Masarykova univerzita Lékařská fakulta VYHODNOCENÍ VÝZNAMU VLASTNÍCH CUT - OFF PRO TESTOVÁNÍ PŘÍTOMNOSTI LUPUS ANTIKOAGULANT

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta VYHODNOCENÍ VÝZNAMU VLASTNÍCH CUT - OFF PRO TESTOVÁNÍ PŘÍTOMNOSTI LUPUS ANTIKOAGULANT Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí diplomové práce: MUDr. Alena Buliková, Ph.D. Autor: Vendula Wiatrová Brno, duben 2014

2 Jméno a příjmení autora: Název bakalářské práce: Pracoviště: Vedoucí bakalářské práce: Vendula Wiatrová Vyhodnocení významu vlastních cut-off pro testování přítomnosti lupus antikoagulant Oddělení klinické hematologie, fakultní nemocnice Brno MUDr. Alena Buliková, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2014 Souhrn: Antifosfolipidový syndrom je klinicko-laboratorní jednotka, která je definovaná přítomností antifosfolipidových protilátek a různými klinickými projevy, z nichž nejčastější je trombóza. V plazmě přítomné APA jsou detekovatelné ELISA metodami (ACLA, antiβ 2 - -GP I) nebo koagulačními testy (LA). Diagnostikou LA se zabývají specializované laboratoře, které si nastavují vlastní cut-off pro jednotlivé diagnostické testy. Předmětem práce je nastavit nové cut-off, porovnat je se stávajícími. The antiphospholipid syndrome is a clinical laboratory unit that is defined by the presence of antiphospholipid antibodies and various clinical symptoms, the most common being thrombosis. APA, present in the plasma, are detectable by ELISA methods (ACLA, antiβ2- -GP I) or coagulation tests (LA). The specialized laboratories that deal with the diagnostics LA have their own set cut-off" for individual diagnostic tests. The object of this work is to set up a new cut-off" and compare them with the existing ones. Klíčová slova: lupus antikoagulant, antifosfolipidový syndrom, antifosfolipidové protilátky, trombóza, fosfolipidy Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Aleny Bulikové, Ph.D. a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne 29. dubna 2014 Podpis autora

4 PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucí bakalářské práce paní MUDr. Aleně Bulikové, Ph.D. za odbornou pomoc, vedení a cenné připomínky při zpracovávání bakalářské práce. Mé poděkování patří také paní Dagmaře Chytré za poskytnutou pomoc při získávání informací a podkladových materiálů, které byly nezbytné pro vznik této práce.

5 OBSAH 1. ÚVOD OBECNÁ ČÁST Antifosfolipidový syndrom Definice antifosfolipidového syndromu Katastrofický antifosfolipidový syndrom Antifosfolipidové protilátky = fosfolipid dependentní protilátky Historie Definice antifosfolipidových protilátek Etiopatogeneze Mechanizmy působení antifosfolipidových protilátek Laboratorní diagnostika antifosfolipidových protilátek Laboratorní diagnostika protilátek proti kardiolipinu a proti β 2 -glykoproteinu Laboratorní diagnostika lupus antikoagulant SPECIÁLNÍ ČÁST Diagnostika lupus antikoagulant drvvt aptt PTT LA APTT Actin FS Destičkový neutralizační test = PNP HNP EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Metodika Interpretace výsledků Diskuze ZÁVĚR... 62

6 6. POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM GRAFŮ PŘÍLOHY... 70

7 Použité symboly a zkratky ACLA AIHA AK Antiβ 2 -GPI APA APC apoer2 APS aptt AT BCSH β 2 GP I CAPS CMP daptt DIC drvvt ELISA FN FV FVa FVIII FVIIIa FIX FX antikardiolipinové protilátky autoimunitní hemolytická anémie aminokyselina protilátky proti β 2 -glykoproteinu I antifosfolipidové protilátky aktivovaný protein C receptor 2 pro apolipoprotein E antifosfolipidový syndrom aktivovaný parciální tromboplastinový test antitrombin Britský výbor pro standardizaci v hematologii β 2 -glykoproteinu I katastrofický antifosfolipidový syndrom cévní mozková příhoda aptt se sníženým obsahem fosfolipidů diseminovaná intravaskulární koagulace ředěný test s jedem Russelovy zmije = dilute Russell s viper venom time enzyme-linked immunosorbent assay fakultní nemocnice faktor V aktivovaný faktor V faktor VIII aktivovaný faktor VIII faktor IX faktor X

8 FXI FXa FXII GLP HELLP HIT HMWK HNP HPE HUS INF ICHS IL INR ISTH ITP i.v. KCT LA LAR LIS LMWH MAC MLP OKH PC PK PL faktor XI aktivovaný faktor X faktor XII fosfolipidové jednotky ve třídě IgG hemolysis, elevated liver enzym, low platelet syndrome heparinem indukovaná trombocytopenie vysokomolekulární kininogen hexagonal neutralization procedur hexagonální fáze fosfatidyletanolaminu hemolyticko-uremický syndrom interferon ischemická choroba srdeční interleukin mezinárodní normalizační poměr Mezinárodní společnost pro trombózu a hemostázu idiopatická imunitní trombocytopenická purpura intravenózně kaolinový test lupus antikoagulant normalizovaný poměr laboratorní informační systém nízkomolekulární heparin membránu atakující komplex fosfolipidové jednotky ve třídě IgM oddělení klinické hematologie protein C prekalikrein fosfolipid

9 PNP PS PT Ri RVV SLE SSC ISTH TNF α TT TTI TTP destičkový neutralizační test protein S protrombinový test Rösnerův index jed Russellovy zmije systémový lupus erythematodes standardizační výbor Mezinárodní společnosti pro trombózu a hemostázu tumor nekrotizující faktor α trombinový čas inhibitor tkáňového tromboplastinu trombotická trombocytopenická purpura Text obsahuje další zkratky, které jsou vytvořeny výlučně pro specifické potřeby laboratoře jako indexové výpočty a jsou vysvětleny v textu.

10 10 1. ÚVOD Cílem této práce je nastavení vlastních cut-off při testování přítomnosti lupus antikoagulant. Práce je klasicky členěna na obecnou, speciální a experimentální část. Obecná část je zaměřena na definici antifosfolipidového syndromu, jeho klinické projevy a diagnostická kritéria. Důraz je kladen na antifosfolipidové protilátky. Kapitola obsahuje definici APA a mechanizmy působení APA a jejich vliv na vznik klinických projevů APS. V třetí kapitole obecné časti je popsána diagnostika APA s důrazem kladeným na diagnostiku LA. V této části jsou popsány obecné postupy testování přítomnosti LA. Rozepsány jsou jednotlivé testy diagnostiky LA. Speciální část se zabývá diagnostikou LA v koagulační laboratoři OKH FN Brno, PMDV. Popsány jsou jednotlivé testy používané při testování přítomnosti LA v této konkrétní laboratoři. Experimentální část je zaměřena na zhodnocení statistických výsledků práce. Cílem statistické práce bylo nastavení nových cut-off při testování přítomnosti lupus antikoagulant, zhodnocení praktického dopadu na další průběh testů, porovnání nových cut- -off se stávajícími a posouzení, jak by nově nastavené cut-off změnily diagnostiku přítomnosti či nepřítomnosti LA u již vyšetřených pacientů.

