peritrichární bičíky, obvykle pohyblivé, ale mohou být i nepohyblivé. Obrázek č. 5: Skladba buňky bakterie Esechrichia coli Zdroj: HowStuffWorks 19

20 Některé kmeny Escherichia coli mají polysacharidové pouzdro. Rostou na běţných půdách, na ţivných půdách rostou v hladkých bezbarvých koloniích o průměru 2 3 mm dobře do 18 hodin. Na krevních agaru mohou tvořit hemolýzu a na MacConkeyově půdě rostou obvykle v rudých a velkých koloniích. Optimální teplota pro růst je 37 C, ale rozmezí moţnosti růstu je široké, mohou růst i při C. Určitou dobu přeţívají i 60 C (15 minut) a 55 C (60 minut). Jsou chemoorganotrofní a fakultativně anaerobní, mají jak fermentativní, tak i respiratorní typ metabolismu. Biochemická aktivita escherichií je značná. Jsou kataláza pozitivní, oxidáza negativní, citráty většinou negativní a metylčerveň pozitivní. Téměř všechny kmeny jsou schopné do hodin okyselit glukózu, ale i jiné sacharidy (např. laktózu) za vývinu plynu. Nepohyblivé kmeny, které okyselují nebo neokyselují laktosu, a neprodukují plyn, se obtíţně klasifikují. V dnešní době se označují jako atypické kmeny Escherichia coli. 3.3 Patogenita Escherichia coli je rozšířeným střevním patogenem lidí, ostatních savců, ale také ptáků. Přestoţe je vázaná na fekální kontaminaci, samostatně se nevyskytuje mimo ţivočišné tělo. Některé kmeny escherichií jsou patogenní jak pro člověka, tak pro zvířata, způsobují průjmová onemocnění, ale také septické, močové nebo vaginální infekce. Také můţe být původcem nozokomiálních infekcí a meningitid. Epidemiologicky významné a patogenní kmeny jsou charakterizovány a identifikovány sérologicky na základě somatických (O), kapsulárních (K) a bičíkových antigenů. Jiné druhy tohoto rodu se vzácně vyskytují jako oportunně patogenní, většinou ve spojitosti s infekcemi ran. (Sedláček 2007) Patogenita ve střevě Escherichia coli je bakterie, která ve většině případů ve střevě funguje jako komenzál, součást normální flóry u člověka. Pokud způsobuje akutní enteritidu u člověka či zvířat, jde o určité kmeny vybavené specifickými faktory virulence. Kmeny, které způsobují infekce v intersticiálním traktu, se podle svých patogenetických mechanismů dají rozdělit do čtyř skupin: a) enteropatogenní v uţším slova smyslu (EPEC) b) enterotoxigenní (ETEC) 20

21 c) enteroinvazivní (EIEC) d) enterohemoragické (EHEC) Enteropatogenní E. coli (zvané téţ dyspeptické) jsou vyvolavateli novorozeneckých a kojeneckých průjmů. Kromě malých dětí mohou postihovat i zvířecí mláďata (telata, selata, jehňata). Při vodnatých průjmech dochází k dehydrataci, případně aţ ke smrti. Problémem je zejména v rozvojových zemích. U EPEC kmenů nebyla prokázána ţádná tvorba enterotoxinů. V rozvojových zemích vykazuje vysokou mortalitu, u nás je většina případů včas zachycena a léčena. Kmeny EPEC patří zpravidla k několika specifickým antigenním typům. Dvanáct nejběţnějších je vyhledáváno pomocí antigenní analýzy při rutinním pátrání po novorozeneckých a kojeneckých průjmech. Mezi nejběţnější patří např. typy O55 a O111.. Enterotoxigenní kmeny mohou vyvolat průjmy nejen u dětí, ale také u dospělých. Vyskytují se hlavně v teplých oblastech, kde postihují zejména cestovatele, místní obyvatelé bývají imunní. Tyto kmeny jsou schopné produkovat dva typy enterotoxinů, a to termostabilní enterotoxin ST nebo termolabilní enterotoxin LT, popřípadě můţe i oba. Enteroinvazivní E. coli EIEC působí podobným mechanismem jako patogenity jako shigely, tj. ţe pronikají do buněk a poté se v nich mnoţí. Vznikající onemocnění je podobné shigelové dyzenterii. Enterohemoragické E. coli EHEC se váţí zejména v tlustém střevě. Produkují toxin, který je podobný toxinu některých kmenů shigel a vzhledem k cytopatickému efektu na buněčné kultury VERO se také označoval jako verotoxin. Proto se tyto kmeny také označují jako STEC (shiga-like toxigenní E. coli) nebo VTEC (verotoxigenní E. coli). Izolují se u onemocnění hemoragickou kolitidou, u některých nemocných, zejména u dětí, můţe vzniknout významná komplikace, a to hemolyticko-uremicky syndrom (HUS). Zdrojem infekce je nejčastěji hovězí maso. Onemocnění je často smrtelné. V prevenci je nejvýznamnější zabránit styku s infekčním agens, coţ v zemích třetího světa představuje zejména kontaminovaná potrava a voda. U některých enteritid je důleţité dodrţovat striktní hygienu. Při léčbě je nejdůleţitější včasná náprava bilance vody a elektrolytů. 21

22 Obrázek č. 6: Vzájemné působení patogenních E. coli s epiteliárními buňkami střeva Zdroj: Xavier a Podolský, Patogenita mimo střevo Escherichia coli je nečastějším původcem nekomplikovaných infekcí močových cest, které vznikají mimo nemocnici. Uvádí se, ţe způsobuje 70 aţ 80 procent těchto tzv. komunitních močových infekcí. I v případě močových infekcí vzniklých v nemocnici je Escherichia coli na prvním místě s asi 55 % (následována dalšími enterobakteriemi, jako jsou klebsiely). Za velkou část těchto infekcí jsou zodpovědné kmeny vybavené specifickými faktory virulence, zvané uropatogenní E. coli (UPEC). Kromě těchto infekcí je Escherichia coli schopná způsobit také sepsi novorozenců, meningitidu, pooperační sepsi, infekce ran, hnisavé procesy, abscesy v orgánech, ale také vaginální infekce. Sepse novorozenců: jedná se o stav velmi těţké infekce, kde nejčastějším původcem sice bývá Streptococcus agalactiae, ale můţou jej vyvolat i jiní původci, jako např. právě Escherichia coli nebo Klebsiella. Podstatou tohoto systémového onemocnění je zánětlivá odpověď organismu na infekci, spojená s výskytem bakterií v krvi. Důleţitou součástí prenatální péče je profylaxe přenosu infekce z matky na dítě. Definice sepse i systémové 22

23 zánětlivé odpovědi (SIRS systemic inflammatory response syndrom) v dětském věku jsou odlišné od dospělých, jiná je etiologie těchto závaţných stavů. Léčba sepse musí být komplexní, musí respektovat celou řadu nepříznivých faktorů, které provází multiorgánové selhání. (Černá, Pokorná, Sádlo, 2007) Novorozenecká sepse se objevuje nejčastěji mezi 5.-7.dnem ţivota dítěte. Projevuje se: cyanóza, apatie, křeče, tachypnoe, acidóza, vzedmuté bříško, průjem. Provádí se kultivace, laboratorní vyšetření (KO, biochemie, glykémie aj.) a zobrazovací metody (SONO). Léčba: ATB parenterálně (ampicilin, ko-ampicilin, cefalosporiny III. generace).například ampicilin lze v 1. týdnu ţivota podávat v celkovém mnoţství 50 mg/kg/24 hod. ve 2 dávkách; 2. týden mg/kg/24hod. ve 3 dávkách s gentamicinem 2,5-5 mg/kg/24 hod.; sedativa pro neklid a dráţdivost; imunoglobuliny max. 750 mg/kg (dávku moţno opakovat 3krát). (Laštovičková, 2009) Léčba sepse musí být vţdy komplexní. Je nutné racionálně volit vhodný typ antibiotik a nutně zvaţovat kaţdou ATB indikaci. Novorozenecká meningitida: z 60 % je vyvolavatelem novorozeneckých meningitid Escherichia coli. Enterobakterie se jako původci hnisavých meningitid uplatňují do 3 měsíců věku, později pouze u imunodeficitních osob. Infekce močových cest: jak uţ bylo řečeno, infekce močových cest patří vůbec k nejčastějším zánětlivým onemocněním spolu s respiračními infekty. Jedná se o patologický stav, při němţ můţeme prokázat přítomnost patogenních mikroorganismů ve tkáních močového ústrojí nebo v moči, tzn. ţe se jedná o onemocnění charakterizované přítomností bakterií a zánětlivých buněk v moči, provázené charakteristickými klinickými příznaky. Z vědeckého pohledu lze na toto onemocnění pohlíţet jako na interakci mezi hostitelem a patogenem. Výskyt uroinfekcí v novorozeneckém věku je u chlapců vyšší asi 3-5 krát, naopak v batolecím věku prevalence výrazně stoupá u dívek a v reprodukčním věku jiţ velice výrazně převaţuje výskyt uroinfekcí u ţen. IMC jsou v nemocnici nejčastěji se vyskytujícími nozokomiálními infekcemi, souvisí to zejména s katetrizací močových cest, vzácně z kontaminovaných pomůcek nebo roztoků. Klinické příznaky jsou většinou provázeny signifikantní bakteriurií, která vyjadřuje kvantitativně významnou bakteriurii ve standardním, přesně definovaném mnoţství vzorku spontánně vymočené, popřípadě vycévkované moči. (Ševčíková, Ševčík, 2005) 23

