UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie Vývoj UHPLC-MS/MS metody pro stanovení pravastatinu, rosuvastatinu a jejich metabolitů Vedoucí diplomové práce: Doc. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. Vedoucí katedry: Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Hradec Králové 2012 Alena Mikšová

2 ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Alena Mikšová Školitel: Doc. PharmDr. Lucie Nováková, PhD. Název diplomové práce: Vývoj UHPLC-MS/MS metody pro stanovení pravastatinu, rosuvastatinu a jejich metabolitů Tato diplomová práce se zabývá vývojem UHPLC-MS/MS metody určené pro stanovení pravastatinu, rosuvastatinu a jejich metabolitů. Byly optimalizovány základní parametry pro MS detekci desolvační teplota, iontová optika (napětí na hexapolu a na extraktoru), průtok dusíku na vstupním kuželu, napětí na kapiláře, průtok dusíku a napětí na vstupním kuželu, které je specifické pro každou látku. K separaci analytů byla použita kolona BEH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7µm). Jako detektor byl použit trojitý kvadrupól. Ionizace byla provedena elektrosprejem v negativním i pozitivním modu. Kvantifikace analytů byla provedena pomocí SRM (monitorování vybrané reakce). Prekurzorovým iontem pro všechny stanovované statiny v pozitivním modu byl vybrán iont [M+H] +, který byl v hmotnostním spektru nejintenzivnější. U pravastatinu laktonu byl dále vybrán amonný adukt [M+NH 4 ] +. V negativním modu byl u všech stanovovaných statinů vybrán iont [M-H] -. U pravastatinu laktonu a rosuvastatinu laktonu byl rovněž vybrán acetátový adukt [M-H+CH 3 COO] -. Při zvolených optimálních podmínkách byla změřena opakovatelnost metody, její linearita a citlivost. Metoda je lineární. Hodnoty korelačních koeficientů byly v rozmezí 0,9903 0,9986 v pozitivním modu a 0,9954 0,9978 v negativním modu. V pozitivním modu byly hodnoty detekčního limitu (LOD) v rozmezí 0,01 0,55 nmol/l a hodnoty kvantitativního limitu (LOQ) v rozmezí 0,03 1,87 nmol/l. V negativním modu byly hodnoty LOD v rozmezí 0,03 524,86 nmol/l a hodnoty LOQ v rozmezí 0, ,10 nmol/l. V pozitivním modu poskytoval lepší výsledky pravastatin lakton, rosuvastatin lakton a N-desmetyl rosuvastatin. Naopak v negativním modu poskytoval lepší výsledky pravastatin a rosuvastatin. Klíčová slova: pravastatin, rosuvastatin, pravastatin lakton, rosuvastatin lakton, N-desmetyl rosuvastatin, UHPLC-MS/MS 2

3 ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Alena Mikšová Supervisor: Doc. PharmDr. Lucie Nováková, PhD. Title of Graduation Thesis: A development of UHPLC-MS/MS method for the determination of pravastatin, rosuvastatin and their metabolites This graduation thesis is dealing with the development of UHPLC/MS-MS method for the determination of pravastatin, rosuvastatin and their metabolites. The basic parameters were optimized for MS detection desolvation temperature, ion optics (RF lens and extractor), nitrogen flow at the sample cone, capillary voltage, nitrogen flow and cone voltage, which is specific for each substance. Separation of analytes was performed on BEH C18 analytical column (2.1 x 100 mm, 1.7µm). Triple quadrupole was used for detection. Electrospray ionization was performed in both negative and positive mode. Quantification of analytes was performed using the SRM (selected reaction monitoring). Ion [M+H] + was chosen for all statins determined in positive ion mode. This ion was the most intense in full scan spectrum. In positive ion mode pravastatin lactone offered also ammonium adduct [M+NH 4 ] +. All statins determined in negative mode provided a precursor ion [M-H] -. Pravastatin lactone and rosuvastatin lactone offered acetate adduct [M-H+CH 3 COO] - in negative ion mode. Considering the selected optimal conditions the system suitability test, linearity of the method and its sensitivity were measured. The method was linear. The values of correlation coefficients were in the range from to in positive ion mode and from to in negative ion mode. In positive ion mode limits of detection (LOD) ranged from 0.01 to 0.55 nmol/l and limits of quantitation (LOQ) ranged from 0.03 to 1.87 nmol/l. In negative ion mode limits of detection (LOD) ranged from 0.03 to nmol/l and limits of quantitation (LOQ) ranged from 0.11 to nmol/l. Pravastatin lactone, rosuvastatin lactone and N-desmethyl rosuvastatin provided better results in positive ion mode. Pravastatin and rosuvastatin provide better results in negative ion mode. Keywords: pravastatin, rosuvastatin, pravastatin lactone, rosuvastatin lactone, N-desmethyl rosuvastatin, UHPLC-MS/MS 3

4 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci jsou řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové Alena Mikšová 4

5 Děkuji Doc. PharmDr. Lucii Novákové, Ph.D. za odborné vedení mé diplomové práce, za cenné rady, připomínky a pomoc při zpracování práce. Také děkuji všem pracovníkům Katedry analytické chemie, hlavně Mgr. Haně Vlčkové za vstřícné jednání a příjemnou pracovní atmosféru. Velké poděkování patří mým rodičům a mému příteli za trpělivost a podporu při studiu. 5

6 OBSAH 6

7 Obsah Seznam zkratek ÚVOD CÍL A POPIS ZADÁNÍ PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST Statiny Chemická struktura statinů Vlastnosti statinů Mechanismus účinku statinů Účinky a indikace statinů Metody stanovení pravastatinu a rosuvastatinu Chromatografické separační metody Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie - UHPLC Hmotnostní spektrometrie - MS Iontové zdroje Hmotnostní analyzátory Detektory Vakuový systém Tandemová hmotnostní spektrometrie Validace metody Validační parametry EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Materiál a pomůcky Chemikálie Přístroje a pomůcky Příprava roztoků Výchozí chromatografické podmínky Optimalizace podmínek pro MS detekci MS sken - zjištění prekurzorových iontů ze spekter

8 4.4.2 Optimalizace podmínek v SIM Sken produktových iontů a optimalizace podmínek v modu SRM Optimalizace aditiva mobilní fáze Opakovatelnost v rámci SST Ověření linearity a citlivosti metody VÝSLEDKY A DISKUZE Výchozí chromatografické podmínky Optimalizace podmínek pro MS detekci Výběr prekurzorových iontů v MS skenu Optimalizace podmínek s využitím SIM experimentu Sken produktových iontů Iontové přechody a optimalizace podmínek v SRM Optimalizace aditiva mobilní fáze Opakovatelnost v rámci SST Ověření linearity a citlivosti metody ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA

9 Seznam zkratek AmAc AmF APCI APPI CE CI CK EI ESI FAB FD GC GLC GPC GSC HDL HMG-CoA HPLC ICR IČ IEC LC LDL LLC LLE LOD LOQ LSC MALDI MS MS/MS PC octan amonný mravenčan amonný chemická ionizace za atmosférického tlaku fotoionizace za atmosférického tlaku kolizní energie chemická ionizace kreatinkináza elektronová ionizace ionizace elektrosprejem ionizace odstřelováním vzorku rychlými atomy ionizace desorpcí polem plynová chromatografie plynová rozdělovací chromatografie gelová kapalinová chromatografie plynová absorpční chromatografie lipoprotein o vysoké hustotě 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym A vysokoúčinná kapalinová chromatografie iontová cyklotronová rezonance infračervená oblast iontově výměnná kapalinová chromatografie kapalinová chromatografie lipoprotein o nízké hustotě rozdělovací kapalinová chromatografie extrakce kapalina - kapalina detekční limit kvantitativní limit adsorpční kapalinová chromatografie ionizace desorpcí laserem v přítomnosti matrice hmotnostní spektrometrie tandemová hmotnostní spektrometrie papírová chromatografie 9

