Dendritické buňky MASARYKOVA UNIVERZITA. Bakalářská práce PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie živočichů Dendritické buňky Bakalářská práce Brno 2007 Jana Daňková Vedoucí práce: Mgr. Monika Dušková, Dr. Konzultant: Mgr. Vít Hubinka 1

2 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a čerpala jsem pouze z uvedených zdrojů. V Brně 20. května 2007 Podpis 2

3 Děkuji Mgr. Monice Duškové, Dr. za její hodnotné připomínky k práci a za to, že mi umožnila zpracovávat bakalářskou práci na oddělení fyziologie a imunologie živočichů. Velmi děkuji Mgr. Vítu Hubinkovi za čas který mi věnoval při konzultacích, za jeho cenné rady, připomínky, trpělivost a podporu při zpracování daného tématu. 3

4 OBSAH 1. Abstrakt Úvod Historie Charakteristika dendritických buněk Myeloidní DC Lymfoidní DC Folikulární DC Receptory DC Vývoj dendritických buněk Vývoj dendritických buněk z prekurzorů v kostní dřeni Myeloidní linie Lymfoidní linie Diferenciace dendritických buněk in vitro Chemokiny ve vývoji DC Fyziologické interakce DC ve zdravém organismu Změny dendritických buněk po setkání s patogenem Setkání s antigenem Maturace DC interakce s dalšími imunokompetentními buňkami Aktivace T buněk Aktivace B buněk Interakce s NK buňkami Spolupráce s M buňkami DC jako dvojsečná zbraň Produkty dendritických buněk Využití dendritických buněk v klinické praxi DC a infekční nemoci DC a alergické reakce Protinádorová imunita DC v transplantologii Závěr Seznam zkratek Seznam publikací Přílohy

5 1. Abstrakt Dendritické buňky jsou nejdůležitější antigen prezentující buňky, které mají schopnost stimulovat naivní T a B buňky a regulovat tak imunitní odpověď organismu. Jsou rozmístěny téměř ve všech tkáních organismu. Pohlcují antigeny a následně migrují do sekundárních lymfatických orgánů, kde zpracovaný antigen prezentují T buňkám, čímž je umožněn rozvoj účinné imunitní odpovědi. Na charakter této odpovědi má kromě typu antigenu třídy MHC a cytokinového prostředí vliv i typ zúčastněných dendritických buněk. Dále jsou výsledné reakce ovlivněny různými vývojovými stádii dendritických buněk, známe dendritické buňky nezralé (tolerogenní) a zralé (imunoregulační). Speciálním případem jsou folikulární dendritické buňky, které jsou morfologicky podobné dendritickým buňkám, ale nejsou s nimi příbuzné. Tyto buňky jsou důležité pro dozrávání B buněk a ovlivňují tak produkci protilátek. Dendritické buňky představují nástroj pro léčbu infekcí, nádorových onemocnění, autoimunitních onemocnění, alergií a uplatňují se i v transplantologii. Dendritic cells are the most important antigen presenting cells, which can stimulate naive T and B cells and regulate immune response of organism. They are spread nearly through all tissues of the organism. Dendritic cells capture antigen and then migrate to the secondary lymphatic tissue, where antigen is presented to the T cells. By this way it is possible to development of effective immune response. Charakter of immune response is influenced beyond by type of MHC molecule, cytokine microenvironment also by the subtype of dendritic cells. Furthermore immune responses are influenced by maturation stages, we have dendritic cells immature (tolerogenic) and mature (immunoregulatory). Follicular dendritic cells are special case of dendritic cells, they are similar morfologicaly to dendritic cells, but they haven t the same origin. These cells are important for maturation of B cells, thus they influence production of antibodies. Dendritic cells represent the vector for immunotherapy of infections, autoimmune diseases, allergic diseases, tumour immunotherapy and they play role also in transplantology. 5

6 2. Úvod Imunitní reakce v organismu jsou výsledkem součinnosti dvou základních složek: nespecifické a specifické imunity. Nespecifická část je založena zejména na fagocytech, antigenně specifická část je založena na produkci protilátek B buňkami a na antigenně specifické T buněčné odpovědi. Mezi oběma těmito systémy existuje důležité spojení antigen prezentující buňky. Nejvýznamnějšími z těchto buněk jsou dendritické buňky. Pro své unikátní vlastnosti stimulace T a B buněk jsou dendritické buňky intenzivně studovány, avšak v současnosti chybí ucelený odborný přehled o této problematice. Cílem práce je proto shrnout obecné i nejnovější poznatky formou literární rešerše. Bakalářská práce je pro přehlednost rozdělena do několika kapitol. Nejdříve se zabývá historií, charakteristikou a vývojem dendritických buněk, dále navazuje na fyziologické interakce dendritických buněk v organismu. Nejrozsáhlejší kapitola je věnována změnám dendritických buněk po setkání s patogenem. Klinickým využitím DC v praxi se pak zabývá poslední kapitola. 6

7 3. Historie V roce 1868, student medicíny Paul Langerhans, objevil v kůži populaci buněk dendritického tvaru. Označil je jako nervové buňky kůže a nepřikládal jim velkou důležitost. Nyní však tyto buňky nesou jeho jméno a patří do skupiny důležitých buněk označovaných jako profesionální antigen prezentující buňky (Onji, 2004). V průběhu 60. let 20. století se imunologové shodli na tom, že jsou tři typy buněk, které spolupracují při antigen specifické imunitní reakci. T buňky, B buňky a makrofágy. Mechanismus jejich spolupráce však nebyl jasný. Spekulovalo se nad tím, že existují ještě další typy buněk, které musí pohltit antigen, zpracovat ho a nabídnout příslušným imunokompetentním buňkám. Tradičně byly tyto buňky označovány jako APC (Antigen Pressenting Cells; antigen prezentující buňky) (Onji, 2004). Až více než po 100 letech od Langerhansova objevu, Steinman a Cohn (1973), objevitelé dendritických buněk ve slezině, určili, že se jedná o skupinu buněk odlišnou od makrofágů a specializovanou ke stimulaci naivních T buněk. Skupinu buněk exprimující molekuly MHC I i MHC II (Major Histocompatibility Complex) (Steinman, 1973). Byl stanoven nový typ buněk imunitního systému. Postupem času byly objevovány nové markry dendritických buněk, které odhalovaly různorodost jejich funkcí. Zejména v 80. letech 20. století studie s dendritickými buňkami v imunologii dominovaly. Dendritické buňky byly lokalizovány, izolovány a podrobněji charakterizovány (Onji, 2004). Dnes dendritické buňky jakožto hlavní antigen prezentující buňky představují spojující článek mezi rychlou antigenně nespecifickou a pomalu se rozvíjející antigenně specifickou částí imunitního systému (Hořejší & Bartůňková, 2002). V souvislosti s novými poznatky o roli dendritických buněk je logická snaha o jejich klinické využití v imunitních reakcích zprostředkovaných T buňkami (Šedivá, 2002). Kdysi zapomenuté buňky se v současnosti daří izolovat v dostatečném množství pro molekulární a biologické analýzy. Dendritické buňky jsou intenzivně studovány pro své potenciální využití jako buněčná adjuvancia v protinádorové imunitě (Satthaporn, 2001). Na experimentální úrovni se také pracuje s imunoregulačním potenciálem DC, hlavně v transplantologii, alergologii, v protiinfekční imunitě a u autoimunitních onemocnění (Šedivá, 2002). 7

