Mikroorganismy a jejich význam v technologii výroby jogurtů

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Mikroorganismy a jejich význam v technologii výroby jogurtů Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Zuzana Krupinská Brno 2013

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Mikroorganismy a jejich význam v technologii výroby jogurtů samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne.. podpis.

3 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D., vedoucímu mé bakalářské práce, za čas a rady, které mi při psaní práce věnoval.

4 Abstrakt Krupinská, Z. Mikroorganismy a jejich význam v technologii výroby jogurtů. Bakalářská práce. Brno, Bakalářská práce se zaměřuje na mikroorganismy, které se podílí na vzniku jogurtu. Úvodní část bakalářské práce je věnována historii jogurtu a významu v lidské společnosti. Další část je věnována výrobě jogurtu a čistým mlékařským kulturám, včetně jogurtové. Druhá polovina rešerše je věnována bakteriím mléčného kysání a jejich taxonomickému zařazení. Poslední část je zaměřena na patogenní mikroorganismy a produkty jejich metabolismu, podílející se na kažení jogurtů či negativně ovlivňující lidské zdraví. V praktické části byly analyzovány počty mikroorganismů ve čtyřech různých bílých jogurtech: bio jogurtu Hollandia, jogurtu Klasik značky Olma, bio jogurtu Olma a jogurtu značky Milblu Classic. Klíčová slova: čisté mlékařské kultury, bakterie mléčného kvašení, výroba jogurtu, patogenní mikroorganismy Abstract Krupinská, Z. Microorganisms and their importance in the production technology of yoghurt. Bachelor thesis. Brno, This thesis focuses on the microorganisms that are involved in the formation of yogurt. The introductory part of the thesis is devoted to the history and meaning of yogurt in human society. Another section is devoted to the production of yogurt and fresh mlékařským cultures, including yogurt. The second half is devoted to research of lactic acid bacteria and their taxonomic classification. The last part is focused on pathogenic microorganisms and their metabolic products involved in the spoilage of yoghurt or adversely affecting human health. In the practical part of the microbial counts were analyzed in four different white yogurt: Hollandia bio yoghurt, yoghurt Classic brand Olma, bio yoghurt and yoghurt Olma Milblu Brand Classic. Key words: pure dairy cultures, lactic acid bacteria, manufacturing of yoghurt, pathogenic microorganisms.

5 OBSAH PRÁCE 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Historie jogurtu Výroba jogurtu Mléčné kvašení Čisté mlékařské kultury Bakterie mléčného kysání Rod Lactobacillus Rod Streptococcus Rod Bifidobacterium Patogenní mikroorganismy v jogurtech Bacillus cereus Clostridium botulinum Escherichia coli Salmonella sp Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Mikrobiální vady jogurtu MATERIÁL A METODIKA Odběr vzorku Očkování vzorku Živné půdy MRS Agar PCA se sušeným odstředěným mlékem VRBL Agar Agar s kvasničným extraktem, glukózou a chloramfenikolem Kultivace Vyjádření výsledků VÝSLEDKY A DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 37

6 1 ÚVOD Zdraví, dobrý fyzický stav, respektování zdravého životního stylu, to jsou oblasti každodenního zájmu velké části populace. Neustále se snažíme najít tu nejsprávnější a nejvyváženější výživu, a k ní nepochybně patří mléčné výrobky, zejména zakysané především jogurt. (Štafen, 2011) Jogurt je mléčný výrobek, který vzniká z mléka procesem zvaným mléčné kysání, při kterém se přeměňuje laktóza na kyselinu mléčnou. Pokud k jogurtu přidáme i další bakterie (rod Bifidobacterium) či jiné látky (vitaminy, stopové prvky), můžeme hovořit o jogurtu jako o nejrozšířenější funkční potravině na světě. ( Rod Bifidobacterium patří mezi tzv. probiotika. Probiotika jsou živé mikroorganismy, které aplikovány v přiměřeném množství příznivě ovlivňují zdravotní stav člověka tím, že upravují složení jeho střevní mikroflóry. Nejčastěji se jedná o laktobacily a bifidobakterie. Jednotlivé bakteriální kmeny mohou být zařazeny mezi probiotika, pokud mají prokazatelně pozitivní vliv na zdraví hostitele a nejsou toxické ani patogenní. (Nagy et al., 2011) Jak je známo, jogurt pochází z Balkánu. Svědčí o tom proslulá dlouhověkost zdejších lidí odvozovaná právě z konzumace jogurtů. Celá řada dnešních zakysaných výrobků se řadí mezi tzv. funkční potraviny obsahujících živé probiotické mikroorganismy. Funkční potravina je taková, která kromě základní výživové funkce musí mít ještě vědecky prokázané příznivé účinky na lidské zdraví. Funkční potravina je buď sama zdraví prospěšná, nebo přinejmenším snižuje riziko určitého lidského onemocnění (např. poruchy zažívacího traktu, kardiovaskulární choroby). ( Při své relativně nízké energetické hodnotě je jogurt bohatým zdrojem plnohodnotných bílkovin, vápníku, fosforu a různých vitaminů skupiny B. ( 6

7 2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je shrnout základní poznatky o mikroflóře jogurtu, charakterizovat jednotlivé druhy mikroorganismů uplatňujících se při výrobě jogurtu, a také mikroorganismů, jejichž působení je při výrobě nežádoucí. 7

8 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Historie jogurtu Prapředek dnešního jogurtu pravděpodobně vznikl kdesi na Blízkém Východě ve vaku z kozí kůže, v němž se přepravovalo mléko. Mléko v teple, za přítomnosti vhodných bakterií zkvasilo a majitel vaku usoudil, že výsledný pordukt je chutnější než mléko. Podle dochovaných nálezů se usuzuje, že se tak mohlo stát zhruba 3000 př.n.l. ( Renomovaný ruský badatel a dřívější ředitel Institutu Louise Pasteura prof. Ilja Iljič Mečnikov, kterému byla v roce 1908 udělena Nobelova cena za výzkum imunity, vyslovil jako první hypotézu, že již dlouho známá dlouhověkost zejména zemědělského obyvatelstva v Bulharsku, Turecku a Arménii je dána jejich specifickým způsobem stravování. Tento způsob stravování spočíval v každodenní konzumaci velkého množství fermentovaného (kysaného) mléka, které bylo předchůdcem jogurtu. Profesor Mečnikov identifikoval dva kmeny mikroorganismů, bakterií obsažených v kysaném mléku, kterým zároveň přisoudil onen pozitivní vliv na dlouhověkost. Tyto kmeny byly později identifikovány jako Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Do dnešních dní jsou tyto dva rody bakterií, žijící v symbióze, součástí každého jogurtu. ( Na práci profesora Mečnikova navázal Isaac Carasso, který vyrobil první jogurty Danone v roce 1919 ve Španělsku. Hlavním podnětem byl hromadný výskyt střevních chorob u malých dětí v Barceloně. Jogurty Danone se původně prodávaly na doporučení lékařů v lékárnách. Ve velkém množství pro spotřebitele se ve světě začal jogurt vyrábět teprve na začátku 20. století. Původně se nechával kysat přímo ve skleničkách, ve kterých se později prodával, ale postupem času se kysání přesunulo do obrovských nádrží v mlékárnách a do skleniček či kelímků se stáčel již zkysaný produkt. (Štafen et al., 2011) Dle průzkumu Vu Thi Thuy (2011), kdy se dotazoval 271 respondentů na konzumaci jogurtů, 95 % dotazovaných odpovědělo, že konzumuje jogurt, z toho zhruba 34 % preferuje značku Danone, 40 % dotazovaných preferuje jiné značky, z nichž je nejvíce kupovaná značka Hollandia. Průměrnou konzumaci týdně označilo 8