10 PV PVL CH 3 COO - PVL NH4 PVL Q QqQ RV RV DES RVL CH 3 COO - RVL SFC SPE SRM TLC TOF UHPLC UV VLDL pravastatin pravastatin lakton - acetátový adukt pravastatin lakton - amonný aduk pravastatin lakton kvadrupólový analyzátor trojitý kvadrupól rosuvastatin N-desmetyl rosuvastatin rosuvastatin lakton - acetátový lakton rosuvastatin lakton superkritická fluidní chromatografie extrakce kapalina - pevná látka monitorování vybrané reakce tenkovrstevná kapalinová chromatografie analyzátor doby letu ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie ultrafialová oblast lipoprotein o velmi nízké hustotě 10

11 1. ÚVOD 11

12 Statiny patří mezi látky, které snižují hladinu cholesterolu, tj. hypolipidemika. Mechanismus jejich působení spočívá v inhibici HMG-CoA-reduktázy, čímž se zastaví syntéza cholesterolu. Cholesterol je v krvi přítomen ve formě lipoproteinů u všech lidí. Lidem s hladinou vyšší než 6,5 mmol/l hrozí vyšší riziko vzniku srdečně-cévních onemocnění. Pravastatin a rosuvastatin byly dosud stanovovány řadou metod. Mezi tyto metody patří HPLC, UHPLC, kapalinovou chromatografií ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS/MS). Metoda UHPLC je pro daná měření více vhodná, jelikož umožňuje zkrátit čas analýzy bez ztráty účinnosti a snížení citlivosti. MS/MS detekce zajišťuje vysokou citlivost a selektivitu při stanovení analytů v komplikovaných matricích jakými jsou biologické materiály. 12

13 2. CÍL A POPIS ZADÁNÍ PRÁCE 13

14 Tato diplomová práce se zabývá stanovením pravastatinu, rosuvastatinu a jejich metabolitů pomocí ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostním spektrometrem typu trojitého kvadrupólu. Nejprve budou změřena hmotnostní spektra pravastatinu, rosuvastatinu, pravastatinu laktonu, rosuvastatinu laktonu a N-desmetylu rosuvastatinu, ze kterých budou vybrány prekurzorové ionty. Poté budou stanoveny optimální hodnoty základních parametrů MS detekce. Mezi tyto parametry patří napětí na vstupním kuželu, desolvační teplota, napětí na kapiláře, iontová optika (napětí na hexapolu a na extraktoru), teplota sušícího plynu, průtok dusíku, průtok dusíku na vstupním kuželu. Prekurzorové ionty budou dále fragmentovány pomocí kolizní cely trojitého kvadrupólu a bude vybrán fragment s dostatečnou intenzitou pro SRM přechod. Dalším měřením bude následně zjištěna hodnota kolizní energie, aby citlivost metody byla co nejvyšší. Nakonec bude proměřena opakovatelnost metody, linearita a citlivost metody. 14

15 3. TEORETICKÁ ČÁST 15

16 3.1 Statiny Statiny řadíme mezi hypolipidemika, což jsou látky, které snižují hladinu cholesterolu v krvi. Syntéza cholesterolu je velmi složitý proces, jehož rychlost je dána přeměnou 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzymu A (HMG-CoA) na mevalonovou kyselinu. Tato přeměna je metabolizována HMG-CoA-reduktázou. Statiny inhibují právě tento enzym, čímž se syntéza cholesterolu zastaví. Jsou také jediná hypolipidemika, která snižují mortalitu a morbiditu na kardiovaskulární onemocnění [1][2]. Lze je rozdělit na [3]: a) proléčiva simvastatin, lovastatin, které jsou laktony účinných látek b) vlastní účinné látky atorvastatin, fluvastatin, pravastatin, rosuvastatin, které jsou volnými kyselinami Chemická struktura statinů Většina inhibitorů HMG-CoA-reduktázy obsahuje v molekule částečně hydrogenované naftalenové jádro, které se váže na hydrofóbní část receptoru. Dále je na nákladní skelet esterově vázán postranní 2-methylbutanoylový zbytek a pomocí dvouuhlíkového spojovacího řetězce seskupení strukturálně podobné mevalonové kyselině, které je zodpovědné za kompetitivní inhibici HMg-CoA-reduktázy. Pravastatin (obr. 1) nevyžaduje metabolickou aktivaci a podává se ve formě sodné soli. Mezi jeho metabolity patří např. pravastatin lakton (obr. 2). Rosuvastatin (obr. 3) obsahuje polarizovanou methylsulfonamidovou skupinu, díky které má nejvyšší počet vazebných interakcí s enzymem HMG-COA-reduktázou. Tato chemická struktura umožňuje rosuvastatinu nízkou pasivní difúzi přes buněčné membrány a selektivní vychytávání v jaterních buňkách. Mezi metabolity rosuvastatinu patří např. rosuvastatin lakton (obr. 4) a N-desmetyl rosuvastatin (obr. 5). Aktivní část molekuly mevastatinu, lovastatinu a simvastatinu (obr. 6) má charakter laktonového kruhu, jehož hydrolýzou se uvolňuje aktivní seskupení, které odpovídá 3,5-dihydroxyvalerové kyselině. U fluvastatinu je hydrogenované naftalenové jádro nahrazeno skeletem indolovým. U atorvastatinu je aromatická část tvořena složitě substituovaným pyrolem. Charakteristické pro atorvastatin a fluvastatin je nahrazení postranního 2-methylbutanoylového zbytku 4-fluorfenylem a substituce heterocyklického kruhu isopropylem. Obě látky se podávají ve formě solí [2][4]. 16

17 Obr. 1: Struktura pravastatinu Obr. 2: Struktura pravastatinu laktonu Obr. 3: Struktura rosuvastatinu Obr. 4: Struktura rosuvastatinu laktonu Obr. 5: Struktura N-desmetylu rosuvastatinu Obr. 6: Struktura simvastatinu 17

18 3.1.2 Vlastnosti statinů Většina statinů jsou bílé krystalické prášky nerozpustné ve vodě. název sumární molekulová vzorec hmotnost log P pka pk atorvastatin C 33 H 35 FN 2 O 5 558,64 3,85 ± 0,73 4,29 ± 0,10 0,38 ± 0,50 fluvastatin C 24 H 26 FNO 4 411,46 4,57 ± 0,70 4,27 ± 0,10 lovastatin C 24 H 35 O 5 404, 54 4,31 ± 0,48 13,49 ± 0,40 pravastatin C 23 H 36 O 7 424,53 2,21 ± 0,53 4,31 ± 0,10 pravastatin lakton C 23 H 34 O 6 406,51 2,39 ± 0,49 13,49 ± 0,40 rosuvastatin C 22 H 28 FN 3 O 6 S 481, 54 0,89 ± 0,67 4,25 ± 0,10-0,37 ± 0,10 rosuvastatin lakton C 22 H 26 FN 3 O 5 S 463,52 1,20 ± 0,65 13,22 ± 0,40-0,45 ± 0,10 N-desmetyl rosuvastatin C 21 H 26 FN 3 O 6 S 467,51 0,74 ± 0,67 4,25 ± 0,10-0,57 ± 0,10 simvastatin C 25 H 38 O 5 418, 57 4,72 ± 0,49 13,49 ± 0,40 Tab. 1: Základní vlastnosti statinů Mechanismus účinku statinů Mechanismus účinků statinů spočívá v inhibici (blokaci) enzymu 3-hydroxy-3- methylglutaryl-koenzym A reduktázy (HMG- CoA-reduktázy), který katalyzuje první krok tzv. endogenní biosyntézy cholesterolu. Vzniklý nedostatek cholesterolu vyvolá v játrech kompenzační zvýšení počtu a aktivity LDL receptorů, které způsobí zvýšené vychytávání LDL cholesterolu z plazmy, čímž dojde k jeho snížení v krvi. Současně dochází i k mírnému vzestupu HDL cholesterolu [1][3] Účinky a indikace statinů Účinky statinů můžeme rozdělit na lipidové a nelipidové. Mezi lipidové patří výrazné snížení LDL cholesterolu, a tím i celkového cholesterolu, dále pak zvýšení HDL cholesterolu, mírné snížení VLDL a triglyceridů. Stabilizaci aterosklerotického plátu, antiagregační a protizánětlivý účinek řadíme k nelipidovým účinkům. Statiny se užívají hlavně při izolované a smíšené hypercholesterolémii, v primární a sekundární prevenci ischemických kardiovaskulárních a cerebrovaskulárních příhod [3]. Nejvíce obávaným nežádoucím účinkem statinů je myopatie, která se projeví svalovou slabostí, bolestí, ztuhlostí či křečemi. Trpí jí zhruba 1-5 % pacientů [1]. Velice vzácně se může u pacientů léčených statiny objevit rhabdomyolýza. Poškozením buněčné stěny může dojít k uvolnění myoglobinu ze svalů. Uvolněný myoglobin koluje v plazmě, ukládá se do ledvinových tubulů, poškozuje tubulární transport a může vést 18

