Disková difuzní metoda EUCAST pro vyšetřování citlivosti k antibiotikům. Verze 5.0 Leden 2015

Transkript

1 Disková difuzní metoda EUCAST pro vyšetřování citlivosti k antibiotikům Verze 5.0 Leden 2015

2 Obsah Půdy Příprava inokula Očkování ploten Disky Inkubace Odečítání zón Interpretace Kontrola kvality Analýza chyb 2

3 EUCAST - disková difuzní metoda modifikace prezentace Verze Verze 5.0 Leden 2015 Verze 4.0 Červen 2014 Verze 3.0 Duben 2013 Modifikace Informace o prodloužené inkubaci enterokoků pro glykopeptidy, obr. 20. Přesun E. coli ATCC z rozšířené do rutinní QC. Oprava tiskové chyby u čísla sbírky DSM, obr. 31. Přidání poznámky o odstranění H. influenzae NCTC 8468, obr. 32. Přidání H. influenzae ATCC do tabulky rutinní QC, obr. 32. Oprava tiskové chybyčísla sbírky u E. faecalis ATCC 51299, obr. 33. Informace o čistotě β-nad, obr. 6. Corynebacterium spp. je přidáno na obr. 7 a 20. Informace o skladování a používání agarových ploten, obr. 14. Stafylokoky na obr. 28 jsou změněny na S. aureus. Odkaz na rozšířené tabulky pro kontrolu kvality EUCAST, obr. 30. Informace o odečítání a hodnocení výsledků kontrol, obr. 34. Vysvětlení ohledně defibrinované koňské krve v půdě MH-F, obr. 5 a 6. Pasteurella multocida, Campylobacter jejuni a C. coli přidány na obr. 6 a 19. Vysvětlení ohledně výběru kolonií pro diskovou difuzi, obr. 11 a 12. Přidán Campylobacter jejuni ATCC 33560, obr. 30. Přidána čísla sbírek DSM and CCUG pro E. faecalis ATCC 51922, obr

4 EUCAST - disková difuzní metoda modifikace prezentace Verze Verze 2.1 Únor 2012 Verze 2.0 Leden 2012 Modifikace Vysvětlení ohledně odečítání zón, obr. 23 a 25. Nová terminologie (Skupina viridujících streptokoků) a přidání Listeria monocytogenes na obr. 6 a 19. Vysvětlení ohledně odečítání zón, obr. 24. Další výjimky u odečítání zón, obr. 27. K. pneumoniae ATCC a E. faecalis ATCC přidány na obr. 31. Verze 1.1 Červen 2010 Verze 1.0 Prosinec 2009 Vysvětlení ohledně výšky agaru na obr. 7. Čísla španělské sbírky kultur přidána na obr. 30 a 31. EUCAST poprvé zveřejňuje na webových stránkách obrázkovou prezentaci diskové difuzní metody EUCAST. 4

5 Půdy pro vyšetření citlivosti 5

6 Půdy pro vyšetření citlivosti Používá se pouze Mueller-Hinton agar (MH). Půda pro náročné bakterie (MH-F, Mueller-Hinton Fastidious) je MH obohacený 5% mechanicky defibrinované koňské krve a 20 mg/l β-nad (nikotinamid adenin dinukleotid). Používá se β-nad o čistotě 98 %. 6

7 Půdy pro různé bakterie Bakterie Enterobacteriaceae Pseudomonas spp. Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Streptococcus pneumoniae Streptococcus sk. A, B, C a G Skupina viridujících streptokoků Haemophilus spp. Moraxella catarrhalis Listeria monocytogenes Pasteurella multocida Campylobacter jejuni a coli Corynebacterium spp. Ostatní náročné bakterie Mueller-Hinton agar Půda Mueller-Hinton (MH) agar + 5 % mechanicky defibrinované koňské krve + 20 mg/l β-nad (MH-F) V přípravě 7