24 Symptomatické ţeny 10 na druhou nebo více koliformních mikrobů/ml moči + leukocyty 10 na třetí nebo více jakkéhokoliv patogenního organismu/ml moči jakkýkoliv záchyt patogenního organismu ve vzorku moči získaného suprapubickou punkcí Symptomatičtí muţi Symptomatičtí pacienti 10 na třetí nebo více patogenního organismu ve vzorku moči 10 na třetí nebo více patogenního organismu/ml moči ve dvou nezávislých vzorcích Tabulka č. 3: Oxfordská kritéria diagnózy signifikantní bakteriurie Zdroj: Kolombo, 2005 Nejčastější bránou vstupu infekce je ascendentní cesta, zejména u ţen a dívek, kdy je IMC vyvolány zejména enterobakteriemi fekálního původu z kolonizace vaginy. Méně častými typy jsou hematogenní typ, lymfatický typ, per continuitatem a přenosem pohlavním stykem. Nejběţnějším patogenem vyvolávající akutní nekomplikované cystitidy je bezesporu Escherichia coli, a to aţ v %. Escherichia coli se řadí mezi primárně patogenní kmeny, tzn. ţe jsou schopny vyvolat IMC u jedinců s normálním močovým systémem. Komplikované a nozokomiální IMC vyvolává široké spektrum mikroorganismů, např. Klebsiella, Proteus, Serratia aj. Odběr pro diagnostiku IMC musí být proveden před nasazením ATB, nejlépe ráno. Vzorek moči by měl být zpracován do 2 hodin od odběru, pokud to není z nějakého důvodu moţné, je nutné vzorek uchovávat při teplotě 4 C v chladničce, maximálně však ale 24 hod. Provádí se základní kultivační vyšetření, kterým získáme informace o druhu mikrobiálního patogena a to se doplní vyšetřením citlivosti na antibiotika. Pokud jde o léčbu, tak obecně platí, ţe nekomplikované infekce DCM se téměř vţdy řeší perorálními přípravky, naopak k léčbě komplikovaných infekcí a infekcí HCM je nutné pouţít přípravky se systémovým účinkem. V případě infekce vyvolané Escherichia coli (zejména u zdravých dospělých ţen) je doporučována 3denní léčba, která významně sniţuje výskyt neţádoucích účinků a jejíţ účinnost je srovnatelné s podáváním 7denních antibiotik. Perorální léčba akutní nekomplikované cystitidy u dospělých ţen je tedy zaloţena na podávání 3denních antibiotik: amoxicilin, cefuroxim, kotrimoxazol, trimetoprim, nitrofurantoin (výjimka, jedná se o 7denní terapii), ciprofloxacin, ofloxacin a norfloxacin. 24

25 4. Antibiotika a citlivost bakterií na ně 4.1 Obecné vlastnosti antimikrobiálních látek Antimikrobiální látky (nebo také antiinfektiva) jsou léčiva, která slouţí k profylaxi a k terapii infekčních onemocnění. Antimikrobiální látky působí jemně a cíleně uvnitř organismu s cílem maximálního zásahu mikroba a minimálního vlivu na organismus. Mnohé z těchto látek jsou původu přírodního mikrobiálního (jsou získávány zejména z bakterií a mykotických organismů) a nazýváme je antibiotika (v uţším slova smyslu). Prvním systémově pouţitým antibiotikem byl penicilin. Abychom antibiotika mohli pouţít jako léčivo, musí zabít nebo alespoň inhibovat mikroby v takových dávkách, které nepoškozují makroorganismus. Antimikrobiální léčiva obecně tedy musí být selektivně toxická pro mikroba. To vyjadřuje chemoterapeutický index, coţ je poměr mezi dávkou účinnou na mikroba a dávkou toxickou pro hostitele. Účinnost antimikrobiální látky na daného mikroba můţeme definovat pomocí dvou laboratorních hodnot minimální inhibiční koncentrace a minimální baktericidní koncentrace. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) je termín, který se u antibiotik pouţívá pro označení meze mnoţení (růstu) mikroba. Tedy nejniţší koncentrace určité látky, která zabrání růstu mikroba. Minimální baktericidní koncentrace (MBC) je pojem, vyuţívaný pro vyjádření meze přeţití bakterie. Jde o nejniţší moţnou koncentraci látky, která je schopná příslušného mikroba usmrtit. Pro praxi má větší význam stanovení MIC, protoţe u antibiotik primárně bakteriostatických (inhibujících růst mikrobů) tak jako tak MBC nedosahujeme, a u antibiotik primárně baktericidních (svým mechanismem účinku přímo zabíjejících bakterie) je naopak hodnota MBC a MIC prakticky shodná a je tedy zbytečné určovat i druhou z nich. Antibiotika jsou látky přírodního původu, i kdyţ jsou chemicky modifikované nebo vyrobené synteticky. Antimikrobiální látky, které jsou vyrobeny zásadně a jen chemicky, říkáme chemoterapeutika. Dnes uţ se ale tento rozdíl stírá a prosazuje se pouţívání pojmu antibiotika pro obě skupiny léčiv. Antibiotika (a chemoterapeutika) můţeme vzájemně kombinovat. Za tímto účelem se rozdělují do čtyř skupin: 25

26 skupina účinek Příklady látek I baktericidní Aminoglykosidy, peptidy II baktericidní Peniciliny, cefalosporiny, monobaktamy, karbapenemy, glykopeptidy III bakteriostatická Chloramfenikol, tetracyklin, makrolidy, linkosamidy IV bakteriostatická sulfonamidy Tabulka č. 4: Čtyři skupiny antibiotik a chemoterapeutik Zdroj: med.muni Podání antibiotik bez průkazu etiologického agens a bez přesného určení jeho citlivosti k danému antibiotiku je častokrát bez klinického efektu a hlavně mrháním léčivy a hazardováním se zdravím pacienta. Zásadou racionální antibiotické terapie je, ţe antimikrobiální léčba je na místě pouze u infekčních stavů, a to zejména tehdy, je-li původce antimikrobiální látkou vůbec postiţitelný. Antibiotika a vůbec antimikrobiální látky podáváme aţ po odběru vhodných vzorků na mikrobiologické vyšetření. 4.2 Stanovení citlivosti na antimikrobiální látky Zjišťování citlivosti in vitro (v laboratoři) nezaručí stoprocentní účinnost léčby, přesto je vhodné a nutné provést tento test u většiny kultivovaných patogenních bakterií a kvasinek. Nejběţněji se provádí u bakterií, ale jen u těch, které lze kultivovat, jelikoţ u všech rutinně pouţívaných (fenotypových) metod potřebujeme kmen Kvalitativní testy V rutinní diagnostické praxi nejrozšířenější metodou je difúzní diskový test, který umoţní jednoduchým a málo pracným způsobem vyhodnotit citlivost velkého mnoţství bakteriálních patogenů na širokou škálu antibiotik. Pro difúzní diskové metody k testování citlivosti bakterií na různá antibiotika se vyuţívá nejčastěji půda Muellerova-Hintonové. Před naočkováním na testovací plotnu se musí připravit suspenze bakterií ve fyziologickém roztoku. Suspenze testovaného kmene se naočkuje na půdu pomocí tamponu ve dvou na sebe kolmých směrech, nebo se asi 2 ml suspenze na plotnu napipetují a poté kývaním rozlejí po povrchu půdy. Testy citlivosti je moţné provést i přímo z infekčního materiálu, který se naočkuje tamponem na kultivační půdu. Na půdy naočkované zkoumanými mikroby se pomocí jehly nakladou disky. K testování se pouţívají papírové disky o průměru 5 6 mm, které jsou nasycené daným 26

27 mnoţstvím antibiotika. Disky se kladou ve směru hodinových ručiček v určitém pořadí. (Je také moţné pouţít nástroj zvaný dispenzor, který na agarovou plotnu umístí všechny disky najednou.) Papírový disk nasaje vodu z půdy a antibiotikum poté difunduje do okolí. Naočkované půdy spolu s disky se dají inkubovat při 37 C asi na hodin. Obráze č. 7: Difúzní diskový test Zdroj: fvl.vfu Citlivé bakterie jsou ve svém růstu inhibovány a kolem disků se vytvoří zóny zábrany růstu tzv. inhibiční zóny. Výsledky testů se vyhodnotí pomocí srovnání průměru inhibičních zón kolem antibiotických disků s průměry referenčních zón, které jsou udány výrobcem. Nepřímo se tak vlastně porovnává koncentrace MIC versus léčebná koncentrace (breakpoint). Pokud je průměr inhibičních zón menší, tak je mikrob na dané antibiotikum rezistentní a pokud je průměr větší, mikrob je na antibiotikum citlivý Kvantitativní testy E-test: E-testy jsou podobné difúznímu diskovému testu, s tím rozdílem, ţe místo disku se pouţije prouţek. V tomto prouţku je napuštěné antibiotikum ve stoupající koncentraci od jednoho konce ke druhému. Zóna není kruhová, ale vejčitá, a umoţňuje odečtení hodnoty MIC, ne tedy jen určení, zda je kmen citlivý či rezistentní jako u difúzního diskového testu. Na papírku se nachází stupnice, a tak je odečítání jednoduché. Hodnotu MIC určuje místo, kde je okraj zóny proťat daným prouţkem. Test je však velice nákladný, protoţe výroba prouţků se stoupající koncentrací antibiotika vyţaduje speciální technologii. 27