11 11 2. OBECNÁ ČÁST 2.1 Antifosfolipidový syndrom Poprvé byl antifosfolipidový syndrom popsán v roce 1983 Grahamem Hughesem jako stav spojený s přítomností antifosfolipidových protilátek, se vznikem trombóz a se ztrátami plodu (BULIKOVÁ, 2012a). V roce 1986 byl APS ve spolupráci s Harrisem upřesněn v laboratorní diagnostice, ale byl nazván antikardiolipinový syndrom, jelikož v té době hrála hlavní roli sérologická diagnostika (BULIKOVÁ aj., 2009) Definice antifosfolipidového syndromu Antifosfolipidový syndrom je definován jako klinické projevy hyperkoagulačního stavu (trombóza cév a/nebo poruchy gravidity) spojené s přítomností antifosfolipidových protilátek. APS může vzniknout samostatně nebo jako komplikace autoimunitního onemocnění, nejčastěji systémového lupus erythematodes (HIRMEROVÁ, 2010). Antifosfolipidový syndrom je klinicko-laboratorní jednotkou charakterizovanou klinickými projevy ve formě trombóz či reprodukčních ztrát a současně přítomností antifosfolipidových protilátek (BULIKOVÁ aj., 2006). APS, který se někdy nazývá i Hughesův syndrom, svou problematikou zasahuje do řady medicínských oborů a to klinických i laboratorních. Etiopatogeneze APS není zcela vyjasněna, má velmi různorodou klinickou symptomatologii, složitou laboratorní diagnostiku a omezené léčebné možnosti (HIRMEROVÁ, 2010). U pacientů s APS se vyskytují trombózy cév a/nebo poruchy gravidity (reprodukční ztráty). V krvi jsou průkazné antifosfolipidové protilátky. Nejčastěji se žilní trombózy u APS diagnostikují v dolních končetinách jako hluboké žilní trombózy a/nebo vzniká plicní embolie. Avšak trombózy se mohou vyskytovat v celém žilním systému,

12 12 např. v povrchových, intrakraniálních, mesenterických, portální i renálních žilách. Arteriální trombóza u APS je nejfrekventovanější v mozkových arteriích, kde způsobuje mozkovou ischémii (cévní mozkovou příhodu). Méně častou komplikací je infarkt myokardu, i když mohou být rozpoznány subklinické myokardiální ischémie. Je jasný vztah mezi APA a trombózou (KELLING aj., 2012). V mnoha medicínských oborech mohou být klinické projevy velmi rozmanité. Trombózy mohou postihovat venózní i arteriální řečiště jakéhokoli orgánu (tabulka 1) (HLUŠÍ, 2003). Tabulka 1. Nejčastější klinické manifestace APS trombózy velkých cév neurologie kardiologie gastroenterologie nefrologie endokrinologie revmatologie dermatologie oftalmologie hematologie chirurgie transplantace hluboké nebo povrchové končetinové žíly, vena cava inferior, ileofemorální, axilární, renální žíly migrenózní stavy, tranzitorní ischemie, CMP, epilepsie, myelopatie, sclerosis multiplex, chorea, multiinfarktová demence, pseudotumor cerebri, trombózy mozkových sinů trombózy věnčitých tepen s ICHS, infarkt myokardu, plicní hypertenze, chlopenní vegetace, intrakardíální tromby, kardiomyopatie Buddův-Chiariho syndrom, trombózy jaterních žil, ischemie střevní glomerulární trombózy, trombotická mikroangiopatie, vasculitis, maligní hypertenze adrenální trombózy a Addisonova choroba SLE-like syndrom, vaskulitis, aj. livedo reticularis, Sneddonův syndrom, kožní ulcerace, Raynaudův fenomén, tříštivé hemorrhagie arteriální nebo žilní retinální okluze, aneuryzmata, vaskulitis, akutní renální nekrózy, tranzitorní diplopie, amaurosis fugax, fotopsie, konjuktivální teleangiektazie, episcleritis, neuropatie optického nervu trombocytopenie, ITP, AIHA kostní nekrózy, postoperativní trombózy orgánové rejekce (ZDROJ: HLUŠÍ aj., 2003) Katastrofický antifosfolipidový syndrom Relativně vzácnou klinickou manifestací přítomnosti APA, která se vyskytuje u nemocných s APS nejvýše v 1% je katastrofický antifosfolipidový syndrom. Tento

13 13 syndrom může vznikat i tzv. de novo u pacientů, u kterých nikdy nebyla zjištěna pozitivita APA ani u nich nebyl diagnostikován antifosfolipidový syndrom (BULIKOVÁ aj., 2012). Nejčastěji jsou postiženy plíce, mozek, ledviny a nadledviny, ale vzniká i v mikrocirkulaci ostatních orgánů (KEELING aj., 2012). Není pro ni typická hluboká žilní trombóza. Klinicky se může podobat trombotické trombocytopenické purpuře nebo aktivní DIC (HLUŠÍ aj., 2003). U CAPS není zcela vyjasněná patogeneze. Má bouřlivý průběh (často do týdne) a vysokou mortalitu (cca 53%). Účinnou a včasnou léčbou (antikoagulace, výměnná plazmaferéza, kortikoidy, i.v. imunoglobuliny) může být snížena o 20% (GUMULEC, 2010). Doposud nejsou spolehlivě vysvětleny podmínky, za kterých CAPS vzniká. Jednak se uplatňuje trombofilní dispozice daná přítomností APA, dále se zapojují zánětlivé cytokiny (TNF α, zánětlivé IL, INF), aktivace endotelu, ovlivnění komplementového systému, působení jiných autoprotilátek nebo další jiné příčiny. Pro rozvoj CAPS byly jako možný spouštěcí moment identifikovány infekce (cca 1/5 pacientů), chirurgické zákroky jsou méně často, dále jsou pravděpodobná traumata nebo jiné invazivní zásahy, nádory, vysazení antikoagulační terapie, těhotenské komplikace, propuknutí SLE a/nebo užívání hormonálních kontraceptiv. U CAPS dochází k rychlému vzniku trombóz (v průběhu týdne), které vedou k multiorgánovému selhání. Jsou postiženy malé cévy a rozvíjí se syndrom systémové zánětlivé odpovědi, jsou postiženy neobvyklé orgány (infarkty kostní dřeně či reprodukčních orgánů). Laboratorně se prokazují antifosfolipidové protilátky. Na 10. mezinárodním kongresu o antifosfolipidových protilátkách v roce 2002 v Taormině v Itálii byla stanovena mezinárodní diagnostická kritéria CAPS, která zahrnují: 1. Postižení tří orgánů, tkání nebo systémů 2. Současný vývoj klinické manifestace v intervalu jednoho týdne a méně 3. Histopatologické ověření okluze malé cévy nejméně v 1 orgánu nebo tkáni 4. Laboratorní průkaz APA průkaz lupus antikoagulans, průkaz ACLA ve třídě IgM nebo IgG a v titru 40 a více MPL či GPL nebo hodnoty přesahující 99. percentil a/nebo průkaz antiβ 2 GP I ve třídě IgG nebo IgM v titru přesahující 99. percentil. Pozitivita musí být ověřena opakovaným stanovením v časovém odstupu 12 a více týdnů. Při naplnění všech čtyř kritérií je stanovena definitivní diagnóza. Pokud jsou naplněna kritéria 1, 2 a 4 znamená to pravděpodobnou diagnózu. Pravděpodobná diagnóza je dále při naplnění kritérií 1, 3 a 4 za předpokladu vývoje CAPS ve dvou orgánech do týdne a ve třech orgánech do měsíce nebo při splnění všech 4 kritérií, ale při postižení jen dvou orgání či tkání nebo při