8 4. Charakteristika dendritických buněk Dendritické buňky (DC; Dendritic cells) získaly své pojmenování na základě skutečnosti, že z jejich těla vystupují dlouhé (> 10 µm) membránové výběžky (Obr.1), které se podobají dendritům nervových buněk (Buc, 2001) a umožňují kontakt s mnoha buňkami nacházejícími se v blízkosti DC. V in vitro experimentech bylo prokázáno, že jedna DC stimuluje až T buněk (Krejsek & Kopecký, 2004). Obr. 1: Dendritická buňka (upraveno podle Hunt, 2003) Dendritické buňky se od ostatních buněk imunitního systému liší zejména tím, že mohou exprimovat MHC I i MHC II molekuly, nemají povrchové imunoglobuliny, ani jiné lymfocytární a monocytární znaky. Mají nepravidelné jádro, malá jadérka. Nesou mnoho mitochondrií, ale málo lysosomů, ribosomů a endoplasmatické retikulum také není příliš vyvinuté. Na povrchu nemají ani záhyby ani mikroklky (Stites, 1994). Progenitorové DC vzniklé v kostní dřeni se krví dostávají do tkání, kde se usídlují jako nezralé dendritické buňky (Buc, 2001). V menším množství se nacházejí ve všech orgánech a tkáních kromě mozku, varlat a rohovky (Šedivá, 2002). Nejvíce je jich v kůži a ve sliznicích dýchacího a trávicího traktu, kde tvoří 1-2 % celkového počtu buněk (Hořejší & Bartůňková, 2002). Charakterizuje je nízká mobilita a velká kapacita pohlcování a zpracování antigenu (Buc, 2001). 8

9 Nezralé DC jsou vybaveny odpovídajícími receptory, které usnadňují jejich kontakt s mikrobiálními agens. Velmi účinná je fagocytóza zprostředkovaná membránovými receptory, dále například makropinocytóza. Kromě významných receptorů jako jsou například TLR (Toll-Like Receptors), MMR (Macrophage Mannose Receptor) mají DC na svém povrchu receptory FcγRI (CD64; Cluster of Differentiation 64), FcγRII (CD32), FcεRI (high affinity IgE receptor) a receptor pro C3b složku komplementu (CD11b) prostřednictvím kterých jsou například účinně endocytovány imunitní komplexy (Krejsek & Kopecký, 2004) MYELOIDNÍ DC Od myeloidní vývojové linie (viz dále) jsou odvozeny Langerhansovy DC (označované též jako kožní) a intersticiální DC (Toman, 2000). Od lymfoidní linie se pak odvozuje třetí typ DC lymfoidní (plazmacytoidní) DC (Šedivá, 2002). Intersticiální DC se nacházejí v dermis a ve většině orgánů, např. plicích a srdci (Krejsek & Kopecký, 2004). Langerhansovy buňky se nacházejí ve stratum spinosum epidermis (Toman, 2000). Langerhansovy a intersticiální dendritické buňky mají několik společných znaků, ale Langerhansovy DC jsou specifické tím, že exprimují CD1a, langerin, adhezivní molekulu E-cadherin a mají Birbeckova granula, která zřejmě představují určitý typ fagosomu (Krejsek & Kopecký, 2004). Naproti tomu jsou intersticiální DC jedinečné v expresi koagulačního faktoru XIII. Zásadní rozdíl mezi Langerhansovými a intersticiálními DC je ve schopnosti aktivovat naivní B buňky a navodit jejich diferenciaci v plazmatické buňky. Intersticiální DC tuto schopnost mají, Langerhansovy DC ne (Tab.1) (Lipscomb, 2002). Intersticiální DC Langerhansovy DC Typický antigenní profil CD14 + CD1a - CD14 - CD1a + Charakteristické znaky Růstové faktory Schopnost aktivovat B buňky CD11b; CD15b; CD68; koagulační faktor XIII GM-CSF, TNF-α / IL-4 ano Langerin; E-cadherin; Birbeckova granula GM-CSF, TNF-α / IL-4 TGF-β ne Tab. 1: Srovnání rozdílných DC vzniklých z myeloidní linie (upraveno podle Satthaporn, 2001 a Lipscomb, 2002). 9

10 4.2. LYMFOIDNÍ DC K buňkám patřícím do lymfoidní linie se řadí DC v thymu nebo v periferních lymfatických orgánech. Mají osobitou funkci účastní se indukce centrální tolerance selekcí T buněk v thymu, a možná i indukce periferní tolerance T buněk k vlastním antigenům v sekundárních lymfatických orgánech (Šedivá, 2002). Prekurzor lymfoidních DC v krvi exprimuje CD62L a chemokinový receptor CXCR3 (chemokine C-X-C motif receptor 3), který zprostředkovává navádění a migraci těchto buněk do lymfatických uzlin přes endotel HEV (High Endothelial Venules) jako odpověď na zánětlivé chemokiny (Lipscomb, 2002). Lymfoidní DC exprimují hlavně receptory nukleových kyselin TLR-7 (Toll-Like Receptor-7) a TLR-9, což vysvětluje dlouho známý fakt, že po setkání s viry produkují velká množství INF-α (Interferon-α). TLR-7 a TLR-9 jsou totiž velmi účinně stimulovány virovými RNA resp. DNA (Hořejší & Bartůňková, 2002). Lymfoidní dendritické buňky mají některé společné funkce s Langerhansovými a intersticiálními dendritickými buňkami. Aktivují CD4 + (pomocné) a CD8 + (cytotoxické) naivní T buňky a při interakci s CD40L (ligandem na T buňkách) produkují IL-12 (Interleukin-12) (Lipscomb, 2002). Avšak funkce myeloidních DC je odlišná od funkce lymfoidních DC, pokud jde o polarizaci pomocných T buněk (Buc, 2001) FOLIKULÁRNÍ DC Folikulární DC (FDC) jsou morfologicky podobné ostatním dendritickým buňkám, ale nejsou s nimi příbuzné. Nejnovější studie předpokládají, že jsou speciální formou myofibroblastů a mají původ v prekurzorech stromálních buněk kostní dřeně (Munoz-Fernandez, 2006). Nejsou schopné prezentovat antigen, neexprimují na povrchu antigeny s MHC molekulami (Klener, 2002). FDC mají receptor pro komplement a protilátkové komponenty FcR (Fragment Crystallizable Receptor) (Tew, 2001). Jsou důležité pro dozrávání B buněk především během sekundární imunitní odpovědi. Tyto buňky dokáží obklopit intaktní antigen a nebo pomocí nefagocytového Fc receptoru připoutat na svůj povrch imunitní komplexy na dlouhou dobu (Ferenčík, 2004). Imunokomplexy zůstávají vázané na FDC od několika týdnů až měsíců, po roky (Buc, 2001). Antigeny a imunitní komplexy s protilátkami vytvářejí korálky (iccosomes immune complex coated bodies) podél povrchu folikulárních DC a jsou předávány B buňkám v zárodečných centrech. Dále tyto buňky exprimují na svém povrchu molekulu 10