28 Obrázek č. 8: E-test Zdroj: uniklinik-ulm Mikrodiluční test: také v tomto případě jde o kvantitativní test, tedy stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC). Výrobce dodává mikrotitrační destičky, které jiţ přímo obsahují vysušené antibiotikum. Po přidání přesně definovaného objemu suspenze bakterie ve fyziologickém roztoku s glukózou se nastolí definovaná koncentrace antibiotika. Zpravidla se pouţívá destička o rozměrech 8 12 důlků (celkem tedy 96 důlků), která slouţí k určení MIC kmene na 12 různých antibiotik. Jedenáct antibiotik je přítomno v osmi koncentracích (koncentrace postupně klesají geometrickou řadou s koeficientem 2). Dvanácté antibiotikum je přítomno pouze v sedmi koncentracích, osmý důlek je vyčleněn pro kontrolu růstu kmene bez antibiotika. Pro kaţdé ze dvanácti antibiotik pak platí, ţe nejniţší koncentrace, kde je inhibován růst, představuje hodnotu MIC. V přiloţené šabloně je označena léčebná koncentrace (breakpoint). Je-li MIC niţší neţ tento breakpoint, kmen je citlivý. Je-li MIC vyšší, je rezistentní. Stanovením MIC lze určit přesnou dávku antibiotika, která nejméně zatěţuje organismus pacienta toxickými účinky Zjišťování faktorů rezistence V některých případech je lepší zjišťovat konkrétní přítomnost faktorů rezistence, např. betalaktamáz, pomocí speciálních metod. Můţou to být třeba diagnostické prouţky, kde je prokazujeme chemicky daný enzym nebo jiné testy. Těchto tesů vyuţíváme zejména tam, kde 28

29 testy citlivosti nedávají spolehlivé výsledky, nebo chceme (např. z epidemiologických důvodů) prokázat přímo konkrétní typ rezistence. Testování kmenů na produkci běžných betalaktamáz: Vyuţívají se diagnostické prouţky a princip testu je stejný jako u stripových biochemických identifikačních testů, např. oxidázový test nebo enterotest. Pouţívá se v případě selhaní difúzního diskového testu a mikrodilučního testu, kde výsledek není spolehlivý. Tentýţ test lze provést také ve formě důlků v mikrotitrační destičce. Pouţívá se např. u hemofilů, neisserií a moraxel. Testování na produkci ESBL (širokospektrých betalaktamáz): U širokospektrých betalaktamáz má inhibitor betalaktamázy (např. kyselina klavulanová) svůj účinek, i kdyţ není dle dostupných údajů dostatečný pro léčbu in vitro. Lze ho však vyuţít činí-li rozdíl mezi zónami kolem disků cefotaximu bez inhibitoru a s ním více neţ pět milimetrů, je kmen povaţován za producenta (širokospektré) betalaktamázy. (Zahradníček) Druhem širokospektrých betalaktamáz jsou i betalaktamázy KampC, které jsou však citlivé na cefalosporiny čtvrté generace. Jejich rezistence je trvalá vlastnost, coţ určuje písmeno K, které znamená konstituční. Test probíhá na běţném MH agaru a na MH agaru s oxacilinem. Na závěr se porovnává rozdíl mezi velikostmi zón citlivosti čtyř antibiotik. Obráze č. 9: Průkaz ESBL a AmpC, rozloţení disků Zdroj: betalaktamázy 29

30 4.2.4 Genotypové metody zjišťování citlivosti/rezistence V moderní době se vedle fenotypových metod prosazují také genotypové metody, které třeba i přímo ve vzorku dokáţí odhalit gen kódující určitý faktor zodpovědný za rezistenci bakterie. Problém je ovšem v tom, ţe exprese takového genu můţe být ovlivněna řadou dalších vlivů a samotný průkaz příslušného genu nelze povaţovat za jednoznačný důkaz fenotypicky vyjádřené rezistence. Proto, ale také pro velkou nákladnost a náročnost na vybavení, se tyto metody prozatím nedostaly do rutinní praxe. 30

31 5. Záněty pochvy 5.1 Význam a charakteristika poševních zánětů Zánětlivá onemocnění jsou jeden z nejčastějších důvodů, proč ţeny navštěvují ordinaci gynekologa. K nejběţnějším zánětlivým onemocněním genitálního traktu u ţen v reprodukčním věku patří smíšené vaginální infekce. Ty jsou vyvolány společným působením několika patogenů. Vzestup výskytu těchto onemocnění sebou nese velké riziko problémů nejen medicínských, ale také sociálních a ekonomických. Postiţené ţeny své potíţe často tají nebo jim nevěnují dostatečnou pozornost. Dochází k narušení vztahů, zejména partnerských, současně je ţena neurotizována a společensky kompromitována kvůli nepříjemným výtokům, které skoro vţdy záněty doprovází. Vedle výtoku můţe být také přítomna bolestivá menstruace či bolesti při styku. Můţe však dojít i k daleko závaţnějším důsledkům těchto onemocnění, pokud se zánět rozšíří z pochvy do dělohy, vejcovodů a břišní dutiny. Důsledkem salpingitidy (zánětu vejcovodů) mohou být srůsty s důsledkem neplodnosti, průnik do břišní dutiny můţe znamenat zánět pobřišnice a septický stav hrozící aţ smrtí pacientky. Záněty ţenských pohlavních orgánů jsou onemocněním infekčního charakteru, vyvolaná nejčastěji bakteriemi a kvasinkami, řidčeji viry nebo parazity. Většinou jde o polymikrobiální infekce, které lze přesně diagnostikovat pouze moderními kultivačními technikami. (Citterbart 2001) původce počet % Candida albicans Gardnerella vaginalis 9 45 Bacteroides fragilis 3 15 Enterococcus faecalis 4 20 Escherichia coli 7 35 Streptococcus agalactiae 6 30 Viridující streptokoky 4 20 Tabulka č. 5: Původci poševních infekcí Zdroj: Gerţová Podíl jednotlivých skupin lze vyjádřit v procentech takto: bakteriální vaginóza 15 %, kandidiáza 20 % a smíšené infekce 65 %. (Gerţová) 31

32 5.1.1 Mikroflóra pochvy Čerstvě narozená novorozená dívka má vulvu sterilní, osídlení mikroorganismy nastává aţ za 7 8 hodin. Nejdříve se zde objevují enterokoky, difteroidy a stafylokoky, které zhruba za dva aţ tři dny vystřídá prakticky čistá kultura laktobacilů. Později laktobacily vymizí a aţ do puberty zůstane vaginální sekret alkalický Fyziologie poševního ekosystému Přirozenou ochranu genitálního ústrojí ţeny představuje poševní ekosystém. Chrání před rozvojem a rozšířením zánětlivého onemocnění. Tento ekosystém vytváří několik faktorů, které se mohou navzájem i ovlivňovat: a) Slizniční imunitní systém sekreční imunoglobulin A (siga), který ve velkém mnoţství produkuje děloţní hrdlo, stéká spolu s leukocyty, lymfocyty a makrofágy do pochvy, kde vytváří s transsudátem cervikovaginální sekret. b) Endogenní poševní flóra tu tvoří pestrá směs anaerobních a aerobních mikroorganismů, které jsou ve vzájemné rovnováze a které pochvě nevadí. U kaţdé ţeny je její sloţení individuální a je ovlivňováno řadou faktorů, závisí na endogenních a exogenních vlivech. U zdravé a dospělé ţeny je součásti její poševní flory tyčinka Lactobacillus acidophilus, které je přisuzován dozor nad endogenní poševní florou. Mezi nejdůleţitější úkoly této grampozitivní aerobní nebo anaerobní nepohyblivé tyče patří zejména fermentace glukózy na kyselinu mléčnou, která se podílí na výrazné kyselosti poševního prostředí (ph 3,8 4,2). Dále zprostředkovává produkci peroxidu vodíku, který ve vyšších koncentracích můţe být toxický pro některé bakterie a zastavuje tak jejich růst. Také je schopný produkovat bakteriociny, coţ jsou sloučeniny bílkovinné povahy, které působí svým baktericidním účinkem na některé mikroorganismy. 32

