MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ FAKULTA AGRONOMICKÁ DISERTAČNÍ PRÁCE. ve studijním oboru CHEMIE. Mgr. Barbora Procházková

Transkript

1 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ FAKULTA AGRONOMICKÁ DISERTAČNÍ PRÁCE ve studijním oboru CHEMIE Mgr. Barbora Procházková STANOVENÍ METABOLITŮ S VYUŽITÍM ELEKTROMIGRAČNÍCH METOD

2 Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat prof. RNDr.Vlastimilovi Kubáňovi, DrSc. za podporu při odevzdávání této práce, doc. Ing. Janu Pospíchalovi, DrSc. ze odborné vedení a rady během mého studia, Ing. Jiřímu Šalplachtovi, PhD. za pomoc při měření na MALDI TOF MS, Ing. Pavle Andrlové za pomoc s metodou 1-D SDS PAGE, Mgr. Nikole Kotlánové, PhD. za pomoc při měření na spektrofotometru NanoDrop a všem kamarádům a rodině za psychickou podporu. Prohlášení Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Stanovení metabolitů s využitím elektromigračních metod vypracovala samostatně s použitím literatury, kterou cituji. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně MZLU v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně Mgr. Barbora Procházková 2

3 OBSAH 1. ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST SINICE, ŘASY A JEJICH FYKOBILIPROTEINY ELEKTROMIGRAČNÍ METODY CÍLE PRÁCE EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST CHEMIKÁLIE POUŽITÉ PŘÍSTROJE BIOLOGICKÝ MATERIÁL METODY KULTIVACE, SKLIZNĚ A EXTRAKCE EXTRAKCE PBP CAF-IEF GELOVÁ ELEKTROFORÉZA V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU (1-D SDS PAGE) MALDI-TOF/TOF MS UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIE VÝSLEDKY A DISKUSE VÝBĚR ELEKTROLYTOVÉHO SYSTÉMU DÁVKOVACÍ PROCES A PROCES FOKUSACE ZÁVĚR LITERATURA SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ABSTRAKT SUMMARY ŽIVOTOPIS SEZNAM PUBLIKACÍ POSTER VEŘEJNÁ PREZENTACE

4 1.Úvod V posledních letech se zájem jak široké veřejnosti, tak i vědecké obce stále více obrací k problematice sinic a řas. Jednak jako k možnému zdroji potravy a zdroji surovin pro přípravu potravinových doplňků, dále také jako k potenciálnímu zdroji surovin pro výrobu biopaliv a v neposlední řadě také jako k velkému aktuálnímu problému našich vod. Řasy jsou zdrojem potravy lidstva už od nejstarších dob např. v Japonské a Čínské kuchyni je mnohostranně používána mořská červená řasa rodu Porphyra, která se u nás prodává pod obchodním název řasa Nori. Další sinice používaná do polévek a omáček je Spirulina platensis, známá také jako Arthrospira fusiformis a zelená řasa rodu Chlorela. Sinice a řasy jsou bohaté na bílkoviny, esenciální aminokyseliny, vitamíny (A, B2, B12, C), vlákninu a minerály (vápník, hořčík, zinek, jód, sodík, železo). Jsou zásadotvorné a vyrovnávají tak překyselení organismu, což bývá příčinou mnoha nemocí. Obsahují nenasycené mastné kyseliny, které příznivě regulují hladinu cholesterolu v krvi. Sinice a řasy svými antioxidačními účinky chrání buňky před působením volných radikálů. Odnímají z těla těžké kovy jako je olovo, rtuť a kadmium. Používají se jako prevence nebo stav zlepšující prostředek při široké škále civilizačních chorob, např.: vysoký krevní tlak, arterioskleróza, alergie, revmatismus, rakovina, poruchy nervové i gynekologické. Na druhou stranu, vysoký nárůst řas a sinic v letních měsících v rybních, přehradách a mořích způsobuje jak lidem, tak živočichům nemalé problémy. Sinice vystoupají na hladinu v podobě zelené kaše nebo drobných až několik milimetrů velkých částeček a vznikne tzv. vodní květ. Sinice a některé řasy obsahují látky, které mohou u alergiků způsobit výskyt přecitlivělých reakcí, jako jsou kožní problémy, záněty a alergické reakce očí a spojivek. Vlivem produkce toxinů dochází k otravám. Mohou to být projevy od lehkých akutních otrav, projevujících se střevními a žaludečními potížemi, přes bolesti hlavy, až po vážnější jaterní problémy. Jsou známy případy úhynu zvířat, ryb a dokonce i úmrtí lidí, kteří pravidelně pili vodu ze zdroje s masovým výskytem sinic. Vzhledem k nutnosti důkladného poznání složení řas a sinic byla vypracována řada separačních metod pro izolaci jednotlivých složek organického vzorku. Některé tyto složky potom nachází využití v návazných výzkumných pracích, lékařství apod. Separování a koncentrování proteinů hraje významnou roli v biochemii, proto byla vypracována řada purifikačních metod a postupů. Při separaci proteinů je nejvíce používána metoda gelové elektroforézy, která je však poměrně časově náročná. Pro rychlou přípravu vzorků, např. pro hmotnostní spektrometrii se nabízí relativně nově vyvinutá metoda izoelektrické fokusace bez nosných amfolytů, které je tato práce věnována především. 4

5 Izoelektrická fokusace bez nosných amfolytů (CAF-IEF) je metoda, která spojuje prvky izotachoforézy (ITP) a izoelektrické fokusace. (IEF), která je akceptována jako standardní metoda pro charakterizaci a separaci amfolytů z jejich směsí. K její realizaci je nutné mít k dispozici nosné amfolyty, které vytváří gradient ph, ve kterém dochází k separaci amfolytů na základě jejich pi. Použití nosných amfolytů může při pozdější identifikaci činit problémy, např. absorbci ve stejné oblasti spektra jako amfolyty, nebo mohou tvořit s amfolytem konjugáty. Také pořizovací cena je poměrně vysoká. Všechny tyto faktory vedly k pokusu o vytvoření stabilního ph gradientu bez těchto nosných amfolytů. U izoelektrické fokusace bez nosných amfolytů je gradient ph, původně vytvořený nosnými amfolyty, nahrazen ph skokovým rozhraním tvořeným vhodným elektrolytovým systém. Zde dochází k fokusaci amfolytů na základě jejich pi. Její přednosti jsou v jednoduchém experimentálním uspořádání, ve finanční nenáročnosti a v poměrně krátké době potřebné pro analýzu. Již dřívější práce poukázaly na vhodnost použití této metody pro předkoncentraci a purifikaci směsí modelových proteinů pro hmotnostní spektrometrii [1]. Tato práce rozšiřuje využití uvedené metody pro purifikaci proteinů z biologických matric, konkrétně fykobiliproteinů ze sinic a červených řas. 5