19 až k renálnímu selhání. Rhabdomyolýza se projevuje bolestí a otokem svalů s výrazným vzestupem CK (keratinfosfokinázy) a přítomností myoglobinu v tmavě zbarvené moči [3]. Mezi další nežádoucí účinky patří bolest hlavy, nevolnost, únava. V klinických studiích se však jejich frekvence výrazně nelišila oproti placebu [1] Metody stanovení pravastatinu a rosuvastatinu Pravastatin a rosuvastatin jsou nejčastěji stanovovány v lidské plazmě, v lidském séru a v krysí plazmě (tab. 2 a tab. 3). Délka kolony pro analýzu pravastatinu byla mm s velikostí částic 1,7-5µm, pro rosuvastatin je kolona dlouhá mm s velikostí částic 4,6 µm nebo 5 µm. Vzorky pravastatinu jsou nejčastěji upravovány pomocí SPE (solid phase extraction). LLE (liquid-liquid extraction) nebo proteinová precipitace se používá při úpravě rosuvastatinu. Mobilní fází u pravastatinu je nejčastěji směs acetonitrilu a 1% kyseliny mravenčí. U rosuvastatinu převládá směs acetonitrilu a octanu amonného. Při stanovování statinů kapalinovou chromatografií se k detekci používá většinou hmotnostní spektrometrie. Délka analýzy pravastatinu je velmi rozdílná (1,8 28,5 min). U rosuvastatinu je čas analýzy v rozmezí 3,5 33,5 min. Citlivost jednotlivých analýz je v rozmezí 0,1-1,9 ng/ml u pravastatinu a 0,02 1,8 ng/ml u rosuvastatinu, což vypovídá o potřebnosti metod s vysokou citlivostí pro stanovení takto nízkých hladin [5]-[19]. 19

20 stanovovaná látka původ vzorku analytická kolona mobilní fáze detekce čas analýzy citlivost odkaz pravastatin moč krysy ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1 pravastatin, pravastatin lakton lidské sérum mm, 1,7 µm) Keystone Betasil (100 mm 2,1 mm, 5 µm) A: 0,1%FAc v H 2O B: 0,1%FAc v ACN ACN:MeOH:5mM AmAc, ph 4,5 (30:30:40) pravastatin myší plazma Atlantis dc18 (150 mm 2,1 mm, 3 µm) ACN: 0,1% FAc v H 2O (29:71) pravastatin pravastatin pravastatin pravastatin lidská plazma lidská plazma lidská plazma lidská plazma Inertsil ODS-3 C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm) ACN:H 2O:AmAc:TEA (400/600/0,77/0,2/0,6) Luna C 18 (250 mm 4,6 mm, 5 µm) 300 ml ACN: 700ml 0,05M dihydrogenfosforečnan draselný, ph 2,3 ESI-MS/MS 13 min NA [5] [M+H] + LS-MS/MS 9 min 0,5 ng/ml [6] LC/MS/MS 14 min 3,4 ng/ml [7] LC / APCI-MS / MS 2,3 min 0,1ng/ml [8] [M-H] - UV detekce 14 min 1,9 ng/ml [9] Zobrax XDB C8 (50mm x 2,1 mm, 5 µm) ACN: 1mM AmF (2:1), ph 3,3 LC MS MS [M-H] - 1,8 min 0,25 ng/ml [10] Synergi Max-RP (150 mm x 2,0 mm, 4 µm) ACN:MeOH:5mM AmAc (30:30:40), pravastatin C18 Intertisl ODS 3V (4,6mm 250 mm, 5 pravastatin, pravastatin lakton lidské sérum µm) Symmetry C18 (50 mm x 3,9 mm, 5 µm) ph 4,5 A: 0,01 AmAc:ACN (ph 5,0) 90:10 B: 0,01 AmAc:ACN (ph 5,0) 5:95 C: 0,01 AmAc:MeOHl (ph 5,0) 10:90 ACN:1 mm FAc (100 0% FAc) LC-DAD-MS/MS 8 min 0,5 ng/ml [11] UV detekce 28,5 min 0,1 ng/ml [12] LC-MS/MS [M-H] - 2,5min 0,5 ng/ml [13] pravastatin lidské sérum Purospher star C18 (250mm 4,6 mm, 5 μm) ACN: H 2O (60:40, ph 3,0) UV-VIS detektor 3,1 min 1,4 ng/ml [14] pravastatin lidská plazma Thermo electron Betabasic C8 (100 mm 4,6 mm, 5 µm) 0,1% NH 3 v H 2O (25% NH 3, v/v):acn (20:80) LC MS MS 3,0 min 0,5 ng/ml [15] Tab. 2: Analytické metody pro stanovení pravastatinu a pravastatinu laktonu ACN- acetonitril, AmAc- octan amonný, FAc- kyselina mravenčí, H 2 O- voda, MeOH- metanol, NH 3 - amoniak, TEA- triethylamin, NA- not available 20

21 stanovovaná látka rosuvastatin původ vzorku lidská plazma analytická kolona mobilní fáze detekce čas analýzy citlivost odkaz X-Terra C 18 (150 mm x 4,6 mm, 5,0 µm) AmAc:ACN:MeOH (50:40:10), ph UV detekce 6,7 min 0,03 ng/ml [16] 5,0 rosuvastatin NA Intertisl ODS 3V (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) AmAc:ACN:MeOH UV detekce 33,5 min 0,1 ng/ml [12] rosuvastatin lidská plazma Atlantis C 18 (150 mm x 2,1 mm, 5,0 µm) 0,2% FAc:MeOH (30:70) LC-MS/MS 6 min 0,2 ng/ml [17] rosuvastatin lidské sérum Purospher star C18 (250 mm 4,6 mm, 5 μm) ACN:H 2O (60:40, ph 3,0) UV-VIS 4,5 min 1,8 ng/ml [14] rosuvastatin lidské sérum Purospher STAR RP-18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) rosuvastatin krysí Kromasil KR 100-5C 18 (250 mm x 4.6 mm, 5 plazma µm) MetOH:H 2O (90:10, ph 3,5) UV-VIS detekce 3,5 min 0,16 ng/ml [18] s kyselinou fosforečnou 0,05 mm FAc:ACN (55:45) UV detekce 8,6 min 0,02 µg/ml [19] Tab. 3: Analytické metody pro stanovení rosuvastatinu ACN- acetonitril, AmAc- octan amonný, FAc- kyselina mravenčí, H 2 O- voda, MeOH- metanol, NA- not available 21

22 3.2 Chromatografické separační metody Chromatografické metody patří mezi fyzikálně-chemické separační metody, které slouží ke kvantitativní i kvalitativní analýze. Principem je distribuce látek mezi dvě fáze: pohyblivou (mobilní) a nepohyblivou (stacionární), které se od sebe liší některou základní fyzikálně-chemickou vlastností, např. polaritou. Mobilní fází může být kapalina (eluent, eluční činidlo) nebo plyn (nosný plyn), stacionární fází pak kapalina nebo tuhá látka (sorbent). Dělené látky (analyty) mají rozdílnou afinitu ke stacionární a mobilní fázi. Analyty s větší afinitou ke stacionární fázi jsou zadržovány déle, než analyty, které mají větší afinitu k mobilní fázi. Dochází k opakovanému vytváření rovnovážných stavů dělených látek mezi stacionární a mobilní fází, a tím pádem k rozdělení jednotlivých složek směsi. Chromatografické separační metody se uplatňují nejen v oblasti analytické chemie, ale také v potravinářském a farmaceutickém průmyslu či v oblasti forenzních věd - při analýze pro kriminalistické účely [20][21][22]. Chromatografii je možné rozdělit na [21]: A. Plynovou chromatografii gas chromatography (GC) B. Kapalinovou chromatografii liquid chromatography (LC) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie high performance liquid chromatography (HPLC), patří mezi nejvíce používané separační metody. Tato metoda umožňuje kvalitativní i kvantitativní hodnocení separovaných složek směsí. HPLC se využívá k lékopisné kontrole (totožnost, obsah, čistota), k analýze složitých lékových přípravků, ke stabilitním studiím, k analýze přírodních léčiv v rostlinném materiálu, k monitorování léčiv a metabolitů v tělesných tekutinách. Mezi další výhody patří malá spotřeba vzorku, vysoká citlivost, rychlost a možnost automatizace. Tato metoda je vhodná k dělení těkavých a polárních látek, jejichž analýza plynovou chromatografií bývá obtížná [23][24][25]. HPLC je založena na separaci analytů na základě jejich distribuce mezi stacionární a mobilní fázi. Mobilní fází je kapalina (voda, metanol, acetonitril) nebo plyn. Stacionární fází může být kapalina nebo tuhá látka [22]. 22