14 14 splnění všech čtyř kritérií bez konfirmace pozitivity APA po 12 týdnech (např. úmrtí postiženého) (BULIKOVÁ aj., 2012) Diagnostická kritéria antifosfolipidového syndromu Pokud APS vznikne bez zjevné příčiny, je řazený mezi autoimunitní onemocnění a označuje se jako primární APS (MALÝ aj., 2007). APS se může vyskytovat u pacientů se systémovým lupus erytematodes nebo u osob s jinou autoimunitní chorobou. V tomto případě označujeme APS jako sekundární (BÁRTKOVÁ, 2010). Avšak rozdělení APS na primární a sekundární není pro klasifikaci zásadní (BULIKOVÁ aj., 2009). Antifosfolipidový syndrom je jednotka definovaná klinickými a laboratorními kritérii, přičemž k diagnóze je nutné splnění minimálně jednoho kritéria klinického a jednoho laboratorního (HLUŠÍ aj., 2003). V posledních dvou desetiletích prodělala diagnostická kritéria APS několik revizí. Autoři ze skupiny kolem Donata Alacróna-Segovii stanovili na základě svých vlastních zkušeností první předběžná kritéria APS u nemocných se SLE. Piette a kolektiv později nastavili kritéria, která vyloučí primární antifosfolipidový syndrom a je nutné posoudit rozvoj systémového onemocnění. Tento systém je i v dnešní době užitečný při běžné péči o pacienty s APA (BULIKOVÁ aj., 2009). Z mezinárodního konsenzu na pracovním setkání při 8. mezinárodním kongresu o antifosfolipidových protilátkách v Sapporu v roce 1998 vzešlo první ucelené diagnostické schéma. V klinických hodnoceních je toto schéma široce užíváno a akceptováno. Revize těchto kritérií byla provedena v roce 2004 na 11. mezinárodním kongresu o antifosfolipidových protilátkách v Sydney (tabulka 2) (BULIKOVÁ aj, 2006). Doporučení upřesňuje, za jakých okolností může být diagnóza klinické manifestace potvrzena. Mezinárodní konsenzus navíc určuje časové rozhraní mezi klinickou manifestací a průkazem autoprotilátek připouštějící kauzální souvislost, a tudíž diagnózu APS je to nejméně 12 týdnů (umožňující opakovaný průkaz protilátek) a nejvíce 5 let (BULIKOVÁ aj., 2009). Tato kritéria slouží ke sjednocení diagnózy APS v klinických studiích, avšak v klinické praxi by se neměla tato diagnostická kritéria nekriticky aplikovat. Důkladně se posoudí

15 15 klinická anamnéza, u trombózy a těhotenských komplikací se zváží alternativní příčiny a posoudí se výsledky laboratorních testů (KEELING aj., 2012). Tabulka 2. Revidovaná kritéria antifosfolipidového syndromu (Sydney 2004) Klinická kritéria Trombóza jedna či více klinických manifestací arteriální nebo venózní trombózy, případně trombózy malé cévy ve kterékoli tkáni či orgánu; je prokázána objektivními validovanými kritérii, v případě histopatologického průkazu bez známek zánětu v cévní stěně Porucha těhotenství jedno či více nevysvětlitelných úmrtí morfologicky normálního plodu v nebo po 10. týdnu těhotenství s potvrzením normální morfologie plodu ultrasonograficky či přímým vyšetřením jedno či více předčasných narození morfologicky normálního novorozence před 34. týdnem těhotenství z důvodu eklampsie či těžké preeklampsie podle standardní definice nebo při prokázaných známkách placentární insuficience tři a více nevysvětlitelných následných spontánních potratů před 10. týdnem těhotenství po vyloučení anatomických či hormonálních abnormit matky a po vyloučení chromozomálních abnormit rodičů Laboratorní kritéria LA je prokázán v plazmě dva a vícekrát v časovém odstupu 12 a více týdnů je detekován podle doporučení Mezinárodní společnosti pro trombózu a hemostázu ACLA jsou prokázány v séru či plazmě, IgG či IgM izotopu, ve středním a vysokém titru (tj. 40 GPL či MPL, nebo > 99. percentil). Jsou měřeny standardizovaným typem ELISA metody jsou prokázány dva a vícekrát v časovém odstupu 12 a více týdnů Antiβ 2 -GPI jsou prokázány v séru či plazmě, IgG či IgM izotopu (titr >99. percentil) jsou prokázány dva a vícekrát v časovém odstupu 12 a více týdnů standardizovaným typem ELISA podle doporučeného postupu (ZDROJ: BULIKOVÁ aj., 2006) Dále je doporučeno rozlišovat případy, u kterých je prokázán další rizikový faktor klinické manifestace (tabulka 3) a takové, u kterých nebyla nalezena takováto příčina (BULIKOVÁ aj., 2006).

16 16 Tabulka 3. Přídatné rizikové faktory pro klinickou manifestaci APS dle mezinárodního konsenzu (Sydney 2004) Věk muži >55 let, ženy > 65 let Rizikové faktory kardiovaskulární hypertenze diabetes mellitus zvýšení LDL nebo snížení HDL cholesterolu kouření cigaret rodinná anamnéza předčasného výskytu kardiovaskulárního onemocnění body mass index 30 kg/m 2 mikroalbuminurie průkaz glomerulární filtrace < 60 ml/min Vrozené trombofilie zejména Leidenská mutace FV Získané rizikové faktory trombózy hormonální kontraceptiva nefrotický syndrom maligní onemocnění imobilizace operace (ZDROJ: BULIKOVÁ aj., 2006) Mezi nemocnými je účelné rozlišovat skupiny, podle kterých byla laboratorní diagnóza APS stanovena. Na základě poznatků se zjistilo, že některé antifosfolipidové protilátky jsou asociovány s trombotickými komplikacemi více než jiné. Doporučuje se rozlišovat: skupina I: je přítomno více než jedno laboratorní kritérium v jakékoli kombinaci skupina IIa: izolovaný průkaz lupus antikoagulant skupina IIb: izolovaná přítomnost antikardiolipinových protilátek skupina IIc: izolovaná přítomnost protilátek proti β 2 -glykoproteinu I Striktní vymezení diagnostických kritérií je z důvodu, že některé publikace uvádějí, že jen velmi málo nemocných, kteří jsou dlouhodobě léčeni antikoagulační léčbou z indikace APS má tuto diagnózu syndromu jasně potvrzenu a léčba je tudíž neoprávněná (BULIKOVÁ aj., 2006).