6 2.Teoretická část 2.1. Sinice, řasy a jejich fykobiliproteiny Sinice Cyanobacteria (Cyanophyta) Sinice jsou prokaryontní gramnegativní autotrofní organismy s oxygenní fotosyntézou, které podle stavby stélky a přítomnosti specializovaných buněk (heterocystů) rozlišujeme na řády: Chroococcales, Oscillatoriales, Nostocales a Stigonematales. Název sinic, Cyanophyta, zdůrazňuje speciální asimilační modré barvivo (fykocyanin), které spolu s jinými asimilačními barvivy propůjčuje stélkám těchto sinic modrozelenou barvu. Od řas i vyšších rostlin se sinice odlišují tím, že asimilační barviva nejsou uložena v chromatoforech, nýbrž jsou difusně rozptýlena ve vnější plasmě, která přejímá funkci asimilačního orgánu. U sinic nejsou přítomny obrvené rozmnožovací buňky ani gamety nebo jiné pohlavní orgány [2]. Protoplast sinic je primitivně rozdělen na vnější chromatoplasmu, obsahující asimilační barviva, a vnitřní bezbarvou centroplasmu, zvanou také centrální těleso. Chromatoplasma obsahuje difusně rozptýlená asimilační barviva, jichž ubývá do středu buňky. Chromatoplasma přejímá jako celek fyziologickou funkci chromatoforu, není však od ostatní plasmy oddělena zřetelnou hranicí. Asimilační pigmenty sinic jsou rovnoměrně rozptýleny v chromatoplasmě, která u kulovitých sinic je pravidelná a stejnoměrná. U vláknitých forem je chromatoplasma výrazně tlustší při povrchu vlákna než u příčných stěn. Obsahuje převážně chlorofyl a (nejdůležitější fotosyntetické barvivo [3]). Chlorofyl b zcela chybí. Ze skupiny karotenoidů byly v mnoha sinicích nalezeny hlavně β-karoten a v malém množství flavacin. Z xanthofylů převládá myxoxanthin a myxoxanthofyl. Charakteristické modré barvivo sinic, C-fykocyanin (CPC), nechybí žádnému druhu. Toto bílkovinné barvivo je rozpustné ve vodě a nerozpustné v tucích. Podobně se chová červené barvivo sinic, fykoerythrin (PE), který se nepatrně liší od stejnojmenného barviva červených řas (Rhodophyta). Mnohým sinicím však fykoerythrin chybí. Obě barviva náleží do skupiny barviv tzv. fykobilinů (PBP) [2]. Buněčná blána (membrána) obklopující protoplast sinic je složena, zvláště u vláknitých typů, ze dvou vrstev: z vnitřní blány a z vnějšího obalu. Skoro všechny sinice jsou opatřeny slizovými pochvami, které jsou buď rozplývavé a bez struktury, nebo pevné a vrstvené. Plynné vakuoly se zpravidla vyskytují u planktonních sinic a snižují jejich specifickou hmotnost do té míry, že tyto sinice se vznášejí při hladině 6

7 v podobě vodního květu. Kromě planktonních sinic mají plynné vakuoly sinice žijící na hnijícím bahně nebo v jiném prostředí chudém na kyslík. Tvar buněk sinic je jednoduchý: kulovitý, elipsoidní, válcovitý, soudečkovitý, vejčitý, tyčinkovitý nebo půlměsíčitý. Buňky jsou nečleněné, bez výrůstků a bez nápadné specializace. Nové buňky vznikají nepohlavním dělením, některé rody tvoří spory. Buňky sinic zřídka žijí jednotlivě. Zpravidla tvoří slizovité kolonie nebo jsou seskupeny ve vlákna. Shluky kolonií buněčných sinic mohou nabýt takových rozměrů, že jsou viditelné pouhým okem vodní květ [4]. Některé vláknité formy mívají specializované buňky heterocyty, ve kterých probíhá fixace vzdušného dusíku a akinety, což jsou klidové buňky určené k přetrvání nepříznivých období [2] Výživa sinic Sinice jsou autotrofní organismy, které asimilují CO2 pomocí asimilačních pigmentů a světelné energie. Dovedou však zpracovávat i organické látky, a žijí tedy mixotrofně. Proto některé druhy mohou vegetovat i za nepřítomnosti světla. U druhů rostoucích hluboko pod vodní hladinou můžeme pozorovat chromatickou adaptaci, tj. přizpůsobení barvy sinic ke změně spektrální charakteristiky světla; chromatická adaptace byla dokázána také experimentálně, ukázalo se, že kromě barvy světla je důležitá i jeho intenzita. Sinice vytvoří komplementární barvu k barvě dopadajícího světla, tj. při modré barvě v hloubce vody se v chromatoplasmě sinic zvýší množství fykoerythrinu [4] Výskyt sinic Sinice jsou v přírodě obecně rozšířeny. Rostou i na místech, na nichž jsou životní podmínky pro ostatní rostliny nepřijatelné (skály, ledovce, horká vřídla atd.). Vynikají neobyčejnou odolností vůči nízkým teplotám. Rostou jako první organismy na nově vytvořené a neosídlené zemi, např. na vulkanických ostrovech. Mnoho sinic nacházíme v planktonu. Život sinic v planktonní zóně v četných případech umožňují plynné vakuoly, které činí buňky lehčími než voda, takže se sinice za klidného počasí shromažďují při hladině a tvoří vodní květy. Terestrické formy sinic žijí na vlhkých stanovištích, na zemi, na skalách, na střechách, na kůře stromů, v jeskyních apod. Sinice jsou také důležité z hlediska zemědělské výroby. Vnikají hluboko do ornice a dovedou tam žít i bez viditelného záření. Tyto sinice mají pro mikrobiální život jistě větší význam, než je dosud známo. Např. sinice z rýžových polí Indie dovedou asimilovat vzdušný dusík do té míry, že spolu s bakteriemi kryjí spotřebu dusíku pro pěstované plodiny. 7

8 Některé sinice jsou citlivými ukazateli jakosti vody, proto mají význam jako vůdčí indikátory v biologické analýze vod. Sinice dokáží srážet vápence a jejich činnost je někdy tak intenzivní, že vznikají mohutné sraženiny (sintry, tufy, travertiny). Vápenec se sráží obyčejně v pochvách nebo na pochvách vláknitých sinic z čeledi Oscillatoriaceae. Symbióza sinic s lišejníkovými houbami se vyskytuje u rosolovitých lišejníků [4] Ruduchy Červené řasy (Rhodophyta) Ruduchy jsou fotoautotrofní eukaryotní organismy s jednobuněčnou nebo mnohobuněčnou stélkou. Jedním z hlavních znaků je absence bičíků v životních cyklech všech známých ruduch. Podle stavby stélky a dalších znaků rozlišujeme tři třídy. První z nich, Cyanidiophyceae, obsahuje jednobuněčné ruduchy rostoucí v extrémních podmínkách. Třída Bangiophyceae obsahuje vývojově primitivní ruduchy. Třetí třída, Florideophyceae, zahrnuje většinu známých ruduch. Patří sem ruduchy se složitější stélkou, která může být jednoosá, nebo mnohoosá. Buňky ruduch jsou vždy pokryté buněčnou stěnou. Její základní strukturu tvoří submikroskopické mikrofibrily celulózy s pravidelným křížovým uspořádáním. Celulóza je v buněčné stěně obsažena jen několika procenty. Podstatnou složkou jsou vysoce amorfní hydrofilní polygalaktany. Důležitou součástí stélek a reprodukčních buněk je sliz. Ruduchy patří k několika skupinám řas, u nichž dochází ke kalcifikaci buněčné stěny, při které se ukládají kalciové nebo aragonitové krystaly. Při velké reprodukční potenci ruduch mají tyto řasy značnou horninotvornou kapacitu, která se uplatňovala a uplatňuje při vzniku fosilních a růstu recentních korálových útesů. Chloroplasty ruduch mají v rozsahu celého oddělení podobnou submikroskopickou stavbu. Jsou uloženy volně v cytoplasmě a nemají žádné spojení s jádrem nebo s cisternou endoplazmatického retikula. Jejich povrch pokrývá dvojice membrán. Tylakoidy jsou uloženy vzájemně rovnoběžně. Jejich vnější povrch pokrývají polokulovité nebo válečkovité fykobilizomy, které obsahují přídavná fotosyntetická barviva, fykobiliproteiny (PBP), podobně jako ve stejných strukturách tylakoidů sinic. Jedná se o modrý fykocyanin, allofykocyanin a červený fykoerythrin. Hlavní fotosyntetický pigment, chlorofyl a, je obsažen v tylakoidech. U některých ruduch byl zjištěn také chlorofyl d, ale jeho distribuce není přesně zmapována. Dalšími pigmenty obsaženými v chloroplastech jsou: α-karoten a β-karoten a xantofyly, zeaxantin a lutein. Výsledná barva ruduch závisí na poměrném zastoupení jednotlivých pigmentů v chloroplastech. Červená barva stélky je považovaná za typickou a vyjadřuje převahu fykoerythrinu [2], nicméně sladkovodní ruduchy obvykle červené nejsou [3] Výskyt ruduch Ruduchy jsou velmi početná skupina převážně mořských řas ( druhů) a jsou dominantními mořskými makrofyty. Rostou v litorální a sublitorální zóně, 8