11 CD23, která je ligandem pro komponentu CR2 (Complement Receptor 2; CD21) koreceptorového komplexu CD19 B buněk, a tak mohou zasahovat do produkce protilátek. Na druhou stranu schopnost těchto buněk dlouhodobě držet Ag částice se někdy může obrátit proti imunitnímu systému, např. při infekci HIV nebo v patogenezi prionóz (Ferenčík, 2004) RECEPTORY DC Dendritické buňky vychytávají antigeny za pomoci specifických antigenních receptorů, které mohou být rozděleny do několika hlavních skupin: TLR, C-lektiny, integriny a Fc receptory. Tyto receptory usnadňují efektivní prezentaci MHC peptidových komplexů T buňkám (Mahnke, 2003). Důležitou regulační úlohu hrají také negativní kostimulační receptory (např. CTLA-4; Cytotoxic T Lymphocyte Ag-4), které potlačují příliš silnou kostimulaci (Hořejší, URL 1). C-lektiny váží cukerné struktury bakteriálního původu, integriny váží apoptotické buňky a Fc receptory zprostředkovávají endocytózu komplexů antigen-protilátka. Mezi C-lektiny můžeme zahrnout makrofágový receptor pro manózu (MMR; CD206) a povrchovou molekulu DEC-205 (Dendritic and Epithelial Cells-205) (Mahnke, 2003). Významnou úlohu v celém procesu hrají i vychytávací receptory MSR-1 (Macrophage Scavenger Receptor-1; CD204). Na nezralých DC, nacházejících se v tkáních, jsou přítomny některé adhezivní molekuly, např. LFA-1, LFA-3 (Lymphocyte Function- Associated antigen-1,3), ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1). Exprimovanou mají také molekulu specifickou pro DC, označovanou jako DC-SIGN (DC-Specific Intercellular-adhesion-molecule-Grabbing Nonintegrin; CD209), jejímž ligandem je ICAM-3 (Intercellular Adhesion Molecule-3; CD50). Všechny jmenované molekuly slouží ke kontaktu s dalšími imunokompetentními buňkami (Krejsek & Kopecký, 2004). Receptory skupiny TLR a jejich ligandy Na dendritických buňkách jsou exprimovány Toll-Like receptory, které umožňují rozpoznání struktur pocházejících z patogenů. Skupina TLR v současné době zahrnuje celkem 11 zástupců, na dendritických buňkách jsou exprimovány tyto (Tab.2): 11

12 TLR Podtyp DC Ligand Patogen TLR-1 Myeloidní i lymfoidní LPS bakterie, viry TLR-2 Myeloidní LPS bakterie, viry TLR-3 Myeloidní dsrna viry TLR-5 Myeloidní flagellin bakterie TLR-6 Myeloidní i lymfoidní LPS bakterie, viry TLR-7 Lymfoidní ssrna viry TLR-8 Myeloidní ssrna viry TLR-9 Lymfoidní motivy CpG, DNA bakterie, viry TLR-10 Myeloidní neznámá neznámý Tab. 2 : TLR a jejich vybrané ligandy (upraveno podle Landes Biosciences a Sandor, 2005). 12

13 5. Vývoj dendritických buněk Buňky imunitního systému jsou v těle jedince ustavičně obměňovány. Odumírající buňky jsou odstraňovány a kontinuálně nahrazovány buňkami novými. Většina buněk zapojených do imunitních odpovědí vzniká z nediferencovaných kmenových hemopoetických buněk (HSC; Hemopoetic Stem Cells). Pluripotentní kmenová buňka (CD34 + ) je schopna sebeobnovy a pod vlivem faktorů mikroprostředí (mezibuněčné interakce, cytokiny) se může diferencovat do dvou hlavních vývojových linií: lymfoidní a myeloidní (Obr.2). Z lymfoidní vývojové linie vznikají T buňky, B buňky a NK buňky, z myeloidní linie vznikají erytrocyty, megakaryocyty, monocyty a granulocyty. Imunitní buňky jednotlivých vývojových linií jsou adaptované na vykonávání specializovaných funkcí při imunitních reakcích. Buňky myeloidního původu zabezpečují hlavně nespecifické obranné reakce (fagocytóza, zánět, homeostáza), buňky lymfoidní linie jsou klíčové pro odpovědi specifické imunity (produkce protilátek, specifická cytotoxicita) (Kontseková, 2004) (Bureš, 2003). Dendritické buňky vznikají z CD34 + kmenové buňky kostní dřeně, přičemž některé subtypy vznikají z myeloidní a jiné z lymfoidní linie (Obr.3, Tab.3). In vitro lze DC získat také z krevních prekurzorů za použití různých kombinací růstových faktorů, jako GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor), TNF-α (Tumor Necrosis Factor α), IL-4 (interleukin-4), CSF (Colony Stimulating Factor), TGF-β (Transforming Growth Factor-β), IL-3 a další. Například Flt3L (Fms-like tyrosine kinase 3 Ligand) byl užíván u lidí ke stimulaci proliferace kmenových buněk a progenitorů dendritických buněk in vivo, navíc in vivo mobilizuje všechny typy DC a jejich progenitory (Lipscomb, 2002). 13

14 Obr. 2: Hematopoéza (Bartůňková, 2007). 14

15 Obr. 3: Schéma vývoje dendritických buněk z CD34 + prekurzoru lymfoidní a myeloidní linie, včetně cytokinů (upraveno podle Lipscomb, 2002). Vývojová linie Subtyp DC Antigenní profil MYELOIDNÍ (mdc) CD34 + CD11c + Langerhansovy CD14 - CD1a + Intersticiální CD14 + CD1a - LYMFOIDNÍ (pdc) CD34 + CD11c - Lymfoidní CD14 - CD123 + Tab. 3: Shrnutí antigenních profilů dendritických buněk. 15

16 5.1. VÝVOJ DENDRITICKÝCH BUNĚK Z PREKURZORŮ V KOSTNÍ DŘENI Principiálně jsou možné dvě dráhy diferenciace DC. První představuje vývoj z prekurzorů v kostní dřeni, kde se potom DC dostávají jako nezralé do krve a své dozrávání končí v tkáních. Druhá dráha diferenciace pak představuje přepojení z vývoje monocytů (Buc, 2001) Myeloidní linie Myeloidní DC se vyznačují podobností některých znaků s fagocyty, které taktéž pochází z myeloidní linie. Studie s multipotentním CD34 + progenitorem a periferními krevními mononukleárními buňkami (PBMC; Peripheral Blood Mononuclear Cells) prokázaly dva rozdílné podtypy myeloidních DC (Satthaporn, 2001). Lidská kůže obsahuje dva podtypy nezralých dendritických buněk. Oba typy vznikají z CD34 + CD11c + prekurzoru v kostní dřeni. Tyto prekurzory exprimují myeloidní markry CD13 a CD33. Za přítomnosti GM-CSF a buď IL-4 nebo TNF-α vznikají intersticiální DC. Langerhansovy dendritické buňky navíc potřebují jako růstový faktor TGF-β (viz Tab.1) a vznikají jak z CD14 + monocytů, tak z CD14 - prekurzorů (viz Obr.2). Intersticiální DC vznikají pouze z CD14 + prekurzorů, které se za přítomnosti M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor) mohou diferencovat také v makrofágy (Lipscomb, 2002) Lymfoidní linie Jak bylo již výše uvedeno, třetím podtypem dendritických buněk jsou lymfoidní = plazmacytoidní DC (podobnost s plazmatickými buňkami). Nacházejí se v krvi, thymu a v sekundárních lymfatických orgánech (Šedivá, 2002). Dendritické buňky lymfoidní linie vznikají z CD11c - krevních prekurzorů, které mají málo exprimované GM-CSF receptory, postrádají myeloidní markry CD14, CD13 a CD33 a chybí jim také receptor pro manózu. Exprimují ale velké množství CD123. Lymfoidní DC pro svou diferenciaci potřebují IL-3 a exprese receptoru pro IL-3 (CD123) je také hlavním znakem, který dovoluje identifikaci lymfoidních DC v krvi a tkáních (Lipscomb, 2002). 16