8 Vlastní příprava půd Při přípravě se postupuje podle pokynů výrobce. Krev nebo β-nad lze přidat, pouze je-li půda ochlazena na C (je třeba zajistit příslušné nastavení teploty), poté se půda pečlivě promíchá a vylije na plotny. Půda se do ploten vylévá na rovném povrchu do jednotné výšky 4.0 +/- 0.5 mm. Pokud opakované měření prokáže výšku agaru pod nebo nad 4 mm, vylévaný objem se upraví, i když je výška agaru na plotně v rozmezí mm. Obvykle se používají kulaté plotny o průměru 90 mm (~25 ml), 100 mm (~31 ml), 150 mm (~71 ml), nebo čtvercové plotny o straně 100 mm (~40 ml). 8

9 Kontrola kvality Mueller-Hinton agaru Je třeba ověřit, zda na všech používaných šaržích Mueller-Hinton agaru jsou přípustná rozmezí inhibičních zón pro všechna vyšetřovaná antibiotika a bakterie. Zvláštní problémy: Inhibiční zóny aminoglykosidů u P. aeruginosa ATCC o menším/větším průměru než je dolní/horní limit ukazují na vysokou/nízkou koncentraci dvojmocných kationtů v půdě. Inhibiční zóny trimethoprim-sulfamethoxazolu u E. faecalis ATCC o menším průměru než je dolní limit ukazují na vysoký obsah thyminu a thymidinu v půdě. 9

10 Sušení a skladování agarových ploten Před vyšetřením citlivosti nesmí být na povrchu ploten žádné viditelné kapky vody. Plotny nesmí být přesušené. Agarové půdy se uchovávají při 4-10 C. Při vlastní přípravě ploten závisí podmínky pro sušení a skladování na dostupném vybavení a měly by být určeny na místě. Při skladování komerčně připravovaných půd je zapotřebí postupovat podle pokynů výrobce. Před inokulací musí mít agarové půdy pokojovou teplotu. Agarové půdy MH-F, skladované v plastikových sáčcích nebo uzavřených konteinerech, může být nezbytné před použitím usušit. Tím se odstraní přebytečná vlhkost, která může být příčinou neostrých okrajů zón a/nebo povlaku uvnitř zón. 10

11 Inokulum Metoda vyžaduje zákal inokula odpovídající 0,5 McFarlandova standardu*. * Odpovídá přibližně 1-2 x108 CFU/ml u E. coli. 11

12 Výběr izolovaných kolonií vyrostlých přes noc na neselektivní půdě 12

13 Příprava inokula Sterilní kličkou nebo bavlněným tamponem se k vyloučení atypických variant odebere několik (pokud možno) morfologicky podobných kolonií, které se rozetřou ve fyziologickém roztoku tak, aby homogenní, viditelný zákal odpovídal McFarlandovu standardu 0,5. Výjimka: Streptococcus pneumoniae z krevního agaru se připraví podle zákalového stupně 0,5 McFarlanda, z čokoládového agaru podle zákalového stupně 1,0 McFarlanda. Hustotu suspenze lze upravit přidáním bakterií nebo fyziologického roztoku tak, aby odpovídala McFarlandovu standardu 0,5. Zákal se změří nejlépe na fotometru. 13

14 Inokulace ploten Suspenze inokula se očkuje na plotny, nejlépe do 15 minut od přípravy, a nejpozději do 60 minut. Bavlněný tampon se ponoří do suspenze a přebytečná tekutina se odstraní jeho rotací po vnitřní stěně zkumavky. Je třeba se ujistit, že plotny mají pokojovou teplotu. Inokulum se roztírá tamponem ve třech směrech nebo rotátorem tak, aby byl naočkován celý povrch plotny. 14