33 Obrázek č. 10: Působení laktobacila na poševní floru Zdroj: gynoflóra Přestoţe laktobacily, kterých existuje velké mnoţství, jsou hlavními producenty kyselé sloţky poševní, ostatní mikroorganismy (např. streptokoky, koryneformní bakterie) k tomu mohou přispívat také. Jsou-li laktobacily potlačeny, např. z důvodu terapie antibiotiky, v mnohých případech dochází ke zmnoţení kvasinek a necitlivých mikrobů, které způsobují dráţdění a jsou schopné vyvolat i zánět. c) Hormonální hladiny menstruačního cyklu v pubertě dochází k produkci estrogenů a to vede k zesílení poševní stěny, ke zvýšení glykogenu v buňkách a k většímu osídlení pochvy laktobacily. Naopak po klimaktériu se v důsledku hormonálních změn mnoţství laktobacilů sniţuje a nakonec zpravidla vymizí laktobacilární flóra úplně. Hormonální hladiny mají vliv i na patogenní organismy, např. u kvasinek byly prokázány receptory na estrogeny. Proto je výskyt některých infekcí vyšší v těhotenství, a proto také zkušení gynekologové vědí, ţe jednou z věcí, na kterou je třeba se vţdy zaměřit při léčbě poševních zánětů, je pouţívaná antikoncepce. d) Kyselé poševní ph stabilita poševního ph je zajišťována kontinuálním štěpením glykogenu na kyselinu mléčnou (jejíţ ph je 3,0 3,5). Prevalence všech mikroorganismů stoupá během menstruace. 5.2 Poševní infekce, jejich diagnostika a léčba Infekce se šíří buďto descendentně (sestupem) nebo ascendentně (vzestupem). Nejčastější, ale také nejpravděpodobnější cestou šíření infekce je intrakanalikulární vzestup mikroorganismů genitálem ţeny. Toto riziko je za fyziologických podmínek do jisté míry 33

34 eliminováno obrannými mechanismy, které jsou funkční a anatomické povahy. Porušení těchto mechanismů můţe vést k usnadnění proniknutí mikroorganismů do vyšších oddílů ţenského genitálního ústrojí. K rozvoji zánětu můţe vést i hormonální porucha, krvácení z rodidel, podvýţiva a vyčerpání Typy poševních infekcí Kolpitis (zánět pochvy, vaginitis) je jedním z nejčastějších onemocnění sexuálně aktivních ţen. Dochází k němu v důsledku porušení ekologické rovnováhy a přemnoţení mikroorganismů, které jsou patogenní. Nejběţnějším příznakem poševního zánětu je výtok (fluor), hodnotíme makroskopický vzhled, mikroskopický obraz, kultivaci. Méně často se vyskytuje pocit svědění, pálení, zápach nebo bolest při styku. K rizikovým faktorům, které přispívají ke vzniku poševního zánětu se řadí diabetes mellitus, stavy imunodeficience, léčba širokospektrými antibiotiky, gravidita, hormonální kontracepce, neestrogenizovaný terén, hematologické malignity, autoimunitní onemocnění nebo chronická medikace kortikoidy. Poševní infekce se velmi liší podle původců, způsobu vzniku a další charakteristiky. V posledních desetiletích se rozlišují zejména pojmy: Bakteriální vaginóza. Jde o patologickou situaci poševní sliznice (nezánětlivá porucha) bez výrazného zastoupení leukocytů. Dochází k redukci aţ úplnému vymizení laktobacilů, které jsou nahrazeny anaerobními, ale i některými aerobními bakteriemi (v případě anaerobních baktérií jde aţ o 1000násobné přemnoţení). Při tomto stavu se zvyšuje mnoţství vaginálního sekretu a také jeho ph, čímţ se vytváří ideální prostředí k přemnoţení anaerobních mikroorganismů. Mezi klinické příznaky patří hojný výtok a zápach (zejména po nechráněném pohlavním styku). Nejsou přítomny běţné známky zánětu, jako je hnisavý sekret, bolest, svědění ani dysurie. Bakteriální vaginóza (BV) je velmi častou příčinou zánětů pochvy, která byla spojena s vysokým výskytem porodnické a gynekologické komplikace a představuje také zvýšené riziko přenosu HIV-1. Název vaginóza souvisí právě s nepřítomností klasického zánětu (proto koncovka -óza a nikoli -itida ). Moderní práce ovšem ukazují, ţe nepřítomnost leukocytů je dána aktivitní činností některých bakterií (zejména gardnerel), které brání jejich proniknutí do místa zánětu, takţe ve skutečnosti nejde o nezánětlivý stav, ale o zvláštní případ zánětu. 34

35 Anaerobní vaginitida klasická bakteriální kolpitida představuje infekci běţnými bakteriemi (E. coli, S. agalactiae, enterokoky) s přítomností leukocytů, na rozdíl od bakteriální vaginózy jde tedy o klasický hnisavý zánět. Více se tímto stavem budu zabývat v kapitole 5.3. Jiné poševní infekce (kandidóza, trichomonóza, infekce chlamydiemi, mykoplasmaty, papilomaviry apod.) Diagnostika V první řadě je důleţité pečlivě zhodnotit anamnézu, makroskopický vzhled pochvy a její sekret, zda je hustý, stíratelný, jaké je barvy, konzistence. Pro praxi je velice přínosné hodnocení a mikroskopické vyšetření nativního preparátu. Odběr biologického materiálu provedeme tak, ţe odebereme platinovou sterilní kličkou kapénky sekretu z poševních kleneb nebo vatovou štětičkou a naneseme na podloţní sklíčko. Přidáme kapku fyziologického roztoku a po překrytí krycím sklíčkem ihned prohlíţíme světelným mikroskopem při zvětšení 400násobném. Pozorujeme mnoţství buněk (leukocyty, epitelie), přítomnost bakterií a klíčových buněk, pohyb ţivých mikroorganismů atd. Stejně naneseme biologický materiál na další sklo, kde ho smícháme s pár kapkami 10% roztoku louhu draselného (10% KOH). Poté ucítíme typický rybí zápach, jedná se o aminový test, který je v diagnostice poševních zánětů důleţitý a má své nezastupitelné místo. Zejména se zvýrazní typický zápach v případě trichomonádové infekce. Hydroxid draselný rozpouští takřka všechny buněčné formy, pouze kvasinky zůstávají neporušené. Součástí diagnostických postupů je také měření poševního ph. Poševní ph většinou stanovujeme pomocí testačního papírku, jeho přiloţením na přední poševní stěnu. Normální osídlení mikroorganismů v pochvě je do ph 4,5, nad tuto hranici není prakticky moţné. V některých případech je nutné provést také mikrobiologické kultivační vyšetření. Biologický materiál odebereme ze zadní klenby poševní nebo z horní poloviny přední poševní stěny. K transportu pouţíváme výhradně transportní půdy, aby jejich sloţení odpovídalo rozsahu poţadovaných vyšetření. Kultivační vyšetření má velkou roli při recidivujících vulvovaginálních infekcích. V rámci kultivačního vyšetření je důleţité i kvantitativní stanovení mnoţství přítomných organismů a vyšetření jejich citlivosti k antibiotikům. (Mašata a kol. 2004) Kultivační vyšetření se dlouho povaţovalo za přínosnější a citlivější neţ mikroskopické vyšetření, dnes se však tento postoj přehodnocuje mikroskopie můţe 35

36 odpovědět na některé otázky, na které kultivace neodpoví, například jestli je nález gardnerel pouze náhodný, nebo jde o skutečnou bakteriální vaginózu, charakterizovanou typickým mikroskopickým obrazem. K vyšetření MOP (mikrobiální obraz poševní) se zasílá dvojice nátěrů z pochvy na podloţních sklech. Jedno sklo se obarví Gramovým barvením a druhé metodou dle Giemsy. K diagnostice různých forem bakterií slouţí Gram. Podle Jírovce, Petera a Málka MOP dělíme na šest základních obrazů. Toto dělení se v praxi stále pouţívá, i kdyţ někteří autoři je přehodnocují a opouštějí. MOP Mikroskopický nález I. (fyziologický) Döderleinovy tyčinky (laktobacily), epitelie, hleny II. (nehnisavý) III. (hnisavý) IV. (kapavčitý) Smíšený obraz tyček a koků, leptotrichie, mobilunci (vibria), ojedinělé leukocyty a epitelie Záplava kokoidních bakterií a leukocytů, laktobacil chybí, epitelií málo nebo chybějí Záplava leukocytů s nálezem diplokoků, laktobacil chybí, epitelií málo nebo chybějí V. (trichomonádový) Trichomonas vaginalis, smíšená bakteriální flora, leukocyty, málo epitelií VI. (kvasinkový) Tabulka č. 6: Mikrobiální obraz poševní Zdroj: Mašata a kol Oválná tělíska blastospor nebo mycelia, smíšená bakteriální flora, hojné epitelie Obrázek č. 11: MOP 0-III, kultivačně Escherichia coli v M-fázi, zvětšení 1500x Zdroj: Holec,