9 66 % dotazovaných jako 1 3 x týdně. Osmdesát procent dotazovaných byly ženy ve věku 15 až 28 let. Spotřeba mléka a mléčných výrobků v České republice roce 2011 vlivem doznívající hospodářské krize meziročně klesla o necelých šest kilogramů na 244 kilogramů na osobu. Vyplývá to z informací, které u příležitosti Světového dne mléka zveřejnil Českomoravský svaz mlékárenský (ČMSM). ( 3.2 Výroba jogurtu V současné době jsou k výrobě jogurtů používány moderní technologické linky. Jsou vyrobeny z nerezové oceli a koncipovány tak, aby byly výborně čistitelné. Naprostá sterilita zařízení je nezbytným předpokladem pro zajištění správné fermentace, vyloučení možnosti kontaminace a dosažení trvanlivosti jogurtů. (Štafen et al., 2011) Jogurt se vyrábí z mléka kravského, lze ale použít také mléko buvolí, ovčí nebo kozí. Mléko se používá plnotučné, polotučné nebo odtučněné, v závislosti na tom, jaký výsledný produkt chceme. Mléko se uchovává v nerezových tancích o kapacitě sto litrů. (Štafen et al., 2011) Základní schéma výroby jogurt se rozděluje na 2 části, podle toho jaký chceme vyrobit jogurt. U tzv. set jogurtů probíhá prokysání přímo v obale, a výsledná konzistence jogurtu je pevná. U tzv. stirred jogurtů dochází k prokysání v tanku a až poté je plněn do obalů. Výsledná konzistence jogurtu je krémovitá. Také můžeme vyrobit tzv. tekutý jogurt, do nějž se nepřidávájí žádné látky zvyšující sušinu. (Tamime et al., 2001) Prvním krokem při výrobě jogurtů je úprava mléka. Nejdůležitější je, aby mléko bylo prosté inhibitorů kysání, tzn. nesmí obsahovat antibiotika nebo rezidua čistících prostředků. Mléko musí být dojeno ze zdravých dojnic a při přejímce podléhá přísné hygienické kontrole. (Šustová, Lužová, 2008) Mléko přichází na odstředivky, kde se odděluje smetana a odstředěné mléko, které se pak míchá v určitém poměru na požadovanou tučnost. Z tohoto hlediska můžeme jogurty rozdělit do 4 skupin na nízkotučné (0,5 % tuku), jogurty se sníženým obsahem tuku (0,5 3 % tuku), klasické jogurty (více než 3 % tuku) a smetanové jogurty, do kterých se přidává smetana, obsahují nad 10 % tuku. (Hrabě et al., 2006) 9

10 Dalším krokem je homogenizace mléka. Mléko se homogenizuje, aby došlo ke zmenšení tukových kuliček a tím zvětšení jejich povrchu, tudíž nebude docházet k vyvstávání tuku na povrch. Používá se homogenizace za vysokého tlaku MPa. Vlivem homogenizace se také posouvá začátek srážení mléka do oblasti nižšího ph (4,9), čímž se zkrátí srážecí proces. (Hylmar, 1986) Tepelné ošetření jogurtů, které je důležitým krokem při výrobním procesu, se provádí při teplotě C po dobu 5-10 sekund. (Kadlec et al., 2009) Vysokým tepelným záhřevem dochází k denaturaci syrovátkových bílkovin, což ovlivňuje výslednou konzistenci. Vyšší tepelný záhřev má také vliv na hustotu koagulátu, ten se poté stává jemnější a pevnější, dochází k menšímu oddělování syrovátky. (Hylmar, 1986) Zaočkování je nejdůležitější fáze při výrobě jogurtu. Čisté mlékařské kultury se dodávají v tekuté nebo lyofilizované formě. (Tamime et al., 2001) Dříve se používala spíše tekutá kultura, v dnešní době se preferují lyofilizované kultury. Zaočkování se provádí mikroorganismy Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, a to v poměru 1:1, až 1:2. Přidávají se také probiotika, pro pozitivní účinky na střevní mikroflóru - Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum. (Marth, Steele, 2001) Mléko se zchladí před očkováním na teplotu ideální pro rozvoj mikroorganismů, C a poté se přidá 1-2 % očkovací kultury. (Hylmar, 1986) Fermentace jogurtů je dvojího druhu. U set jogurtů probíhá fermentace přímo v obalu při C 2 4 hodiny, poté dojde k rychlému zchlazení na 10 C, aby se fermentační proces co nejrychleji ukončil. Nevýhodou těchto jogurtů je, že při nesprávném zchlazení může prokysávat dál a způsobovat tak kovovou příchuť. U stirred jogurtů probíhá prokysání v tancích při teplotě 30 C po dobu hodin. Tank je vyroben z nerezu s kónickým dnem, opatřený chladícím systémem. Jogurt vyrobený tímto způsobem má krémovitější konzistenci. Výsledná kyselost by se měla pohybovat v rozmezí SH, ph 4,1 4,6. (Görner, Valík, 2004) Jogurty se skladují při teplotě 4 8 C. Při vyšších teplotách dochází ke kysání a mohou vznikat různé vady jogurtů. (Hylmar, 1986) Balení jogurtu je důležitou části při výrobě, neboť jogurt musí být ke spotřebiteli doručen ve výborném stavu. 10

11 Funkce obalu je ochrana před nečistotami a cizími tělesy a také vlivy vnějšího prostředí, jako je světlo a kyslík. Mezi obalem a jogurtem nesmí docházet k chemické reakci a obal musí být zdravotně nazávadný. Při špatném uzavření obalu je nežádoucí odpařování vody, které má vliv na konzistenci a způsobuje ztrátu hmotnosti. Obal by měl také fungovat jako izolace od okolního prostředí, aby se dovnitř nedostávaly pachy a nedocházelo ke ztrátě aroma. Nejvyužívanějšími látkami pro obalové materiály jsou polyethylen PE, polypropylen PP, polyester PS a polyvinylchlorid PVC. Na obalu musí být uvedeny tyto údaje: název produktu, chemické složení, informace o výrobci a datum spotřeby. (Tamime et al., 2001) Schéma výroby jogurtu je uvedeno v následujícím obrázku: Obr. č. 1: Schéma výroby jogurtu (Tamime et al., 2001) 11