15 Husté inokulaci ploten je třeba se vyhnout Je důležité, aby inokulum na plotně nebylo husté. Ověří se, zda průměry zón kontrolních kmenů jsou v přípustném rozmezí. Husté inokulum vytváří zóny inhibice o menším průměru. Přebytek inokula na tamponu se před inokulací odstraní jemnou rotací po vnitřní stěně zkumavky (u grampozitivních bakterií se však nesmí tampon příliš vysušit). 15

16 . Skladování disků s antibiotiky Disky se skladují podle podmínek daných výrobcem. Běžně používané disky se uchovávají v temnu při 4-8 C v uzavřených kontejnerech s indikátorem vlhkosti. Před otevřením je nutno kontejner s disky umístit do pokojové teploty, aby nedocházelo ke kondenzaci vody. Lépe je ponechat disky během pracovního dne při pokojové teplotě, než je opakovaně ukládat do ledničky. Disky nelze používat po datu expirace uvedeném na obalu. 16

17 Aplikace disků s antibiotiky Disky se aplikují do 15 od inokulace ploten. Disky musí být pevně a celou plochou přitištěny k povrchu půdy. Počet disků na plotně je nutno omezit, aby se předešlo překrývání inhibičních zón a interferenci mezi antibiotiky. Tím lze dosáhnout spolehlivé měření průměrů zón. 17

18 Souhrn postupu při inokulaci Suspenze inokula se vytvoří z izolovaných kolonií vyrostlých přes noc na neselektivní půdě. Hustota inokula se upraví podle zákalu McFarlandova standardu. Inokulum se v optimálním případě naočkuje na plotny do 15 minut od vytvoření suspenze. Sterilní tampon se ponoří do inokula a přebytek tekutiny se odstraní rotací tamponu po vnitřní stěně zkumavky. Inokulum se rovnoměrně naočkuje po celém povrchu agaru. Disky se aplikují do 15 minut po inokulaci ploten a inkubace se zahájí do následujících 15 minut. 18

19 Inkubace ploten Do 15 min od aplikace disků se plotny obrátí víčkem dolů a dají se inkubovat. Toto omezení času predifuze předchází tvorbě zón o nežádoucím větším průměru. Počet ploten ve sloupci by měl být co nejnižší k potlačení rozdílné teploty uvnitř sloupce, která ovlivňuje průměry zón (podle možností inkubátoru). MH se inkubuje na vzduchu, MH-F na vzduchu s 4-6% CO 2. 19

20 Inkubace ploten Bakterie Podmínky inkubace Enterobacteriaceae 35+/-1 ºC na vzduchu po 16-20h Pseudomonas spp. 35+/-1 ºC na vzduchu po 16-20h Stenotrophomonas maltophilia 35+/-1 ºC na vzduchu po 16-20h Acinetobacter spp. 35+/-1 ºC na vzduchu po 16-20h Staphylococcus spp. 35+/-1 ºC na vzduchu po 16-20h Enterococcus spp. 35+/-1 ºC na vzduchu po 16-20h (24h pro glykopeptidy) Streptococcus sk. A, B, C a G 35+/-1 ºC na vzduchu s 4-6% CO 2 po 16-20h Viridující streptokoky 35+/-1 ºC na vzduchu s 4-6% CO 2 po 16-20h Streptococcus pneumoniae 35+/-1 ºC na vzduchu s 4-6% CO 2 po 16-20h Haemophilus spp. 35+/-1 ºC na vzduchu s 4-6% CO 2 po 16-20h Moraxella catarrhalis 35+/-1 ºC na vzduchu s 4-6% CO 2 po 16-20h Listeria monocytogenes 35+/-1 ºC na vzduchu s 4-6% CO 2 po 16-20h Pasteurella multocida 35+/-1 ºC na vzduchu s 4-6% CO 2 po 16-20h Campylobacter jejuni a coli Corynebacterium spp. Další náročné bakterie 41+/-1 ºC v mikroaerobním prostředí po 24h (40-48h) 35+/-1 ºC na vzduchu s 4-6% CO 2 po 16-20h (40-48h) V přípravě 20