23 Přístroj, na kterém se provádí HPLC analýzy, se označuje kapalinový chromatograf (obr. 7). Kapalinový chromatograf se skládá ze zásobníků s mobilní fází, vysokotlaké pumpy, dávkovače, kolony a detektoru [23][24]. Pokud se v průběhu HPLC analýzy složení mobilní fáze nemění, jedná se o tzv. izokratickou eluci. Je-li k jedné mobilní fázi plynule přimícháváno rostoucí množství druhé mobilní fáze s větším elučním účinkem, jedná se o tzv. gradientovou eluci [21]. Obr. 7: Schéma kapalinového chromatografu [26] Kolony HPLC Kolony HPLC je možné dělit na dvě skupiny [27]: a) částicové b) monolitické Kolony jsou nejčastěji vyráběny z nerezové oceli, plastu nebo ze skla. Částicové kolony jsou plněny částicemi sorbentu o definovaném průměru a velikosti pórů. Monolitické kolony se dostávají do popředí v průběhu posledních let a jsou zhotoveny z jednoho kusu porézního síťovaného polymeru (např. polystyrenu) nebo porézního silikagelu (SiO 2 ), který zcela zaplňuje vnitřek separační kolony. Monolity neobsahují mezičásticové prostory, na rozdíl od částicových kolon, a proto musí mobilní fáze protékat póry monolitu. Silikagelové monolitické kolony jsou tvořeny dvěma typy pórů: makropóry a mezopóry. Makropóry tvoří hustou síť pórů, jsou zodpovědné za rychlý konvektivní tok mobilní fáze skrz monolit a výrazně urychlují přenos hmoty mezi mobilní a stacionární fází. Mezopóry tvoří jemnou porézní strukturu, čímž vytvářejí velký povrch, a zvyšují tak separační kapacitu kolony. 23

24 Struktura organických polymerů se skládá z málo uspořádaných pospojovaných makroglobulí a makropórů, které jsou mezi nimi. Tyto kolony umožňují použít vysoký průtok v kolonách bez zvýšení zpětného tlaku, což je jejich hlavní výhodou. Mezi nevýhody patří omezený počet komerčně dostupných stacionárních fází. K stacionárním fázím pro monolitické kolony řadíme pouze modifikované silikagely C8, C18 a prostý silikagel. Další nevýhodou monolitických kolon oproti částicovým kolonám je horší reprodukovatelnost retenčních vlastností mezi jednotlivými výrobními sériemi. Monolitické kolony jsou vyráběny polymerací a jsou často používány ve spojení s UV nebo fluorescenčním detektorem [27][28][29][30] Sorbenty HPLC Silikagel patří k nejvíce používaným polárním sorbentům. Mezi nevýhody silikagelu patří limitovaný rozsah ph mobilní fáze (ph = 2,5 7,0). Pokud je ph nižší než 2,5 dochází k hydrolýze silikagelu, což vede ke snížení retenčního času a ke snižování životnosti kolony. Při ph vyšším než 7,0 se silikagel začíná rozpouštět a opět může docházet ke snížení retenčního času, účinnosti kolony a vzrůstu zpětného tlaku na koloně. Dalším nedostatkem je chvostování bazických látek, které jsou více zadržovány na mírně kyselém povrchu silikagelu než látky neutrální či kyselé [31]. Jestliže je ph mobilní fáze nižší než 2,5 nebo vyšší než 7,0, používají se sorbenty založené na polymerní fázi, které mohou pracovat v celém rozsahu ph. Tyto sorbenty jsou chemicky i mechanicky stálé a nedochází na nich k iontovým interakcím. Mezi nevýhody patří nižší účinnost a špatně předvídatelná retence solutů [32]. O spojení výhodných vlastností obou typů sorbentů a dosažení optimálních vlastností se pokouší hybridní organicko-anorganická technologie. Tato technologie kombinuje nejlepší vlastnosti silikagelu - vysokou účinnost a mechanickou odolnost, s nejlepší vlastností organických polymerů - schopností pracovat v širokém rozsahu ph. Díky této kombinaci dochází ke zvýšení stability, snížení zpětného tlaku a zvýšení účinnosti při vysokém průtoku [32]. Mezi faktory ovlivňující separaci v HPLC patří např. velikost pórů, eluční síla, iontová síla a ph mobilní fáze [29][32]. 24

25 3.2.2 Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie - UHPLC Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie (UHPLC) je relativně nová metoda, která poskytuje nové možnosti v kapalinové chromatografii. UHPLC se využívá nejen pro analýzu při vývoji léčiv (vývoj léčiv, kontrola kvality léčivých přípravků), ale také pro analýzu potravin, rostlin, metabolitů a ke kontrole životního prostředí. Tato separační metoda má mnoho výhod oproti klasické HPLC technice. Mezi ně patří hlavně kratší doba analýzy a s tím spojená vyšší produktivita, dále pak snížení nákladů, zvýšení separační účinnosti, zvýšení citlivosti a získávání více kvalitativních informací. Jednotlivé UHPLC systémy se liší objemem nástřiku, maximálním zpětným tlakem, teplotou, možností nastavení průtoku, časem nástřiku atd. [30][33][34] Stacionární fáze a kolony pro UHPLC Sorbenty jsou připravovány patentovanou technologií a vynikají mechanickou pevností a vysokou separační účinností. Sorbenty pro UHPLC jsou v dnešní době dvojího typu: hybridní a silikagelové. Oba dva typy byly upraveny různými chemickými procesy. Hlavní výhodou hybridních sorbentů je vysoká chemická stabilita, díky které je možné tyto sorbenty použít v celém rozsahu ph [30]. Velikost částic sorbentu má vliv na účinnost separačního procesu, jelikož se snižující se velikostí částic dochází ke zvýšení účinnosti separace. V roce 1950 byly používány sorbenty s velikostí částic 100 µm, v současnosti jsou částice menší než 2 µm, přičemž optimální velikost částic pro UHPLC je okolo 1,7 µm. Díky zmenšování velikosti částic je možné docílit kratší doby analýzy bez ztráty účinnosti. Další snižování velikosti vede ke zvyšování zpětného tlaku, ale zvýšení účinnosti je zanedbatelné [30][32]. V dnešní době existuje u UHPLC široká škála stacionárních fází (reverzní fáze, iontově výměnné, HILIC, normální fáze). Novinkou jsou mixed-mode stacionární fáze, které byly představeny teprve v roce 2010 a lze je nalézt např. v CSH (charged surface hybrid) analytických kolonách [35]. Další velkou skupinou jsou ACQUITY BEH kolony, pro které jsou k dispozici 5 druhů stacionárních fází: C18, C8, Amid, Phenyl a Shield RP18. Každá stacionární fáze má rozdílnou hydrofobicitu, chemickou stabilitu a rozdílné interakce s analytem [35]. Průměr UHPLC kolon je obvykle 2,1 nebo 1,0 µm [30]. 25