12 3.3 Mléčné kysání Fermentační proces přeměny glukózy na kyselinu mléčnou zajišťují bakterie mléčného kysání. Konečným produktem tohoto fermentačního procesu je kyselina mléčná. (Atlas, 1995) Základním anaerobním katabolickým procesem sacharolytických mikroorganismů je tzv. glykolýza neboli Embden Meyerhofova metabolická dráha. Během této dráhy dochází k přeměně glukózy na pyruvát. Mezi reakce glykolýzy patří postupná fosforylace glukózy až na fruktosu-1,6-bifosfát, jeho následné štěpení ve dva triosafosfáty a jejich oxidace v 1,3-bisfosfoglycerát. Při této reakci dochází současně k redukci koenzymu NAD + na NADH + H +. (Šilhánková, 2002) Podle výsledného produktu metabolismu se rozdělují bakterie na homofermentativní nebo heterofermentativní. Homofermentativní druhy přeměňují okolo 95 % glukózy na kyselinu mléčnou, podle rovnice: glukóza + 2 ADP + 2 P i 2 kyselina mléčná + 2 ATP Je produkované také malé množství oxidu uhličitého a dalších těkavých kyselin. Disacharidy jsou zkvašovány stejným způsobem, z jednoho molu laktózy vzniknou čtyři moly kyseliny mléčné. (Salle et al., 1954) V závislosti na specifitě laktátdehydrogenázy a na přítomnosti laktátracemázy vzniká při kysání kyselina mléčná, D(-) nebo L(+). (Hoďák, 1979) Homofermentativní rody přeměňují pyruvát vzniklý glykolýzou na laktát, tj. konjugovaná báze kyseliny mléčné (CH 3 -CHOH-COO - ), které popisuje rovnice: pyruvát + NADH + H + laktát + NAD +. ( Mezi homofermentativní rody bakterií patří Lactobacillus a Streptococcus. (Atlas, 1995) Heterofermentativní druhy se liší v tom, že kyselina mléčná je pouze jedním z dalších produktů, které vznikají ze sacharidů. Dalšími látkami jsou ethanol, kyselina octová, glycerol a oxid uhličitý. (Salle et al., 1954) Zjednodušeně to lze zapsat v rovnici: glukóza + ADP + P i kyselina mléčná + ethanol + CO 2 + ATP Mezi heterofermentativní rody patří Leuconostoc a Lactobacillus brevis. (Atlas, 1995) 12

13 U heterofermentativních rodů dochází k přeměně glukózy na pentosa-5-fosfát a oxid uhličitý, v důsledku chybějícího glykolytického enzymu aldolasy. Pentosa-5-fosfát se pak štěpí na přítomnosti anoganického fosfátu na acetylfosfát (CH 3 -COO-PO 3 -H 2 ) a glyceraldehyd-3-fosfát. Ethanol vzniká z acetylfosfátu, glyceraldehyd-3-fosfát je přeměněn v pyruvát a pak laktát. (Šilhánková, 2002) Kyselina mléčná patří mezi organické kyseliny. V mléčných výrobcích se vyskytuje ve 2 izomerech: D (-) levotočivá kyselina a L (+) pravotočivá kyselina. (Hylmar, 1986) Bakterie mléčného kysání tvoří převážně pravotočivou kyselinu. Rozdíl mezi pravotočivou a levotočivou kyselinou je v metabolismu. Obě jsou transformovány v trávicím traktu, levotočivá se transformuje jen omezeně a přechází až do tlustého střeva. Tam snižuje ph a omezuje růst hnilobných mikroorganismů. Pravotočivá se kompletně přeměňuje v respiračním procesu na glukózu nebo glykogen. Z tohoto důvodu se nedoporučuje překročit denní množství 100 mg levotočivé kyseliny na 1 kg hmotnosti na den. (Hylmar, 1986) 3.4 Čisté mlékařské kultury Pojem čisté mlékařské kultury, dále ČMK, zahrnuje klíčové výrobní prostředky mlékárenského průmyslu, kterými jsou do základní suroviny mléka zbaveného tepelným ošetřením pokud možno všech nežádoucích, škodlivých i patogenních mikroorganismů původní mikroflóy syrového mléka zaváděny vybrané a účelově zaměřené druhy specifických mikroorganismů. Čistou kulturou v technickém smyslu se rozumí příslušné živné prostředí (resp. živná půda), v němž jsou rozmnoženy nebo v němž rostou známé druhy užitečných mikroorganismů. (Teplý, 1968) Základní funkce ČMK lze shrnout do 3 bodů. První je tzv. prokysávací funkce, při které se rozkladem laktózy vytváří kyselina mléčná. Vzniká tak kyselé prostředí, nevhodné pro rozvoj jiné kontaminující mikroflóry. Sleduje se získání nejlepších smyslových vlastností. Další funkce je funkce zrací. Během ní mikroorganismy vyvíjí specifickou aktivitu, zejména proteolytickou a lipolytickou. V této fázi se vytváří aromatické látky a oxid uhličitý. Třetí funkcí je dieteticko-léčebná funkce, při které kultury zvyšují nutriční hodnotu, a výrazně inhibují patogenní bakterie. (Holec, 1989) 13

14 Jednotlivé druhy ČMK jsou pak definovány jednak účelem, kterému v mlékařské výrobě slouží, jednak složením, které podle technických podmínek má obsahovat živné prostředí čisté kultury v rozmnoženém a živém stavu. (Teplý, 1968) K výrobě jogurtu se používá různých typů jogurtových kultur. Jogurtová kultura (klasická) je směsný typ kultury, kterou tvoří termofilní tyčinka Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a termofilní streptokok druhu Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. V mikroskopickém obraze jogurtového zákysu má být poměr tyčinek a koků 1:1, nejvýše 2:1. Kyselost zákysu v nezahuštěném mléce má být 42 až 50 SH. (Teplý, 1968) Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus je termofilní tyčinka ze skupiny bakterií mléčného kysání. Při teplotě kolem 40 C sráží mléko za 2,5 až 4 hodiny. V tekutém prostředí tvoří tyčinky dlouhé 4 až 10 µm a široké 0,5 až 1,5 µm. V nepříznivém prostředí má sklon k tvorbě řetízků až dlouhých vláken tyčinek. (Teplý, 1968) Streptococcus salivariius ssp. thermophilus je termofilní streptokok mléčného kysání, jehož optimální teplota je 37 až 45 C. Při optimální teplotě sráží mléko za 16 až 20 hodin (Teplý, 1968). Štěpí také kasein, čímž uvolňuje valin, methionin a kyselinu glutamovou. Tento valin pak působí stimulačně na rozvoj streptokoků. (Holec et al, 1989) Chuť jogurtové kultury má být čistě kyselá, jogurtově aromatická s hustou konzistencí. Film by neměl být tak celistvý jako třeba u smetanové kultury (Holec et al., 1989). Jogurtová kultura přeměnuje laktózu na kyselinu mléčnou. Při optimální teplotě 40 až 43 C koaguluje za 3 hodiny. Koagulace končí na hodnotě ph 4,5. (Görner, Valík, 2004) 3.5 Bakterie mléčného kysání Společným znakem bakterií mléčného kysání je tvorba kyseliny mléčné z fermentovaných sacharidů. Dalé je možno je třídit na homofermentativní, které přeměňují sacharid výhradně na kyselinu mléčnou, a heterofermentativní, přeměňující sacharid na kyselinu mléčnou, kyselinu octovou, CO 2 a ethanol. (Görner, Valík, 2004) Bakterie mléčného kysání, dále jen BMK, se začínají množit, svými enzymy začnou rozkládat laktózu a tvoří tak velké množství kyseliny mléčné, která mléko konzervuje a 14