21 Pravidlo minut Plotny je třeba připravit tak, že: inokulum se očkuje do 15 minut od přípravy, nejpozději však do 60 minut, disky se kladou do 15 minut po inokulaci ploten, do 15 minut po aplikaci disků je třeba plotny začít inkubovat. 21

22 Prohlížení ploten po inkubaci Správné inokulum, dobře rozetřené na plotny, poskytuje splývavý nárůst. Rovnoměrný nárůst kolonií umožňuje vytvoření kruhových zón inhibice s ostrými (nevykousanými) okraji. (viz následující obrázek). Málo koncentrované inokulum vytváří izolované kolonie a vyšetření je nutno opakovat. 22

23 Růst by měl být splývavý a rovnoměrný Plotny by měly vypadat takto... a NIKOLI takto! 23

24 Odečítání zón Okraje zón se odečítají ve vzdálenosti 30 cm od oka, od bodu úplné inhibice viditelné pouhým okem. Příklady: E. coli Ciprofloxacin S. aureus Erythromycin CoNS Trimethoprim S. pneumoniae Rifampicin 24

25 Odečítání zón MH plotny se odečítají ze spodní strany proti tmavému pozadí v odraženém světle. MH-F plotny se odečítají po odstranění víčka z horní strany v odraženém světle. 25

26 Odečítání zón Plotny nelze odečítat v procházejícím světle (kdy je plotna umístěna proti zdroji světla) nebo pomocí lupy, pokud není stanoveno jinak (viz dále). Průměry zón lze měřit pravítkem, posuvným měřítkem nebo automatickým odečítáním zón. Zřetelné kolonie, které se vyskytnou uvnitř zóny, je třeba vyočkovat, ověřit jejich čistotu a pokud je nutno, opakovat vyšetření. 26

27 Odečítání zón výjimky (1) Bakterie Antibiotikum Odečítání inhibičních zón Proteus spp. Kterékoli Plazivý růst se přehlíží. Streptococcus spp. Kterékoli Odečítá se zóna inhibice růstu, nikoli hemolýzy. Kterákoli Trimethoprim Trimethoprimsulfamethoxazol Jemný, zastřený růst v inhibiční zóně se zřetelnými okraji se ignoruje. Staphylococcus spp. Linezolid Zóna se prohlíží v procházejícím světle (proti zdroji světla). Enterococcus spp. Vankomycin Zóna se prohlíží v procházejícím světle (proti zdroji světla). Enterobacteriaceae Ampicilin Jemný růst uvnitř zóny, který se může vyskytnout u některých šarží MH agaru, se přehlíží. 27

28 Odečítání zón výjimky (2) Bakterie Antibiotikum Odečítání inhibičních zón E. coli Mecilinam Izolované kolonie uvnitř inhibiční zóny se přehlížejí. Staphylococcus aureus Benzylpenicilin Zóna se prohlíží v blízkosti procházejícího světla (proti zdroji světla). Stafylokoky Cefoxitin Inhibiční zóna se pečlivě prohlíží a pátrá se po koloniích uvnitř zóny. 28

29 Interpretace zón Před interpretací výsledků se ověří, zda průměry inhibičních zón vytvořené kontrolními kmeny jsou v přípustném rozmezí. Naměřené průměry inhibičních zón (na nejbližší milimetr) se interpretují v kategoriích citlivosti (C, I a R) podle tabulek breakpointů EUCAST (EUCAST Breakpoint Tables ( česky Tabulky breakpointů EUCAST ( 29

30 Kontrola vyšetření citlivosti Ke kontrole správnosti provedení je zapotřebí používat doporučené kmeny pro kontrolu kvality (viz EUCAST Quality Control Tables, česky Kontrola kvality EUCAST). Kontrolní kmeny s definovanou rezistencí lze použít ke kontrole schopnosti detekovat rezistenci (viz EUCAST Extended QC Tables, česky Kontrola kvality EUCAST). Kontrolní kmeny lze koupit ze sbírek kultur nebo z komerčních zdrojů. 30

