= látka, která se stanovuje

Transkript

1 IMUNOSENSORY

2 Definice biosensoru Biosensor je analytický přístroj, který obsahuje citlivý prvek biologického původu, který je součástí nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem

3 převodník (transducer) elektronická jednotka výstupní signál biorekogni ční vrstva analyt = látka, která se stanovuje

4 Biorekognikační vrstva: biokatalytické (enzym) bioafinitní (afinitní vazba Ab, hormon, receptor) Převodníky: elektrochemické optické akustické a piezoelektrické kalorimetrické

5 Bioafinitní sensory: využívají jako biorekognikační složku biomolekuly, které jsou schopné specificky vytvářet komplex s analytem, který je strukturně komplementární k vazebnému místu imobilizované biomolekuly.

6 TYPY AFINITNÍCH INTERAKCÍ Molekulární reakce mezi: ANTIGEN HORMON LÉČIVO ENZYM RECEPTOR NUKLEOVÁ KYSELINA NUKLEOVÁ KYSELINA PROTILÁTKA RECEPTOR RECEPTOR KOFAKTOR (SUBSTRÁT, INHIBITOR) MIKROORGANISMUS VAZEBNÁ BÍLKOVINA KOMPLEMENTÁRNÍ ŘETĚZEC

7 + Afinitní interakce k a k d komplementární oblasti afinitní komplex Kinetické konstanty: k a... asociační rychlostní konstanta k d... disociační rychlostní konstanta K A = k a /k d asociační rovnovážná konstanta

8 Rozdělení afinitních sensorů přímé afinitní biosensory vznik biokomplexu je možné sledovat přímo v průběhu afinitní interakce (v reálném čase) převodníky: - optické světlovodné systémy - piezosensory - impedimetrická zařízení nepřímé afinitní biosensory jeden z afinitních partnerů je vhodně označen, na konci interakce se pak stanoví množství značky navázané na povrchu sensoru podle typu značky (enzym nebo fluorofor) se použije převodník vhodný pro měření enzymové aktivity nebo fluorescence

9 Přímé afinitní sensory

10 Schéma měření 1. imobilizace ligandu Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 2. asociace se vzorkem 4. regenerace Y Y Y Y Y Y Y 3. pufr disociace Y Y Y Y Y Y Y

11 PŘÍMÁ METODA vznik biokomplexu průběžně v reálném čase bez pomocí značek rozvoj telekomunikačních technologií na bázi světlovodu (nelineární optika) Jeden reakční partner je imobilizován na povrchu převodníku, druhý je volně v roztoku, průběžně se sleduje vazba na citlivém povrchu. Měřený signál odráží pouze změny na povrchu sensoru a v jeho těsné blízkosti.

12 Přímé imunosensory nelineární optika (optická vlákna) piezoelektrické imunosensory impedometrická zařízení

13 Optická vlákna kritická mez Šíření paprsku ve světlovodu jádro (core) - index lomu n 1 plášť (cladding) - n 2, n 2 <n 1 mechanický obal úhel dopadu větší než kritická mez - paprsek se šíří úhel dopadu menší než kritická mez - paprsek se tlumí

14 Jádro vlákna Plášť Obal Průměr vlákna sklo křemen (UV) plast (levné) silikonový plast (polykarbonát) stovky mm

15 Dva způsoby využití optických vláken přímé ozařování (extrinsic sensing) interakce se uskutečňuje na konci vlákna vlákno slouží k vedení světla nepřímé ozařování (intrinsic sensing) optický vodič neslouží pouze k pasivnímu vedení světla, ale chemické změny v těsném okolí světlovodu se sledují na základě vyvolaných změněných podmínek pro vedení světla uvnitř světlovodu. Význam pro konstrukci přímých imunosensorů

16 intrinsic sensing 1 2 Při vedení světla uvnitř světlovodu dochází k interferenci mezi dopadajícím a odraženým světelným paprskem a tím vzniká elektromagnetické stojaté vlnění. tlumená (zhášivá) vlna (evanescent wave). 1.Velmi tenký světlovod (tloušťka asi vlnová délka světla), světlo se šíří v určitých diskrétních modech (více odrazů na jednotku délky) 2. Silný světlovod

17 Exponenciální vlna z E mod: na vnějším povrchu interakce s látkami elektromagnetická vlna se šíří do okolí mimo světlovod, přitom její intenzita klesá exponenciálně se vzdáleností od rozhraní ( exponenciální vlna ) energetické profily exponenciální vlny jsou pro tři základní mody ukázány na obrázku pro vyšší mody narůstá podíl vnější energie a zvětšuje se penetrační hloubka