15 potlačuje rozvoj jiných bakterií. Nejdříve se rozvíjejí mléčné koky, které se intenzivně množí při neutrálním ph, svým metabolismem sníží hodnotu ph až na 4,5, což je hodnota, při které se přestávají rozvíjet. Následuje intenzivní rozvoj laktobacilů, které sníží hodnotu ph až na 4, což je hodnota tak nízká, že ustává rozvoj všech BMK. (Vlková et al., 2009) Jogurty, jogurtová mléka a od nich odvozené podobné mléčné produkty se připravují pomocí kmenů druhů Streptococcus salivarius ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Tyto mikroorganismy mají symbiotický vztah a společně se vyznačují rychlou tvorbou kyseliny mléčné. Při optimální teplotě 40 až 43 C koagulují kasein za 2 až 3 hodiny. Koagulace začíná při hodnotě ph 5,3 a je ukončena na hodnotě 4,5. Druhou významnou vlastností je tvorba aromové látky jogurtu acetaldehydu, v množství 20 až 30 mg.l -1. (Görner, Valík, 2004) Rod Lactobacillus Mezi zástupce rodu Lactobacillus patří tyto druhy: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a další. (Klaban, 2005) Příslušníci tohoto rodu se mezi bakteriemi tyčinkovitého tvaru jednoznačně rozlišují na základě své katalázonegativní reakce. Jsou charakterizovány jako grampozitivní, nepohyblivé tyčinky. Glukózu, její polymery a polyhydroxyalkoholy zkvašují na kyselinu mléčnou, což znamená, že se řadí mezi homofermentativní druhy, nebo na ethanol a oxid uhličitý, pak je řadíme mezi heterofermentativní mikroorganismy. (Arpai et al., 1977) Laktobacily jsou metabolicky na hranici mezi anaerobním a aerobním způsobem života. Upřednostňují mezofilní a mírně termofilní teploty. Laktobacily jsou všeobecně acidotolerantní až acidofilní. Při fermentaci snižují kyselost prostředí až na ph pod 4,0. (Görner, Valík, 2001) Buňky rodu Lactobacillus jsou ve tvaru pravidelných tyčinek, tyčinky jsou obvykle delší, občas také kokovité, uspořádané v palisádách nebo krátkých řetízcích. Jsou grampozitivní, nesporulující, fakultativně anaerobní. (Sedláček, 2007) Laktobacily v potravinách přispívají k tvorbě chuťových vlastností vznikem látek jako je acetaldehyd, diacetyl a kyselina octová. (Görner, Valík, 2004) 15

16 Optimální růstová teplota je 30 až 40 C a optimum ph obvykle mezi 5,5 až 6,2. Laktobacily dělíme na tři skupiny, na základě konečných produktů fermentace. První skupina, obligátně homofermentativní, hexózy fermentují výhradně na kyselinu mléčnou. Patří sem Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Druhá skupina, fakultativně heterofermentativní druhy, fermentují hexózy na kyselinu mléčnou nebo na směs kyseliny mléčné, octové, mravenčí a ethanolu. Mezi tyto druhy se řadí Lactobacillus casei a Lactobacillus plantarum. Poslední skupinou jsou obligátně heterofermentativní druhy. Tyto druhy, mezi které patří Lactobacillus buchneri a Lactobacillus fermentum, fermentují hexózy na kyselinu mléčnou, ethanol a CO 2. (Sedláček, 2007) Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus patří do první skupiny obligátně homofermentativních bakterií. Nejvýznamnější úlohu v potravinářství má právě při výrobě jogurtu, neboť při své optimální teplotě, která je 45 až 50 C, sráží mléko a vytváří tak kompaktní hmotu v celé hmotě během 3 až 4 hodin. (Teplý, 1968) Dle Vose (2009) je jeho růstové minimum při 45 C a v prostředí s nízkým obsahem kyslíku vykazuje výrazně vyšší aktivitu. Při výrobě jogurtu dokáže vysrážet mléko za 2,5 až 4 hodiny, při teplotě 40 C. Během fermentace vytváří pravotočivou i levotočivou kyselinu mléčnou, menší množství kyseliny octové a mravenčí. (Teplý et al., 1968) Kolonie vytvářející se na agaru mají průměr 2 až 5 mm, povrch je hladký a lesklý. (Vos et al., 2009) 16

17 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus stimuluje růst Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, který má malou schopnost hydrolyzovat bílkovinu, proto prvního podporuje uvolňováním aminokyselin z bílkovin díky své proteolytické aktivitě. (Görner, Valík, 2004) Obr. č.1 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ( Rod Streptococcus Rod Streptococcus zahrnuje buňky ovoidní, vyskytující se ve dvojicích nebo v řetízcích, pokud rostou v tekutém médiu. Jsou nepohyblivé, fakultativně anaerobní, nesporulující a grampozitivní. Jejich teplotní optimum se pohybuje v rozmezí 25 až 45 C, nejlépe rostou při 37 C. (Görner, Valík, 2004) Klasifikace rodu se v posledních 25 letech značně změnila. Ve starší literatuře najdeme rozdělení na 6 skupin: pyogenní, orální, jiné, anaerobní, enterokoky a mléčné streptokoky. V nové klasifikaci z roku 1987 zůstává rozdělení stejné, s vyjímkou vynechání anerobních streptokoků. Došlo taky k oddělení enterokoků a mléčných streptokoků na samostatné rody: Enterococcus a Lactococcus. (Görner, Valík, 2004) Všechny druhy streptokoků fermentují sacharidy na kyselinu mléčnou a malé množství kyseliny octové, kyseliny mravenčí, ethanolu a CO 2. Jsou velmi nároční na živiny, pro svůj růst vyžadují aminokyseliny, peptidy a vitaminy. Mnohé streptokoky jsou citlivé na širokou škálu antibiotik a inhibičních látek, což se využívá při důkazu těchto látek v mléce. Buňky streptokoků se nachází na sliznici v ústech, v dýchacím a zažívacím traktu, na pokožce lidí a zvířat. (Görner, Valík, 2004) 17

18 Při výrobě mléčných produktů je používán druh Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. (Šilhánková, 2002) Streptococcus salivarius subsp. thermphilus nepatří z hlediska systematiky k tzv. mléčným streptokokům. Zařazuje se mezi jiné streptokoky. Stimuluje tvorbou kyseliny mravenčí růst a metabolismus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Streptococcus salivarius subsp. thermophilus roste v teplotním rozmezí 20 až 50 C, jeho optimální teplota je mezi 40 až 45 C, dobře roste i při 37 C. Při fermentaci tvoří pravotočivou kyselinu mléčnou. Štěpí také mléčnou bílkovinu, kasein. Tvoří kulovité až vejčité buňky s průměrem 0,7 až 0,9 µm, jsou v párech nebo řetízcích. Při nižší teplotě než je optimální, tvoří krátké řetízky nebo dvojice koků. (Görner, Valík, 2004) Obr. č. 2 Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ( Rod Bifidobacterium Bifidobakterie jsou grampozitivní, striktně anaerobní tyčinky. Charakteristický je pro ně nepravidelný tvar od kokovitých bakterií po dlouhé větvené tyčinky. (Vlková et al., 2009) Některé druhy tolerují přítomnost kyslíku v prostředí, kde se vyskytuje i oxid uhličitý, anebo bifidogenní faktory přítomnost laktulózy. Na Petriho miskách za aerobních podmínek nerostou. (Görner, Valík, 2004) Jsou nepohyblivé, nesporulující a jsou anaerobní. Nerostou pod hodnotu ph 4,5 ani nad ph 8,5. Optimální hodnota ph je 6,5 až 7. Cukry fermentují za vzniku kyseliny octové a mléčné v molárním poměru 3:2, kyselinu máselnou ani propionovou netvoří. (Sedláček, 2007) 18