31 EUCAST - kmeny pro rutinní kontrolu kvality Druh Číslo sbírky kultur Vlastnosti E. coli E. coli ATCC 25922; NCTC 12241; CIP 7624; DSM 1103; CCUG 17620; CECT 434; CNCTC 5276; CCM 3954 ATCC 35218; NCTC 11954; CIP ; DSM 5923; CCUG 30600; CECT 943; CNCTC 5321; CCM 4225 Citlivý, divoký typ Producent TEM-1 β-laktamázy P. aeruginosa S. aureus ATCC 27853; NCTC 12903; CIP 76110; DSM 1117; CCUG 17619; CECT 108; CNCTC 5482; CCM 3955 ATCC 29213; NCTC 12973; CIP ; DSM 2569; CCUG 15915; CECT 794; CNCTC 5480; CCM 4223 Citlivý, divoký typ Slabý producent β-laktamázy E. faecalis ATCC 29212; NCTC 12697; CIP ; DSM 2570; CCUG 9997; CECT 795; CNCTC 5483; CCM 4224 Citlivý, divoký typ 31

32 EUCAST - kmeny pro rutinní kontrolu kvality Druh Číslo sbírky kultur Vlastnosti S. pneumoniae ATCC 49619; NCTC 12977; CIP ; DSM 11967; CCUG 33638; CNCTC 5043; CCM 4501 Snížená citlivost k penicilinu H. influenzae* NCTC 8468* Citlivý, divoký typ H. influenzae ATCC 49766; NCTC 12975; CIP ; DSM 11970; CCUG 29539; CNCTC 5105; CCM 4457 Campylobacter jejuni ATCC 33560; NCTC 11351; CIP 702; DSM 4688; CCUG 11284; CNCTC 7365; CCM 5214 Citlivý, divoký typ Citlivý, divoký typ * H. influenzae NCTC 8468 vykazuje neobvyklé růstové vlastnosti a od roku 2016 bude odstraněn. 32

33 EUCAST - kmeny pro detekci specifických mechanizmů rezistence (rozšířená QC) Druh Číslo sbírky kultur Vlastnosti K. pneumoniae ATCC ; NCTC 13368; CCUG 45421; CECT 778 Producent ESBL (SHV-18) S. aureus E. faecalis H. influenzae NCTC ATCC 51299; NCTC 13379; CIP ; DSM 12956; CCUG 34289; CNCTC 5530; CCM 4647 ATCC 49247; NCTC 12699; CIP ; DSM 9999; CCUG 26214; CNCTC 5063; CCM 4456 Heterorezistentní k oxacilinu, meca pozitivní Rezistentní k vysoké koncentraci aminoglykosidů (HLAR) a k vankomycinu (vanb pozitivní) β-laktamáza negativní, ampicilinrezistentní (BLNAR) 33

34 Sbírky kultur ATCC, American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA. NCTC, National Collection of Type Cultures, Health Protection Agency Centre for Infections, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK. CIP, Collection de Institut Pasteur, Rue du Docteur Roux, Paris Cedex 15 France. DSMZ, Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 16, D Braunschweig, Germany. CCUG, The Culture Collection University of Gothenburg CECT. Colección Española de Cultivos Tipo. Universidad de Valencia Burjassot. Valencia. Spain. CNCTC, Česká sbírka typových kultur, Státní zdravotní ústav, Šrobarova 48, , Praha, Česká republika. CCM Česká sbírka mikroorganizmů, Přírodovědecká fakulta MU, Kotlářská 2, Brno 34