26 3.3 Hmotnostní spektrometrie - MS Hmotnostní spektrometrie je fyzikálně-chemická metoda založena na přímém měření hodnoty poměru hmotnosti a nábojového čísla (m/z) (počtu kladných a záporných iontů v plynné fázi vzniklých po ionizaci analyzované látky). Tento poměr je vyjadřován v atomových hmotnostních jednotkách (1 atomová hmotnostní jednotka odpovídá jedné dvanáctině atomové hmotnosti izotopu uhlíku 12 C) nebo v daltonech (1 Da je hmotnost vodíkového atomu) [36]. Tato metoda umožňuje analýzu komplexních směsí, nekovalentních komplexů, měření molekulové hmotnosti, kontrolu kvality, identifikaci proteinů, odhalení mutací a DNA sekvenčních chyb. Přístroj, na kterém se provádí MS analýzy, se nazývá hmotnostní spektrometr (obr. 8). Spojení hmotnostního spektrometru s moderními separačními metodami umožňuje provádět stopovou kvalitativní i kvantitativní analýzu. Mezi výhody MS patří citlivost, rychlost a jednoduchost interpretace dat [37][38]. Tato metoda v sobě zahrnuje tři hlavní kroky: 1. ionizace - generování iontů sledovaných atomů nebo molekul pomocí iontového zdroje 2. separace - rozdělení iontů podle poměru jejich hmotnosti k náboji (m/z) pomocí hmotnostního analyzátoru 3. detekce - měření zastoupení jednotlivých druhů separovaných iontů pomocí detektoru Mezi další části přístroje patří vakuový systém, zařízení pro zavádění vzorku (sonda), iontová optika k urychlení a fokusaci iontů, počítač na ovládání a ladění přístroje, sběr a ukládání dat a porovnání spekter s knihovnou [39]. 26

27 3.3.1 Iontové zdroje Obr. 8: Schéma hmotnostního spektrometru [37] Iontový zdroj slouží k ionizaci, tj. k převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice. Iontové zdroje mohou být v kontinuálním (ESI - ionizace elektrosprejem) nebo diskontinuálním provedení (MALDI - ionizace desorpcí laserem v přítomnosti matrice). Volba techniky ionizace je závislá na povaze látky (polarita, rozpustnost, molekulová hmotnost, ionizační energie) a separační technice. Ionizační techniky rozdělujeme podle energie ionizace na měkké a tvrdé techniky. Další způsob dělení je podle tlaku v iontovém zdroji na ionizaci za sníženého nebo za atmosférického tlaku (ESI) [39][40] Měkké ionizační techniky Mezi měkké ionizační techniky patří ionizace elektrosprejem (ESI), termosprejem (TS), chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI), ionizace desorpcí polem (FD), ionizace desorpcí laserem v přítomnosti matrice (MALDI), ionizace ostřelováním vzorku rychlými atomy (FAB). Jejich výhodou je nízká ionizační energie. U těchto technik vznikají protonované molekuly [M+H] + (při záznamu kladných iontů) nebo deprotonované molekuly [M-H] - (při záznamu záporných iontů). Ionizované molekuly získávají velmi malé množství energie, proto ve spektrech pozorujeme zejména (de)protonované molekuly a minimum fragmentů. Výtěžnost ionizace a tvorba aduktů závisí na zvolených podmínkách (ph, složky mobilní fáze, matrice atd.) [39][40]. 27

28 ESI ionizace elektrosprejem Tento typ ionizace probíhá za atmosférického tlaku. Vzorky v roztoku jsou přiváděny do iontového zdroje kovovou kapilárou, na jejíž konec je vloženo napětí. Kapalina je rozprášena působením nehomogenního elektrického pole a vytvořený sprej je rychle desolvatován protiproudem horkého inertního plynu. Látky, které jsou disociované v roztoku, přecházejí v iontové formě přímo do plynné fáze. V závislosti na povaze analyzované látky mohou být produkovány jednou nebo vícenásobně nabité ionty. Průtoková rychlost, kterou kapalná fáze přichází do elektrospreje, se pohybuje v rozmezí několika µl/min až 1 ml/min. ESI je vhodná pro analýzu polárních, vysokomolekulárních látek do molekulových hmotností až 100 kda. Tato technika se používá ve spojení s kapalinovou chromatografií nebo kapilární elektroforézou. Mezi její výhody patří snadnější určení náboje iontů, a to díky přítomnosti analytu ve více iontech s různým nábojem. Nevýhodou je menší přehlednost spekter složitějších směsí [36][38]. TS - ionizace termosprejem Vzorek v mobilní fázi obsahující vodu, organické rozpouštědlo a těkavý elektrolyt je rozprášen průchodem kovovou kapilárou za kontrolované teploty. Konec kapiláry je zahříván na teplotu nad bodem varu kapalných složek roztoku. K vlastní ionizaci dochází při desolvataci vytvořeného spreje působením povrchového elektrostatického náboje a přítomného elektrolytu. Průtoková rychlost kapalné fáze přicházející do termospreje se pohybuje v rozmezí 0,5-2 ml/min. Ionty elektrolytu ionizují analyzované složky. V případě čistě organického rozpouštědla může být produkce iontů nahrazena nebo podpořena působením elektrického výboje. Tato technika ionizace je kompatibilní ve spojení s kapalinovou chromatografií [36][41]. MALDI ionizace desorpcí laserem v přítomnosti matrice Při této technice (obr. 9) je vzorek ve vhodné matrici nanesen na kovovou destičku a ionizován zářením pulzního laseru (oblast vlnových délek od UV do IČ, délka trvání pulzu od pikosekundy až k nanosekundám). Matricí je látka, která absorbuje energii laseru a následně ionizuje analyt (kyselina α-hydroxyskořicová, kyselina sinapová, ). Tato ionizace umožňuje analýzu širokého spektra molekulových 28

29 hmotností i velkých proteinů a je často používána ve spojení s průletovými hmotnostními analyzátory [36][40]. Obr. 9: Schéma mechanismu MALDI [42] CI chemická ionizace Tato technika ionizace využívá pro přenos energie na ionizovanou molekulu vzorku tzv. reakčního plynu, kterým může být metan, amoniak, oxid dusnatý či kyslík. Pro hmotnostní spektrum po CI je v závislosti na použitém reakčním plynu charakteristická přítomnost iontu typu [M + H] +, [M + H] - nebo aduktových iontů vznikajících mezi vzorkem a použitým plynem. Při CI je obecně produkováno menší množství fragmentových iontů. Varianta desorpční chemické ionizace je využívána pro ionizaci tepelně nestálých látek. Během této ionizace je vzorek nanesený na žhavené kovové vlákno velmi rychle odpařen vlivem Joule-Thomsonova jevu [36]. APCI chemická ionizace za atmosférického tlaku Tato ionizace probíhá za atmosférického tlaku za průtoku HPLC eluentu rychlostí 0,1 1 ml/ml a její princip je obdobný jako pro konvenční chemickou ionizaci. Na výbojovou (jehlovou) elektrodu je vloženo vysoké napětí (3-4 kv), čímž vzniká koronový výboj, kterým jsou nejdříve ionizovány molekuly mobilní fáze (protože jsou v přebytku) a následně jsou ionizovány molekuly analytu působením iontmolekulárních reakcí reakčního plynu (tj. ionizovatelnými molekulami mobilní fáze). Produkované ionty jsou většinou jednou nabité, typu [M + H] +, [M + H] - v závislosti na podmínkách a jsou elektrodami usměrněny do analyzátoru. Protiproud 29

30 sušícího plynu slouží k rozbití případných nekovalentních klastrů. Tato technika je ideální pro spojení s kapalinovou chromatografií [36][39] Tvrdé ionizační techniky EI elektronová ionizace EI patří k nejběžnějším a nejpropracovanějším způsobům ionizace. Velmi často je spojována s plynovou chromatografií. Při této ionizaci dochází k ovlivnění elektromagnetických polí, v důsledku čehož se uvolní valenční elektron a vznikne molekulární iont M 0 (M + e - M e - ). Při EI je vzorek v plynné fázi ionizován proudem elektronů, jejichž kinetická energie je vyšší než ionizační energie analyzovaných molekul. Zdrojem elektronů je nejčastěji elektricky žhavené rheniové nebo wolframové vlákno. Proud elektronů je směrován prostorem iontového zdroje k anodě. Vzniklé ionty jsou následně vytlačovány z iontového zdroje elektrickým polem pomocné elektrody. Ve spektrech je možné pozorovat mnoho fragmentových iontů, které jsou charakteristické pro strukturu pozorovaných molekul. Hlavní výhodou EI je vytváření knihoven spekter, které se využívají k snadnější identifikaci látek. Tato technika je limitována nutností převedení vzorku do plynné fáze a není vhodná pro látky polární, tepelně nestálé nebo vysokomolekulární [36][37][39][40] Hmotnostní analyzátory Hmotnostní analyzátory slouží k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle jejich poměru hmotnosti a náboje (m/z). Principem je pohyb nabitých částic v magnetickém nebo elektrickém poli. Separace iontů probíhá na základě různých fyzikálních principů [43]: a) Zakřivení dráhy letu iontů v magnetickém (nebo elektrickém) poli magnetické analyzátory b) Různá stabilita oscilací iontů v dvoj- nebo trojrozměrné kombinaci stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí kvadrupóly a iontové pasti c) Různá doba letu iontů v oblasti bez pole analyzátory doby letu (TOF) d) Různá absorpce energie při cyklonálním pohybu iontů v kombinovaném magnetickém a elektrickém poli iontová cyklotronová rezonance (ICR) 30