9 ve větších hloubkách než jiné řasy. Jsou to producenti, ostatním organismům poskytují potravu i úkryt. Od rovníků k pólům však jejich význam klesá, jde hlavně o tropické druhy, ale lze je nalézt na celém světě, včetně Antarktidy. Sladkovodní ruduchy preferují prudce tekoucí vody, kde je menší kompetice ostatních řas. Nejhojnější sladkovodní ruducha je Potěrka žabí símě, která roste i v Česku, v rašelinných tůních a v potocích [5] Využití ruduch Makrofytické ruduchy nachází tradiční i moderní využití v potravinářském a farmaceutickém průmyslu. Vyrábí se z nich agar a jsou důležitým potravním doplňkem. V tradičním lékařství se používaly při léčení různých chorob. Jsou účinné proti parazitickým červům, počítá se s nimi při léčbě epilepsie a přípravek z Ptilota plumosa specificky sráží krev skupiny B [2] Tylakoidy Tylakoid je slovo pocházející z řečtiny a znamená podobný pytli. Tylakoidy jsou ploché váčky, buď přibližně kulaté, o průměru zpravidla méně než jeden mikrometr, nebo užší a protáhlé v jednom směru. Jsou tvořeny tylakoidními membránami, jejichž tloušťka se pohybuje okolo šesti nanometrů. Složkami tylakoidních membrán (obr. 1) jsou mj. dva typy chlorofylbílkovinných komplexů (PS 1 a PS 2). Molekuly chlorofylu v reakčních centrech obou komplexů mají schopnost přenášet elektrony (odebírané z molekul vody) přes tylakoidní membránu proti potenciálovému spádu. Oddělení elektrických nábojů v reakčních centrech je vlastní podstatou fotosyntetické přeměny energie. Pro každé reakční centrum sbírá (soustřeďuje) zářivou energii několik stovek molekul chlorofylů (chlorofyl a, chlorofyl b) a dalších barviv, karotenů a xantofylů, tvořících ve vazbě na bílkoviny světlosběrné komplexy fotosystémů [6]. 9

10 Obr. 1.OEC komplex uvolňující kyslík, PS fotosystém (reakční centrum, dřeňový komplex), LHC světlosběrný komplex (u LHC 2 vyznačena jeho periferní mobilní a vnitřní imobilní část), Cyt blf komplex cytochromů, CF / CF ATP syntáza (coupling factor), P680, P700 pigment centra fotosystému (s udaným maximem absorpce), PQ - plastochinon, PC plastocyanin, Fd ferredoxin [6]. Na povrchu tylakoidního váčku se nacházejí tzv. fykobilizómy. Ty zachytí více než polovinu fotonů, které se dostanou do reakčního centra. Jsou to proteinové komplexy s charakteristickou vnější strukturou, které slouží jako světlosběrné přenašeče energie pro fotosystém II [7]. Mívají různý tvar (polokulovité nebo vějířovité útvary). Jsou různě veliké, obvykle o průměru asi 30 nm, molekulové hmotnosti 7 až 15 tisíc kda a obsahují 300 až 800 bilinových molekul [8]. Obr. 2.Struktura fykobilizómu [9]. 10

11 Jednotlivé vějířovité (nebo polokulovité) fykobilizómy sestávají ze dvou nebo tří válců, na které nasedají radiálně tyčky (obr. 2). Válce i tyčky jsou sestaveny ze strukturních jednotek tvaru terčíku o průměru 11 nm uprostřed s otvorem o světlosti 3 nm. Terčíky sestávají z trimerů (tloušťka 3 nm) a hexamerů (tloušťka 6 nm) základního dimeru, složeného z neidentických podjednotek α a β, jejichž molekulová hmotnost je okolo 20 kda. Ta obsahují jednu nebo více kovalentně připojených otevřených tetrapyrolových jader, která jsou navázána přes jednu a někdy dvě thioétherové vazby. Jsou známy úplné primární struktury bílkovinných podjednotek α a β všech spektroskopických tříd fykobilinů. Je také známo, na kterých cysteinových zbytcích jsou vázány fykobilinové chromofory a jak nekovalentní vazba jejich druhého konce mění absorpční vlastnosti barviva. Dále je známo, jak se podjednotky α a β spojují v dimer (αβ) a jak tyto dimery vytváří trimery (αβ)3 nebo hexamery (αβ)6, základní stavební kameny fykobilizómů. Dimery (αβ) lze disociovat při velmi nízké iontové síle roztoku nebo působením chaotropních činidel, ale na disociaci heterodimeru je třeba použít činidel, která současně bílkoviny denaturují. Přenos excitace je směrován skrze tyčinky do jádra a zde z donorových bilinů s absorpčním maximem 660 nm na koncové akceptorové biliny o maximu 670 nm. V tyčinkách je přenos také směrován pořadím fykobilinových pigmentů ve sloupci terčíků od fykoerythrinu přes fykocyanin k allofykocyaninu, tedy z barviva s maximem absorpce při kratší vlnové délce na barvivo s maximem při delší vlnové délce. Pravidelnost struktury pro takto přesně uspořádanou funkci zajišťují spojovací bílkoviny, které jednotlivé terčíky k sobě poutají [8]. Fykobilizómy se skládají z fykobiliproteinů, což jsou rostlinná barviva vyskytující se u sinic a zástupců některých oddělení nižších rostlin u skrytěnek, rozsivek, hnědých řas, ruduch a krásnooček [9, 10]. Mohou představovat až 60 % z rozpustných buněčných proteinů. Patří do rodiny světlosběrných makromolekul, jejichž funkcí je zachytávání energie v rozmezí vlnových délek nm a přenášení energie na chlorofyl a dále do fotosyntetického reakčního centra. Značná citlivost tohoto typu světlosběrné antény umožňuje mj. fotosyntézu sinic při velmi nízké hladině osvětlení hluboko pod hladinou vody, v půdě, uvnitř kamenů, v jeskyních atd. Podle spektrálních vlastností můžeme fykobiliproteiny rozdělit do tří hlavních skupin: fykoerythrin (PE, λmax = 560 nm), fykocyanin (PC, λmax = 620 nm) a allofykocyanin (APC, λmax = 650 nm) [8] Fotosyntetická barviva Ve fotosyntetickém ústrojí plní barviva tři úlohy: 1. Vlastní fotochemická přeměna energie v reakčních centrech. V oxygenní fotosyntéze je takto činný pouze chlorofyl a, u fotosyntetických bakterií jsou to nejčastěji také (bakterio)chlorofyly BChl a, ale u mnohých také BChl b. (Bakterio)chlorofyly, které po excitaci rozdělují náboje, tvoří obvykle dimerovou strukturu, tzv. zvláštní pár. 11