17 Antifosfolipidové protilátky = fosfolipid dependentní protilátky Historie Antifosfolipidové protilátky byly poprvé popsány Augustem Paul von Wassermannem, německým bakteriologem, který v roce 1906 vynalezl komplement-fixační test pro diagnostiku syfilis. Tento test byl proveden z jater plodu s vrozeným syfilis pomocí solné extrakce. Pro Wassermannův test byly stanoveny různé postupy, které používají antigeny získané z alkoholových extraktů normálních tkání. Jsou to komplement-fixační testy a různé flokulační techniky (VDRL = Venereal Disease Research Laboratory, rychlý plasminový reaginový test, automatizovaný reaginový test). V roce 1941 Pangborn identifikoval kyselý fosfolipid, jako antigen z alkoholových extraktů hovězího srdce a byl pojmenován kardiolipin (DOUGLAS, 2002). Conley a Hartmann poprvé popsali v roce 1952 přítomnost cirkulujícího antikoagulantu. Tento antikoagulant popsali u dvou pacientů s diagnózou SLE, kteří měli zvláštní hemoragickou diatézu s přítomným jedinečným inhibitorem, prodlužujícím dobu krevního srážení i protrombinový čas. Zároveň byl prokázán falešně pozitivní test na syfilis. Pro různé klinické stavy (autoimunitní choroby, nemoci vyvolané léky, nádory) byl popsán podobný inhibitor. Stejný inhibitor byl nalezen i v krvi u některých zdravých osob. V roce 1972 byl Feisteinem a Rapaportem zaveden termín lupus antikoagulant, který i přes nepřítomnost inhibitoru proti jednomu koagulačnímu faktoru inhibuje koagulační testy in vitro (ESPINOZA aj., 1986). V roce 1983 Boey ve své publikaci píše o vztahu těchto protilátek se ztrátami plodu. V tomto samém roce publikoval Harris článek se zaměřením na laboratorní diagnostiku a Hughes definoval antifosfolipidový syndrom. V roce 1990 popsaly tři na sobě nezávislé vědecké skupiny (Galli, Matsura, McNeil) úlohu β 2 -glykoproteinu I, který je pro antifosfolipidové protilátky cílovým antigenem. Po tomto objevu mnoho vědců začalo zkoumat strukturu tohoto proteinu, funkce i jeho význam (BULIKOVÁ, 2012) Definice antifosfolipidových protilátek Antifosfolipidové protilátky jsou velmi heterogenní skupinou autoprotilátek či zkříženě reagujících aloprotilátek s různým cílovým antigenem a různým klinickým významem. APA, které se vztahují k antifosfolipidovému syndromu, jsou autoprotilátky zaměřené proti

18 18 makromolekulárním látkám navázaných na negativně nabité povrchy, kterými jsou většinou fosfolipidy. Ty jsou v systému krevního srážení nejčastější funkční skupinou. Cílové epitopy jsou většinou β 2 -glykoprotein I, protrombin nebo anexin V, ale uplatňuje se řada dalších látek (trombomodulin, protein C, protein S, tkáňový faktor, protrombin aj.). Z diagnostického hlediska APS se vyčleňují tři velké skupiny antifosfolipidových protilátek protilátky proti kardiolipinům (ACLA) protilátky proti β 2 glykoproteinu I (antiβ 2 GP I) lupus antikoagulant (LA) První dvě skupiny lze diagnostikovat pomocí ELISA metod. LA jsou skupinou APA, které se diagnostikují na základě jejich schopnosti ovlivňovat reakce krevního srážení závislé na fosfolipidech koagulační reakce (PENKA aj., 2011). Protilátky proti kardiolipinům = antikardiolipidové protilátky (ACLA) se řadí do třídy IgG nebo IgM. Kardiolipin je mitochondriální fosfolipid z hovězího srdce (ROUBEY, 1994). Protilátky proti β 2 glykoproteinu I (antiβ 2 -GP I) se řadí, stejně jako předchozí, do třídy IgG nebo IgM. β 2 glykoprotein I = apolipoprotein je hlavní cílový antigen, který rozpoznávají antifosfolipidové protilátky. Je to plazmatický protein s afinitou pro fosfolipidy (RAND, 2007). Patří do rodiny kontrolních proteinů komplementu. Váže se na negativně nabité povrchy a na receptory na povrchu buněk. Nejvíce se spojují s trombózou (KEELING aj., 2012). Protein cirkuluje v plazmě v koncentraci cca 200 µg/ml a má hmotnost 43 kda. Celý je sestaven z 326 aminokyselin a je rozčleněn do pěti domén. Čtyři domény jsou shodné a sestávají každá z 60 AK, zatímco pátá doména má v molekule včleněno dalších 6 AK a 19 AK je na C-konci molekuly. Tyto vytvoří na páté doméně velké množství pozitivně nabitých míst, která slouží jako vazebná místa pro negativně nabité fosfolipidy. S trombotickými komplikacemi více souvisí protilátky proti β 2 -glykoproteinu I, které jsou namířené proti epitopu umístěném na první doméně než protilátky namířené proti ostatním doménám (AGAR aj., 2010).

19 19 Lupus antikoagulant (LA) tento termín je z několika důvodů nepřesný a zavádějící. Je to zvláštní laboratorní fenomén a ne přímo detekovatelný, specifický analyt. Tímto fenoménem se vyznačují hlavně ty APA, které in vitro interferují s koagulačními testy závislými na fosfolipidech. APA soutěží s koagulačními faktory o negativně nabité fosfolipidy. Tyto fosfolipidy fungují pro koagulační reakce jako katalytické povrchy. Tím dojde při koagulačních testech k prodloužení výsledných časů. In vitro se LA tedy chová jako inhibitor koagulace, ale není zaměřen proti konkrétnímu koagulačnímu faktoru. Z klinického hlediska je zavádějící označení antikoagulant. Vede k obavám z krvácivé diatézy, in vivo je spojen LA s trombotickými komplikacemi. Není přesný ani přívlastek lupusové, jelikož LA nejsou přítomné jen u pacientů se SLE a naopak ne každý pacient se SLE je pozitivní na LA (HIRMEROVÁ, 2010). Antifosfolipidové protilátky se vyskytují ve třídách imunoglobulinů IgG a IgM, mohou se vyskytovat i ve třídě IgA, které nejsou diagnostickými kritérii APS, i když zřejmě mají klinický význam. Jednorázově se můžeme setkat s nízkými titry APA asi u 5 10 % zdravé populace. V asociaci s užíváním drog nebo některých léků (chlorpromazin, prokainamid) nebo po virových infektech byl pozorován přechodný výskyt APA. U méně než dvou procent zdravé populace se vyskytuje přetrvávající pozitivita APA. Prevalence 4-21 % je u pacientů s trombózou (BÁRTKOVÁ, 2010) Etiopatogeneze APS je příkladem patologické autoimunity, kdy ne zcela jasných příčin se autoprotilátky (za běžných okolností plnící fyziologické imunoregulační funkce) stanou patogenními. Tato dysregulace může být u APS podmíněna např. endoteliálním poškozením nebo oxidačním stresem. In vitro se APA uplatňují jako inhibitory koagulace, ale paradoxně vykazují silnou asociaci s trombotickými příhodami in vivo (HIRMEROVÁ, 2010). Při působení APA se pravděpodobně uplatňují složité etiopatogenní mechanizmy, které se mohou lišit u jednotlivých stavů. Není ještě zdaleka objasněn mechanizmus, jakým APA zapříčiňují trombofilní stav a jednoznačně není rozhodnuto, zda jsou APA příčinou hyperkoagulace, nebo jsou jejím epifenoménem. In vivo probíhá složitá interakce mezi heterogenní skupinou