31 Kvadrupólový analyzátor (Q) Tento analyzátor patří mezi tzv. dynamické a je tvořen čtyřmi kovovými tyčemi (elektrodami), které jsou paralelně rozmístěny na kružnici (obr. 10). Na protilehlé tyče je vloženo vždy stejné napětí, které je kombinací stejnosměrné (U) a střídavé (V) složky. Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyče, začnou v prostředí střídavého elektrického pole oscilovat. Napětí vložená na dva páry tyčí jsou zvolena v daném časovém okamžiku tak, aby mezi tyčemi proletěly pouze ionty s určitou hodnotou m/z. Zbylé ionty jsou zachyceny na tyčích kvadrupólu. Plynulou změnou hodnot střídavého a stejnosměrného napětí jsou postupně analyzovány všechny ionty ve zvoleném rozsahu. Výhodou tohoto analyzátoru je rychlý záznam celého spektra, nepřítomnost magnetu, možnost kvalitně pracovat i při vyšších tlacích. Nevýhodou je větší propustnost iontů a tzv. iontová diskriminace, tj. čím je větší m/z, tím je menší relativní intenzita iontu. Kvadrupólový analyzátor se často používá ve spojení GC/MS nebo HPLC/MS [38][44]. Tento analyzátor umožňuje také měření v tandemovém uspořádání hmotnostního spektrometru, kdy jsou použity stejné hmotnostní analyzátory (QqQ- trojitý kvadrupól) nebo kombinace různých analyzátorů (Q-TOF). U trojitého kvadrupólu umožňuje první kvadrupólový filtr izolaci prekurzoru - mateřského iontu. Druhý kvadrupól slouží jako kolizní cela, ve které dochází ke srážkám s molekulami kolizního plynu (argon). Tento proces se označuje jako kolizně indukovaná disociace, během které dochází ke vzniku produktových iontů, jež jsou analyzovány třetím kvadrupólem [38]. Obr. 10: Kvadrupólový analyzátor [37] Magnetický analyzátor Ionty jsou v tomto analyzátoru separovány podle zákona působení síly na nabitou částici. Ionty urychlené záporným potenciálem vstupují do magnetického pole tvořeného elektromagnetem ve tvaru kruhové výseče. Silové účinky magnetického pole vyvolají pohyb iontů po kruhové dráze. Na detektor následně dopadá iont o určité 31

32 m/z. Částice s jinou hmotností opisují dráhu o jiném poloměru, dochází tak k prostorové disperzi iontů podle jejich hmotnosti [45] Iontová past Jedná se v podstatě o trojrozměrný kvadrupól složený z prstencové střední elektrody s hyperbolickým průřezem a dvou kruhových elektrod stejného průřezu, které prstenec volně uzavírají. Na prstenec je vloženo kombinované stejnosměrné a střídavé napětí, které způsobí stabilní oscilaci iontů v pasti. Všechny ionty nad určitou hodnotu m/z, která odpovídá amplitudě vysokofrekvenčního napětí, mají trajektorie, které je udržují uvnitř pasti. Do iontové pasti je dále zaváděn tlumící plyn (helium), který tlumí oscilace iontů a udržuje je ve středu pasti. Při zvyšování vysokofrekvenční amplitudy se ionty s rostoucí hodnotou m/z postupně stávají nestabilními, jsou vypuzovány z pasti a detekovány [38] Průletový analyzátor (TOF) Jedná se o nejjednodušší a nejrychlejší hmotnostní analyzátor, který je v podstatě tvořen pouze prázdnou trubicí. TOF (obr. 11) řadíme mezi pulzní hmotnostní analyzátory, protože jsou ionty nejdříve velmi krátkým pulzem urychleny na vstupu do analyzátorové trubice a potom se přesně měří čas, za který ionty dolétnou k detektoru. K rozdělení iontů tak dochází na základě jejich odlišné doby letu v oblasti bez pole. Ionty s nižší hmotností mají větší rychlost a dopadají na detektor dříve než ionty s vyšší hmotností, které dorazí na detektor později. Výhodou tohoto analyzátoru je vysoká rychlost, citlivost a široký rozsah m/z. Nevýhodou je nižší rozlišovací schopnost, kterou lze zvýšit pomocí elektrostatického zrcadla (reflektronu) nebo opožděnou extrakcí iontů. Použitím reflektronu dochází k vyrovnání různých kinetických energií pro ionty se stejnou hodnotou m/z. Při opožděné extrakci jsou ionty ze zdroje extrahovány se zpožděním, čímž dojde ke sjednocení jejich kinetických energií [43][45]. 32

33 Obr. 11: Schéma průletového analyzátoru s reflektronem [40] Orbitrap Tento nejnovější typ hmotnostního analyzátoru byl popsán ruským fyzikem Makarovem v roce 2005 a lze jej označit "elektrostatickou pastí. Principem je vstřikování iontů do axiálně symetrického elektrostatického pole. Toto pole je tvořené centrální elektrodou, kolem které se vytvoří rotující prstenec iontů. Ionty jsou detekovány měřením indukovaných proudů, které vznikly v důsledku obíhajícího náboje. Pomocí Fourierovy transformace jsou určeny frekvence iontů, které slouží k určení m/z iontů v cele. Tato metoda vyžaduje ultravysoké vakuum, což patří mezi její hlavní nevýhody. Výhodou je vysoká přesnost určení hmoty, vysoké rozlišení a nepřítomnost magnetu [40][46] Iontová cyklotronová rezonance (ICR) Iont se v silném magnetickém poli pohybuje po cykloidální trajektorii s frekvencí ω c. Krátké vložení střídavého proudu vyvolá simultánní excitaci všech iontů v cele. Následně se detekuje frekvence všech iontů a pomocí Fourierovy transformace se převádí na hmotnostní spektrum. Mezi nevýhody patří nutnost vysokého vakua, omezený dynamický rozsah, přítomnost supravodivého magnetu, vysoké pořizovací a provozní náklady [40][45] Detektory Detektory slouží k detekci iontů po jejich separaci a k určení relativní intenzity jednotlivých iontů. Dle způsobu detekce jsou rozlišovány detektory dvojího typu [38]: 1) Detektory pro přímá měření detekují elektrický proud, který vzniká přímým dopadem stanovovaných iontů. Tyto detektory lze použít 33