12 2. Zachycení fotonů a přenos energie soustavou molekul barviv do reakčního centra. To je úkol barviv zabudovaných v bílkovinných molekulách světlosběrných antén. V těchto pigmentproteinech jsou vedle (bakterio)chlorofylů a a b také další (bakterio)chlorofyly (c, d a e), fykobiliny a xanthofyly. Podle toho rozeznáváme antény převážně (bakterio)chlorofylové, převážně xanthofylové a výhradně fykobilinové. 3. Ochrana fotosyntetického ústrojí před (a) nežádoucí nebo (b) nadměrnou excitací. Chemicky patří všechna barviva fotosyntetických membrán do dvou skupin: tetrapyroly s uzavřeným kruhem (chlorofyly a bakteriochlorofyly) nebo s kruhem otevřeným (fykobiliny) [8] Otevřené tetrapyroly Fykobiliproteiny (PBP) jsou chromoproteiny s kovalentně vázanými barvivy fykobiliny. Fykobiliny jsou lineární neboli otevřené tetrapyroly a představuji hydrofilní (ve vodě rozpustné) polypeptidy. U živočichů se také setkáváme s biliny; jsou produktem rozkladu hemu (žlučová barviva). Také u sinic a řas vznikají fykobiliny oxidačním otevřením porfyrinového kruhu. Uhlíkové můstky mezi pyrolovými jádry bilinů mohou mít obě vazby jednoduché nebo jednu dvojnou. Všechny tři můstky nasycené mají bilany, např. urobilinogen, který je pouze u živočichů. Jeden můstek s nenasycenou vazbou mají bileny, např. fykourobilin, dva nenasycené můstky mají bilidieny, např. fykoerythrobilin nebo fykobiliviolin, a všechny tři můstky mají dvojnou vazbu u bilitrienů, jejichž příkladem je fykocyanobilin. Fykobiliny se na bílkovinu váží na jejich thioétherovou vazbu mezi prvým uhlíkem vinylového substituentu na pyrolovém kruhu fykobilinu a cysteinovým zbytkem v molekule bílkoviny. Všechny fykobiliny jsou takto vázány přes vinyl na kruhu A. Některé fykoerythrobiliny a fykourobiliny mají ještě druhou takovou vazbu na kruhu D [8]. 12

13 Obr. 3.Strukturní vzorce fykocyanobilinu (A) a fykoerythrobilinů (B, C) [8]. Čtyři druhy fykobiliproteinů, které se vyskytují v sinicích a ruduchách, se liší polohou absorpčních maxim ve spektru: allofykocyanin (APC) má maximum absorpce mezi 650 a 680 nm, fykocyanin (PC) mezi 620 a 635 nm, fykoerythrocyanin (PEC) absorbuje nejsilněji u 575 nm a fykoerythrin (PE) mezi 545 a 565 nm. Velká rozmanitost absorpčních vlastností fykobiliproteinů není tolik dána nepříliš výraznými rozdíly ve struktuře molekul samotných fykobilinů, jako především jejich vzájemným působením s bílkovinou, na níž jsou vázány. Ačkoli fykobiliny nazýváme lineární tetrapyroly, jejich molekula má tvar přeštípnutého prstence, jehož volné konce jsou od sebe oddáleny ve směru kolmém na rovinu kruhu. To je přirozené uspořádání čtyř pyrolových molekul. Ve fykobiliproteinech jsou však fykobilinové molekuly v různé míře nataženy, buď kovalentní vazbou na bílkovinu na obou koncích, nebo jiným silovým působením aminokyselinových zbytků v bílkovině. S natažením molekuly se výrazně mění její absorpční vlastnosti. Nejčastějšími chromofory fykobiliproteinů jsou modrý fykocyanobilin (λmax = nm), červený fykoerythrobilin (λmax = nm) a červený fykourobilin (λmax = nm). Méně častý je purpurový fykobiliviolin a dosud blíže neurčený zelený fykobilin odvozený od biliverdinu (λmax = nm). Všechny sinice a ruduchy obsahují allofykocyanin (αapcβapc )3 a fykocyanin (αpcβpc)6. Především u ruduch (ale také u některých sinic) k nim přistupuje fykoerytrocyanin (αpecβpec)6 nebo některý z fykoerythrinů. To může být C-PE, jehož složení je (αpeβpe )6, nebo B-PE a R-PE se strukturou (αpeβpe )6τ. Písmena C, B u fykoerythrinů a R u skrytěnek (Cryptophyta) označují příslušnost ke skupině charakterizované tvarem absorpčního spektra (a ovšem také strukturou, na níž tvar spektra závisí). τ ve fykoerythrinech je třetí podjednotka s molekulovou hmotností okolo 30 kda a s vysokým obsahem chromoforů [8]. 13

14 2.1.4.Fykocyanin (PC) Fykocyanin je modrý protein, který slouží jako světlosběrná anténa pro světelnou energii přijímanou z okolního prostředí, která je sinicí nebo řasou dále převáděna do molekuly ATP. Je to bílkovinný komplex, který se skládá ze dvou bílkovinných podjednotek α a β, na podjednotce α je navázán jeden fykocyanobilin a na podjednotce β jsou navázány dva [11]. Bílkovinný komplex se nepatrně liší organismus od organismu [12]. Je dobře rozpustný ve vodě, nerozpustný v kyselých roztocích (ph 3) [13], jeho izoelektrický bod (pi) je okolo 4,7 a molekulová hmotnost jednotlivých podjednotek je v rozmezí kda [14]. Také jsou známy krystalové struktury fykobilinového komplexu [14]. Fykocyanin se rozkládá vlivem světla a je nestabilní již při pokojové teplotě, kdy ztrácí modrou barvu [16]. Experimentálně se u fykocyaninu neprokázaly toxické účinky na zvířatech [17]. Naopak, fykocyanin má v nanomolárním množství antioxidační vlastnosti [18], indukuje apoptózu [19] a jeví se jako možné chemoterapeutikum [20]. Zvyšuje obranyschopnost organismu před infekcemi, má protizánětlivé účinky [18], je neuroprotektivní [21] a chrání před ledvinovým kameny [22] Allofykocyanin (APC) Allofykocyanin je modrý fykobiliprotein, který je lokalizován v jádře fykobilizómu a je jeho hlavní součástí. Skládá se z podjednotek α a β, které jsou v poměru 1:1, a na každé podjednotce je jedna molekula chromoforu fykocyanobilinu. Fykobilizómy sinic a červených řas mají tři typy jader: bicylindrické, tricylindrické a pentacylindrické. U bicylindrického typu oba cylindry leží na povrchu tylakoidní membrány. Při ph pufru 6 7 disociuje fykobilizóm na jednotlivé biliproteiny, které mohou být dále purifikovány. Allofykocyanin je purifikován jako trimetr (obr. 4). Jsou známy primární struktury podjednotek α a β u sinic i červených řas [23, 24]. Molekulová hmotnost podjednotek se pohybuje okolo 18 kda. Trimer allofykocyaninu je disociován na monomer za určitých podmínek. Částečné disociace se dosáhne mírným okyselením a použitím chaotropních činidel 0,5 1,0 M NaSCN nebo NaClO4. Monomery se mohou asociovat zase zpět na polymery. Absorpční spektra trimeru a monomeru jsou rozdílná. Monomer má absorpční maximum při 615 nm a trimer při 650 nm se zřetelným sekundárním maximem při 620 nm [25, 26]. Allofykocyanin stejně jako fykocyanin indukuje apoptózu [27]. 14