17 5.2. DIFERENCIACE DENDRITICKÝCH BUNĚK IN VITRO Myeloidní DC jsou blízce příbuzné s monocyty, čehož lze využít při in vitro diferenciaci. Jestliže kultivujeme monocyty s GM-CSF a IL-4, dochází k jejich diferenciaci na myeloidní DC. Dále se v podmínkách in vitro pod vlivem stejných cytokinů daří indukovat diferenciaci DC z CD34 + kmenových buněk izolovaných z kostní dřeně, pupečníkové nebo periferní krve. Takto připravené DC lze tedy označit jako myeloidní. Podobně můžeme pod vlivem cytokinů dosáhnout diferenciace lymfoidních DC z lymfoidního prekurzoru v krvi (Buc, 2001). Naopak při kultivaci myeloidních DC s M-CSF vznikají makrofágy (Pulendran, 2001) CHEMOKINY VE VÝVOJI DC Chemokiny ovlivňující přechod DC z krve do tkání Přechod nezralých DC z krve do periferní tkáně a pohyb z této tkáně do sekundárních lymfatických orgánů je řízen chemoatraktanty nebo-li chemokiny. Jsou to bílkovinné aktivátory G-proteinové skupiny receptorů exprimovaných na leukocytech. Chemokiny jsou různě produkovány v periferních tkáních buňkami endoteliálními, epiteliálními a leukocyty jako odpověď na rozličné zánětlivé stimuly (Lipscomb, 2002). Prostřednictvím chemokinů, tvořených během zánětlivé reakce, např. chemokinů RANTES (Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted), MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1), MIP-1α (Macrophage Inflammatory Protein 1α) a MIP-1β, je regulována migrace prekurzorů DC z kostní dřeně do tkání. Funkčně velmi důležitá je následná ztráta schopnosti DC reagovat na výše uvedené chemokinové signály (viz 7.2 Maturace DC). To je nutné k tomu, aby tkáňové DC setrvaly ve své lokalizaci a byl jim umožněn dostatečně dlouhý kontakt s mikrobiálními podněty (Krejsek & Kopecký, 2004). Chemokiny ovlivňující přechod DC z tkání do lymfatických uzlin Usměrněnou migraci maturovaných DC do sekundárních lymfatických uzlin regulují především chemokiny SDF-1 (Stromal-cell Derived Factor 1) a MDC (Monocyte Derived Chemokine) (Krejsek & Kopecký, 2004). 17

18 Maturované DC exprimují na svém povrchu chemokinový receptor CCR7 (chemokine C-C motif Receptor 7). Ligandy tohoto receptoru, chemokiny CCL19 (chemokine C-C motif Ligand 19) a CCL21 (Legler, 2002) regulují cílenou migraci DC do parakortikálních oblastí lymfatických uzlin, kde převažují T buňky (Krejsek & Kopecký, 2004). 18

19 6. Fyziologické interakce DC ve zdravém organismu Není-li v organismu přítomna infekce, pohlcují nezralé dendritické buňky odumřelé buňky zdravých tkání a molekuly rozpuštěné v mezibuněčné tekutině. Po pohlcení antigenu DC migrují z tkání do sekundárních lymfatických orgánů. Během cesty tyto molekuly zpracují a jejich fragmenty vystaví v komplexu s MHC I proteiny na svém povrchu. Specifické T buňky, které takto zpracované vlastní antigeny rozpoznají, tímto kontaktem nejsou aktivovány. Jsou buď zcela utlumeny, nebo se z nich tvoří tzv. regulační T buňky (T reg ; T r ), které imunitní reakce vůči danému antigenu aktivně potlačují. Nezralé DC se tak významně podílejí na zachování tolerance vůči vlastním tkáním (Hořejší & Bartůňková, 2002). Mimo mikrobiální podněty jsou nezralé DC aktivovány také strukturami a cytokiny, které vznikají při smrti buňky. V přítomnosti protizánětlivých cytokinů, např. TNF-α, PGE 2 (prostaglandin E 2 ) a dalších molekul, produkovaných v průběhu zánětu, se nezralé DC diferencují a maturují. DC mají membránové receptory, např. CD36 a integrin α v β 5, prostřednictvím kterých jsou schopny identifikovat molekulové vzory apoptotických buněk (ACAMP; Apoptotic-Cell-Associated Molecular Patterns). Je tedy vidět, že DC, nacházející se v tkáních, jsou stimulované velmi rozmanitými podněty exo- i endogenního původu (Krejsek & Kopecký, 2004). Mazmanian et al. z Harvardovy univerzity překvapivě objevili, že dendritické buňky jsou schopné předkládat T buňkám i fragmenty polysacharidů ačkoli dříve se mělo za to, že předkládají jen peptidové fragmenty proteinů (Mazmanian, 2005). Objev Mazmanianovy skupiny může být klíčem k vysvětlení alergií. Určitou roli hraje mikrobiální flóra ve střevě, která produkcí určitých typů polysacharidů může stimulovat Th1 dráhu. Pokud je nedostatek těchto polysacharidových stimulů, převládnou při odpovědích na různé podněty (pylová zrnka či prach) konkurenční buňky Th2. Ty podporují vznik IgE protilátek, odpovědných za alergické reakce (Hořejší, 2005). 19

20 7. Změny dendritických buněk po setkání s patogenem Pokud nezralé DC rozpoznají podnět, který představuje pro organismus nebezpečí aktivují se a stávají se z nich zralé dendritické buňky. Nebezpečný podnět představují zejména molekulární struktury spojené s patogeny (PAMP; Pathogen-Associated Molecular Patterns), které jsou rozpoznávány příslušnými receptory PRR (Pattern Recognition Receptors). Aktivace vyvolaná prostřednictvím těchto receptorů vede k maturaci dendritických buněk, která je spojena s dramatickými změnami jejich vlastností (Hořejší & Bartůňková, 2002) SETKÁNÍ S ANTIGENEM Dendritické buňky předkládají Ag T buňkám třemi způsoby: 1) Prostřednictvím molekuly MHC II DC pohltí exogenní Ag, který je degradován na oligopeptidy v endozomech a navázan na molekulu MHC II, která se vynoří na buněčném povrchu (Šedivá, 2002). 2) Prostřednictvím molekuly MHC I Antigen vystavený na molekule MHC I je endogenního původu, pochází z proteinů produkovaných v buňce nebo z intracelulárních parazitů (např. virů). Prezentace antigenního peptidu na molekule MHC I je nutná k vyvolání cytotoxické reakce prostřednictvím CD8 + T buněk (Šedivá, 2002). Speciálním mechanismem předkládání Ag je kombinace předcházejících dvou vystavení exogenního antigenu na molekule MHC I. Tento proces se označuje jako cross-priming (cross-presentation). Pohlcené antigeny mohou být uvnitř buňky zpracovány a navázány na MHC I molekulu několika způsoby, což záleží na původu a vlastnostech antigenu. Mechanismus nebyl ještě úplně objasněn (Basta, 2007). 3) Prostřednictvím molekuly CD1 Molekuly CD1 se svou strukturou podobají molekulám MHC I, funkčně se však chovají spíše jako molekuly MHC II. Velmi neobvyklým rysem molekul CD1 je jejich schopnost vázat a prezentovat glykolipidy, zvláště odvozené od složek 20