34 při měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin. Do této skupiny patří např. Faradayova klec. 2) Násobičové detektory využívají efekt násobení elektronů, které se uvolní z prvních konverzní dynody po dopadu iontů. Patří zde fotonásobič a elektronásobič, jehož výhodou je rychlost odezvy Vakuový systém Přítomnost vakua je podmínkou pro dostatečně dlouhou střední dráhu iontů a pro zabránění kolizním srážkám s neutrálními atomy. Hmotnostní analyzátory a iontové zdroje pracují za vysokého vakua, jehož hodnota se liší podle typu hmotnostního analyzátoru ( Pa). Pouze některé ionizační techniky pracují za atmosférického tlaku. Mezi tyto techniky ionizace patří ESI, APCI a APPI (fotoionizace za atmosférického tlaku). K získání vysokých hodnot vakua je potřeba dvou a více stupňové čerpání velmi výkonnými vakuovanými pumpami. Jsou používány dva typy pump. Rotační pumpy se používají pro první stupeň čerpání. Jejich výkon je 80 l/s. Pro druhý stupeň čerpání jsou určeny turbomolekulární nebo difúzní pumpy, které mají výkon 250 l/s [39] Tandemová hmotnostní spektrometrie Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS), popř. hmotnostní spektrometrie n-tého stupně (MS n ), slouží k bližší charakterizaci analyzované látky. Hmotnostní spektrometry pro tuto metodu obsahují dva analyzátory, které jsou sériově propojeny kolizní celou. Pomocí prvního analyzátoru dochází k rozlišení prekurzorových iontů a výběru jednoho z nich. Daný prekurzor je v kolizní cele podroben fragmentaci za vzniku produktových iontů, které jsou rozlišeny v druhém analyzátoru [38]. 3.4 Validace metody Validace metody je proces, kterým se zjišťují nejdůležitější charakteristiky metody. Cílem je stanovit podmínky, za kterých je zkušební postup použitelný, a zajistit stejnou spolehlivost při opakovaném použití v jedné nebo různých laboratořích. Mezi validační parametry patří správnost, přesnost (opakovatelnost, mezilehlá přesnost, reprodukovatelnost), selektivita, detekční limit (LOD), kvantitativní limit (LOQ), linearita, rozsah a robustnost. Zjištěné hodnoty daných parametrů se zpracovávají do validačního protokolu [47]. 34

35 3.4.1 Validační parametry Detekční a kvantitativní limit limit of detection and quantitation Detekční limit (LOD) je definován jako nejnižší koncentrace analytu, kterou lze detekovat. Může být stanovován opakovanou analýzou alikvotního podílu slepého pokusu a je to koncentrace analytu, jehož odezva odpovídá průměrné odezvě slepého pokusu s trojnásobkem odhadu směrodatné odchylky [48][49]. Kvantitativní limit (LOQ) je nejnižší koncentrace analytu, která může být určena s přijatelným stupněm správnosti a přesnosti. Hodnota LOQ je zjišťována pomocí vhodného vzorku a je jím nejčastěji nejnižší bod kalibrační křivky. Je to taková koncentrace analytu, jejíž odezva odpovídá součtu průměrné odezvy slepého pokusu s desetinásobkem odhadu směrodatné odchylky [48][49] Linearita - linearity Linearita je definována jako rozsah koncentrace, ve které je odezva analytu přímo úměrná koncentraci. K určení linearity se využívá kalibrační křivka, která je sestavována z analýzy minimálně pěti standardních roztoků o koncentraci % z výsledné koncentrace analytu. Pro přijatelný rozsah linearity by měl být korelační koeficient větší než 0, 999 [48] Přesnost precision Přesnost metody je míra vzájemné shody mezi sérií měření různých odběrů vzorku za předem specifikovaných podmínek. Přesnost může být vyjádřena jako rozptyl, směrodatná odchylka nebo koeficient rozptylu. Přesnost může být uváděna na třech úrovních: opakovatelnost, mezilehlá přesnost a reprodukovatelnost [48][49] Správnost accuracy Správnost je míra shody naměřené hodnoty se skutečnou hodnotou. Správnost lze určit analyzováním vhodného materiálu nebo srovnáním s již existujícími dobře charakterizovanými metodami [48][49] Selektivita selectivity Selektivita dané metody je schopnost metody měřit pouze cílový analyt v přítomnosti dalších látek obsažených ve vzorku [48]. 35

36 Robustnost robustness Robustnost vyjadřuje schopnost metody zůstat netečný vůči malým změnám různých parametrů metody, kterými mohou být např. teplota nebo ph. Robustnost je experimentálně zjišťována v laboratoři, která danou metodu zavádí, a je nezbytná pro úplnost validace [48] Rozsah - range Vyjadřuje oblast, ve které metoda poskytuje použitelné výsledky. Jsou rozlišovány dva typy rozsahů pracovní a lineární. Pracovní rozsah vyjadřuje koncentrační rozsah, v rámci kterého lze měřit/kalibrovat. Rozsah, ve kterém je kalibrační závislost lineární, označujeme jako rozsah lineární [48][50]. testování nečistot parametr identifikace kvantitativní limitní obsah přesnost správnost selektivita robustnost linearita detekční limit rozsah Tab. 4: Přehled testovaných validačních parametrů podle účelů použití [47] 36

37 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 37

38 4.1 Materiál a pomůcky Chemikálie Pravastatin, SIGMA-ALDRICH, Praha, ČR Pravastatin lakton, TRC, Kanada Rosuvastatin, TRC, Kanada Rosuvastatin lakton, TRC, Kanada N-desmethyl rosuvastatin, TRC, Kanada Acetonitril, LC-MS CHROMASOLV, SIGMA-ALDRICH, Praha, ČR Kyselina mravenčí, 98%, SIGMA-ALDRICH, Praha, ČR Kyselina octová koncentrovaná, 99%, SIGMA-ALDRICH, Praha, ČR Octan amonný, 99%, SIGMA-ALDRICH, Praha, ČR Ultračistá voda pro UHPLC Přístroje a pomůcky Váhy Sartorius 2004 MP, SARTORIUS, Německo Chromatografická kolona ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100mm, 1,7µM), Waters, ČR ACQUITY UPLC Systém, Waters, ČR: Čerpadlo Automatický dávkovač Kolonový termostat Quattro Micro, (trojitý kvadrupól), Waters, ČR Vakuová pumpa a filtrační zařízení, CHROMSERVIS, ČR Ultrazvuková vodní lázeň SONOREX DIGITEC, FISCHER SCIENTIFIC,ČR Automatické pipety se špičkami BIOHIT, FISCHER SCIENTIFIC, ČR Laboratorní ph metr- HANNA INSTRUMENTS ph 212 Microprocessor ph Metr, FISCHER SCIENTIFIC, ČR Magnetická míchačka- IKA RET basic, FISCHER SCIETIFIC, ČR Třepačka- IKA MS 3 basic, CHROMSEVIS, ČR 38

39 4.2 Příprava roztoků Pro přípravu zásobních roztoků byl v případě pravastatinu laktonu, rosuvastatinu laktonu a rosuvastatinu použit acetonitril. Pravastatin a N-desmethyl rosuvastatin byly rozpuštěny v mobilní fázi, jejíž složení odpovídalo počátku gradientu (1 mm octan amonný ph 4,0:acetonitril, 70:30). K lepšímu rozpuštění látek byla použita třepačka a ultrazvuková lázeň. Zásobní roztoky byly skladovány v lednici. Pracovní roztoky byly připravovány ředěním zásobních roztoků mobilní fází, jejíž složení odpovídalo počátku gradientu (viz. výše), v koncentracích x vždy čerstvé před každým měřením. Pracovní roztok směsi látek vznikl smísením 100 µl každého standardu a 500 µl mobilní fáze. Dalším ředěním této směsi vznikly pracovní roztoky o koncentraci x Ředění bylo prováděno mobilní fází, jejíž složení odpovídalo počátku gradientu (viz. výše). 4.3 Výchozí chromatografické podmínky Byla použita kolona ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1 mm, 1,7 µm) od firmy Waters, ČR. Podmínky gradientové eluce jsou zaznamenány v tab. 5. čas [min] 1 mm AmAc ph 4,0 [%] ACN [%] průtoková rychlost [ml/min] ,25 1, ,25 5, ,25 6, ,25 7, ,25 Tab. 5: Gradientová eluce 4.4 Optimalizace podmínek pro MS detekci MS sken - zjištění prekurzorových iontů ze spekter Proměřením hmotnostních spekter jednotlivých látek byly zjištěny prekurzorové ionty, tzn. ionty, které vykazovaly nejvyšší intenzitu v MS spektru. 39