15 Obr. 4.Strukturní schéma APC [28] Fykoerythrin (PE) Fykoerythrin je červený, ve vodě rozpustný fykobiliprotein, složený ze dvou podjednotek α a β a dále ještě z polypeptidu γ (τ), který je spojovacím proteinem. Jsou známy dva fykoerythriny: B-PE a R-PE, přičemž každý z nich obsahuje jiný počet fykoerythrobilinů. To se projevuje přítomností různých absorpčních maxim (R-PE 565 nm, B-PE 545 nm). Množství variant je dáno druhem organismu [29]. PE je rozpustný ve vodě a je známa jeho krystalová struktura [30]. Molekulová hmotnost podjednotky α je asi 18 a β 20 kda. Izoelektrický bod (pi) jednotlivých podjednotek je 4,3 [31] Využití fykobiliproteinů PBP se používají jako přírodní barvící látky v potravinářství (žvýkačky, zmrzlina) a v kosmetice (krémy) [32, 33]. Fluorescenčních vlastností se využívá v molekulární genetice ke značení nukleových kyselin [34] a také při sledování vývojových stadií fytoplanktonu a biomasy. 15

16 2.1.8.Metody extrakce, purifikace a identifikace fykobiliproteinů (PBP) Fykobiliproteiny (PBP) mohou být z organismu získávány různými destrukčními a extrakčními technikami, a to jak metodami fyzikálními (mechanickými), tak chemickými, příp. enzymatickými, např. extrakcí v ultrazvukové lázni, metodou french press, metodou postupného zmrazování a rozmrazování, pomocí dvoufázového vodního systému (ATPS), rozrušením pomocí kuliček nebo písku, mrazením dusíkem a následným pomletím na kryogenním mlýnku nebo enzymatickou hydrolýzou lysozymem [25, 35-42]. Purifikace PBP se obvykle provádí kombinací metod např. vysolováním (síranem amonným), dialýzou a poté obvykle následuje chromatografie (iontoměničová, gelová nebo adsorpční chromatografie). Další možnou separační technikou je centrifugace v gradientu sacharózy a kapilární elektroforéza. Také byla provedena separace PBP pomocí izoelektrické fokusace (IEF) na čipu a izoelektrické fokusace ve volném roztoku ve speciálně upraveném přístroji s izoelektrickou membránnou [25, 37, 43-53]. K charakterizaci a identifikaci PBP se používají techniky jako je kapilární elektroforéza s laserem indukovanou fluorescenční detekcí a kapilární elektroforéza v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (CE-IT-MS, CE-ESI-MS, CE-TOF-MS). Dalšími technikami jsou reverzně fázová kapalinová chromatografie (HPLC, HPLCESI-MS) a planární gelová elektroforéza - SDS-PAGE [37, 38, 48, 50, 51, 54]. Čistota a množství proteinu mohou být přímo stanoveny pomocí absorpční spektrometrie, spektrofotometrie, polarizační fluorescencí, fluorescencí indukovanou laserem, nebo cirkulárním dichroismem [ 40, 41, 49, 50, 51, 55-57]. 16

17 2.2. Elektromigrační metody Základy elektromigračních metod Historie objevu elektroforézy se datuje rokem 1892, kdy byl poprvé popsán pohyb anorganických částic v koloidním roztoku pod vlivem elektrického pole a nedlouho poté byl tento jev popsán i u proteinů ve vodných roztocích. Ve 30. letech 20. století zkonstruoval švédský chemik Arne Tiselius [58] zařízení umožňující rozdělení proteinů krevního séra na základě jejich elektroforetických pohyblivostí. Za tento významný objev byl oceněn Nobelovou cenou v roce 1948 [59]. V polovině 60. let vznikla nová elektroforetická metoda kapilární izotachoforéza (ITP), která se ukázala vhodnou pro analýzu směsí malých iontů, jak anorganických, tak i organických. Teoretické základy popisu této metody položil Kohlrausch [60] a první praktické pokusy separace látek pomocí ITP byly popsány Kendallem [61,62]. Bouřlivý rozvoj separačních elektromigračních technik nastal v 80. letech s použitím křemenných kapilár v separačním procesu [63, 64]. Účinnost separace v porovnání s velmi rozšířenou kapalinovou chromatografií byla do té doby nevídaná. V současnosti se používají především následující moderní kapilární elektroforetické techniky: zónová elektroforéza (CZE), izotachoforéza (ITP), izoelektrická fokusace (IEF), které mají velmi dobré separační vlastnosti, jako je selektivita, rozlišení a rychlost analýzy. Díky těmto skutečnostem patří elektromigrační metody mezi nejúčinnější separační metody vůbec [65, 66, 67, 68]. Dalšími kapilárními elektromigračními metodami jsou kapilární gelová elektroforéza, která využívá síťová pole polyakrylamidových a agarových gelů, dále bioafinitní elektroforéza v kapilárním uspořádání, elektrokinetická chromatografie a elektrochromatografie [69, 70, 71, 72] Popis a princip elektromigračních metod Elektromigrační metody patří mezi separační metody, kde dochází k separaci nabitých látek iontů, molekul, makromolekul i nižších organismů, na jednotlivé složky působením elektrického proudu, procházejícího roztokem elektrolytu. Jednotlivé separované složky vzorku jsou pak vhodným způsobem detekovány. Principem elektromigrační metody je využití rozdílné pohyblivosti nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli k jejich separaci. Pohyblivost (nebo-li mobilita) nabitých částic závisí na velikosti náboje, velikosti a tvaru molekul, podmínkách separačního prostředí a intenzitě použitého elektrického pole [73]. Obecně se přístroj pro kapilární elektromigrační metodu skládá z elektrodových komůrek, elektrod, kapiláry, místa pro nástřik, zdroje vysokého napětí a detektoru (obr. 5). 17