19 Jejich optimální růst je v rozmezí 37 až 41 C, hraniční teploty pro minimum jsou v rozmezí 25 až 28 C a jejich maximum je v teplotním rozmezí 43 až 45 C. (Görner, Valík, 2004) Bifidobakterie jsou prospěšnou součástí střevní mikroflóry, kde pomáhájí udržovat rovnováhu a znesnadňují jiným patogenům pomnožení ve střevech. Tyto bakterie jsou navíc vybaveny mechanizmy, které detoxikují škodlivé složky tráveniny. Používají se v probioticích. (Šilhánková, 2002) K tomuto účelu se používá bakterie mléčného kysání původem z lidského střeva, Bifidobacterium longum BB536, která má schopnost usídlit se v zažívacím traktu člověka, musí mít schopnost překonat v žaludku pro ně nepříznivé prostředí (žaludeční šťávy) a musí odolávat pohyblivosti střev (peristaltika). (Görner, Valík, 2004) Do tohoto rodu se zahrnují druhy: B. bifidum, B. longum a B. breve. (Sedláček, 2007) Obr. č. 3 Bifidobacterium sp. ( 19

20 3.6 Patogenní mikroorganismy v jogurtech Potraviny, které mají být zdravotně nezávadné, nesmí obsahovat toxické ani choroboplodné (patogenní) mikroorganismy. Patogenní mikroby jsou častou příčinou chorob přenášených potravou, a to i v industrializovaných zemích s dobrou hygienickou úrovní. Choroby, způsobené mikroorganismy kontaminující potraviny nebo jejich toxiny, jsou označovány jako alimentární infekce a alimentární intoxikace. Při alimentárních infekcích se mikroby v hostitelském organismu rozmnožují, parazitují a narušují nejdůležitější životní funkce. Podle příznaků jsou pak příčinou různých chorob. Infekce se nejčastěji přenáší do hostitele potravou. Při alimentární intoxikaci způsobí otravu toxiny, které jsou produkty metabolizmu jednotlivých mikroorganismů. (Jičínská, Havlová, 1995) Bacillus cereus Bacillus cereus je grampozitivní, aerobní nebo fakultativně anaerobní sporulující tyčinka. Její spory jsou stejně velké jako šířka vegetativní buňky. (Vlková et al., 2009) Bacillus cereus je nepochybně technologicky nejdůležitější a současně i hygienicky rizikový bakteriální kontaminant mléka. V dřívějších dobách mléko a mléčné výrobky obsahovaly psychrotrofní kontaminaci (Pseudomonas spp., laktokoky aj.) a tato mikroflóra s krátkou generační dobou určovala rychlost znehodnocování výrobku. Se zlepšujícími se hygienickými podmínkami a systematickým využíváním chlazení ve všech fázích produkce určují uchovatelnost výrobku mikroorganismy, které přežívají pasteraci a rychle se množí i při nízké toplotě. B. cereus, který je psychrotrofní a tvoří termorezistentní spory, tyto technologicky nežádoucí vlastnosti má. (Jičínská, Havlová, 1995) B. cereus je saprofyt, který roste na rozkládajících se zbytcích rostlin v půdě, v hnoji a v krmivech. Ke kontaminaci syrového mléka dochází nejčastěji při dojení ze znečištěných vemen například od hnoje. (Jičínská, Havlová, 1995) Méně běžná je přímá kontaminace mléka cereovými mastitidami. Jestliže se dojení neprovádí v dojírnách, ale přímo v chlévě, kde se manipuluje s krmivem, může dojít ke kontaminaci přímo. (Harmon, Kautter, 1991) 20

21 3.6.2 Clostridium botulinum Clostridium je anaerobní, grampozitivní, sporulující rod. Většina druhů klostridií jsou patogeny, které produkují různé typy toxinů, z nichž některé způsobují alimentární otravy. (Jičínská, Havlová, 1995) Clostridium botulinum produkuje nebezpečné neurotoxiny (botulotoxiny), které jsou ovšem termolabilní a lze je spolehlivě inaktivovat varem. (Vlková et al., 2009) Otrava toxinem se projevuje jako botulismus, a může se vyskytovat jak u lidí, tak u zvířat. (Grieger et al., 1990) Pramenem nákazy typu A a B jsou spory, které se dostaly do potraviny z půdy nebo ze zařízení znečištěných půdou nebo prachem.v mléku a mléčných výrobcích se vyskytují sacharolytické klostridie (C.butyricum) a proteolytické (C.sporogenes). (Görner, Valík, 2004) Spolu s listeriovými infekcemi se vyznačují botulinové intoxikace nejvyšším procentem úmrtnosti (cca 19 % případů). Početnost výskytu je poměrně stálá, v posledních letech jeví jen mírné fluktuace. (Jičinská, Havlová, 1995) Escherichia coli Gramnegativní tyčinka Escherichia coli je součástí normální střevní mikroflóry člověka a teplokrevných zvířat. Protože hlavním rezervoárem E. coli je zažívací trakt a stolice hospodářských zvířat, je v provovýrobě považována za součást mikroflóry prostředí. Její přitomnost v provozech se pokládá za neškodný indikátor fekálního znečištění, tedy za ukazatel špatné hygieny provozu. (Jičínská, Havlová, 1995) Bakterie E. coli řadíme mezi fakultativně anaerobní, mohou růst v širokém rozmezí teplot od 7 do 50 C, s optimální teplotou 37 C. (Karpíšková, 2011) Escherichia coli se běžně vyskytuje ve střevech člověka a teplokrevných zvířat. Většina kmenů E. coli jsou neškodné. Některé kmeny však, jako enterohemoragická E. coli (EHEC), mohou způsobit vážné alimentární onemocnění. To se přenáší na člověka především prostřednictvím konzumace kontaminovaných potravin, jako je syrové nebo nedostatečně tepelně opracovaný výrobek - mleté maso, syrové mléko a kontaminovaná zelenina. ( Nejznámnějším zástupcem EHEC skupiny je sérotyp O157:H7, ale na onemočnění v EU se podílí i další sérotypy. Klinické příznaky se 21