20 20 autoprotilátek a stejně složitou heterogenní a dynamickou strukturou cílových antigenů. Cílovými antigeny APA jsou na negativně nabitý, nejčastěji fosfolipidový povrch, navázané plazmatické proteiny. Vzhledem k velikosti molekuly nejsou samotné fosfolipidy imunogenní (HLUŠÍ aj., 2003). Biologicky patří fosfolipidy (obrázek 1) do velmi významné skupiny složitých lipidů. Fosfolipidy jsou polární lipidy a zbytek kyseliny fosforečné je součástí jejich molekuly. Tzv. fosfatidáty patří mezi nejdůležitější fosfolipidy. Prekurzorem fosfatidátů je kyselina fosfatidová. Fosfatidylcholin, fosfatidylserin a jeho dekarboxylační produkt fosfatidyletanolamin jsou nejvýznamnější strukturní fosfatidáty. Tvoří základ lipidové dvojvrstvy biologických membrán. V membráně krevních destiček obsažené fosfolipidy mají důležitou funkci při hemokoagulaci. Na povrchu trombocytů, po jejich aktivaci, dochází k transmembránovým přesunům a tím pádem k expresi negativních fosfolipidů, které poskytují katalytické povrchy a vznikají komplexy koagulačních faktorů (HIRMEROVÁ, 2010). Fosfolipidy tvoří základní složku biomembrán. Mezi jejich další významné funkce patří poskytování reakční plochy k interakci s koagulačními faktory a s inhibitory koagulace, dále tvoří transportní systémy a účastní se přenosu signálu do buňky (HLUŠÍ aj., 2003). Obrázek 1. Schéma molekuly fosfolipidu (ZDROJ: KŘEMENOVÁ, 2010)

21 Mechanizmy působení antifosfolipidových protilátek Rozlišují se dva základní mechanizmy působení APA. Buď ovlivňují kinetiku reakcí závislých na fosfolipidech (často ovlivňují systém proteinu C), nebo ovlivňují funkční nastavení částic či buněk (endotelií, trombocytů, monocytů, neutrofilů, neuronů, fibroblastů a buněk placenty). Působením APA může docházet k ovlivnění komplementového systému, k inhibici fibrinolýzy a/nebo dojde k blokování antitrombotické funkce anexinu V (tabulka 4). Ve svém konečném důsledku vedou všechny tyto procesy k protrombotickým, proateromatózním a/nebo prozánětlivým dějům a dochází k různým klinickým projevům (BULIKOVÁ aj., 2013). V klinickém vyjádření představuje přítomnost APA široký záběr projevů od zcela asymptomatického průběhu, přes cévní a gynekologické komplikace, širokou škálu netrombogenních manifestací až po katastrofický průběh s vysokým rizikem úmrtí pacienta (BULIKOVÁ aj., 2012). U APS se v patofyziologii klinických projevů zmiňuje úloha krevních elementů, zejména endotelií, trombocytů a monocytů. Při působení APA dochází v organizmu k některým změnám, které nevznikají důsledkem trombózy nebo mikrotrombotizace, ale autoprotilátky působí přímo na různé buněčné struktury (receptory). Tím dojde například k aktivaci buňky, nepřímému zásahu do imunitních reakcí nebo k jiné její funkční změně. Tyto změny jsou pravděpodobné v patofyziologii reprodukčních ztrát nebo některých neurologických projevů (BULIKOVÁ aj., 2006)

22 22 Tabulka 4. Mechanismy působení antifosfolipidových protilátek β 2 -glykoprotein I anti protrombin/ anti-trombin anti-protein C anti-protein S anti-fosfolipáza A 2 anti-trombomodulin anti-heparan-sulfát inhibice aktivace PC, inhibice inaktivace FVa a FVIII cestou APC/PS, inhibice aktivace fibrinolýzy komplexem FXII/PK, inhibice aktivace AT mediované heparan sulfátem, potenciace aktivace trombocytů, potenciace tvorby FXa na trombocytech, snížení volného PS cestou inhibice interakce β 2 -glykoprotein I a C 4 vázající protein vazba na trombinem aktivované destičky, inhibice uvolnění prostacyklinu pod vlivem trombinu, inhibice aktivace PC inhibice aktivace proteinu C, inhibice inaktivace FVa a FVIIIa cestou APC/PS inhibice inaktivace FVa a FVIIIa cestou APC/PS inhibice produkce prostacyklinu z endoteliálních buněk inhibice aktivace PC Inhibice aktivace AT mediované heparan sulfátem cévní stěny anti-annexin V ovlivnění funkce placentárního antikoagulačního proteinu I (= annexinu V) tvorbou komplexů, blokádou nebo odstraněním annexinu V z jeho přirozených míst v placentě (ZDROJ: PENKA aj., 2011) Mechanizmus působení antifosfolipidových protilátek při vzniku trombózy Není zcela objasněna souvislost mezi trombózou a přítomností APA, ale studie na zvířatech prokázaly přímý protrombotický účinek APA (KEELING aj., 2012). Monika Galli ve své metaanalýze prokázala, že přítomnost lupus antikoagulans se vždy spojuje s trombotickými komplikacemi, zatímco nález protilátek proti kardiolipinu ve středním nebo vyšším titru a IgG izotopu zvyšuje riziko jen arteriální trombózy. I prospektivní studie HUNT, která sledovala ACLA v běžné populaci jako rizikový faktor pro žilní trombózu, zvýšení tohoto rizika neprokázala. U 34 z 59 studií (tj. 57 %) byla prokázána asociace antiβ 2 - -GP I s trombózou. Tyto protilátky jsou velmi různorodé, protilátky proti první doméně β 2 - -GP I nesou vyšší riziko trombotických komplikací (BULIKOVÁ aj., 2006). Přítomnost antiβ 2 -GP I je fyziologická, má za úkol chránit molekulu β 2 -GP I v cirkulaci, aby plnila své normální funkce a to až do té doby, kdy se dalším vlivem naváže β 2 -GP I na fosfolipidový povrch. Změní se struktura cílové molekuly a původně ochranné protilátky se stanou

23 23 patogenními (BULIKOVÁ aj., 2013). Do procesu koagulace zasahují APA s největší pravděpodobností na několika úrovních: vážou se přímo na endoteliální buňky vážou se přímo na trombocytární fosfolipidy mění funkci antitrombinu a trombocytární agregaci zvyšují expresi prozánětlivých cytokinů a interakci s komplementovým systémem inhibují tvorbu prostacyklinu a komplexů proteinu C a S inhibují fibrinolýzu (BÁRTKOVÁ, 2010). V poslední době se pozornost zaměřuje na protilátky proti β 2 -glykoproteinu I. V plazmě se β 2 -glykoprotein I vyskytuje ve dvou konformacích, v uzavřené (kruhové) a otevřené podobě. Jak bylo řečeno v předchozím textu, β 2 -glykoprotein I se skládá z pěti domén. Kruhová forma proteinu je udržována interakcí mezi první a pátou doménou β 2 -glykoproteinu I (KEELING aj., 2012). Poté, co se β 2 -glykoprotein I naváže na fosfolipidový povrch, změní se jeho konformace na otevřenou, dojde k odhalení antigenního kryptického epitopu a tím se odhalí vazebné místo pro autoprotilátku. Po navázání protilátky molekula β 2 -GP I dimerizuje, vznikne trimolekulární komplex (autoprotilátka vázaná na dimer β 2 -GP I), který je navázaný na fosfolipidový povrch, kde různě interaguje s buněčnými receptory (Toll-like receptory 2 a 4, glykoprotein 1bα, ) a hemostatickými reakcemi (obrázek 2) (HIRMEROVÁ, 2010). Protilátky nerozpoznávají volný β 2 -GP I v plazmě, ale pouze β 2 -GP I vázaný na fosfolipidové povrchy. V plazmě mohou být detekovány i imunokomplexy β 2 -GP I s protilátkou (AGAR aj., 2010). Fosfolipidové povrchy s receptory, na které se navazují trimolekulární komplexy se nacházejí na různých typech buněk, nejčastěji to jsou endotelové buňky, monocyty a trombocyty. Po navázání komplexu na receptor na povrchu buněk dojde k intracelulární signalizaci a poté k indukci řady dějů např. zvyšuje se exprese adhezních molekul, narůstá produkce prozánětlivých cytokinů, u endoteliálních buněk se inhibuje uvolňování prostacyklinu, na základě dysfunkce endotelu dochází k inhibici fibrinolýzy, zvyšuje se adheze leukocytů k endotelu, u trombomodulinu dochází k down-regulaci, monocyty a endotelie zvýšeně exprimují tkáňový faktor, aktivují se trombocyty a ve vyšší míře uvolňují tromboxan A2 (HIRMEROVÁ, 2010).