21 mykobakteriální buněčné stěny. Díky tomu je možné prezentovat antigenní fragmenty, které by nebylo možné prezentovat prostřednictvím klasického heterodimeru molekul MHC II (Krejsek & Kopecký, 2004). Pohlcení antigenů je natolik účinné, že na jeho prezentaci postačuje, aby byl v prostředí v nanomolové koncentraci (Toman, 2000) MATURACE DC Po setkání s antigeny putují DC z epitelů a dermis aferentními lymfatickými cévami jako závojové buňky (veiled cells) do mízních uzlin a DC z intersticia orgánů krevním oběhem (tvoří asi 1 cirkulujících leukocytů) do sleziny. Mobilizaci a následnou migraci DC provází jejich dozrávání (maturace) do zralého stádia (Toman, 2000). Při maturaci dochází k zásadním změnám DC a provází je : SNÍŽENÍ množství receptorů, které zabezpečují pohlcení Ag míry pohlcování antigenů citlivosti na prozánětlivé cytokiny ZVÝŠENÍ exprese MHC I a II molekul (prezentace Ag T buňkám) exprese kostimulačních molekul CD80, CD86 a CD40 (zvýšení stimulace imunokompetentních buněk) exprese adhezivních molekul ICAM-2 (CD102) a DC-SIGN (CD209) (komunikace s imunokompetentními buňkami) exprese CD83 (komunikace s B buňkami) secernace chemokinů DC-CK (Dendritic Cell derived CC ChemoKine) (cílená akumulace naivních T buněk) prodloužení poločasu rozpadu molekuly MHC II (prodloužení prezentace Ag) 21

22 Dále DC produkují cytokiny potřebné pro optimální stimulaci diferenciace antigenně specifických efektorových T buněk (např. IL-1, IL-6, TNF-α a IL-12). Při zrání dojde k prodloužení poločasu molekuly MHC II na membráně DC z 10 na 100 hodin (není již exprimována bez navázaného antigenního peptidu) (Toman, 2000). Indukci dozrávání regulují různé vlivy, jako jsou: molekuly patogenu, rovnováha mezi prozánětlivými a protizánětlivými signály v okolním prostředí, signály z T buněk. Hlavními stimulátory diferenciace progenitorů DC jsou TNF-α a GM-CSF (dalšími jsou např. IL-3, IL-4, IL-13, TGF-β) (Šedivá, 2002). Výrazný podnět pro aktivaci DC, rozptýlených v tkáních, jsou mikrobiální povrchy, jejich secernované produkty a také mikrobiální nukleové kyseliny, bohaté na úseky CpG. Lipopolysacharidové mikrobiální struktury jsou identifikovány prostřednictvím molekuly CD14, která váže komplexy LPS-LBP (LipoPolySacharide (LPS)-Binding Protein) (Krejsek & Kopecký, 2004). Proces maturace je typicky zahájen vazbou molekul PAMP, jejichž spektrum se u patogenů vyselektovalo během evoluce na příslušné receptory (PRR; Pattern-Recognition Receptors) exprimované na DC. Tyto receptory zahrnují například rodinu Toll-like receptorů (Spíšek, 2004). Receptory TLR a povrchová molekula CD14 jsou spojeny s nitrobuněčným signálním systémem, jehož aktivace vrcholí aktivací transkripčního faktoru NFқB (Nuclear Factor kappa B). Aktivovaný transkripční faktor NFқB spolu s MAP kinázami (Mitogen Activated Protein Kinase) stimuluje v DC přepis genů pro mnohé cytokiny. Jmenovat můžeme především INF-γ, INF-α, IL-12, IL-18, IL-6. Všechny tyto cytokiny jsou velmi podstatné v rozvoji celkové imunitní odpovědi proti bakteriím (Krejsek & Kopecký, 2004). T buněčné receptory (TCR) na T buňkách rozeznávají fragmenty antigenů vázaných s MHC na APC buňkách. Tyto komplexy jsou dvojího typu, MHC I a MHC II. Interagují a stimulují cytotoxické T buňky (Tc) a T pomocné buňky (Th). Po vstupu do APC buňky jsou antigeny zpracovány a rozloženy až na bílkoviny v cytosolu. Následně jsou vystaveny na jednom z MHC proteinů. Pokud je antigen vystaven na MHC I molekule, jsou generovány a aktivovány cytotoxické T buňky a buňky vystavující daný antigen (např. virem infikované buňky) jsou rozpoznány a zničeny. Antigeny vystavené na MHC II molekule interagují s Th buňkami, které mají pokud jsou aktivované, opravdové imunoregulační účinky (Satthaporn, 2001). 22

23 Vyzrávající DC se mění na účinné APC, přesunují se z tkání do lymfatických uzlin a jiných sekundárních lymfatických orgánů (Hořejší & Bartůňková, 2002). V těchto oblastech se DC mění na interdigitující dendritické buňky, které prezentují antigeny T buňkám během primární specifické imunitní odpovědi (Toman, 2000). Myeloidní DC tvorbou vysokého množství IL-12 stimulují vyzrávání T buněk do subsetu Th1. Lymfoidní DC tvoří cytokiny ke stimulaci subsetu Th2 a stimulují jeho vyzrávání. DC mohou přímo i nepřímo reagovat s B buňkami cestou interakcí CD40/CD40L, tvorbou cytokinů IL-10 a TGF-β, které stimulují přepnutí syntézy těžkých řetězců (Krejsek & Kopecký, 2004). Výsledkem uvedených interakcí je klonální expanze T a B buněk se všemi efektorovými a regulačními důsledky pro imunitní odpověď (Krejsek & Kopecký, 2004). Zralé DC mají cípatý tvar a produkují TNF-α, IL-1 a IL-12. Na rozdíl od monocytů/makrofágů nemají receptor pro lipopolysacharid CD14 (Toman, 2000). DC dosáhne zralosti během cca 48 h a tento proces je ireverzibilní. Ve zralém stadiu DC vydrží asi 2-3 dny, během nichž aktivují T buňky (Hořejší & Bartůňková, 2002). Vycházejíc ze skutečnosti, že DC se v eferentní lymfě nepodařilo dokázat, usuzuje se, že svoji životní pouť končí v lymfatických uzlinách, kde po indukci imunitní odpovědi podléhají procesu apoptózy. Tento proces podporuje IL-10. Apoptóza slouží k zabránění nadměrné stimulace imunitní odpovědi (Buc, 2001). Zásoby DC jsou kontinuálně doplňovány z prekurzorů v kostní dřeni a snad i z krevních monocytů (Hořejší & Bartůňková, 2002). Na příkladu Langerhansových buněk můžeme vidět, že po aktivaci dochází k jejich zásadním změnám. Např. ke ztrátě membránové molekuly CLA (Cutaneous Lymphocyteassociated Antigen) a ztrátě tzv. Birbeckových granulí. Dále postupně ztrácejí povrchové adhezní molekuly E-cadhedriny, které zajišťují homotypickou adhezní interakci s keratinocyty, což umožní jejich migraci z kůže (Krejsek & Kopecký, 2004). Výsledkem imunitní reakce může být indukce tolerance, nebo imunitní reakce. Dendritické buňky bývají z tohoto důvodu běžně děleny na tolerogenní nezralé DC a imunogenní zralé DC. Avšak nové nálezy odmítají tento model vzhledem k tomu, že byla dokázána indukce regulace CD4 + T buněk maturovanými DC. Bližším zkoumáním se ukázalo, že tolerance je navozena částečně nebo polo-maturovanými DC, zatímco navození 23