18 Optické převodníky pro afinitní interakce α n2 opticky řidší n1 opticky hustší Vznik exponenciální vlny Princip:Základem interakce je interakce exponenciální vlny s okolím sensoru. Při dopadu paprsku šířeného v opticky hustším prostředí na rozhraní s řidším prostředí pod úhlem větším než kritický (sina > n 2 /n 1 ), dochází k totálnímu vnitřnímu odrazu světla. přitom vzniká v opticky řidším prostředí elektromagnetická vlna vyvolaná interakcí dopadajícího a odraženého světla, jejíž intenzita klesá exponenciálně se vzdáleností od povrchu.

19 Dva typy optických systémů Interakcí exponenciální vlny s blízkým okolím sensoru, dochází ke změně podmínek pro šíření světla v optickém systému, které se kvantifikují podle změn intenzity nebo fázového posuvu vedeného světla. Planární světlovod IOS (integrated optical sensor) Rozhraní kov/dielektrikum rezonance elektromagnetické vlny šířené povrchovou vrstvou kovu (interakce vlny s volnými elektrony v kovu SPR (surface plasmon resonance)

20 IOS A SPR z exponenciální vlna C F d z P x C M d z P S IOS S SPR Teorie vychází ze změn efektivního indexu lomu N pro šíření vedené vlny uvnitř optického systému. Šíří se jeden definovaný mod, který má u: IOS složku magnetickou TM 0 a elektrickou TE 0 SPR pouze složku magnetickou TM 0.

21 Změny v poli exponenciální vlny jsou vyvolané navázáním biomolekul na citlivý povrch (změny indexu lomu n C v oblasti vzorku C) Penetrační hloubka exponenciální vlny v prostoru vzorku Z P S je podkladový substrát (obvykle sklo, n S = 1,46) F je planární světlovod (n F, tloušťka d, n F asi 2,0, d = 80 až 120 nm, materiály SiO 2 /TiO 2 nebo Si 3 N 4 ) M tenká vrstvička kovu (Au, Ag, tloušťky 20 až 60 nm) z exponenciální vlna C F d z P x C M d z P S IOS S SPR

22 Měřené signály: IOS C C F (M) z F F (M) změna indexu lomu okolního roztoku x adsorbovaná vrstva F df Měří se efektivní index lomu homogenní změna indexu lomu Dn C celého okolního prostředí C (roztoky pufrů n C = 1,33), systém tedy funguje jako refraktometr homogenní adsorbované vrstvy F je vlastní děj, má index lomu nf a tloušťku df vrstvu bílkovin: index lomu nf 1,45 1,55 tloušťka vrstvy df 4 10 nm

23 C vzorek M kov S podklad SPR hranol LED, laser α DAD Pro zavedení světla se používá vstupní hranol, povrchová vlna se excituje na rozhraní mezi kovem M a dielektrickou vrstvou C (vzorek). Místo hranolu lze použít i vstupní mřížku Jako detektor slouží řada fotodiod (DAD, diode array detector), což umožňuje určit závislost intenzity na úhlu odrazu

24 SPR signál Vazebná reakce => změna resonančních podmínek Intensita odraž. paprsku úhel odrazu α resonanční úhel odpovídající minimu intensity odraženého paprsku je kontinuálně vyhodnocován, jeho poloha je úměrná změnám povrchové hmotnosti vyvolaným adsorpcí biomolekul

25 SPR BIOSENSOR čip systému BIACORE Rozměry: 9 x 2,5 x 0,1 cm Modifikace povrchu: CM5 karboxymethyl-dextran, HPA hydrofobní, SA streptavidinový, NTA komplexace kovů

26 firma Pharmacia

27 Komerční optické systémy Biacore 2000 (Biacore) KI 1 (BioTuL) IAsys (Affinity Sensors) IBIS II (XanTec)

28 Piezoelektrické imunosensory Piezoeletrický efekt (bratři Curieové): V některých anizotropních krystalech (křemen, turmalín, Rochellova sůl) se při mechanickém namáhání generují orientované dipóly a vznik elektrické napětí. Tento efekt se uplatňuje i v obráceném smyslu: Pokud se na krystal přivede střídavé napětí o vhodné rezonanční frekvenci, začne krystal se stejnou frekvencí vibrovat,přitom se převážná část energie (105 : 1) uchová v oscilujícím systému a nerozptyluje se do okolí.