24 24 Obrázek 2. Tvorba komplexu APA/β2-GP I a jejich vazba na fosfolipidový povrch (ZDROJ: HIRMEROVÁ, 2010) Výše bylo řečeno, že APA ovlivňují systém proteinu C. Aktivovaný protein C inaktivuje koagulační faktory Va a VIIIa tím, že se na ně naváže. In vivo inhibují komplexy antiβ 2 -GP I/β 2 -GP I aktivovaný protein C. V navázání na fosfolipidový povrch komplexům APC/Va/VIIIa zabraňují komplexy antiβ 2 -GP I/β 2 -GP I nebo je úplně rozruší (obr. 3) (VLACHOYIANNOPOULOS aj., 2010). Obrázek 3. Ovlivnění systému proteinu C působením APA A: protein S aktivuje protein C, který se váže na koagulační faktory Va a VIIIa a inaktivuje je. B: antiβ 2 -GP I/β 2 -GP I komplexy zabraňují komplexům APC/Va/VIIIa v navázání na fosfolipidový povrch nebo zabrání ve zformování tohoto komplexu. (ZDROJ: VLACHOYIANNOPOULOS aj., 2010)

25 Mechanizmus působení antifosfolipidových protilátek při poruchách gravidity Antifosfolipidový syndrom je v těhotenství nejčastěji spojován se syndromem rekurentních potratů. V období fetálního vývoje se vyznačuje třemi a více potraty po sobě. Ke ztrátám dochází nejčastěji v 8. až 10. týdnu gravidity, což je až po ultrasonografické detekci srdeční akce embrya (KŘEPELKA, 2007). Dále dochází k úmrtí plodu, k růstové retardaci plodu, placentární nedostatečnosti, u žen ke komplikacím těhotenství jako je časný rozvoj preeklampsie (SALMON, 2008). Potraty způsobují antikardiolipinové protilátky, které reakcí s trofoblastem zabraňují jeho proliferaci (KŘEPELKA, 2007). Ke ztrátám plodu vedou trombotické i netrombotické mechanizmy. K trombotickým mechanizmům patří protilátková destrukce ochranného štítu, který tvoří annexin V na fosfolipidových membránách trofoblastu placenty. Destrukcí se odkryjí fosfolipidy, které jsou pak k dispozici koagulačním reakcím. Aktivace komplementového systému vedoucí k zánětlivým změnám patří k netrombotickým komplikacím (LAZÚR, 2008). APA mohou měnit strukturu annexinu V, což je přirozený antikoagulant endotelových buněk placenty. Na trofoblastu tvoří ochranný štít. Během diferenciace trofoblastu se na povrchu buněk vystavuje fosfatidylserin, který představuje cíl pro APA. Komplex antiβ 2 -GP I/β 2 -GP I může vytěsnit z povrchu trofoblastu annexin V, čímž se poruší ochranný štít a dojde ke zvýšené tvorbě trombinu. Tato změna může vést k tvorbě protilátek proti annexinu V. Kromě navození hyperkoagulačního stavu v trofoblastu, mohou APA zvyšovat produkci cytokinů. U APS vykazují abnormální vývoj spirální artérie v placentě, což může být příčinou poškození placenty (TINCANI aj., 2008). Komplementový systém se skládá z více než dvaceti sérových proteinů. Jeho úlohou je ochrana organizmu proti patogenním agens, způsobuje zánět a poškození tkáně. Aktivací komplementu se aktivují zánětlivé buňky. Aktivace klasické cesty je způsobena vazbou protilátky na antigen, což způsobí uvolnění silných efektorů, které jsou spojené s humorální odpovědí v imunitně zprostředkovaném poškození tkáně. Aktivace komplementu mannoza- -vázající lektin drahou je zprostředkována navázáním lektinu na mannozu (často na infekčním agens). Aktivace alternativní cesty je zahájena spontánní aktivací složky komplementu, která se naváže na povrch patogenu. Bylo dokázáno, že oxidační stres aktivuje všechny tři cesty

26 26 komplementu (SALMON, 2008). Rozštěpení složky C3 je zásadním krokem v aktivaci komplementu. Vznikne fragment C3a, který má prozánětlivé účinky a nazývá se anafylatoxin. Ten aktivuje C5, jehož fragment C5a obzvláště silně indukuje zánět. Fragment C5b se složkami komplementu C6, C7, C8 a C9 vytvoří tzv. membránu atakující komplex. MAC naruší fosfolipidovou dvojvrstvu membrány mikroorganismů tím, že vytvoří do této membrány kanál a dojde k lýze buňky a k její smrti (OKU aj., 2012). Komplementový systém je schopný navodit trombotické komplikace antifosfolipidového syndromu přímo aktivací koagulační kaskády přes MAC nebo nepřímo interakcí C5a složky komplementu a receptoru C5a, která vede k produkci tkáňového faktoru a tím k aktivaci koagulační dráhy (MEHDI aj., 2010). Aktivované fragmenty komplementu mají schopnost vazbou na receptor C5a nebo prostřednictvím MAC aktivovat zánětlivé a endotelové buňky. Oku a kolektiv prokázali, že u pacientů s primárním APS je častá hypokomplementémie, která je důsledkem aktivace a spotřeby komplementu. Při aktivaci komplementu vzniká anafylatoxin, jehož prostřednictvím APA mohou aktivovat monocyty a makrofágy. V placentě komplexy antiβ 2 - -GP I/β 2 -GP I aktivují komplement klasickou cestou. Vznikají fragmenty C3a a C5a, dochází k aktivaci neutrofilů, krevních destiček a monocytů, uvolnění cytokinů (TNF aj.), zánětlivých mediátorů, reaktivních oxidantů a proteolytických enzymů. Zánět poškozuje trofoblast a v závislosti na jeho rozsahu buď dojde intrauterinímu odumření plodu nebo k poruchám růstu plodu. Aktivace komplementu prostřednictvím komplexu antiβ 2 -GP I/β 2 -GP I se dá zablokovat heparinem (ESPINOSA aj., 2008) Mechanizmus působení antifosfolipidových protilátek při vzniku krvácivých stavů Přítomnost antifosfolipidových protilátek může mít za následek nejen trombotickou, ale i krvácivou tendenci. Důvodem může být sekundární hypoprotrombinémie, trombocytopenie, trombocytopatie či současný výskyt specifických inhibitorů krevního srážení (BULIKOVÁ aj., 2006). Při sekundární hypoprotrombinémii se vytvářejí komplexy vazbou APA na nefunkční místo molekuly faktoru II. Tyto komplexy jsou odstraňovány z cirkulace, důsledkem je snížení hladiny protrombinu zvýšením clearence komplexů APA + protrombin a v klinickém obraze je rozhodující krvácivá diatéza (BULIKOVÁ aj., 2006). V tomto případě může hladina protrombinu dosáhnout hodnot, pří kterých jednak mohou nastat provokované (krvácení po drobných operacích nebo úrazech, často silné menstruační krvácení), tak i spontánní krvácivé projevy (BULIKOVÁ aj., 2013). V tomto případě je