37 Mezi další moţnosti hodnocení nátěrů na sklíčko patří zejména Nugentovo skóre BV. Tento bodovací systém byl navrţen pro diagnostiku bakteriální vaginózy. Bodování (0-10) bylo popsáno jako kombinace těchto typů: laktobacily, Gardnerella vaginalis nebo Bacteriodes (malé gram-negativní tyčinky) a zahnuté gram-variabilní tyčky. Skóre poskytuje gradace narušení poševní flóry, které mohou být spojeny s různou mírou rizika pro komplikace v těhotenství. Laktobacily průměr na pole (1000x olejová imerze) Gardnerella/Bacteriodes sp. - průměr na pole (1000x olejová imerze) Skóre 0: > 30 Skóre 0: 0 Skóre 0: 0 Skóre 1: Skóre 1: < 1 Skóre 1: < 5 Skóre 2: 14 Skóre 2: 1-4 Skóre 2: 5+ Skóre 3: < 1 Skóre 3: 5-30 Skóre 4: 0 Skóre 4: > 30 Tabulka č. 7: Nugentův skórovací systém Zdroj: Minárik Hodnocení Nugentova skóre: 0 3 BV nepřítomna 4 6 přechodný stav 7 a více+ bakteriální vaginóza 37 Zahnuté gram-variabilní tyčky průměr na pole (1000x olejová imerze) Diagnostický screening můţeme doplnit vyšetřením serologickým, virologickým nebo imunologickým, někdy je moţné provést i gynekologické vyšetření kolposkopii Léčba Léčba aerobních vaginitid bude popsána v kapitole 5.3.3, zde pouze krátce zmíním léčbu ostatních poševních infekcí. K terapii bakteriální vaginózy se pouţívá nejčastěji metronidazol, v těhotenství pak zejména klindamycin, buďto jako perorální tablety nebo jako vaginální krém. Léčbu antibiotiky se doporučuje doplnit aplikací tablet s laktobacily nebo uţíváním bílých jogurtů s ţivou kulturou. Podle pokusu Mikamoa a kol. z roku 1996 se zdá být z klinického a bakteriologického aspektu přijatelnější pouţití perooralního metronidazolu (500mg 2 denně) neţ 2% klindamycinu ve formě vaginálního krému (5g 1 denně po dobu 7 dnů). Oduyebo (2009) zkoumal symptomatické ţeny v souvislosti s výskytem neţádoucích účinků při léčbě BV a podle něj má klindamycin tendenci způsobovat méně neţádoucích účinků neţ

38 metronidazol (kovová chuť v ústech, nevolnost a zvracení). Navíc zjistil, ţe léčba perorálně podaným laktobacilem spolu s metronidazolem je daleko účinnější neţ pouţití samotného metronidazolu a léčba peroxidem vodíku, sprchou a sulfonamidy je neúčinná. Novým problémem je rozvoj rezistence vaginální anaerobní flóry k makrolidům při léčebném pouţívání klindamycinu (vzhledem k často zkříţené rezistenci makrolidů a linkosamidů).. Bude potřeba mnoha dalších studií, aby mohly být zvoleny optimální formy prevence a léčby bakteriální vaginózy. Šanci mají zejména přístupy, které se nespoléhají na antibiotickou léčbu, ale na udrţení zdravého vaginálního ekosystému, coţ můţe být pro zdraví pacientek mnohem přínosnější a můţe eliminovat neţádoucí účinky antibiotik. (O Brien 2005) Moderním léčebným postupem u terapie kandidózy je pouţití imidazolových preparátů. Úspěšnost léčby je aţ 90%, problémem je recidiva onemocnění. Antimykotika se aplikují lokálně, ale pouţívá se i systémová a perorální léčba. I zde je ţádoucí nespoléhat jen na antimikrobiální terapii, ale zhodnotit a řešit i všechny ostatní vlivy (dieta, antikoncepce, sexuální ţivot, případná základní choroba např. diabetes a podobně). V terapii trichomonádových infekcí se uplatňují nitroimidazolové preparáty. 5.3 Bakteriální kolpitida Colpitis bacterialis je hnisavý zánět, který je způsobený přemnoţením mikroorganismů, jako jsou enterokoky, stafylokoky, streptokoky a Escherichia coli. Můţe jej způsobit také zvýšení virulence těchto bakterií Klinický obraz Ţeny si často stěţují na hustý výtok, který bývá zapáchající, ţlutý aţ smetanový. Při chronickém zánětu je spíše nevýrazný. Sliznice pochvy bývá zarudlá, zduřená a má zrnitý vzhled. Dochází také k bolestem při styku (dyspareunie) Diagnostika Původce onemocnění se určí pomocí mikrobiologického vyšetření, které navíc doplníme testem citlivosti. Mikroskopické vyšetření samotné nemusí být dostačující, jelikoţ jím zjistíme pouze přemnoţení bakterií. Je-li poševní výtok zabarvený krví, je moţné, ţe se jedná o maligní onemocnění a je potřeba provést další specializovaná vyšetření Terapie Lokální léčba je zaloţena na pouţití chemoterapeutik nebo antibiotik. Chemoterapeutika, např. nitrofurantoin, furadantin, nitromidazol, ani antibiotika, nemusí být 38

39 dostačující. V těchto případech (recidivující infekce) doplňujeme lokální léčbu ještě léčbou celkovou. Kromě toho je dobré doplnit terapii o prebiotické a probiotické preparáty. Jedná se např. o poševní tablety s lyofilizovanou kulturou laktobacilů, ty jsou schopné dočasně stabilizovat poševní ekosystém. Konkrétně často pouţívanými léky jsou nitrofurantoin 100mg, vaginální aplikace na noc 7 10 dní. Široké ATB spektrum (G+, G- bakterie, kvasinky, trichomonády) vykazuje povidon Betadine vaginální gel, Ciklopiroxolamin Batrafen, nifuratel p.o. Macmiror tbl.200mg nebo lokálně v kombinaci s nystatinem Macmiror complex, na grampozitivní bakterie a kvasinky oxikonazol Myfungar crm. Na většinu bakterií lze pouţít i kombinovaný přípravek z neomycinu, polymyxinu B a nystatinu Polygynax cps vag. Per os amoxicilin mg po 8 hodinách, makrolidy jako klaritromycin a azitromycin u určitých typů infekcí v případě citlivosti. (Bartoníková). Antimikrobiální terapie ale nesmí být izolovaná, protoţe poševní infekce je vţdy komplexní problém. Je třeba pátrat po primární příčině. V některých případech můţe pomoci změna antikoncepčního prostředku, jindy (u mykotické infekce) také změna diety. Prevence onemocnění je zaloţena na pečlivém dodrţování zásad osobní a sexuální hygieny, která však zároveň nesmí být přehnaná a nevhodně volená (preparáty s vysokým ph jsou pro intimní hygienu spíše na škodu). 39

40 6. Charakteristika práce v laboratoři STD (MÚ FNUSA) Provoz příjmové laboratoře Mikrobiologického ústavu FNUSA musí být závazně dodrţován podle směrnice č. 9, kterou dodrţují všichni zaměstnanci ústavu. Směrnice popisuje organizaci a činnost, vztahující se k příjmu vzorků ke zkouškám a jejich distribuci do laboratoří (SM č. 9, 2007). 6.1 Odběr, transport a příjem materiálu Vzorek materiálu musí být správně odebrán, správně označen a správně zaslán do laboratoře, na tom závisí správnost výsledku mikrobiologického vyšetření. Odběr jednotlivých vzorků probíhá na klinických pracovištích a provádí jej sestra nebo lékař. Dodavatelé jsou lůţková oddělení a ambulance FN u svaté Anny v Brně, ale také další nemocnice a zdravotnická zařízení v Brně a okolí. Ve větší míře provádí odběr gynekolog. V této fázi je velice důleţité dodrţet nejen zásadu odběru ze správného místa, správným způsobem a ve správný čas, ale také do správných souprav. Spolu s řádně vyplněnou průvodkou jsou vzorky transportovány do příjmové laboratoře. Na dopravě se podílejí zaměstnanci nemocnice, kteří jsou touto prací pověřeni a zodpovídají za ni (sanitáři aj.). Musí se soustředit nejen na to, aby měl vzorek i ţádanku, ale také, aby vzorek byl uchován dle svého charakteru. Od poslů jsou vzorky přijímány v příjmu materiálu. Konkrétně v nemocnici u sv. Anny na MÚ se příjmu vzorku účastní zpravidla 2 pracovníci (laborant a sanitář). Laborant v této chvíli není jen pasivním prvkem, jeho úkolem je zkontrolovat průvodku (všechny informace, které má správně vyplněná průvodka obsahovat), zda je materiál správně odebrán (poškození během transportu, nedostačující mnoţství aj.) a také zda byly pouţity vhodné odběrové soupravy. Pokud je něco v nepořádku, je povinností laboranta zavolat na klinické pracoviště a chybějící údaje dozjišťovat a doplnit nebo vzorek rovnou poslat zpět. V případě, ţe je všechno v pořádku, dané vzorky se polepí štítky, rozdělí a roztřídí ţádanky. Ve FNUSA je zvykem vzorky si roztřídit podle toho, jaké vyšetření bude provedeno. Proto se vzorky na virologické vyšetření oddělí od vzorků na bakteriologické, serologické vyšetření, eventuelně PCR. Potom je materiál spolu s průvodkou zaslán na dané pracoviště ke zpracování podle SOP. Průvodka i materiál musí být označeny stejným pořadovým číslem, dobou, kdy byl vzorek přijat a vše musí být řádně podepsané od laborantky, která má ten den směnu a práci vykonala. 40