22 projevují krvavým průjmem, který může přecházet do stádia akutní nedostatečnosti ledvin. (Karpíšková, 2011) Salmonella sp. Salmonely zaujímají první místo v pořadí původců alimentárních infekcí a intoxikací v epidemiologických statistikách vyspělějších zemí. Salmonely způsobují enteritidy trvající 8-28 dní doprovázené břišními křečemi a horečkou. Rezervoárem salmonelové kontaminace mléka v prvovýrobě jsou zvířecí bacilonosiči hospodářská i volně žijcí zvířata a ptáci, méně často lidé. (Jičínská, Havlová, 1995) Všechny druhy rodu Salmonella jsou pro člověka patogenní, některé způsobují tyfová onemocnění, jiné otravy z potravin. Řada kmenů produkuje endotoxiny, které jsou výrazně termostabilní. (Vlková et al., 2009) Salmonely jsou gramnegativní rovné tyčinky, pohyblivé (s výjimkou S. gallinarum a S. pullorum, které jsou vždy nepohyblivé). Rozmnožují se za aerobních i anaerobních podmínek. (Grieger et al., 1990) Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus je grampozitivní kokovitá buňka s průměrem 0,8 až 1,2 µm. Netvoří spory, je nepohyblivá, fakultativně anaerobní a nejlépe roste v intervalu 6,5 až 46 C, s optimální teplotou 35 až 37 C. Kokovité buňky tvoří hroznovité útvary nebo krátké řetízky. Stafylokoky jsou značně odolné, snášejí záhřev na 60 C po dobu 30 minut a dobře se rozmnožují v potravinách s vyšším obsahem cukru a soli. (Görner, Valík, 2001) Staphylococcus aureus je patogen, který při pomnožení v potravinách produkuje bílkovinné enterotoxiny, které mohou způsobit vážné až smrtelné otravy. Tyto toxiny jsou inaktivovány delším varem, proto se tento patogen vyskytuje především u těch výrobků, které se již dále tepelně neopracovávají. (Šilhánková, 1997) Stafylokokové enterotoxiny jsou různého typu, od A až po E. Zpravidla jeden kmen produkuje pouze jeden typ enterotoxinu, žřídka dva nebo tři. Tvorba enterotoxinu 22

23 A je v poměru k ostatním méně citlivá vůči nepříznivým vlivům prostředí, což znamená, že stafylokokové enterotoxikózy nejčastěji způsobuje enterotoxin A. Pramenem nákazy jsou především nosiči stafylokoků (nosní, krevní, kožní), méně často hospodářská zvířata. Prevence onemocnění spočívá v eliminaci zdrojů nákazy, to znamená dobrá osobní hygiena v potravinářských závodech. (Görner, Valík, 2001) Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes, grampozitivní tyčinková bakterie, byla původně izolována z monocytóz laboratorních hlodavců. Později byla vykultivována také z lidských meningitid. V průmyslově rozvinutých zemích jsou listeriózy příčinou jen asi 0,5 1 % všech hromadných alimentárních infekcí a intoxikací mikrobiálního původu, mají však mezi těmito onemocněními zcela nesporné prvenství v procentu mortality, které se odhaduje až na 30 % úmrtí z celkového počtu onemocnění. (Jičínská, Havlová, 1995) Listerie je psychrotrofní bakterie, která roste už při teplotě 2,5 C. Její maximální teplota je při 44 C a optimální při 30 až 37 C. V potravinách se Listeria vyskytuje nejčastěji v mase, v nepasterovanám mléce a zejména v mléčných výrobcích, tepelné ošetření mléka však riziko nákazy výrazně snižuje. (Erban, 2007) Pramenem nákazy hospodářských zvířat bývá špatně zfermentovaná siláž, jejíž ph je vyšší než 5. (Görner, Valík, 2004) 23

24 3.7 Mikrobiální vady jogurtu Mikroorganismy v jogurtu, v důsledku mléčného kysání, produkují velké množství kyseliny mléčné a způsobují tak jeho vysokou kyselost, což je pro většinu mikroorganismů nežádoucí. Nevylučuje to však všechny skupiny mikroorganismů. Lactobacily obsažené v jogurtové kultuře společně se streptokoky, se při časté změně vyšších teplot pomnoží a produkují tak větší množství kyseliny mléčné (až 2 %) a acetaldehydu. Prevencí vzniku vysoké kyselosti je udržování kultur odděleně. (Marth, Steele, 2001) Jogurty fermentované při 42 až 45 C za 2,5 až 3,5 h s kyselostí 60 až 65 SH a hodnotou ph < 4,5 jsou z mikrobiologického hlediska bezpečné produkty. Vysoká inkubační teplota, krátký inkubační čas a rychle vznikající kyselina mléčná neumožňuje růst kontaminující mikroflóry, například koliformním bakteriím. Míchané jogurty fermentované 16 až 18 h při 30 až 35 C s pomalým kysáním umožňují růst mezofilním a koliformním bakteriím. Jejich počet po dosáhnutí maximální hodnoty působením nižších mastných kyselin, které vznikly během fermentace, postupně klesá. Jejich obsah v jogurtech poukazuje na kontaminaci. (Görner, Valík, 2004) Jiná situace je u plísní a kvasinek. Účinným opatřením vůči těmto kontaminantům je kromě hygieny výroby i chlazení pod 10 C, které oddálí viditelný růst plísní na povrchu asi o 2 týdny. Kontaminace plísněmi působí téměř výhradně zástupci čeledi Mucoraceae, jejichž spory se velmi rychle šíří. Čeleď Mucoraceae se vyznačuje silnou proteolytickou a lipolytickou aktivitou, která vede k intenzivním pachům, a to i přesto, že mycelium ještě není okem zjistitelné. (Holec et al., 1989) Zdrojem kontaminace jogurtů kvasinkami může být i jogurtová kultura, který byla připravena v závodě za špatných hygienických podmínek, nebo se použila starší jogurtová kultura. Na kontaminaci kvasinkami jsou nejvíce náchylné jogurty ochucené džemem nebo sirupem, v důsledku vyššího obsahu sacharózy. Výsledkem jsou chuťové změny (kvasničná chuť) a plynatost (bubliny v koagulátě). Z kvasinek se nejčastěji vyskytují rody Sacharomyces cerevisiae a Kluyveromyces fragilis. (Görner, Valík, 2004) 24

25 4 MATERIÁL A METODIKA Mikrobiologický rozbor byl prováděn u čtyř bílých jogurtů, bio selský jogurt Hollandia (obr. 1), bio jogurt Olma (obr. 2), bílý jogurt Klasik (obr. 3) a bílý jogurt Milblu Classic (obr. 4). Rozbor byl proveden dvakrát, s odstupem 2 týdnů. Bio selský jogurt Hollandia je bílý jogurt obsahující probiotickou kulturu Bifidobacterium, obsah tuku je 3,5 %. Bio jogurt značky Olma má obsah tuku 3,2 % a složky obsažené v jogurtu pocházejí z ekologického zemědělství. Bílý jogurt Klasik značky Olma má obsah tuku 2,4 %. Obsah tuku jogurtu Milblu Classic je 3,9 %. Doba spotřeby u všech 4 jogurtů se nelišila o více než 4 dny. Byly stanovovány tyto skupiny mikroorganismů, bakterie mléčného kysání, CPM, koliformní bakterie, kvasinky a plísně. Obr. č. 1 bio selský jogurt Hollandia Obr. č. 2 bílý jogurt Klasik Olma Obr. č. 3 bio jogurt Olma Obr. č. 4 bílý jogurt Milblu Classic 25