27 27 důležité, aby byla sledována aktivita protrombinového času podle Quicka. Pouze přítomností APA není obvykle prodloužen protrombinový čas, musí být přítomno druhotné snížení faktoru II. U APS nebývá většinou trombocytopenie významná. Vazba APA na krevní destičky překryje funkční místa a tím se navodí funkční porucha trombocytů (BULIKOVÁ aj., 2006) Mechanizmus působení antifosfolipidových protilátek při vzniku trombocytopenie Trombocyty a jejich zapojení do mechanizmu krevního srážení byly vždy považovány za důležitou součást procesů pravděpodobné patogeneze, diagnostiky a případně i léčby nemocných, u nichž byly prokázány APA a/nebo stanovena diagnóza APS. U primárního i sekundárního APS byl dříve součástí diagnostických kritérií snížený počet trombocytů. Trombocytopenie není v současné době součástí diagnostických kritérií APS ani klinické manifestace. Trombocytopenie související s výskytem antifosfolipidových protilátek je nově definovaná jednotka, která je vázána na přítomnost APA a u prokázaných APA se vyskytuje často. Diagnostická kritéria pro trombocytopenie asociované s antifosfolipidovými protilátkami jsou dána mezinárodním konsenzem (tabulka 5). Tabulka 5. Diagnostická kritéria trombocytopenie asociované s antifosfolipidovými protilátkami APA jsou prokázány 2 a vícekrát v časovém odstupu 12 a více týdnů lupus antikoagulant protilátky proti kardiolipinu ve třídě IgG nebo IgM v titru 40 a více GPL/MPL či při překročení 90. percentilu protilátky proti β 2 -glykoproteinu I ve třídě IgG či IgM při překročení 90. percentilu trombocytopenie je prokázána 2 a vícekrát v časovém odstupu 12 a více týdnů případy jsou rozděleny na primární a sekundární počet trombocytů je nižší než 100 x 10 9 /l jsou vyloučeny jiné příčiny trombocytopenie, zejména HELLP syndrom, TTP/HUS, DIC, HIT, resp. trombocytopenie spojená s léky je provedeno rozlišení stavů, které jsou prokázány systémovým procesem (zejména SLE) a těch, u nichž vyvolávající onemocnění nebylo zjištěno (ZDROJ: BULIKOVÁ aj., 2010)

28 28 K častým a důležitým mechanizmům působení APA patří progresivní aktivace krevních destiček, ke které dochází poté, co se na jejich povrch naváží antifosfolipidové protilátky. V 90. letech 20. století předpokládali, že na mírně aktivované trombocyty, které exprimují negativně nabité fosfolipidy, se váží imunitní komplexy tvořené APA a β 2 -GP, což vede k další aktivaci, k tvorbě mikropartikulí a následnému rozšíření fosfolipidového povrchu a ke zvýšení produkce trombinu. Předchozí mírná aktivace destiček a dimerická struktura vazby β 2 -GP I je nutná k působení komplexů antiβ 2 -GP I/β 2 -GP I (BULIKOVÁ aj., 2010a). β 2 -GP I může uvolnit kationový protein destičkový faktor 4 a na povrchu krevních destiček zvyšuje tvorbu patogenních imunitních komplexů (GIANNAKOPOULOS aj., 2013). Destičkový glykoprotein Ibα, který je podjednotkou receptoru GPIb/IX/V, je vazebným místem pro von Willebrandův faktor a další ligandy (BULIKOVÁ aj., 2010a). β 2 -glykoproteinem I může interagovat s tímto receptorem a s receptorem 2 pro apolipoprotein E, což je receptor, který patří do skupiny receptorů pro lipoproteiny s nízkou denzitou. Protilátky proti β 2 -GP I vazbou na β 2 -GP I přemostí tyto receptory, což vede k zesílení aktivace již mírně aktivovaných krevních destiček, zvýší se přilnavost destiček a dojde k produkci tromboxanu A2 (GIANNAKOPOULOS aj., 2013). K produkci tromboxanu A2 a řadě dalších dějů dochází po aktivaci receptorů GPIbα a apoer2 vazbou komplexu antiβ 2 -GP I/β 2 -GP I, čímž dochází k aktivaci dalších signálních drah, zejména k aktivaci p38 mitogen-aktivované proteinové kinázy. Tímto dochází k produkci tromboxanu A2 a k aktivaci řady dalších dějů. Dalším následkem je zvýšení aktivity krevních destiček zvýšením aktivity receptoru GPIIb/IIIa (obrázek 4). Příčiny trombocytopenie v přítomnosti antifosfolipidových protilátek jsou heterogenní. Zvýšená spotřeba trombocytů, která je navozena různým způsobem, je nejpravděpodobnější příčinou trombocytopenie. Na destičku navázané komplexy β 2 -GP I a antiβ 2 -GP I protilátka mohou být odstraňovány v monocyto-makrofágovém systému, zejména ve slezině, cestou vazby Fc receptorů imunoglobulinů. Ke spotřebě může docházet i důsledkem aktivace a přeměny trombocytů v mikropartikule, které obsahují fosfolipidy a zvyšují protrombotické sklony (BULIKOVÁ aj., 2010a).

29 29 Obrázek 4. Vliv aktivace destičkových glykoproteinů antifosfolipidovými protilátkami na další procesy (ZDROJ: BULIKOVÁ aj., 2010) 2.3 Laboratorní diagnostika antifosfolipidových protilátek Od roku 1983, kdy Harris poprvé popsal antifosfolipidové protilátky včetně doporučených metod detekce, není možné označit ani dnes detekci APA za spolehlivou, ačkoli byly snahy o standardizaci vyšetření. Jistý pokrok přineslo zavedení diagnostických schémat v sérologické diagnostice. Standardním vyšetřením byla ustanovena detekce antiβ 2 -GP I, pro jednotlivé typy nálezů byl ustanoven způsob detekce a nastavení jejich cut-off rozhraní. Na konferenci v Sydney byly nastaveny konkrétní hodnoty koncentrací ACLA a používá se dvojí možné nastavení. Standardizace sérologické diagnostiky u APS je obtížná. Evropské fórum o antifosfolipidových protilátkách stanovilo minimální požadavky na postupy. Těmi jsou používáni Louisvillských kalibrátorů a jako kontrolní materiál se užívají Koikeho monoklonální protilátky. Naplněním těchto požadavků je intra- a intermetodická variabilita příznivá. V současné době řada laboratoří i v našich podmínkách vyšetřuje APA. Laboratoře nutně prochází externí kontrolou kvality. Avšak většina kliniků nemá informace o tom, jak je v konkrétních laboratořích zajištěna správnost výsledků a jaké cut-off limity mají laboratoře nastavené pro pozitivní a negativní nálezy. Laboratoře by měly tyto skutečnosti dodávat klinickým lékařům spolu s výsledky nemocného (BULIKOVÁ aj., 2009).