29 ORIENTACE PIEZOELEKTRICKÉ DESTIČKY osa (index) el. pole y (3) z (2) x (1) Orientace krystalografických os: tenký řez krystalu jsou podle tvaru krystalu možné vibrace: Mechanické deformace destička disk d 31 délková radiální d 32 šířková d 33 tloušťková tloušťková Předpokládá se, že elektrické pole ve směru osy y (d 3 )

30 Materiály pro piezoelektrické krystaly PŘÍRODNÍ UMĚLÉ PLASTY monokrystaly křemene, sensor se připraví vyřezáním destičky pod přesnými úhly (řezy AT, BT, ST ) materiály (dnes i křemen), různé druhy keramiky: polykrystalické, ale uniaxiální (orientované), příprava se provádí sintrováním (ZnO, LiNbO 3, LiTaO 3, Bi 12 GeO 20 ) Výhoda: snadné tvarování a nanášení tenkých vrstev. polyvinylidenfluorid PVDF (-CH 2 CF 2 -) n směs amorfní a polykrystalická forma (1:1) sestává se z nepolární náhodně orientované a polární orientované složky

31 Piezosensory - chemické mikrovážky objemová akustická vlna - schéma tloušťkové střihové vibrace základní stav / amplituda kontakty držák kovové elektrody Au nebo Pt na protilehkých stranách destička z křemene AT-řez 5 až 20 MHz Hmotnostní citlivost: QCM - quartz crystal microbalance Piezoelektrický krystal Df = 2-2f 0 Dm A r q m

32 Rezonanční frekvenci f 0 určují fyzikální vlastnosti křemene a tloušťka destičky (čím je tenčí, tím rychlejší vibrace a vyšší f 0 ) U typu QCM bývá f 0 od 5 do 20 MHz, pokud by krystal byl ještě tenčí, lámal by se. Když dojde k navázání látky na povrch elektrod, dojde ke změně rezonanční frekvence f 0. Změní se hmotnost celého systému a vibrace se zpomalí frekvence poklesne. Pokud krystal osciluje v přítomnosti kapaliny, dojde k dalším změnám f 0 v důsledku tlumení oscilací (viskozita prostředí)

33 Měření s PZ krystaly aktivní metoda PZ krystal je součástí širokopásmového oscilačního obvodu, jehož frekvence se řídí vlastnostmi krystalu aktuální frekvence se stanoví pomocí čítače, rozlišení je 0,1 až 1 Hz při základní frekvenci 10 až 20 MHz citlivost kolem 3 ng/hz a mez detekce 10 ng/cm 2 pasivní metody na PZ krystal se zvenčí přivádí střídavé napětí o známé proměnné frekvenci a v okolí rezonance se proměří impedanční charakteristika, závislost velikosti /Z/ a fázového úhlu f na frekvenci. Nákladná aparatura, impedanční analyzátor několik milionů korun, ale odliší hmotnostní a viskózní změny.

34 Měřící uspořádání počítač pumpa vzorek čítač (měřič frekvence) odpad oscilační obvod průtočná cela s krystalem

35 UKÁZKA MĚŘÍCÍHO ZAŘÍZENÍ Biochemická laboratoř MU Brno, PřF, katedra biochemie

36 UKÁZKA KINETICKÉ ANALÝZY pufr 5 ug/ml MAb k obs (s -1 ) Hz k obs = k d + k a *[Ab] k d = ( / ) -1 s k a = (2460 +/- 98) l mol -1 s min [MAb] (nmol/l) Studium interakce protilátky s imobilizovaným hapténem pomocí piezoelektrického biosensoru

37 Nepřímé afinitní sensory

38 Princip: použití vhodného značkového systému Průběh heterogenní: imunokomplex je zachycen na vhodném povrchu citlivá oblast převodníku), po proběhnutí reakce se odstraní reakční směs, povrch se promyje změří se množství zachycené značky značky: Výchozí metoda: radiaktivita (u biosensorů se nepoužívá) fluorescence luminiscence enzymová značka ELISA

39 Způsob měření: kompetitivní sendvičové uspořádání

40 Kompetitivní uspořádání Na citlivý povrch je imobilizován antigen. Při vlastním stanovení se vzorek smíchá s protilátkou a nechá se určitou dobu inkubovat. Směs se přidá k sensoru a zbylé protilátky se váží na modifikovaný povrch. Volný a vázaný antigen soutěží o limitované množství protilátky. Na konci reakce se povrch opláchne.