24 imunitní reakce je způsobeno pouze zcela zralými dendritickými buňkami (Lutz, 2002). Podle následné imunitní odpovědi tedy můžeme DC dělit na tři typy: nezralé, polozralé a maturované dendritické buňky. Toto dělení však není striktní, jednotlivé formy při procesu maturace plynule přechází jedna v druhou. Nezralé DC sídlící téměř ve všech orgánech indukují T buněčnou anergii. To je způsobeno nízkou expresí MHC molekul, kostimulačních molekul a prozánětlivých cytokinů. Oproti tomu polo-zralé DC exprimují velké množství MHC molekul (signál 1) a kostimulačních molekul (signál 2), ale neprodukují žádné cytokiny (signál 3), takže nenavodí stimulaci T buněčné odpovědi. Naopak indukují tvorbu IL-10 CD4 + T regulačními buňkami. Semi-maturované DC můžeme tedy označit jako tolerogenní. Zralé DC exprimují velké množství MHC a kostimulačních molekul a produkují též cytokiny (např. IL-12) a poskytují tak všechny signály k navození imunitní reakce. Jsou proto nazývány imunogenní DC (Lutz, 2002) INTERAKCE S DALŠÍMI IMUNOKOMPETENTNÍMI BUŇKAMI Aktivace T buněk Rozpoznání komplexu MHC-Ag na DC specifickým TCR receptorem na T buňkách představuje první signál v této interakci. Druhým signálem se označuje interakce mezi kostimulačními molekulami na DC a jejich ligandy na T buňkách (Šedivá, 2002). Zprostředkován je adhezivními molekulami ICAM-1 (CD54), ICAM-3 (CD102) a LFA-3 (CD58). Nezbytný kontext rozpoznávání poskytují T buňkám DC prostřednictvím interakce mezi CD80 (B7.1) a CD86 (B7.2) s molekulou CD28 na T buňkách (Obr.4). Tyto interakce jsou doplňovány interakcí mezi molekulou CD40, která je konstitutivně exprimována na DC a k jejíž zvýšené expresi dochází v přítomnosti protizánětlivých cytokinů, např. TNF-α a GM-CSF. Interakce mezi CD40 a molekulou CD40L (CD154), exprimovanou na T buňkách vede k produkci IL-12 dendritickými buňkami. Výčet kostimulačních interakcí mezi zralými DC a T buňkami uzavíráme interakcí mezi molekulou OX40L, exprimovanou na DC, která reaguje s molekulou OX40 (CD134) na T buňkách. Tato interakce vede na straně DC k jejich zvýšenému vyzrávání a k zesílení exprese kostimulačních molekul CD80 a CD86. Na straně T buněk stimuluje jejich proliferaci a tvorbu cytokinů (Krejsek & Kopecký, 2004). 24

25 Obr. 4: Interakce DC T buňka (Medscape, 2004). Stimulace T buněk různými vývojovými stádii DC Nezralé DC vyvolávají T buněčnou anergii, semimaturované DC produkující IL-10 indukují T regulační buňky (T reg dále produkují také IL-10) a zralé DC indukují imunitní reakci. Obdobnou úlohu mohou plnit též makrofágy a jiné buňky přirozené imunity produkující cytokiny. Dle posledních studií se předpokládá způsob indukce tolerance, kdy tolerogenní DC rutinně transportují antigen (vlastní i cizí) z periferie do thymu, kde pod jejich vlivem dochází k pozitivní selekci T regulačních buněk z naivních prekurzorů. Tolerogenní DC jsou též zapojeny v indukci T regulačních buněk v periferních lymfoidních tkáních. Tolerogenní subsety DC se vyznačují nízkou nebo chybějící expresí kostimulačních molekul CD80 a CD86 (Spíšek, 2004). Stimulace T buněk cysteinem a tryptofanem Donedávna se zdálo, že tím, co určuje schopnost dendritických buněk (resp. jiných typů profesionálních buněk prezentujících antigen) stimulovat T buňky, je 25

26 právě jejich vybavení povrchovými MHC proteiny, různými kostimulačními a adhezivními molekulami a také sekrece některých cytokinů (IL-1 a IL-12). Ukazuje se ale, že velmi důležitá je i schopnost buněk prezentujících antigen regulovat T buňkám přísun dvou důležitých aminokyselin, tryptofanu a cysteinu. T buňky si totiž cystein neumějí vyrábět samy a jsou odkázány na jeho transport z okolního prostředí speciální cysteinovou pumpou. Potíž je, že většina cysteinu je v oxidujícím prostředí tkání přítomna ve formě dimerního cystinu, který T buňky transportovat neumějí. Zralé dendritické buňky ale sekretují cystein (a také thioredoxin, který redukuje cystin na cystein), a tím jej činí pro T buňky přístupným. Tento děj zřejmě dobře vysvětluje působení protizánětlivého léku sulfasalazinu, který se používá k léčbě některých autoimunitních onemocnění. Sulfasalazin totiž brání makrofágům a dendritickým buňkám v produkci cysteinu, čímž nepřímo blokuje aktivaci autoreaktivních T buněk. Cystein ale není jedinou aminokyselinou kontrolující aktivaci T buněk, jejíž hladina je regulována buňkami prezentujícími antigen. Podobnou roli může hrát i tryptofan. DC totiž za určitých okolností produkují enzym indolamin 2,3-dioxygenázu (IDO), který tuto aminokyselinu rozkládá. Zajímavé je, že makrofágy začnou zmíněný enzym produkovat po kontaktu s aktivovanými T buňkami. Ty pak začnou mít nedostatek tryptofanu a dostávají se do útlumového stavu. Ukazuje se, že tento poměrně jednoduchý mechanizmus významně přispívá k normálnímu průběhu těhotenství, tedy k tolerování částečně cizorodého plodu imunitním systémem matky. Inhibice enzymu IDO u březích myší vedla k potratům způsobeným T buňkami (Hořejší, 2003) Aktivace B buněk DC aktivují buď přímo (pomocí IL-12, nebo solubilního receptoru pro IL-6), nebo nepřímo (regulací T buněk) naivní a paměťové B buňky. DC zpracují Ag v parakortikální oblasti sekundárních lymfatických orgánů (zde se nazývají interdigitujícími DC). Konečným výsledkem je diferenciace B buněk v plazmocyty produkující IgM. Folikulární DC nejsou hematopoetického původu a jsou schopny koncentrovat imunokomplexy. Tyto imunokomplexy jsou nabízeny B buňkám ke zpracování a k prezentaci CD4 + T buňkám. Tímto způsobem se pravděpodobně folikulární DC účastní udržování imunologické paměti (Šedivá, 2002). 26