26 4.1 Odběr vzorku Po promíchání jogurtu bylo z každého vzorku odebráno 10 g a smícháno s 90 ml fyziologického roztoku (1000 ml destilované vody a 8,5 g NaCl). Vzorky byly v homogenizátoru důkladně rozmíchány a poté bylo prováděno desetinné ředění, vždy 1 ml vzorku do 9 ml fyziologického roztoku. 4.2 Očkování vzorku Pro analýzu byla použita metoda zalití do půdy. Každá Petriho miska byla označena podle vzorku jogurtu a příslušného ředění. Do všech misek bylo napipetováno 1 ml vzorku, zalito příslušnou půdou a promícháno. Po zatuhnutí agaru byly misky obráceny dnem vzhůru a vloženy do termostatu za určených podmínek. 4.3 Živné půdy Při stanovování byly použity tyto živné půdy MRS, PCA se sušeným odstředěným mlékem, VRBL a agar s chloramfenikolem MRS Agar (Biokar Diagnostic, France) Složení: polypepton masový extrakt kvasničný extrakt glukóza twenn 80 hydrogenfosforečnan drasený octan sodný citran amonný síran hořečnatý síran manganatý agar voda 10,0 g 10,0 g 5,0 g 20,0 g 1,0 g 2,0 g 5,0 g 2,0 g 0,2 g 0,05 g 15,0 g 1000 ml 26

27 Příprava: 70,3 g půdy se smíchá s destilovanou vodou, několik minut se nechá odstát a zahřívá se k varu za občasného promíchání. Jakmile je agar zcela rozpuštěn, upraví se ph na 5,7 při 25 C. Sterilizace probíhá v autoklávu při 121 C po dobu 15 min PCA se sušeným odstředěným mlékem Plate Count Agar with skimmed milk (Biokar Diagnostic, France) Složení: trypton kvasničný extrakt glukóza sušené odtučněné mléko agar voda 5,0 g 2,5 g 1,0 g 1,0 g 12,0 g 1000 ml Příprava: 21,5 g půdy se smíchá s destilovanou vodou, několik minut se nechá odstát a zahřívá se k varu za občasného promíchání. Jakmile je agar zcela rozpuštěn, upraví se ph na 7 při 25 C. Sterilizace probíhá v autoklávu při 121 C po dobu 15 min VRBL Agar (Biokar Diagnostic, France) Složení: pepton kvasničný extrakt glukóza chlorid sodný žlučové soli neutralní červeň krystalová violeť agar voda 7,0 g 3,0 g 10,0 g 5,0 g 1,5 g 0,03 g 0,002 g 12,0 g 1000 ml 27

28 Příprava: 38,5 g půdy se smíchá s destilovanou vodou, několik minut se nechá odstát a zahřívá se k varu za občasného promíchání. Jakmile je agar zcela rozpuštěn, upraví se ph na 7,4 při 25 C. Půda se nesterilizuje v autoklávu, pouze se 2 minuty povaří Agar s kvasničným extraktem, glukózou a chloramfenikolem (Biokar Diagnostic, France) Složení: kvasničný extrakt dextróza chloramfenikol agar voda 5,0 g 20,0 g 0,1 g 14,0 g 1000 ml Příprava: 40 g půdy se smíchá s destilovanou vodou, několik minut se nechá odstát a zahřívá se k varu za občasného promíchání. Jakmile je agar zcela rozpuštěn, upraví se ph na 6,6 při 25 C. Sterilizace probíhá v autoklávu při 121 C po dobu 15 min. 4.4 Kultivace Bakterie mléčného kysání Ke kultivaci se použil MRS agar. U laktobacilů při 1. pokusu bylo zvoleno ředění 10-5 a 10-4, při 2. stanovení to bylo 10-3 a U mezofilních BMK bylo při 1. pokusu ředění 10-7 a 10-6, u 2. stanovení 10-5 a Kultivace se prováděla u laktobacilů při 37 C po dobu 48 hodin anaerobně, u mezofilních BMK při 30 C 72 hodin aerobně. Poté se spočítaly narostlé kolonie. 28

29 4.4.2 Celkový počet mikroorganismů Ke kultivaci byl použit PCA agar se sušeným odstředěným mlékem. Při 1. pokusu bylo ředění 10-8 a 10-7, při 2. stanovení se ředění neměnilo. Kultivace se prováděla při 30 C po dobu 72 hodin. Poté se spočítaly narostlé kolonie Kvasinky a plísně Ke kultivaci byl použit agar s chloramfenikolem. Při 1. pokusu bylo zvoleno ředění 10-2 a 10-1, při 2. stanovení se ředění neměnilo. Kultivace se prováděla při 25 C po dobu 120 hodin. Poté se spočítaly narostlé kolonie Koliformní bakterie Ke kultivaci byl použit VRBL agar. Při 1. pokusu bylo ředění a 10-1 a 10-2, při 2. stanovení se ředění neměnilo. Kultivace se prováděla při 37 C po dobu 24 hodin. Poté se spočítaly narostlé kolonie Vyjádření výsledků Počty mikroorganismů byly přepočteny podle vzorce stanovujícího počet KTJ (kolonií tvořící jednotku) v 1 g vzorku: c narostlé kolonie po sobě jdoucích dvou ředěních V objem inokula d zřeďovací faktor prvního pro výpočet použitého ředění n 1,n 2 počet misek 29

30 5 VÝSLEDKY A DISKUZE V rámci mikrobiologické analýzy byly stanovovány významné skupiny mikroorganismů nacházející se v jogurtu. Patří mezi ně laktobacily, celkový počet mikroorganismů a bakterie mléčného kysání. Z negativních mikroorganismů byl sledován výskyt plísní, kvasinek a koliformních bakterií. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách a grafech č. 1, 2, 3 a 4. Bio jogurt Hollandia Tabulka č.1 Počet mikroorganismů v jogurtu Hollandia vzorek č. CPM KTJ/g BMK aerobně KTJ/g Lactobacillus anaerobně KTJ/g Koliformní b. KTJ/g Kvasinky/ Plísně KTJ/g 1 3, N* N*** N N 2 9, N** N*** N N 3 2, , , N N 4 3, , , N N průměr 4, , , vypočt. z 2 hodnot vypočt. z 2 hodnot * nedetekováno v ředění 10-6 ** nedetekováno v ředění 10-7 *** nedetekováno v ředění 10-4 **** nedetekováno v ředění 10-5 N.nedetekováno (koliformní bakterie 10-1, kvasinky/plísně 10-1 ) V bio jogurtu značky Hollandia bylo stanoveno průměrné množství celkového počtu mikroorganismů na 4, KTJ/g jogurtu. Co se týče množství bakterií mléčného kvašení a laktobacilů, po analýze jsme stanovily hodnoty v řádu 10 3 a 10 5, jak je patrné z tabulky. Koliformní bakterie, kvasinky ani plísně nebyly detekovány v žádném ze vzorků. 30

31 Jogurt Klasik Olma Tabulka č.2 Počet mikroorganismů v jogurtu Klasik Olma vzorek č. CPM KTJ/g BMK aerobně KTJ/g Lactobacillus anaerobně KTJ/g Koliformní b. KTJ/g Kvasinky/ Plísně KTJ/g 1 6, N* N*** N N 2 9, N** N**** N N 3 9, , , N N 4 1, , , N N průměr 4, , , vypočt. z 2 hodnot vypočt. z 2 hodnot Celkový počet mikroorganismů jsme stanovili na 4, KTJ/g jogurtu. Stejně tak byly detekovány bakterie mléčného kvašení a laktobacily v řádu 10 3 a Kvasinky, plísně ani koliformní bakterie nebyly během analýzy detekovány. Bio jogurt Olma Tabulka č.3 Počet mikroorganismů v bio jogurtu Olma vzorek č. CPM KTJ/g BMK aerobně KTJ/g Lactobacillus anaerobně KTJ/g Koliformní b. KTJ/g Kvasinky/ Plísně KTJ/g 1 4, N* N*** N N 2 8, N** N**** N N 3 8, , , N N 4 8, , , N N průměr 7, , , vypočt. z 2 hodnot vypočt. z 2 hodnot Celkový počet mikrorganismů jsme stanovili na 7, KTJ/g jogurtu. Bakterie mléčného kvašení u tohoto jogurt vyšly nejlépe, a to v řádu Laktobacily byly detekovány v množství 8,