41 Zachycená protilátka primární se detekuje přídavkem sekundární vhodně označené protilátky. Sekundární protilátka má specifitu k té části primární protilátky, která neváže analyt (např. Fc část) Nebo lze používat vhodně označenou primární protilátku.

42 Formát kompetitivního stanovení lze také obrátit, na povrch sensoru lze navázat protilátku. Pak se inkubace provádí se vzorkem obsahujícím analyt a navíc se přidá analyt spojený s vhodnou značkou. Konjugátu značky s jedním z vazebných partnerů se říká tracer. Kalibrační křivka: závislost signálu Y na koncentraci analytu má charakteristický sigmoidní tvar. Strmost je tím větší, čím vyšší je afinita protilátky

43 Sendvičové uspořádání Je vhodné pro rozměrnější analyty, které v molekule nesou několik vazebných míst pro protilátku. Při inkubaci se vzorkem tato protilátka váže přítomný analyt. Poté se povrch opláchne a přidá se další protilátka, která rozpoznává jiné vazebné místo na povrchu analytu. Může být vhodně značená nebo se detekce provede pomocí třetí označené protilátky. Množství navázané značky je přímo úměrné koncentraci analytu ve vzorku.

44 Průběh kalibračních křivek při sendvičovém stanovení je závislý na afinitě protilátek. Afinita hraje menší roli, jak při kompetitivním stanovení.

45 Elektrochemické imunosensory Jednoduché levné velmi citlivé elektrochemický převodník + vysoká specifita protilátek Pracovní povrch: pracovní elektroda výměnná membrána s protilátkou předřazený imunoreaktor Značky: enzymy aktivita měřena elektrochemicky redoxaktivní látky (voltametricky) cheláty kovů (voltametricky)

46 Heterogenní stanovení: elektroda je modifikována protilátkou váže tracer při kompetitivním stanovení, zachycená enzymová aktivita se pak stanoví po přídavku substrátu: -amperometricky (změna proudu) -potenciometricky (změna potenciálu)

47 Amperometrické stanovení je vhodné ve spojení s těmito: enzymy a substráty peroxidasa H 2 O 2 + jodid, ferrocen nebo hydrochinon lakasa O 2 + hydrochinon katalasa (H 2 O 2 ) glukosoxidasa O 2 nebo ferrocen+glukosa alkalická fosfatasa p-aminofenylfosfát galaktosoxidasa p-aminofenyl-b-d-galaktosid acetylcholinesterasa acetylthiocholin Potenciometrické stanovení enzym substrát ureasa močovina

48 Páskové varianty imunochemického stanovení s vizuálním vyhodnocováním. Předstupeň mezi ELISA a nepřímými imunosensory Změna tloušťky vrstvy způsobená specifickým navázáním analytu se při vyhodnocování projeví jako změna pozorované barvy. Semikvantitativního imunostanovení na křemíkovém čipu. Barva a tvar pozorovaných skvrn umožňují kvantitativní vyhodnocení přítomnosti analytu ve vzorku. Výhodou je rychlost: nakápnutí a během několika minut lze pozorovat odezvu.

49 Imunochromatografické testy Těhotenský test zjištění těhotenství z moče detekce lidského gonádotropinu hcg (hormon placenty) včasná detekce těhotenství 25 miu/ml hcg C T konec určený pro držení v ruce testovací část nitrocelulosová membrána poduška: T: Ab proti hcg C: Ab proti myší protilátce poduška Ab proti hcg konjugát koloid Au

50 pozitivní C T

51 negativní C T

52 neplatný C T

53 neplatný C T

54 Imunochromatografické testy Detekce drog stanovení M3: THC, MET, MOR z moče C T konec určený pro držení v ruce poduška: T: drogový antigen C: Ab proti myší protilátce THC- tetrahydrocannabinol (marijuana) MET- methamphetamin MOR-morfin testovací část nitrocelulosová membrána poduška Ab proti drogám konjugát koloid Au

55 pozitivní C T droga z moče se naváže na protilátky z podušky, fialově zbarvený proužek v T oblasti se neobjeví

56 negativní C T málo antigenu z moče, konjugát Ab s Au se naváže na antigen v T oblasti vznikne fialové zbarvení konjugát Ab-Au by se vždy měl navázat na antimyšší Ab v oblasti C výrobce: Alfa Scientific Designs INc. POWAY CA USA dovozce testů: ELISABETH PHARMACON, spol.s.o., Nám. Svobody 18, Brno