30 30 V současné době se vedou diskuze o tom, jaké protilátky a s jakým přínosem pro pacienta sérologicky vyšetřovat. Protilátky proti β 2 -GP I jsou akceptovány ve třídě IgG. Spory se vedou o nálezech protilátkátek proti kardiolipinu ve třídách IgG i IgM a o antiβ 2 -GP I ve třídě IgM. Pro APS je jejich pozitivita klinickým kritériem, avšak o jejich významu při klinické manifestaci APS se vedou diskuze. ACLA jsou rizikem pro rekurenci žilní trombózy, nikoli pro první manifestaci. S častými fetálními ztrátami jsou spojeny ACLA třídy IgG a to i v titru nepřesahujícím 40 GPL IU/ml. Proto je některými autory navrhováno, aby byly odlišné cut- -off limity pro trombózu a pro komplikace gravidity. Tzv. trojnásobná pozitivita, u které se prokazuje současně LA, antiβ 2 -GP I ve třídě IgG a ACLA ve třídě IgG ve vysokých titrech, představuje největší riziko klinické manifestace trombózy a těhotenských komplikací a je spojen s významně vyšším rizikem všech klinických projevů APS. Dalšími diskutovanými nálezy APA, které nepatří do diagnostických kritérií APS, ale jsou spojeny s klinickou manifestací APS, jsou antiβ 2 -GP I ve třídě IgA, které se spojují s vyšším rizikem CMP a/nebo fetálních ztrát a protilátky proti doméně I β 2 -GP I, které se spojují s fenoménem LA a vyšším rizikem trombembolické nemoci. Dále lze laboratorně vyšetřovat antifosfolipidové protilátky proti annexinu V, které mají patogenetický význam. Významný je i průkaz protilátek proti komplexům fosfatidylserin/protrombin (BULIKOVÁ aj., 2013) Laboratorní diagnostika protilátek proti kardiolipinu a proti β 2 -glykoproteinu ACLA a antiβ 2 -GP I se testují ELISA metodami. Harris a kolektiv vyvinuli ELISA metody pro průkaz ACLA. K dispozici je řada komerčně vyráběných ELISA testů. Mikrotitračních destiček se používají 2 typy, vysoce citlivé destičky (ozářené) a destičky s nízkou citlivostí. Na mikrotitrační destičce s vysokou citlivostí, která byla ozářená, je větší antigenní hustota a umožňují vazby bivalentních protilátek z plazmy pacienta. Velkým problémem zůstává vysoká variabilita vykazovaná v testech ELISA. Ani ve specializovaných laboratořích nejsou neobvyklé falešně pozitivní výsledky (DOUGLAS, 2002). Testování APA je poměrně jednoduchá metoda, kterou používá řada laboratoří. Tato metoda se špatně standardizuje, jsou nejasnosti v cut-off rozhraní, má špatnou specifitu a je heterogenita ve výsledcích mezi komerčně dodávanými diagnostickými sety. Proto se musí výsledky pečlivě hodnotit a podle mezinárodních diagnostických kritérií provádí se opakovaná vyšetření (BULIKOVÁ aj., 2006). Chybná diagnóza APS může být stanovena u pacientů se syfilis, lymskou boreliózou, leptospirózou a s jinými infekcemi, u kterých je zvýšená hladina ACLA.

31 31 Zvýšené ACLA u těchto infekcí nejsou spojeny s rizikem trombotických komplikací (RAND, 2003). Při testování ACLA se současně detekují i antiβ 2 -GP I, které jsou přímo spojeny s klinickou manifestací APS. Pro detekci antiβ 2 -GP I a protilátek proti protrombinu jsou k dispozici ELISA metody s purifikovanými proteinovými antigeny. Klinický význam protilátek proti protrombinu je ve výzkumu (FARMER-BOATWRIGHT aj., 2009). Heterogenní skupinou jsou protilátky proti β 2 -GP I. Jsou používány protilátky proti všem pěti oblastem β 2 -GP I. V současné době je řada výzkumů směřována na oblast domény I, konkrétně na epitop kolem aminokyseliny Arg39 a Arg 43. Protilátky proti doméně I β 2 -GP I jsou pro klinické projevy APS významnější než protilátky proti celé molekule β 2 -GP I (OS aj., 2010) Laboratorní diagnostika lupus antikoagulant Poměrně komplikovaný je i průkaz LA koagulačními testy. Před řadou let standardizační výbor Mezinárodní společnosti pro trombózu a hemostázu schválil detailní postup pro stanovení LA. Doporučení Britského výboru pro standardizaci v hematologii je novější dokument. V tabulce 6 jsou shrnuta nejdůležitější kritéria z obou doporučení, ale i ta jsou podrobována v současné době řadě revizí. Průkaz falešně pozitivních výsledků není dle velké italské studie ve specializovaných centrech častý. Spolehlivost laboratorní diagnostiky LA v předchozích letech analyzovalo několik prací. Stanovení celkového profilu APA a klinické manifestace u pacienta může pomoci k přesnému stanovení (BULIKOVÁ aj., 2009) Příprava vzorku plazmy Odběr krve by měl být do citrátu sodného o koncentraci 0,109 mol/l. Plazma pro diagnostiku by měla být zpracována do 1 hodiny od odběru na bezdestičkovou, čehož se docílí dvojitou centrifugací při 2000 g 15 min při C. Po centrifugaci by v plazmě mělo zůstat < 10 x 10 9 /l krevních destiček. Filtrace přes 0,2 µm tlustý filtr a ultrafiltrace při > 5000 g se nedoporučuje, z důvodu možného vzniku mikročástic. Pro vyloučení špatné diagnózy koagulopatií a antikoagulační léčby je užitečné provést předběžné rutinní koagulační testy (KEELING aj., 2012). Pokud se bude vyšetření provádět v časovém odstupu,

32 32 je potřeba vzorek plazmy co nejrychleji zamrazit v tekutém dusíku a uchovávat při -80 C. Vzorky se před vyšetřením rozpouští ve vodní lázni při teplotě 37 C po dobu 5 minut a plazma musí být úplně homogenizovaná (BULIKOVÁ aj., 2009) Komplikace vyšetření LA Při antitrombotické léčbě se vyšetření LA komplikuje. I přes skutečnost, že komerčně vyráběné reagencie obsahují antiheparinové substance, nejméně ¼ laboratoří vykazuje falešně pozitivní výsledky při léčbě nefrakcionovaným heparinem. Interferenci nelze vyloučit ani při použití nízkomolekulárního heparinu. Do roku 2010 byla v této oblasti hlavním úkolem pro SSC ISTC příprava referenčního materiálu pro diagnostiku LA. Dalším problémem je perorální antikoagulační léčba dikumarolovými preparáty. Tato situace se řeší čtyřmi způsoby, ale žádný není optimální: 1) Za 2 týdny po vysazení vitamín K inhibitoru se vyšetří LA. Nelze vyloučit recidivu, i když v takto krátkém období je její pravděpodobnost nízká. Situaci neřeší převedení na LMWH, protože nelze vyloučit se 100 % jistotou artificiální vliv tohoto preparátu. 2) Vyšetření na warfarinu, při kterém se použije směs s normální plazmou stejného objemu. Stanovení LA nízkého titru mohou za těchto podmínek uniknout. 3) Provedení testů dvou hadích jedů, kdy jeden je závislý na fosfolipidech a druhý není a stanoví se poměr jejich časů. Do poměru se používají časy textarinový a ekarinový. Z rutinní laboratorní praxe bylo toto testování vyloučeno pro špatnou možnost standardizace a poměrně náročnou diagnostiku. 4) Sériové vyšetření při vysokých a nízkých koncentracích fosfolipidů. Přítomnost LA způsobí prodloužení koagulačního testu, což je ovlivněno zvýšenou koncentrací fosfolipidů. Tato skutečnost umožňuje použít toto sériové vyšetření. U pacientů hospitalizovaných na JIP se často diagnostikuje LA, i když příčiny tohoto stavu nejsou vyjasněny.