40 4.4.2 Optimalizace podmínek v SIM Měřením byly zjišťovány parametry MS detektoru (tab. 6). Mezi tyto parametry patří desolvační teplota, napětí vkládané na kapiláru, průtok dusíku jako sušícího plynu, iontová optika (napětí na extraktoru a hexapolu) a napětí na vstupním kuželu. typ ionizace ESI + ESI - napětí na kapiláře 1,2-4,0 kv 1,5-3,5 kv napětí na extraktoru 0-20 V 0-20 V napětí na hexapolu 0-3 V 0-3 V desolvační teplota C C průtok dusíku l/hod l/hod průtok dusíku na vstupním kuželu l/hod l/hod teplota ve zdroji 130 C 130 C Tab. 6: Testovaná rozmezí jednotlivých parametrů MS detektoru Sken produktových iontů a optimalizace podmínek v modu SRM Prekurzorové ionty byly fragmentovány v MS/MS modu v kolizní cele trojitého kvadrupólu, do které byl zaváděn kolizní plyn argon. Fragmentací byla získána hmotností spektra produktových iontů, ze kterých byly vybrány fragmenty s dostatečnou intenzitou. Měřením byla zjištěna kolizní energie (CE), tj. energie, kterou je potřeba dodat do kolizní cely pro získání citlivé odezvy SRM přechodu Optimalizace aditiva mobilní fáze Bylo zkoušeno několik aditiv mobilní fáze o různé koncentraci a ph (tab. 7). Aditiva mobilní fáze byla připravována čerstvá před každým měřením. Aditivum mobilní fáze Aditivum mobilní fáze 0,1 mm octan amonný ph = 4,0 0,1 mm mravenčan amonný ph = 4,0 0,5 mm octan amonný ph = 4,0 0,5 mm mravenčan amonný ph = 4,0 1,0 mm octan amonný ph = 4,0 1,0 mm mravenčan amonný ph = 4,0 5,0 mm octan amonný ph = 4,0 5,0 mm mravenčan amonný ph = 4,0 0,1 mm octan amonný ph = 4,5 0,1 mm mravenčan amonný ph = 4,5 0,5 mm octan amonný ph = 4,5 0,5 mm mravenčan amonný ph = 4,5 1,0 mm octan amonný ph = 4,5 1,0 mm mravenčan amonný ph = 4,5 5,0 mm octan amonný ph = 4,5 5,0 mm mravenčan amonný ph = 4,5 Tab. 7: Přehled zkoušených aditiv mobilní fáze 40

41 Příprava zásobního roztoku: 10 mm roztok octanu amonného o ph = 4,0 Do 100 ml kádinky bylo odměřeno 75 ml vody a odpipetováno 57 µl koncetrované kyseliny octové. ph roztoku bylo upraveno pomocí hydroxidu amonného na 4,0 a roztok byl kvantitativně převeden do 100 ml odměrné baňky a doplněn vodou po rysku. 10 mm roztok octanu amonného o ph = 4,5 Tento roztok byl připraven obdobným způsobem, pouze ph bylo upraveno hydroxidem amonným na 4,5. 10 mm roztok mravenčanu amonného o ph = 4,0 Do 100 ml kádinky bylo odměřeno asi 75 ml vody a odpipetováno 38 µl koncentrované kyseliny mravenčí. ph roztoku bylo upraveno pomocí hydroxidu amonného na 4,0 a roztok byl kvantitativně převeden do 100 ml odměrné baňky a doplněn vodou po rysku. 10 mm roztok mravenčanu amonného o ph = 4,5 Tento roztok byl připraven obdobným způsobem, pouze ph bylo upraveno hydroxidem amonným na 4,5. 10 mm AmAc ph 4,0 [ml] Voda [ml] 0,1 AmAc ph 4, ,5 AmAc ph 4, ,0 AmAc ph 4, ,0 AmAc ph 4, Tab. 8: Ředění mobilních fází Ostatní aditiva mobilní fáze byla ředěna stejným způsobem, jaký je uvedený v tab Opakovatelnost v rámci SST Po optimalizaci všech parametrů byla změřena opakovatelnost metody. Opakovatelnost se zjišťuje sérií deseti po sobě následujících měření probíhajících za stejných podmínek, na stejném přístroji v krátkém časovém rozmezí. Opakovatelnost byla vyjádřena pomocí relativní směrodatné odchylky pro retenční čas a plochy píků analyzovaných látek. 41

42 4.6 Ověření linearity a citlivosti metody Na závěr byla ověřena linearita metody proměřením kalibračních křivek a citlivost metody. Pro měření byly použity roztoky o koncentracích 0, nmol/l. Citlivost byla vyjádřena pomocí limitu detekce - LOD a limitu kvantifikace - LOQ. LOQ je určen jako poměr signálu k šumu, který odpovídal hodnotě 10. LOQ byl zároveň nejnižším bodem kalibrační křivky. Hodnoty LOD byly vypočteny z hodnot LOQ. 42

43 5. VÝSLEDKY A DISKUZE 43

44 5.1 Výchozí chromatografické podmínky Byla použita kolona ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7µm, 2,1 x 100 mm) od firmy Waters, ČR. Podmínky gradientové eluce jsou zaznamenány v tab Optimalizace podmínek pro MS detekci Jako ionizační technika byla zvolena metoda ESI v pozitivním a negativním modu ionizace (kap ). Jako hmotnostní analyzátor byl vybrán trojitý kvadrupól (kap ) Výběr prekurzorových iontů v MS skenu Proměřením hmotnostních spekter jednotlivých látek byly zjištěny ionty, které vykazovaly nejvyšší intenzitu (prekurzorové ionty). Vybrané prekurzorové ionty jsou uvedeny v tab. 9. Jednotlivé látky byly proměřeny v pozitivním i negativním modu. ESI + prekurzor typ iontu ESI - prekurzor typ iontu pravastatin 424,9 [M+H] + pravastatin 422,9 [M-H] - pravastatin lakton 407,1 [M+H] + pravastatin lakton 404,8 [M-H] - pravastatin lakton 424,1 [M+NH 4 ] + pravastatin lakton 465,0 [M-H+CH 3 COO] - rosuvastatin 481,9 [M+H] + rosuvastatin 479,9 [M-H] - rosuvastatin lakton 464,0 [M+H] + rosuvastatin lakton 462,0 [M-H] - rosuvastatin lakton 522,0 [M-H+CH 3 COO] - N-desmetyl N-desmetyl 468,0 [M+H] + rosuvastatin rosuvastatin 465,8 [M-H] - Tab. 9: Prekurzorové ionty, ionizace ESI + a ESI - Rosuvastatin poskytl v pozitivním modu hlavní iont [M+H] + a adukty se sodíkem [M+Na] + a s draslíkem[m+k] +, které nejsou vhodné pro další kvantifikaci. V negativním modu nabídl rosuvastatin iont [M-H] -. Jako prekuzorový iont pro SIM byl vybrán iont [M+H] + v pozitivním modu a v negativním modu iont [M-H] -. N-desmetyl rosuvastatin poskytl v pozitivním modu stejné ionty jako rosuvastatin, tj. [M+H] + a adukty [M+Na] + a [M+K] +. V negativním modu pak iont [M-H] -. Ionty [M+H] + a [M-H] - byly vybrány jako prekurzorové ionty pro SIM. Hmotnostní spektrum rosuvastatinu laktonu poskytlo hlavní iont [M+H] + a adukt [M+K] +. V negativním modu byl kromě iontu [M-H] - nalezen také acetátový adukt 44

45 [M-H+CH 3 COO] -. Prekurzovovými ionty byly vybrány ionty [M-H] - a [M-H+CH 3 COO] - v negativním modu a [M+H] + v pozitivním modu. V pozitivním modu byl u pravastatinu laktonu nalezen hlavní iont [M+H] + a amonný adukt [M+NH 4 ] + společně s adukty [M+Na] + a [M+K] +, které nejsou vhodné pro kvantifikaci. V negativním modu pravastatin lakton poskytl iont [M-H] - a acetátový adukt [M-H+CH 3 COO] -. Jako prekurzorové ionty byly vybrány iont [M+H] + a amonný adukt [M+NH 4 ] + v pozitivním modu a acetátový adukt [M-H+CH 3 COO] - v negativním modu. Pravastatin poskytl v pozitivním modu hlavní iont [M+H] + a v negativním modu hlavní iont [M-H] -. Oba tyto ionty byly vybrány jako prekurzorové ionty. Hmotností spektra pravastatinu, rosuvastatinu, rosuvastatinu laktonu, pravastatinu laktonu a N- desmethylu rosuvastatinu jsou uvedeny na obr Obr. 12: Hmotnostní spektrum rosuvastatinu, ionizace ESI + a ESI - 45