35 Denní provádění kontroly kvality pro posouzení celkového provozu Kontrolní testy by měly být prováděny a vyhodnocovány denně, zejména s antibiotiky, která jsou v rutinní sestavě. Kontrolní testy by měly být odečteny a vyhodnoceny vždy před hlášením výsledků klinických izolátů. Každý den, kdy se provádí vyšetření, se prohlédnou výsledky posledních 20 konsekutivních testů. Prozkoumají se výsledky trendů a zón, které opakovaně spadají nad nebo pod přípustné rozmezí. Pokud jsou mimo přípustné rozmezí dva nebo více z 20 testů, je zapotřebí vyšetřit příčinu. 35

36 Monitoring provádění testů Průměr zóny (mm) Jednotlivé výsledky mimo kontrolní limity Všechny výsledky na jedné straně limitu Horní limit rozmezí Cíl Dolní limit rozmezí Konsekutivní výsledky mimo limity na stejné straně Den 36

37 Postup při výsledcích kontrolních kmenů mimo limit Pokud jsou hodnoty dvou nekonsekutivních průměrů inhibičních zón kontrolních kmenů z 20 testů mimo přípustné rozmezí, lze sice výsledky vyšetření citlivosti hlásit, je však třeba vyšetřit příčinu. Pokud jsou hodnoty dvou konsekutivních průměrů inhibičních zón kontrolních kmenů z 20 testů mimo přípustné rozmezí, je zapotřebí vyšetřit příčinu před hlášením výsledků vyšetření citlivosti. Vyšetření citlivosti je zapotřebí opakovat. Pokud je ve stejném dni více disků (>2) mimo rozmezí, je zapotřebí vyšetřit příčinu před hlášením výsledků vyšetření citlivosti. Vyšetření citlivosti je zapotřebí opakovat. Pokud není prokázána rezistence u kontrolního kmene pro rezistenci, pozastaví se hlášení výsledků, vyšetří se příčina a vyšetření se opakuje. 37

38 Uchování a subkultivace kontrolních kmenů Kmeny se uchovávají při -70 C v glycerolovém bujónu nebo na korálcích: jedna lahvička pro použití, jedna pro archiv. Alternativně lze použít lyofilizáty nebo komerční zdroje kmenů. Z lahvičky "pro použití" lze týdně kmeny vyočkovat na neselektivní půdy a kontrolovat čistotu kolonií. Čistou kulturu lze vyočkovávat a používat denně do 7 dnů. Náročné bakterie lze postupně vyočkovávat pouze po 6 dnů. Po spotřebování lahvičky pro použití se subkultivuje lahvička "pro archiv" a připraví se další lahvička pro použití. 38

39 Možné příčiny chyb (1) Půda Podmínky vyšetření Uchovávání ploten Nedodržení postupu při přípravě Variabilita šarží nebo změna dodavatele Suplementy (variabilita šarží, chybná navážka, prošlá expirace) ph Výška agaru/objem agaru Datum expirace Nedodržení pravidla (suspenze naočkována do 15 min, disky kladeny do 15 min, inkubace do 15 min) Inkubace (teplota, prostředí a čas) Inokulum (málo/hodně koncentrované, nebo nehomogenní) Způsob odečítání Odečítání okraje zón 39

40 Možné příčiny chyb (2) Disky Kontrolní kmeny Nesprávný disk (chybný druh nebo obsah disku) Síla disku (nesprávné uchování, labilita, datum expirace) Nevyrovnání na pokojovou teplotu po otevření zásobníku disků Mnoho disků na plotně (interference mezi látkami) Nesprávný kontrolní kmen Mutace Kontaminace Stáří kultury 40

41 Webová stránka EUCAST Webová stránka EUCAST uvádí pravidelné aktualizace metody vyšetření, rozmezí kontrolních kmenů a breakpointů. Jakékoli komentáře a návrhy lze posílat na adresu erika.matuschek@ltkronoberg.se nebo na sekretariát EUCAST (viz webová stránka). 41

42 EUCAST český překlad na stránkách SZÚ