27 Interakce s NK buňkami V posledních 20 letech byly DC zkoumány zejména s ohledem na jejich antigen specifickou imunitní odpověď v získané imunitě. V současnosti však nová data ukazují také na jejich důležitou úlohu v přirozené imunitě, která spočívá v jejich schopnosti aktivace NK (Natural Killer) buněk (Foti, 2004). Studie demonstrují různé efekty této NK-DC interakce, zahrnující například aktivaci a cytokinovou produkci, maturaci DC a NK buněčnou lýzu některých autologních DC. Tyto interakce jsou velmi důležité při imunitní odpovědi, nicméně není zatím přesně dokázáno místo, kde v těle NK a DC buňky interagují a jak tato interakce přesně probíhá. Navrhují se zatím dvě možná místa interakce a to v místech zánětu a v mízních uzlinách (Cooper, 2004). NK buňky a DC reprezentují dvě různé komponenty přirozeného imunitního systému: formují průběh cytotoxických efektů, produkují cytokiny, rozeznávají patogeny a varují adaptivní imunitní systém. DC mohou aktivaci a diferenciaci NK buněk v sekundárních lymfatických uzlinách ovlivňovat několika mechanismy: Prvním důležitým mechanismem je přímá sekrece cytokinů dendritickými buňkami, např IL-12, IL-1, IL-18 a IL-15. Maturované DC jsou zejména zdrojem IL-15, který podporuje přežití a diferenciaci NK buněk. Maturované DC jsou také hlavním zdrojem IL-12, který zvyšuje NK buňkami zprostředkovanou cytotoxicitu a produkci IFN-γ. DC sekretují dodatečné chemokiny jako IL-1 a IL-18, které umocňují efekt IL-12 tím, že indukují expresi IL-12R na NK buňkách. Jiný důležitý mechanismus kterým DC aktivují NK buňky, vyžaduje spoluúčast třetí strany T buněk. Současné studie dokazují, že DC mohou aktivovat NK buňky nepřímo také tím, že podporují expanzi antigen specifických T buněk, které sekretují IL-2, který postupně aktivuje NK buňky. Nakonec obojí DC a T buňky, mohou aktivovat NK buňky zvýšenou regulací ligandů pro stimulační a kostimulační molekuly exprimované na NK buňkách, např. NKG2D (Natural Killer Group 2 member D receptor; CD314), 2B4 (CD244), CD28 a CD137 (Cooper, 2004) Spolupráce s M buňkami Hlavními složkami slizniční imunity v gastrointestinálním traktu (GALT, Gut Associated Lymphatic Tissue) jsou Peyerovy pláty (PP) a intraepiteliální lymfocyty (IEL). PP jsou na luminálním povrchu kryty plochými buňkami, které nemají mikrovilli - tzv. M 27

28 buňkami (M pro membránové nebo microfolded ). M buňky zprostředkovávají transport patogenních podnětů cytoplazmou od luminálního k bazálnímu povrchu, kde se tyto antigeny mohou dostat do styku s DC a makrofágy. M buňky jsou i v dýchacích cestách, kde hrají podobnou úlohu. Výsledkem této interakce je navíc produkce slizničního IgA (Golovkina, 1999) (Milling, 2005) DC JAKO DVOJSEČNÁ ZBRAŇ DC jsou obvykle první buňky rozeznávající nebezpečí v podobě tkáňového poškození nebo mikrobiální invaze. Hrají hlavní roli v iniciaci imunitní odpovědi proti intracelulárním parazitům. Patogeny však disponují mechanizmy, které mohou eliminovat každý stupeň imunitní reakce, včetně inhibice maturace a funkce DC. U některých virových infekcí se DC chovají dvojím způsobem, mohou iniciovat adekvátní CD4 + a CD8 + T buněčnou odpověď, anebo paradoxně poskytnout pro ni útočiště. DC mohou být hostitelskými buňkami pro latentní cytomegalovou infekci, virus HIV-1 a virus morbil. In vitro jsou snahy o vpravení bakteriálních a virových antigenů do DC s účinnou prezentací T buňkám. Jsou snahy zefektivnit imunitní odpovědi na infekci herpes simplex, vir influenzy a HIV infekci, kdy virový peptid vpravený pomocí lipozomů do DC vyvolává silnější cytotoxickou a lymfoproliferační odpověď než vir sám (Šedivá, 2002). 28

29 8. Produkty dendritických buněk Produkt INF-α INF-γ IL-1 IL-6 IL-10 IL-12 IL-15 IL-18 TGF-β Funkce KLÍČOVÁ SLOŽKA PŘIROZENÉ REZISTENCE ORGANISMU: Indukuje stav non-permisivity vůči virové infekci; cytostatický účinek; imunomodulační působení KLÍČOVÝ CYTOKIN SUBSETU Th1: přímé a nepřímé imunomodulační působení; aktivace monocyto-makrofágových buněk; stimulace tvorby TNF-α; tlumení aktivity Th2; protektivní imunita proti intracelulárním patogenům; dále jako INF-α PROZÁNĚTLIVÝ CYTOKIN: kostimulační pro T a B buňky; stimulace hematopoézy; zesílení produkce TNF-α, IL-8, INF-γ; zesílení exprese adhezivních molekul; prokoagulační aktivita; stimulace tvorby bílkovin akutní fáze stimulace hematopoézy; stimulace Th2; tvorba protilátek aktivovanými B buňkami; stimulace proliferace T buněk REGULAČNÍ CYTOKIN: výrazně tlumí aktivitu Th1 T buněk; imunosupresivní působení; v makrofázích tlumí produkci TNF-α, IL-1 a IL-6; snižuje aktivaci a funkce neutrofilních a eosinofilních granulocytů reguluje Th1 cytotoxickou reaktivitu; stimuluje proliferaci a efektorové funkce NK buněk; zesiluje produkci TNF-α a INF-γ NK buňkami stimulace produkce protilátek; nezbytný pro aktivaci a proliferaci populací T a B buněk; stimulace NK buněk indukce aktivity subsetu Th1; prozánětlivé účinky migrace fibroblastů, monocytů, granulocytů; stimulace tvorby cytokinů v monocytech; tlumení proliferace lymfocytů; tlumení tvorby protilátek; tlumení cidní aktivity makrofágů pluripotentní prozánětlivý cytokin; zesiluje aktivaci a proliferaci T a B buněk zesiluje expresi TNF-α adhezních molekul; zasahuje do metabolických aktivit; stimuluje hematopoézu; indukuje apoptózu DC-CK chemokiny cílená akumulace naivních T buněk Tab. 4: Shrnutí produkce dendritických buněk (upraveno podle Krejsek & Kopecký, 2004) 29