41 6.2 Vyšetření sexuálně přenosných chorob (STD) Ve FNUSA je laboratoř STD součástí Mikrobiologického ústavu. Provádí se zde nejen laboratorní vyšetření sexuálně přenosných chorob, jak by odpovídal název, ale i vyšetření dalších chorob postihujících pohlavní orgány (zejména ţenské) bez ohledu na způsob přenosu. Pracují zde jak laboranti, tak lékaři a jiní vysokoškolsky (Mgr.) vzdělaní odborníci, kteří se účastní zejména odečítání výsledků. Biologickými materiály odesílanými na tato pracoviště jsou většinou výtěry a stěry, sperma, prostatický exprimát a jiné tekuté nebo kusové materiály z pohlavních cest. Ve výtěrech hledáme patogenní bakterie, které mohou být příčinou zánětu jak ţenské tak muţské uretry, vaginy, vulvy, cervixu, popřípadě dalších částí pohlavního systému. Zkumavky s materiálem jsou zaslány z příjmu, nejčastěji to je vzorek na tampónu v transportním mediu AMIES, které obsahuje aktivní uhlí a má černou zátku. Slouţí pouze k transportu a přeţití bakterií. Popřípadě další vzorek v tekutém mediu CAT SWAB, který je nutný pro vyšetření na Trichomonas vaginalis a vhodný také k vyšetření na kvasinky. Vzácně jsou zaslány také soupravy Fungi Quick, které slouţí k samostatné kultivaci kvasinek. Pokud klinik pošle také podloţní sklíčka k mikroskopickému vyšetření, je nutné je obarvit. V případě, ţe jsou zaslána dvě sklíčka, jedná se o tzv. MOP neboli mikrobiální obraz poševní a sklíčka jsou obarvena dle Grama a dle Giemsy (viz. kapitola č.5). Výtěry a stěry jsou naočkovány na dané kultivační půdy a kultivovány přesně podle SOP. Před vlastním zpracováním jsou vzorky v laboratoři STD ještě znovu zkontrolovány a zapsány do LIS. Také veškeré výsledky jsou zaznamenány do laboratorního informačního systému. Klinický lékař si můţe sám vybrat, která vyšetření budou provedena na vzorcích, které do laboratoře posílá. Zvolí si tedy podle vlastního uváţení vlastní kombinace následujících vyšetření: a) Aerobní vyšetření, včetně kultivace Gardnerella vaginalis (u těhotenských diagnóz zahrnuje toto vyšetření také screening Streptococcus agalactiae). b) Anaerobní vyšetření c) Vyšetření na Ureaplasma urealyticum a Mycoplasma hominis d) Vyšetření na kvasinky e) Vyšetření na Trichomonas vaginalis f) Vyšetření na kapavku kultivací g) Mikroskopické vyšetření nátěr k barvení dle Grama 41

42 h) Mikroskopické vyšetření nátěr k barvení dle Giemsy Rozsah provedení daných zkoušek závisí na informacích ze zaslané dokumentace. Pokud klinik ţádá všechna vyšetření, včetně vyšetření MOP, uţívá se také pojem vyšetření STD-komplet. Některé části vyšetření provádějí všichni lékaři či jiní vysokoškoláci, některé jsou ale oprávněni provádět jen ti z nich, kteří jsou na laboratoři STD zaškolení, protoţe některá vyšetření mají poměrně speciální charakter. Oprávnění k očkování půd a zapisování do LIS mají vybraní laboranti Opatření pro nepracovní dny Provoz laboratoře STD a tudíţ i provádění všech zkoušek probíhá podle SOP pouze od pondělí do pátku. Proto musí být dodrţena určitá opatření. Pokud kultivujeme materiál, pro který je předepsán čas 24 aţ 48 hodin, kde je kultivace ukončena v některém z nepracovních dnů, laborant, který je pověřen prací v nepracovních dnech, přenese výsledky do tzv. nečisté lednice. V první pracovní den poté jsou výsledky přeneseny a odečteny. Výjimku tvoří dekapsulační test a kultivace Č3 a GC. Pokud je tento test nasazen nebo zahájena kultivace v poslední pracovní den před nepracovním dnem, je odečten ihned v nepracovním dni vysokoškolákem, který se na víkendovém provozu podílí. Výsledky jsou zapsány do zvláštních pracovních listů, odtud je poté v první pracovní den přepsán do LIS Validace zkoušky Kvalitu všech půd, které jsou vyráběny ze sušených základů, garantuje výrobce. Stejně tak i kvalitu antibiotických disků garantuje výrobce. Všichni noví pracovníci MÚ FNUSA jsou vedoucím laboratoře zaškoleni a v ročních intervalech kontrolováni. Navíc jsou půdy kontrolovány v přípravně půd a antibiotické disky úsekovou laborantkou. Laboratoř se účastní také mezilaboratorních porovnávacích zkoušek, kde jsou odečítány kontrolní vzorky zaslané SZÚ nebo z jiných referenčních laboratoří. 6.3 Provedení zkoušky Předtím, neţ laborant provede kultivaci, připraví si všechny potřebné půdy, tj. VLA, KA, GVA, KA-NaCl, ENDO, SABA, URUR, MYHO, SAGB, Č3 a GC. Některé půdy lze vynechat, laborant se řídí vţdy seznamem poţadovaných vyšetření. Misky a zkumavky musí být nesmazatelným způsobem popsány nejméně posledním trojčíslím čísla vzorku. 42

43 6.3.1 Očkování půd vzorek z půdy AMIES Pořadí očkování musí být dodrţeno a je následující: Č3, GC, VLA, KA, GVA, KA- NaCl, ENDO, SABA (není-li k dispozici CAT SWAB), URUR, MYHO, popř. ještě SAGB Očkování na KA: Laborant rozetře vzorek tamponem na asi čtvrtinu misky. Vyţíhanou kličkou rozočkuje vzorek na zbylou polovinu misky (očkuje se jeden vzorek na polovinu misky). Další vyţíhanou kličkou je na KA naočkován čarou kmen Staphylococcus aureus, a to z hustější části do méně naočkované části. Sterilní jehlou se umístí na čáru disk Bacitracin H. Očkování na GVA a ENDO: Laborant očkuje na čtvrtinu misky, nanese tamponem vzorek a poté ho rozočkuje vyţíhanou kličkou a následně ochlazenou kličkou. Očkování na KA-NaCl: Laborant nanese vzorek pouze tamponem na čtvrtinu misky Očkování na SAGB: Tampon se zanoří do bujonu a poté kultivuje 24 hodin. Po uplynutí kultivační doby se bujony vočkují na KA. Očkování půd pro mykoplasmata: Vzorek se očkuje do tekutých půd, které jsou určené pro diagnostiku urogenitálních mykoplasmat. Dle toho, o jaký typ materiálu se jedná, se liší postup. Pokud je biologickým materiálem poševní stěr, laborant si nachystá 3 zkumavky s půdou pro diagnostiku Mycoplasma hominis a 3 pro Ureaplasma urealyticum. Kalibrovanou kličkou se vnese 10 µl do první zkumavky a po promíchání a naředění se přenese stejné mnoţství do druhé a stejným způsobem zase do třetí. Postup je stejný i u druhé půdy. V případě, ţe materiálem je urethrální a jiný stěr, do stojánku se připraví 2 zkumavky a postup je stejný jako u poševních stěrů. Pokud se jedná o tekuté vzorky, připraví se 5 zkumavek, do první se napipetuje 100 µl vzorku a pokračuje se s následným proředěním a přenesením aţ do poslední páté zkumavky. Tampon AMIES je i po provedení kultivace nejméně 48 hodin uchováván v nesterilní lednici, aby v případě potřeby (např. chyby při zpracování, špatného označení apod.) mohla být některá část kultivace zopakována Očkování půd CAT SWAB Očkování SABA: Laborant naočkuje vzorek na šikmý SABA hádkem. Po vyočkování se CAT SWAB umístí do termostatu a aţ do provedení mikroskopie je zde ponechán (cca hodin). 43

44 6.3.3 Kultivace půd Č3 a GC: termostat se zvýšenou tenzí, 36 C 48 hod. KA: termostat se zvýšenou tenzí CO2, 36 C ENDO: termostat s atmosférou laboratoře, 37 C 24 hod. GVA: termostat se zvýšenou tenzí CO2, 36 C 48 hod. KA-NaCl: termostat, 37 C 48 hod. VLA: anaerostat značky BUG-BOX, TRIGON PLUS 37 C 48 hod. SABA: termostat, 30 C do zjištění pozitivity (nejdéle 4 dny) URUR a MYHO: termostat, 30 C po dobu 5 dnů Sklíčko Mikroskopické vyšetření barvení dle Giemsy: Laborant 5 minut sklo fixuje v methanolu, 5 minut suší na vzduchu při laboratorní teplotě. Do skleněné kyvety se nalije barvivo a vloţí se na 30 minut sklíčko. Poté se sklíčko opláchne vodou a osuší pomocí filtračního papíru Mikroskopické vyšetření barvení dle Grama: Sklo se vzorkem je fixováno nad plamenem a obarveno metodou dle Grama. 6.4 Odečet výsledků Odečítání výsledků zkoušky se účastní zejména vyškolený personál, lékaři nebo jiní vysokoškoláci, které k tomu mají vzdělání a oprávnění. KA: Za normální nález na krevním agaru můţeme povaţovat přítomnost běţných, nezávaţných nálezů nebo úplnou nepřítomnost mikrobů. U výtěrů ţen jsou to např. laktobacily nebo malá počet bílých kolonií bez hemolýzy. V případě, ţe se jedná o jiný případ, jde pravděpodobně o patogenní bakterie, které blíţe určujeme a testujeme citlivost na antibiotika. Krevní agar slouţí ke kultivaci běţných bakteriálních patogenů, i kdyţ umoţňuje i růst kvasinek. ENDO: Stejně jako u KA je i tady normálním nálezem nepřítomnost mikrobů, eventuelně přítomnost ojedinělých kolonií. Rostou zde pouze některé gramnegativní patogeny. Zpravidla jsou to enterobakterie (Escherichia coli, Klebsiella, Proteus a další), popř. gramnegativní nefermentující tyčky. GVA: Na této půdě rostou typické drobné kolonie, které mají výraznou hemolýzu beta. Pro ověření je moţné provést Gramovo barvení. KA-NaCl: Významným nálezem jsou neojedinělé kolonie, rostou zde pouze stafylokoky. 44