18 Obr. 5.Schéma kapilárního separačního zařízení. Rozlišujeme čtyři základní mody (varianty) elektroforézy: elektroforéza s pohyblivým rozhraním (MBE) zónová elektroforéza (CZE) izotachoforéza (ITP) izoelektrická fokusace (IEF) Elektroforéza s pohyblivým rozhraním MBE Elektroforéza s pohyblivým rozhraním je nejstarší technikou s diskontinuálním elektrolytovým systémem. Prakticky se pro separaci již nepoužívá, nicméně princip a způsob MBE migrace je ve své podstatě přechodně obsažen na začátku každé separace, ať už se jedná o ITP, CZE nebo IEF, proto je velmi důležité její pochopení. Experimentální uspořádání je analogické frontální metodě v chromatografii. V separačním prostoru je vytvořeno rozhraní mezi dvěma elektrolyty, z nichž jeden obsahuje vzorek a druhý se označuje jako tzv. vedoucí elektrolyt LE (leading electrolyte). Vedoucí elektrolyt je vybrán tak, aby jeden jeho iont (vedoucí iont) měl stejné nábojové znaménko a větší pohyblivost než separované ionty, jeho druhý iont opačného znaménka, tzv. protiiont migrující proti směru pohybu separovaných látek, zajišťuje elektroneutralitu systému a má většinou i vhodné pufrační účinky. 18

19 Průchodem elektrického proudu systémem začne vlastní separační proces. Vedoucí iont se začne pohybovat směrem do kapiláry a za ním se začnou vytvářet zóny složek vzorku. Pro N-komponentní směs vzorku se vytvoří N migrujících rozhraní a N zón. Délka jednotlivých zón se v průběhu času zvětšuje. Každá složka vzorku vytvoří zónu, jejíž pořadí, složení a rychlost pohybu jsou dány pořadím pohyblivostí dané složky ve vzorku, složením vzorku a složením vedoucího elektrolytu. Počet látek v zónách se směrem od vedoucího elektrolytu ke vzorku zvětšuje. Pouze nejrychlejší zóna obsahuje samotnou nejrychlejší složku vzorku, každá další zóna obsahuje kromě své složky i všechny složky rychlejší, které touto zónou neustále procházejí do svých vlastních zón. Koncentrace zón se řídí Kohlrauschovou regulační funkcí tzv. omega funkcí, jejíž hodnota je v průběhu separace konstantní, rozhraní mezi zónami jsou ostrá díky tzv. zaostřujícímu efektu. Metodu můžeme považovat za rovnovážnou, i když délka zón v průběhu separace narůstá, jejich složení zůstává konstantní [73]. Obr. 6. Schéma separace látek elektroforézou s pohyblivým rozhraním Zónová elektroforéza CZE Nejjednodušší elektroforetickou technikou je zónová elektroforéza. Její analogií v chromatografii je eluční metoda, která je nejběžněji používána [73]. CZE je vhodná pro separaci molekul s nábojem (iontů) lišících se svou molekulovou hmotností, tvarem a nábojem [74]. Vzorek migruje v prostředí základního elektrolytu BGE, jehož složení zaručuje v celé kapiláře konstantní separační podmínky, tj. konstantní koncentraci látek, iontovou sílu, ph a homogenní elektrické pole. Zóny jednotlivých látek migrují konstantní (ale každá svou) rychlostí a postupně se od sebe vzdalují. Zónová rozhraní nejsou ostrá a v průběhu experimentu se rozmývají vlivem difuse [75]. 19

20 Pro separaci je nutné, aby elektivní pohyblivosti, a tím i migrační rychlosti různých látek byly navzájem různé. Toho se docílí vhodnou volbou základního elektrolytu. Separace probíhá tak, že se do kapiláry naplněné základním elektrolytem vnese úzká zóna vzorku. Po vložení napětí mezi konce kapiláry začne protékat elektrický proud a jednotlivé látky vzorku začnou migrovat navzájem různými rychlostmi, a tím se separují. V kapiláře pak látky migrují směrem k detektoru, který je často umístěn přímo na kapiláře. Během jednoho experimentu lze dělit a detekovat oba dva druhy iontů (anionty, kationty) [76]. Kromě elektroforetického pohybu nabitých částic je celý objem roztoku uvnitř kapiláry uváděn do pohybu elektroosmotickým tokem. V kapilárách s nemodifikovaným vnitřním povrchem je tento tok orientován směrem ke katodě a jeho rychlost je relativně vysoká (většinou vyšší než rychlost elektroforetická) a anionty i kationty mohou být analyzovány současně během jednoho experimentu [77]. Koncentrace zón se opět řídí Kohlrauschovou regulační funkcí tzv. omega funkcí, jejíž hodnota je v průběhu separace konstantní. Díky přítomnosti základního elektrolytu v zóně je výsledná koncentrace složky vzorku v zóně poměrně nízká [73]. Obr. 7.Schéma zónové elektroforetické separace látek Izotachoforéza ITP Izotachoforéza je moderní analytická separační technika. Patří mezi metody s nehomogenním elektrolytovým systémem, chromatografickým analogem této metody je vytěsňovací chromatografie [73]. V ITP je vzorek umístěn mezi dva pomocné elektrolyty vedoucí elektrolyt (LE) a koncový (TE, tzv. terminating electrolyte) elektrolyt. Po ukončení separace každá zóna obsahuje pouze separovaný ion nebo jeho protiion, který je shodný ve všech zónách, všechny zóny migrují stejnou rychlostí, odtud název izotachoforézy (řecky isos = stejný, tachos = rychlost), stýkají se ostrými rozhraními a postupem času se nerozmývají díky 20

21 samozaostřujícímu efektu. V jedné analýze jsou separovány pouze složky migrující jedním směrem. Proto u ITP hovoříme o kationtové nebo aniontové separaci. Vedoucí elektrolyt má stejné vlastnosti a jsou na něj kladeny stejné požadavky jako na elektrolyt v MBE, koncový elektrolyt je vybrán tak, aby jeho tzv. koncový iont (stejného znaménka jako separované ionty) měl naopak menší pohyblivost než všechny separované složky vzorku. Průchodem elektrického proudu systémem začne vlastní separační proces. Vedoucí iont se začne pohybovat směrem do kolony a za ním se začnou vytvářet zóny složek vzorku. Pro N-komponentní směs vzorku se vytvoří N zón [75]. Koncentrace zón se rovněž řídí Kohlrauschovou regulační funkcí, jejíž hodnota je v průběhu separace konstantní. Metoda je rovnovážná, rozseparované zóny látek se po dosažení rovnováhy již nemění [73]. Obr. 8.Schéma izotachoforetické separace látek Izoelektrická fokusace IEF Izoelektrická fokusace je elektromigrační metoda s nehomogenním elektrolytovým systémem, metoda má obdobu v chromatografické technice nazvané chromatofokusace [73]. Metodou izoelektrické fokusace se separují tzv. amfolyty. Amfolyt je taková chemická sloučenina, která může existovat v kladné, záporné a neutrální formě v závislosti na ph prostředí, ve kterém se nachází. Amfolyty jsou např. aminokyseliny, peptidy a proteiny. Každý amfolyt má svůj izoelektrický bod, tzv. pi, které se rovná určitému ph, při kterém má amfolyt z makroskopického hlediska nulový náboj, a tudíž 21