30 9. Využití dendritických buněk v klinické praxi 9.1. DC A INFEKČNÍ NEMOCI DC jsou považovány za vhodné prostředky pro imunizaci proti viru HIV, herpes simplex viru a proti papillomavirům. Všechno nasvědčuje tomu, že DC upravené IL-12 mají zvýšenou schopnost aktivovat T buňky, což může být využito pro terapii infekcí. U lidí například léčbou 3 Azido-2, 3 -dideoxythymidinem (AZT) dochází k produkci množství DC, které redukují množení virů HIV a zároveň mají zvýšenou schopnost stimulovat T buňky (Yao, 2002) DC A ALERGICKÉ REAKCE Tak jako všechny prozánětlivé stimuly, tak i kontakt s alergeny aktivuje DC. Nedávné objevení vysokoafinního receptoru pro IgE na DC (FcεRI) poskytuje vysvětlení pro amplifikaci zánětlivých reakcí u alergických nemocí. DC nesoucí receptor pro IgE na svém povrchu zpracovávají a prezentují alergen mnohem efektivněji než DC, které tento receptor nemají. Ve snaze zabránit rozvoji alergického zánětu se manipuluje s DC, s cílem navodit anergii alergen specifických Th2 buněk. DC exponované alergenem ve svém nezralém stadiu jsou schopny pomocí IL-10 modifikovat svoji funkci tak, aby indukovaly anergii Th2 buněk (Šedivá, 2002). Další možnost zásahu do průběhu alergie je indukce regulačních T buněk. Ty vznikají in vitro po opakované stimulaci naivních CD4 + T buněk nezralými DC, bez přítomnosti dalších imunomodulačních faktorů. Tak vznikají CD4 +,CD25 + T buňky produkující velké množství IL-10 (ale ne IL-4, IL-5 nebo IL-2). Zdá se, že u lidí regulační T buňky plní důležitou funkci ve specifické alergenové imunoterapii (AIT). Po týdenní AIT metodou rush, u pacientů s alergii na hmyzí jed, byla zjištěna vysoká produkce IL-10 z periferních monocytů po stimulaci odpovídajícím alergenem. Toto zjištění indikuje, že AIT nejenom vychyluje Th2 odpověď k Th1, ale vede i k indukci IL-10 produkujících CD4 + T buněk, které potlačují alergen specifickou imunitní reakcí (Šedivá, 2002) PROTINÁDOROVÁ IMUNITA V posledních letech se pozornost v oblasti imunoterapie nádorů soustřeďuje na použití dendritických buněk. Možnosti manipulace s cross-priming způsobem prezentace 30

31 exogenních antigenů umožňují primární aktivaci (priming) T buněk s požadovanou antigenní specificitou, například právě v imunoterapii nádorů (Šedivá, 2002). Problémem protinádorové imunity je totiž fakt, že z různých důvodů imunitní systém nerozpozná nádorové buňky jako cizí a toleruje je. Bylo zjištěno, že pokud se dendritické buňky pěstují in vitro ve vhodném kultivačním prostředí s nádorovými antigeny (tzv. pulzace antigenem), lze prolomit tuto toleranci a indukovat imunitní reakci proti tumorovým antigenům. Rozvoj tohoto druhu imunoterapie spočívající v přípravě individuální buněčné vakcíny umožnily metody kultivace DC z monocytů periferní krve in vitro, čímž lze získat dostatečné množství těchto buněk. Na základě četných nadějných pokusů in vitro a na zvířecích modelech byly popsány klinické pokusy s ověřováním této léčby u různých nádorových onemocnění. Nicméně zůstává nezodpovězena celá řada principiálních i metodologických otázek. Ty se týkají v preklinických pokusech například optimalizace metodik kultivace DC, forem a koncentrace nádorových antigenů určených k pulzaci, vhodných in vitro testů k ověření indukce protinádorové imunity; v klinických pokusech pak načasování imunoterapie, množství aplikovaných buněk, intervaly mezi aplikacemi, ověření účinnosti in vivo a podobně (Pospíšilová, 2001) DC V TRANSPLANTOLOGII Hromadí se důkazy o dvojím působení DC v interakci příjemce - dárcovský orgán. Na jedné straně DC indukují rejekci a na druhé straně indukují toleranci. K indukci rejekce a začátku cytotoxické reakce musí DC prezentovat antigenní peptid v komplexu s MHC I mechanizmem cross-primingu. To znamená prezentovat exogenní Ag v kontextu s molekulami MHC I. Takto mohou DC zkříženě prezentovat nebo zkříženě tolerovat jak vlastní antigeny, tak antigeny cizích buněk. Procesem zkřížené prezentace mohou být zpracovány například apoptotické buňky (Šedivá, 2002). Podle čeho DC nastartují tak protikladné výsledky imunologických dějů, je předmětem intenzivního výzkumu. Zatím jsou k dispozici 2 hypotézy: 1. Různé typy DC zprostředkovávají různé imunitní reakce 2. Imunitní reakce je závislá na vývojovém stádiu DC Schopnost indukce periferní tolerance na transplantovaný orgán je připisována lymfoidním DC, ale formálně tato teorie nebyla potvrzena. Pro navození centrální tolerance v thymu existují experimentální důkazy. Například myší thymové DC jsou 31

32 schopny negativní selekce T buněk ve fetálních kulturách (Chen, 1997). Genetická manipulace in vitro s cílem vytvořit tolerogenní DC se zdá perspektivní cestou k navození tolerance k štěpu. Jednou z metod je transfekce, kdy se do DC vpraví potřebný gen pomocí adenovirových vektorů. Vhodným kandidátem je opět gen pro IL-10, se svým inhibičním účinkem na syntézu cytokinů s navozením nezralého fenotypu DC. Výsledkem je stav anergie charakterizovaný inhibicí proliferace T buněk (Šedivá, 2002). Další z řady možnosti je například ovlivnění DC pomocí PGE 2, který inhibuje produkci IL-12 z DC a zvýšuje expresi Fas. Zkouší se zablokování vazby molekuly CD40 s CD40L (na T buňce) pomocí monoklonální protilátky proti CD40 L, což vedlo experimentálně u transplantace srdce k dlouhodobému přežívání štěpu. Tyto studie založené na buněčné manipulaci jsou teprve na úrovni experimentu, otevírají však úplně novou možnost léčby rejekce štěpu v transplantologii (Šedivá, 2002). 32

33 10. Závěr I přesto, že dendritické buňky představují stěžejní část adaptivní imunitní odpovědi, byly objeveny teprve nedávno. K jejich objevu se váže poměrně složitá izolace. Dendritické buňky představují spojení mezi nespecifickou a specifickou částí imunitního sytému, které má svůj původ v myeloidních i lymfoidních prekurzorech krvetvorného systému. Správná aktivace těchto imunokompetentních buněk určuje jakým způsobem bude patogen eliminován. Z tohoto hlediska se na dendritické buňky pohlíží jako na významný imunoterapeutický nástroj. Tato práce poukazuje na komplexnost imunitní reakce dendritických buněk, interakce s dalšími imunokompetentními buňkami a podává ucelené informace o vývoji dendritických buněk. 33

34 11. Seznam zkratek ACAMP AIT APC Apoptotic-Cell-Associated Molecular Patterns Allergen-specific ImmunoTherapy Antigen Presenting Cells C3b složka komplementu CCR7 chemokine C-C motif Receptor 7 CCL19 chemokine C-C motif Ligand 19 CD Cluster of Differentiation CD40L Cluster of Differentiation 40 Ligand CR2 Complement Receptor 2 CSF Colony Stimulating Factor CTLA-4 Cytotoxic T lymphocyte Ag 4 CXCR3 chemokine C-X-C motif receptor 3 DC Dendritic cell DC-CK Dendritic Cell derived C-C ChemoKine DC-SIGN DC-Specific Intercellular-adhesion-molecule-Grabbing Nonintegrin DEC-205 Dendritic and Epithelial Cells 205 FcγRI FcεRI FDC Flt3L GALT GM-CSF HEV HSC ICAM IDO IEL IL Fragment Crystallizable γ Receptor I Fragment Crystallizable ε Receptor I Follicular Dendritic Cells Fms-like tyrosine kinase 3 Ligand Gut Associated Lymphatic Tissue Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor High Endothelial Venules Hemopoetic Stem Cells InterCellular Adhesion Molecule Indoleamine 2, 3-DiOxygenase IntraEpithelial Lymphocytes Interleukin 34