45 VLA: Tato půda slouţí zejména k rozpoznání obligátně anaerobních bakterií, které zde hledáme ve zvýšeném mnoţství. Pro patogenní působení svědčí masivní nález. Všechny podezřelé kolonie jsou dále testovány citlivostí na antibiotika a také obarveny dle Grama. SABA: Slouţí k průkazu kvasinek, ty jsou rozpoznány jako bělavé, ţlutavé či narůţovělé kolonie, které voní po burčáku nebo chlebu. Půdy pro mykoplasmata: Půdu URUR i půdu MYHO odečítáme za 6 dní a jako pozitivní hodnotíme změnu zabarvení půdy ze ţluté na červenou. Při pozitivitě většiny zkumavek, se vyhodnocuje jako pozitivní, v případě, ţe jsou pozitivní jen některé, hodnotí se jako pozitivní ojediněle. Č3: Rostou zde všechny druhy mikrobů jako na krevním agaru, navíc ještě Neisseria gonorhoeae. Ověřuje se biochemicky a testuje na antibiotika. GC: Zde by měly růst pouze kolonie Neisseria gonorhoeae. Výsledky veškerých kultivací se zapisují přímo do LIS, coţ je práce laboranta. Výsledky mikroskopií se odečítají do pracovního listu, odkud jsou také přeneseny do LIS. Při mikroskopii (bylo zasláno sklíčko či dvě sklíčka na barvení Gramem a/nebo Giemsou) odečítá lékař výsledek imersním systémem při zvětšení okuláru 10 a objektivu 100. MOP se hodnotí podle předepsaných kritérií. Při vyhodnocení výsledku soupravy CAT se vzorek prohlíţí jako nativní preparát při zvětšení okuláru 10 a objektivu 20 aţ Interpretace Normální nález v případě výtěrů z ţenské urethry, pochvy a cervixu je nález laktobacilů, malé mnoţství anaerobních bakterií, koagulázanegativních stafylokoků, eventuelně menší mnoţství jiných mikrobů. Vše ostatní je povaţováno za patogeny. Při mikroskopii lze za normální nález povaţovat epitelie nebo malé mnoţství epitelií spolu s bakteriemi. Při vyšetření mikroskopického preparátu ţeny je navíc přípustné i větší mnoţství bakterií, pokud jsou to grampozitivní robustní tyčinky, coţ jsou pravděpodobně laktobacily. 45

46 Obrázek č. 12: Laboratoř STD Mikrobiologického ústavu LF MU a FN USA Foto: Ondřej Zahradníček 46

47 7. Materiály, metody a soubor pacientek 7.1 Materiály ke kultivaci Escherichia coli na STD I kdyţ jsem materiály nepouţívala sama a pouze jsem vyuţila data z laboratorního informačního systému, uvádím v této kapitole soupis materiálů pouţívaných při kultivaci Escherichia coli v laboratoři STD, která je součástí laboratoří MÚ LF MU a FN u sv. Anny v Brně Chemikálie Mikrobiologické půdy (připravované ve varně půd, která je součástí mikrobiologického ústavu FNUSA): krevní agar (KA) Endova půda (ENDO) Přístroje a pomocná zařízení Termostat TCH 100, na 37 C Kličky bakteriologické, kovové Kahany plynové 7.2 Metody ke kultivaci Escherichia coli na STD Při diagnostice enterobakterií obecně a Escherichia coli zvlášť se pouţívá k diagnostice kultivace na krevním agaru a zejména Endově půdě. Escherichia coli se diagnostikuje na základě nálezu kolonií typického vzhledu. V případě potřeby se pouţije vhodný biochemický identifikační test, který prokáţe, ţe jde o kmen Escherichia coli a nikoli o jinou bakterii. 7.3 Stanovení citlivosti Escherichia coli k antibiotikům Citlivost na ATB a chemoterapeutika stanovujeme z čisté kultury, která je izolovaná z klinického materiálu. Vzorky od pacientů (v našem případě poševní výtěry a stěry) získává laboratoř STD MÚ FNUSA od klinických lékařů, a to z ambulancí i z lůţkových oddělení. Vyšetřovaný vzorek je laborantem dán ke kultivaci, čímţ se získá čistá kultura bakterií, která se dál pouţije k testování citlivosti. U většiny pacientů se uţívá diskový difusní test, u těch závaţných, např. z JIP nebo z ARO, se uţívá diluční test nebo E-testové prouţky. 47

48 K provedení diskového a dilučního testu jsou oprávněni všichni laboranti, stejně tak k zapisování výsledků do LIS. K odečtení výsledků jsou oprávněni všichni vysokoškoláci mikrobiologického ústavu Principy zkoušek Diskový test: Testovanou kulturu Escherichií coli naočkujeme na Muellerovu- Hintonové půdu a pomocí dispenzoru antibiotických disků aplikujeme na misku testovací disky. Kultivace probíhá při 37 C cca hodin. Během kultivace antibiotika, kterými jsou napuštěné disky, difundují do půdy a zabraňují růstu bakterií, vytváří inhibiční zónu. Je-li bakterie necitlivá, roste aţ k disku. Naopak je-li bakterie citlivá na dané antibiotikum, vytvoří okolo disku zónu. Kvantitativní testy určení citlivosti (tj. stanovení MIC) na tomto místě neuvádím, protoţe pro vzorky z mého souboru nebyly pouţity Chemikálie a spotřební materiál Chemikálie: Mikrobiologické půdy (připravované v tzv. půdárnách, které jsou součástí mikrobiologického ústavu FNUSA): Mueller-Hinton agar Krevní agar Disky pro testování antibiotik (validovány výrobcem): Ampicilin Ciprofloxacin, Cefalotin Co-trimoxazol Doxycyklin Nitrofurantoin Norfloxacin Disky jsou skladovány při teplotě 18 C nebo při chladničkové teplotě Přístroje a pomocná zařízení Termostat biologický BT 120, 37 C Kahany plynové Kličky bakteriologické kovové DENSI-LA-METER fy Lachema Petriho misky jednorázové 48

49 Aplikátor ATB disků Posuvné měřítko Postup zkoušek Diskový difusní test: Několik kolonií čisté kultury Escherichia coli naočkujeme do fyziologického roztoku s glukózou. Na MH půdu naneseme pomocí tamponu na špejli a rovnoměrně rozetřeme. Aplikujeme antibiotické disky na povrch Petriho misky. Takto naočkované půdy kultivujeme v termostatu, poloţené víčkem dolů Odečet výsledků Je-li zóna kolem disku doporučované velikosti, hodnotíme jako citlivý. Byla-li zóna menší, neţ doporučovaná velikost, hodnotíme jako rezistentní. Výsledky jsou poté zapsány laborantem do laboratorního informačního systému MEDLAB. 7.4 LIS Medlab Laboratorní informační systém MEDLAB je pouţívám ve Fakultní nemocnici u sv. Anny v Brně pro evidenci, přenos a archivaci výsledků jednotlivých zkoušek a jejích částí, a to nejen v mikrobiologické laboratoři, ale také v ostatních laboratořích nemocnice. Ze systému jsem získala data potřebná pro zpracování této práce. Data byla zpracována tak, aby bylo zajištěno, ţe budou identifikovány vícečetné nálezy od stejné pacientky, ale zároveň tak, aby byla v maximální míře zajištěna anonymita dat a aby jejich shromaţďování nebylo v rozporu s ochranou osobních údajů pacientek. 7.5 Soubor pacientek Charakteristika odesílajících pracovišť Soubor pacientek pocházel z různých oddělení FN u sv. Anny v Brně i pracovišť mimo tuto nemocnici, tak, jak příslušné vzorky přicházejí k vyšetření v laboratoři. Zahrnoval vţdy pacientky, jejichţ vzorky přišly na vyšetření v měsících lednu aţ březnu po sobě následujících let 2007, 2008, 2009 a Pracoviště, ze kterých přicházejí poševní výtěry spolu s poţadavky na vyšetření citlivosti na Escherichia coli, lze rozdělit na ambulance a lůţková oddělení. Uvádím zde kompletní seznam oddělení (včetně zkratek), ze kterých jsme dále statisticky zpracovávali vzorky v rámci této práce. Ambulance: ORZL Ordinace gynekologie, FN u sv. Anny v Brně, MUDr. A. Závodský GL Soukromé gynekologické centrum GYN LINE, MUDr. V. Páral MOÚ Gynekologická, popř. urologická amb., Masarykův onkologický ústav, Brno 49