22 se nepohybuje v elektrickém poli. Jestliže je ph prostředí vyšší než je pi amfolytu, převládá jeho záporná forma a v elektrickém poli migruje k anodě. V opačném případě převládá jeho kladná forma a amfolyt migruje ke katodě. Izoelektrická fokusace je založena na migraci amfolytu v ph gradientu. Vzorek je zakoncentrován v oblasti o určitém ph, které odpovídá jeho izoelektrickému bodu pi. V praxi se gradient vytvoří tak, že se separační kapilára naplní roztokem směsi amfolytů s různými pi (tzv. nosné amfolyty). Průchodem proudu směsí vhodných nosných amfolytů umístěných mezi dvěma krajními elektrolyty anolytem kyselinou (dávkujícím do kolony H+ ionty) a katolytem zásadou (dávkujícím do kolony OHionty) se vytváří v separační koloně podélný gradient ph. Po aplikaci vzorku a zapnutí proudu začne směs amfolytů a vzorek migrovat v elektrickém poli. Migrující amfolyty postupně ztrácejí náboj v závislosti na jejich pi a vzniká ph gradient. Dělené látky v tomto prostředí migrují, dokud nedoputují do té části separačního prostředí, jehož ph je rovno jejich pi. Zde budou mít z makroskopického hlediska nulový náboj a migrace se zastaví [78]. Izoelektrická fokusace je jedinou metodou, jejíž separační princip nebyl odvozen z Kohlrauschovy práce. Zónová rozhraní jsou velmi ostrá a časově stabilní. Hodnota funkce omega se v průběhu separačního běhu mění, výsledná koncentrace složky vzorku ve fokusované zóně je ovlivněna přítomností pomocných amfolytů v zóně a rovnováhou mezi sílou difuse a fokusace, je tudíž závislá na vloženém napětí na kolonu [73]. Po dosažení ustáleného stavu je v kapiláře třeba fokusované zóny uvést do pohybu tak, aby prošly detektorem a byly detekovány. K přirozené migraci zón dochází při IEF v křemenných kapilárách s neupraveným vnitřním povrchem v důsledku přítomnosti elektroosmotického toku [79]. Obr. 9.Schéma izoelektrické fokusace látek. 22

23 2.2.3.Izoelektrická fokusace bez nosných amfolytů (CAF - IEF) Izoelektrická fokusace bez nosných amfolytů CAF-IEF (Carrier Ampholyte FreeIsoelectric Focusing) je separační metoda spojující výhody kapilární ITP a IEF. Stejně jako IEF zvyšuje koncentraci amfolytu, separuje látky podle jejich pi, odstraňuje přebytek neamfolytů, zóny po ukončení separace neopouští separační kapiláru a většinou je nutné mít dostatečný objem separovaného vzorku. S metodou ITP má společné tyto znaky: tvoří ostře ohraničené zóny o konstantním složení, koncentrace v celém objemu každé zóny je stejná a každá ze zón obsahuje mimo jedné složky vzorku jen pomocný (modifikační) elektrolyt. Používá se ve speciálních případech, zvláště pro mikropreparativní účely, kdy se mohou nosné amfolyty vypustit a nahradit dvěma elektrolyty s regulovatelnou hodnotou ph. Ty vytvoří v koloně ostré rozhraní ph, na kterém se amfolyty vzorku zakoncentrují dle jejich pi [80-83]. Metoda je založena na oboustranné regulaci pohybu neutralizačního reakčního rozhraní (dále jen rozhraní), které je tvořeno dvěma elektrolyty (pufry) s různými hodnotami ph [84]. Tyto dva elektrolyty tvoří ostré rozhraní, na kterém dochází k fokusaci amfolytu. Při různých hodnotách ph elektrolytů se rozhraní pohybuje různou rychlostí. Při určité dvojici hodnot ph, odpovídající rovnosti toků H+ a OH iontů, se pohyb rozhraní zastaví. Regulací ph a rychlosti pohybu rozhraní můžeme dosáhnout stavů, kdy rozhraní stojí, nebo se pohybuje. Stacionární stav o nulové rychlosti je velmi výhodný, jak pro proces kontinuálního dávkování, tak pro fokusaci, předkoncentraci a přečištění vzorku. Nenulového stavu o známé rychlosti pohybu rozhraní se využívá k transportu fokusovaných zón k místu detekce a separace. Výhodou CAF-IEF je nepřítomnost nosných amfolytů, které jsou drahé a tvoří komplexy s analytem, což je nežádoucí pro další analýzu a identifikaci (MALDI-TOF MS) [85]. Experimentálně bylo prokázáno, že CAF-IEF se řídí Kohlraushovou omega funkcí, i když tato funkce není v průběhu fokusace konstantní Princip regulace pohybu neutralizačního rozhrani CAF-IEF Základem metody CAF-IEF je regulace velikosti solvolytických toků v kapiláře, což zásadně ovlivňuje složení elektrolytu v kapiláře a rychlost pohybu rozhraní. Změny velikosti solvolytických iontů se dosahuje tak, že část solvolytických toků JS vtékajících do kapiláry z elektrodové komůrky je nahrazena tokem chemicky nereaktivního co-iontu JG (modifikujícím elektrolytem), který migruje stejným směrem viz obr

24 Obr. 10.Schéma a výpočet toků v elektrodové komůrce[82]. Velikost solvolytických toků (rovnice r1) je pak přímo úměrná poměru koncentrací solvolytických iontů CS (mol/l) a co-iontů CG a jejich pohyblivostí (mobilit) us, ug (m2/v.s), dále je také závislá na vodivosti elektrolytu κ (S/cm) a velikosti proudu I (A) viz rovnice (1), kde k1 je konstanta závislosti [82]. (1) Pro tok libovolného iontu i platí rovnice (2), kde Ii (A) je proud procházející elektrodovou komůrkou, ti je převodové číslo iontu i v roztoku, F je Faradayova konstanta (9, ) a zi je náboj iontu (C) [82]. (2) Jsou známy dva způsoby regulace ph elektrolytů, a to pomocí změny poměrů elektrických proudů elektrická regulace [86], nebo použitím pufrů o konstantním složení, kde požadované změny pro migraci vzorku je dosaženo výměnou elektrolytů v komůrce, popř. přesunutím kapiláry z jedné komůrky obsahující základní elektrolyt do druhé komůrky obsahující elektrolyt modifikující [87]. V obou případech se regulace pohybu rozhraní děje tak, že velikost jednoho solvolytického toku je regulována a velikost druhého solvolytického toku zůstává konstantní. Pro elektrickou regulaci se používá speciální zařízení. Separační kapilára se umístí mezi dva elektrodové bloky. První (startovací) elektrodový blok je složen ze dvou elektrodových komůrek, které jsou navzájem spojeny přes vysokonapěťový zdroj, který dodává elektrický proud do jednotlivých komůrek v určitém poměru. Jedna komůrka obsahuje primární (základní) elektrolyt (BGE) např. 0,01M KCl a druhá obsahuje elektrolyt modifikující např. 0,01M HCl. Druhý elektrodový blok je složen pouze z jedné elektrodové komůrky, která obsahuje BGE. Tento způsob regulace umožňuje 24