32 Kvasinky, plísně ani koliformní bakterie nebyly u tohoto vzorku detekovány. Milblu bílý jogurt Tabulka č.4 Počty mikroorganismů v jogurtu Milblu vzorek č. CPM KTJ/g BMK aerobně KTJ/g Lactobacillus anaerobně KTJ/g Koliformní b. KTJ/g Kvasinky/ Plísně KTJ/g 1 1, N* N*** N N 2 3, N** N**** N N 3 1, , , N , , , N N průměr 1, , , vypočt. z 2 hodnot vypočt. z 2 hodnot Bílý jogurt značky Milblu Classic dopadl při mikrobiologické analýze nejhůře. Dosáhl nejmenšího počtu laktobacilů, a to 1, KTJ/g jogurtu. Celkový počet mikroorganismů jsme stanovili na 1, KTJ/g jogurtu. Pouze u tohoto vzorku byla detekována přítomnost kvasinek. Výskyt mohl být způsoben nedostatečnou hygienou během výroby nebo kontaminací při výrobě. Kvasinky a plísně dobře snáší kyselé prostředí, takže mohou v jogurtu přežít i delší dobu. (Görner, Valík, 2004) 32

33 KTJ/g V grafech č. 1, 2 a 3 jsou zobrazeny rozdíly v počtu mikroorganismů, bakterií mléčného kysání, laktobacilů a celkového počtu mikroorganismů. Bio Hollandia Klasik Bio Olma Milblu Graf č.1 Bakterie mléčného kysání - mezofilní Při výrobě jogurtu jsou technologicky nejdůležitější bakterie mléčného kysání, které zahrnují dva druhy Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, popřípadě zástupce rodu Bifidobacterium. Nejlépe při analýze dopadl bio jogurt Olma. 33

34 KTJ/g KTJ/g Bio Hollandia Klasik Bio Olma Milblu Graf č.2 Laktobacily Bio Hollandia Klasik Bio Olma Milblu Graf č.3 Celkový počet mikroorganismů 34

35 U všech čtyř vzorků byl celkový počet mikroorganismů v řádu 10 9, což splňuje Vyhlášku Ministerstva zemědělství ČR č. 77/2003 Sb., ve znění pozdějších novel, která požaduje obsah bakterií mléčného kvašení minimálně 10 7 KTJ/g. V celkovém počtu mikroorganismů se promítají jak laktobacily, tak streptokoky. Rozdíl je způsoben živnou půdou MRS, na které lépe rostou laktobacily. Nejlépe při této analýze dopadl bio jogurt Olma. Streptococcus salivarius subsp. thermphilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus jsou mikroorganismy fakultativně anaerobní, proto nemusel jejich růst na půdách být při aerobních podmínkách tak velký. Kalhotka et al. (2009) hodnotili při mikrobiologické analýze jogurty značky Olma. Byl stanoven počet bakterií mléčného kvašení v rozmezí 10 5 až 10 7 KTJ/g. Celkový počet mikroorganismů byl stanoven na 10 8 až 10 9 KTJ/g. Koliformní bakterie, kvasinky ani plísně nebyly při této analýze detekovány. Jogurt Klasik dopadl při této analýze nejlépe. Ze senzorického hlediska měl jogurt typickou vůni, kyselost a chuť, během skladování však docházelo ke zhoršení vlastností. (Kalhotka et al., 2009) V dubnu 2012 provedla akreditovaná Chemická a mikrobiologická laboratoř Bureau Veritas rozbor 18 vzorků bílých jogurtů. Z mikrobiologického hlediska byl stanoven počet bakterií mléčného kvašení a bylo také ověřováno, zda jogurty neobsahují kvasinky nebo plísně. Obsah jogurtové mikroflóry byl měřen v poslední den spotřeby a v jogurtech, na nichž byly uvedeny ještě jiné probiotické bakterie, byl zjišťován i jejich obsah. Na prvním místě se při této analýze umístil bílý jogurt značky Agrola Jindřichův Hradec. Na druhém místě se při této analýze umístil právě bio jogurt značky Olma. Při analýze bylo detekováno 7, KTJ/g jogurtu. Jogurt měl nejvíce vápníku ze všech vzorků. (MF Dnes, ekonomika test) 35

36 6 ZÁVĚR Jogurt patří mezi nejrozšířenější funkční potraviny. Obsahují látky velice prospěšné pro náš organismus. Mezi takové látky patří bílkoviny, složené z esenciálních aminokyselin, mléčný tuk, vápník a velké množství vitamínů. Pozitivní vliv na lidský organismus mají také bakterie mléčného kysání, které se používají při výrobě jogurtu. Patří mezi ně Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. Mezi bakterie mléčného kysání se i nepřímo řadí rod Bifidobacterium, kteý má významnou úlohu v trávicím traktu kojenců, kde inhibuje nežádoucí bakterie. U čtyřech vzorků bílých jogurtů Klasik Olma, bio jogurt Olma, bio selský jogurt Hollandia a jogurt Milblu Classic byl proveden mikrobiologický rozbor. Při analýze dosáhl bio jogurt Olma nejlepších výsledků ve všech mikrobiologických rozborech. Nejhůře při analýze dopadl jogurt Milblu Classic, u kterého byly detekovány kvasinky a plísně. Vzhledem k ceně jogurtu Milblu Classic, která je výrazně nižší než u dalších tří jogurtů, není výsledek až tak překvapující. 36

37 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Literární prameny ATLAS, Ronald M. Microorganisms in our world. St. Louis Baltimore: Mosby, s. ISBN JIČÍNSKÁ, Eva, HAVLOVÁ, Jana. Patogenní mikroorganismy v mléce a mlékárenských výrobcích. 1. vyd. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, s. ISBN X. GÖRNER, Fridrich, VALÍK, Lubomír. Aplikovaná mikrobiológia požívatin. 1. vyd. Bratislava: Malé centrum, s. ISBN GRIEGER, Celestín, HOLEC, Josef. Hygiena mlieka a mliečnych výrobkov. 1. vyd. Bratislava: Príroda, s. HARMON, S.M. - KAUTTER. D.A., Journey of Food Protection, 54, 1991, s HOĎÁK, K., Fyziologie a biochemie bakterií, Brno: MU, 1979 HOLEC, Josef et al. Hygiena a technlogie mléka a mléčných výrobků. 2. přepracované vyd. Brno: Státní pedagogické nakladatelství Praha, s. ISBN HRABĚ, J., BŘEZINA, P., VALÁŠEK, P. Technologie výroby potravin živočišného původu. 1. vyd. Zlín UTB Academia centrum, ISBN HYLMAR, Bohumil. Výroba kysaných mléčných výrobků. 1. vyd. Praha: SNTL/ALFA, 1986, 212 s. KADLEC, P., MELZOCH, P. Co byste měli vědět o výrobě potravin? 1.vyd. KEY Publishing s.r.o., Ostrava, s. ISBN