50 KG Gynekologické oddělení, FN u sv. Anny v Brně, MUDr. Filová MBGP Gynekologická ambulance, Nemocnice Mil. bratří Brno SO FNUSA Sexuologické oddělení, FN u sv. Anny v Brně, MUDr. Reguli amb. BOS Gynekologická ambulance II., nemocnice Boskovice DELTA DELTA, spol. s.r.o. v Brně, MUDr. Bílková ÚKIA Ambulance imunologie, Ústav klinické imunologie a alergologie v Brně PTCA Ambulance kardioang. klin., FN u sv. Anny v Brně, MUDr. Hlinomaz GAPL Gynekologická amb., Psychiatrická léčebna v Brně, MUDr. Ţalmanová Lůžková oddělení: IO BRNO Interní oddělení, nemocnice Mil. bratří v Brně, MUDr. Marečková IK II. interní klinika (lůţková část), FN u sv. Anny v Brně DVK I. dermatovenerologická klinika, FN u sv. Anny v Brně NK I. neurologická klinika (lůţková část JIP), FN u sv. Anny v Brně RO FNUSA Doléčovací a rehabilitační odd., FN u sv. Anny v Brně Četnost vzorků z jednotlivých ambulancí prezentuje následující tabulka: ORZL KG MOÚ ostatní Všechny ambulance (42,5 %) 7 (15 %) 9 (19 %) 11 (23,5 %) 47 (100%) (16,5 %) 17 (31,5 %) 20 (37 %) 8 (15 %) 54 (100%) (6,5 %) 11 (23 %) 9 (18,5 %) 25 (52 %) 48 (100%) (10 %) 16 (39 %) 9 (22 %) 12 (29 %) 41 (100%) Tabulka č. 8: Procentuální zastoupení souboru dle ambulantních oddělení V další tabulce je uvedeno zastoupení jednotlivých lůţkových oddělení. IK DVK NK ostatní Všechny ambulance (25 %) 1 (25 %) 1 (25 %) 1 (25 %) 4 (100 %) (50 %) 1 (50 %) - 2 (100 %) (100 %) (100 %) (25 %) 3 (75 %) (100 %) Tabulka č. 9: Procentuální zastoupení souboru dle lůţkových oddělení Z obou tabulek je jasné, ţe mnohem častěji chodí poţadavek na vyšetření z ambulantních oddělení, konkrétně ambulance v našem souboru ze všech vzorků dohromady za všechny 4 roky tvoří 191 vzorků, lůţková oddělení doplňují plný počet o 11 vzorků Rozdělení souboru dle diagnóz Indikací k odběru poševního výtěru můţe být velké mnoţství onemocnění, nejčastěji je to poševní zánět, kde je důleţité zjistit k jakému antibiotiku je Escherichia coli citlivá. Jiná 50

51 situace je u těhotenských diagnóz, kdy lze předpokládat, ţe ţena aktuálně nemá obtíţe a vyšetření má pouze screeningový charakter. Zánětlivé diagnózy Těhotenské diagnózy Ostatní diagnózy (72,5 %) 5 (10 %) 9 (17,5 %) (73,5 %) 3 (5 %) 12 (21,5 %) (57,5 %) 7 (14 %) 14 (28,5 %) (69 %) 4 (9 %) 10 (22 %) Tabulka č. 10: Procentuální rozdělení souboru dle diagnóz Nejvíce diagnóz tvoří zánětlivá onemocnění (zpravidla diagnóza poševního zánětu, tedy N76.0 či N76.1), kterých je ze všech 201 vzorků 137 (68 %). Diagnóz, které se týkají těhotenství, (péče o normální těhotenství, péče o rizikové těhotenství apod.) je dohromady 19 (9,5 %) a ostatní onemocnění, zejména nádorové choroby, tvoří 45 vzorků (22,5 %) Charakteristika souboru z hlediska nálezů dalších patogenů U některých pacientek je v souvislosti s kultivací Escherichia coli indikované vyšetření i dalších patogenů, eventuelně jejich zkoumání na antibiotickou citlivost. V našem případě uvádím nejčastější patogeny, které byly spolu s escherichií kultivovány a testovány. Rok SRAG CAAL CANA Ostatní * Celkem z 20 4 z 20 2 z z z 23 2 z 23 3 z z z 23 0 z 23 2 z z z 14 4 z 14 1 z 14 5 z Celkem 24 z 80 (30 %) 10 z 80 (12,5 %) * (například protey, stafylokoky, klebsiely aj.) SRAG = Streptococcus agalactiae CAAL = Candida albicans CANA = Candida sp. (non-albicans) 8 z 80 (10 %) 38 z 80 (47,5 %) Tabulka č. 11: Procentuální zastoupení dalších zkoumaných patogenů 80 (100%) Z tabulky je zřejmé, ţe nejčastějším dalším zkoumaným patogenem je Streptococcus agalactiae, tvoří 24 vzorků ze všech 80, které byly zkoumány i na další patogeny. Z celého souboru 201 vzorků to činí 12 %. 51

52 8. Výsledky 8.1 Vlastní porovnání citlivosti kmenů Escherichia coli V našem souboru během 4 let (v období vţdy leden březen) je přesně 201 vzorků od 193 pacientek. V roce 2007 bylo v zimním období odebráno dohromady 51 vzorků (26 %), v roce 2008 to bylo 56 vzorků (27 %), v roce vzorků (25 %) a v posledním roce našeho souboru bylo vyšetřeno 45 vzorků (22 %). Porovnání výsledků za čtyři po sobě následující roky ukázalo-neukázalo změny v charakteristice citlivosti kmenů. Zejména se ukázalo, ţe (co se ukázalo, co se neukázalo, v čem byly nebo nebyly rozdíly). Konkrétní vývoj citlivosti uvádějí následující tabulky a grafy: Ampicilin 25 z 51 (50 %) Ciprofloxacin 7 z 51 (13,5 %) Cefalotin 19 z 51 (37 %) Ko-trimoxazol 11 z 51 (21 %) Doxycyklin 14 z 51 (27 %) Nitrofurantoin 3 z 51 (6 %) Norfloxacin 8 z 51 (15,5 %) součet 33 z 56 (59 %) 12 z 56 (21 %) 28 z 51 (50 %) 11 z 56 (19 %) 19 z 56 (34 %) 7 z 56 (12,5 %) 14 z 56 (25 %) 23 z 49 (47 %) 6 z 49 (12 %) 15 z 49 (30%) 5 z 49 (10 %) 11 z 49 (19 %) 3 z 49 (6 %) 9 z 49 (18 %) 26 z 45 (57 %) 5 z 45 (11 %) 13 z 45 (29 %) 11 z 45 (24,5 %) 12 z 45 (26,5 %) 4 z 45 (9 %) 9 z 45 (20 %) Tabulka č. 12: Vývoj rezistencí antibiotik v po sobě jdoucích letech 107 ze 201 (54 %) 30 ze 201 (14,5 %) 75 ze 201 (37 %) 38 ze 201 (20 %) 56 ze 201 (28 %) 17 ze 201 (8,5 %) 40 ze 201 (20 %) 52

53 Graf č. 1: Vývoj rezistence antibiotik v po sobě jdoucích letech graficky U všech 201 kmenů byla pouţita sestava antibiotik pro močové infekce (většina léků je pouţitelná i pro gynekologické infekce), tedy tzv. GNTM test, v některých případech byly vzorky testovány i na další antibiotika (např. amikacin, cefepim, imipenem, meropenem, piperacilin, gentamicin atd.). Procentuálně test GNTM byl zastoupen vţdy, tedy 100% a ostatní testy tvoří z celkového mnoţství 201 vzorků 31 vzorků (15,5 %). Nejčastěji byly další testy vyuţívány roku 2008 celkem 16 vzorků z 56 (28,5 %) a nejméně byly pouţity v roce 2009, kdy byly indikovány pouze ve 3 případech ze 49 (6 %). Z grafu je hezky vidět, ţe nejvíce rezistencí bylo zaznamenáno v roce Kmeny citlivé na všechna ATB Kmeny rezistentní na všechna ATB z 51 (41 %) 0 z 51 (0 %) 4 z 51 (8 %) z 56 (33 %) 1 z 56 (2 %) 5 z 56 (9 %) z 49 (39 %) 0 z 49 (0 %) 2 z 49 (4 %) z 45 (35,5 %) 2 z 45 (4,5 %) 1 z 45 (2,5 %) Celkem 75 z 201 (37 %) 3 z 201 (1,5 %) 12 z 201 (6 %) Kmeny rezistentní na všechna ATB s výjimkou nitrofurantoinu Tabulka č. 13: Procentuální zastoupení plných rezistencí a citlivostí v testu GNTM Z tabulky vyplývá, ţe citlivost na antibiotika zaznamenala ve sledovaném období několik výkyvů, celkově se však nedá vysledovat jednoznačný trend, zvláště s ohledem na poměrně malé počty kmenů. 53