25 ovlivnit složení elektrolytu během samotné analýzy, což je velmi výhodné pro vlastní separaci. Další výhodou je, že nedochází k postupnému vyčerpávání elektrolytů, a tím pádem může být doba fokusace vzorku teoreticky časově neomezena. Nevýhodou je složitější experimentální uspořádání a nutnost použití speciálně upraveného přístroje. Obr. 11.Schéma a výpočet toků v elektrodové dvojkomůrce pro případ elektrické regulace [82]. Výhodou druhého způsobu regulace (výměnou elektrolytů) je jednoduché experimentální uspořádání a možnost použití komerčně dostupného přístroje, nicméně dochází k postupnému vyčerpávání elektrolytů během analýzy Neutralizační reakční rozhraní Neutralizační reakční rozhraní hraje významnou roli v separaci a izolaci látek v ph gradientu a je požadována především jeho ostrost. Pro úspěšnou separaci amfolytů musí mít rozhraní následující vlastnosti: slabé a silné kyseliny a báze procházejí přes ph rozhraní, amfolyty s pi hodnotou v rozmezí ph elektrolytů jsou zachyceny na rozhraní a amfolyty s pi mimo rozmezí procházejí přes rozhraní. Neutralizační rozhraní musí mít stabilní polohu v kapiláře, rozpětí ph skoku musí být regulovatelné a musí být stabilní v čase. Neutralizační rozhraní je charakterizováno těmito vlastnostmi: rozsah ph, rychlost pohybu a časová stabilita. 25

26 Obr. 12.Schéma toků iontů v koloně tvořících neutralizační rozhraní, v základním elektrolytu KCl. Anoda je nalevo, katoda napravo [80] Rychlost pohybu rozhraní a rovnovážný stav Rychlost pohybu rozhraní je dána rozdílem velikosti vstupujících solvolytických toků (H+ a OH- iontů) z elektrodových komůrek do kapiláry a samotnou pohyblivostí solvolytických iontů. Znalost rychlosti pohybu rozhraní a možnosti ovlivnění tohoto pohybu je důležitá pro regulaci vlastní migrace a možnosti transportu látek separovaného analytu. Rychlost pohybu rozhraní je možno vyjádřit pomocí kombinace rovnic pro pohyblivé rozhraní každého iontu, např. iontu R. Podobné rovnice platí i pro solvolytické ionty [82]. (3) WR rychlost pohybu rozhraní iontu R (m3/q) A, Z elektrolyty κ vodivost elektrolytu (S/cm) c molární koncentrace iontu R v elektrolytu (mol/l) celková molární koncentrace (mol/l) Jestliže jsou si vstupující solvolytické toky navzájem rovny, je rozhraní v kapiláře ve stacionárním stavu (rovnovážném stavu) a pohyb rozhraní se zastaví. 26

27 Jh = Joh V=0 (4) Nejsou-li solvolytické toky rovny rozhraní se pohybuje ve směru převládajícího solvolytického toku rychlostí, která je úměrná velikosti rozdílů toků od rovnovážného stavu. V = fce (Jh-Joh) (5) Stabilita reakčního neutralizačního rozhraní Stabilita neutralizačního rozhraní je dána úbytkem elektrolytu na rozhraní, což je charakteristické pro IEF metody. Pomocí teoretických výpočtů lze tento úbytek vypočítat podle následující rovnice (6) [80]. (6) ΔJC, ΔJK úbytek toku elektrolytu (mol/s) K, C ionty elektrolytu (kationt, aniont) JS solvolytické toky (mol/s) U pohyblivost iontů (m2/v.s) Úbytek toku elektrolytu, ΔJ, obou jeho iontů K a C je úměrný velikosti solvolytických toků JS a konstantě závislé na pohyblivosti U jednotlivých iontů elektrolytu. Úbytek elektrolytu způsobuje nepříznivé koncentrační změny v kapiláře, které vedou ke zvyšování odporu, teploty a následně k přerušení analýzy. Stabilitu rozhranní v čase je možné spočítat z rychlosti úbytku koncentrace elektrolytu a velikosti difuse. Koncentrační profil úbytku elektrolytu je dán vztahem (7) [80]. (7) 27

28 CO původní koncentrace elektrolytu (mol/l) D difuzní koeficient (m2/s) ΔJ rozdíl velikosti solvolytických toků (mol/s) T čas (s) x šířka rozhraní (m) Po úpravě dostaneme vztah (8) pro výpočet času stability rozhraní v závislosti na původní koncentraci elektrolytu a rozdílu solvolytických toků [80]. (8) t čas dosažení nulové rychlosti koncentrace elektrolytu (s) Vlastnosti fokusované zóny amfolytu Vlastnosti zón amfolytů jsou závislé na složení daného amfolytu a dále na vlastnostech elektrolytu tvořícího rozhraní. Je-li rozhraní stacionární, zóny amfolytů se zafokusují na rozhraní a nepohybují se. V opačném případě dochází k pohybu zón. ph zón na rozhraní je rovno pi jednotlivých amfolytů a koncentrace těchto zón je závislá na koncentraci základního elektrolytu (viz obr. 13). Délky zón jsou úměrné koncentraci dávkované látky a době dávkování [88]. 28

29 Obr. 13.Závislost koncentrace fokusované zóny nízkomolekulárního pi markeru na koncentraci základního elektrolytu [88]. 29

30 3.Cíle práce 1. Nalezení vhodného elektrolytového systému pro fokusaci a transport PBP. 2. Prekoncentrace, purifikace a mikropreparace PBP z biologické matrice. 3. Identifikace získaných PBP pomocí MALDI-TOF/TOF hmotnostního spektrometru. 4. Kvantifikace PBP. 30

31 4.Experimentální část 4.1. Chemikálie allofykocyanin - Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) fykocyanin - Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) fykoerythrin - Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) sérový hovězí albumin - Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) myoglobin z koňského srdce - Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) modelové syntetické nízkomolekulární pi markry - doc. RNDr. Karel Šlais, DrSc. (Ústav analytické chemie, Akademie věd ČR, Brno, ČR) hydroxypropylmethylceluloza (HPMC) Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) trypsin - Roche Diagnostic (Mannheim, Germany) glycerol Pliva-Lachema (Brno, ČR) glycin - Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) akrylamid - Heidelbarg (New York, USA) bisakrylamid (N,N - methylenbisakryl amid) Heidelbarg (New York, USA) bromfenolová modř Penta (Praha, ČR) Coomassie brilliant blue G Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 2-merkaptoethanol - Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) peroxodisíran amonný Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) SDS (dodecylsulfát sodný) Heidelbarg (New York, USA) TEMED (N,N,N,N - tetramethylethylen diamin) Heidelbarg (New York, USA) standardy pro Mr Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) ostatní chemikálie čistoty p.a. Pliva-Lachema (Brno, ČR) 31

32 4.2. Použité přístroje Laminární box: (Holten LaminAir A/S, Allerod, Dánsko) Autokláv: Tuttnauer 3870 EA (RPI, Replacement Parts Industries, Inc., Van Nuys, CA, USA) Laboratorní vibrační mlýn: VIBROM 2S (Jebavý, Třebechovice, ČR) Centrifuga: MPW 350 R High Speed Brushless Centrifuge (MPW MED.INSTRUMENTS, Varšava, PL) Ultrazvuková lázeň: K5 (Kraintex, SR) Izotachoforetický analyzátor: CS Isotachophoretic analyser (Ústav radioekologie a využití jaderné techniky, Spišská Nová Ves, SK) Hmotnostní spektrofotometr: MALDI TOF/TOF Proteomics Analyzer vybavený lineárním detektorem, (Applied Biosystems, Framinghem, MA, USA) Gelová elektroforéza: Mini-PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad Laboratories, Herkules, CA, USA) Spektrofotometr: NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) Spektrofotometr: HELIOS β (Spectronic Unican Co., Cambridge, GB) Pipetové špičky ZipTip C18: Millipore (Billerica, MA, USA) 32