BD Mueller Hinton Fastidious Agar (MH-F)

Transkript

1 NÁVOD K POUŽITÍ MÉDIA NA MISCE URČENÁ K OKAMŽITÉMU POUŽITÍ PA Rev.: srpen 2016 BD Mueller Hinton Fastidious Agar (MH-F) ÚČEL POUŽITÍ BD Mueller Hinton Fastidious Agar (MH-F) se používá pro testování antimikrobiální citlivosti klinických izolátů náročných organismů v souladu se standardizací Evropské komise pro testování antimikrobiální citlivosti (EUCAST). 1 Toto médium se skládá z agaru Mueller Hinton Agar s doplňkem 5 % mechanicky defibrinované koňské krve a 20 mg/l ß-NAD. Aktuální doporučení EUCAST uvádějí použití agaru MH-F pro kultivaci náročných organismů, včetně Streptococcus pneumoniae, Haemophilus ssp., Moraxella catarrhalis, Campylobacter jejuni a coli, viridujících streptokoků, streptokoků skupiny A, B, C a G, Listeria monocytogenes, Pasteurella multocida a Corynebacterium spp. 2 ZÁSADY A VYSVĚTLENÍ POSTUPU Mikrobiologická metoda. Chcete-li provést testování antimikrobiální citlivosti u náročných organismů (včetně metodologie a implementace difuzního terčíku, pokynů pro odečítání), nahlédněte do aktuálních postupů doporučovaných komisí EUCAST. 2 Ve zkratce platí, že při provedení testu antimikrobiální citlivosti založeném na široce používané Kirby-Bauerově metodě 3 se souvislé inokulum organismu natře na celý povrch média. Na povrch média se pak umístí papírové terčíky impregnované předepsaným množstvím antibiotik nebo jiných antimikrobiálních látek, provede se inkubace misky a změří se zóny inhibice kolem jednotlivých antimikrobiálních terčíků. Určení toho, zda je organismus citlivý (S) nebo rezistentní (R) na určitou látku, se provádí porovnáním velikosti získaných zón s velikostmi uvedenými v tabulkách hraničních hodnot EUCAST. 4 Základ agaru Mueller-Hintonové obsahuje nízkou koncentraci thyminu-thymidinu a kontrolovanou koncentraci kalcia a magnézia, čímž zajišťuje omezení růstu kolem terčíků a umožňuje provedení přesnějších měření zón inhibice. 5-8 Agar Mueller-Hintonové bez doplňků je sice také vhodný pro testování citlivosti rychle rostoucích aerobních patogenů, ale není vhodný pro náročnější organismy vyžadující specifické růstové přídavky. Složení agaru Mueller Hinton Fastidious Agar s defibrinovanou koňskou krví a NAD umožňuje růst náročných bakterií a zaručuje minimální interferenci jednotlivých složek agaru s výsledky testu antimikrobiální citlivosti. Mueller Hinton Fastidious Agar je běžná testovací půda pro většinu výše uvedených náročných mikroorganismů, a nemusíte tudíž používat samostatná média pro testování antimikrobiální citlivosti jednotlivých zástupců. 1 ČINIDLA BD Mueller Hinton Fastidious Agar (MH-F) Složení* na jeden litr čištěné vody Masový extrakt 2,0 g Kyselý hydrolyzát kaseinu 17,5 g Škrob 1,5 g Agar 17,0 g Koňská krev, mechanicky defibrinovaná 5 % ß-NAD 0,02 g ph 7,3 ± 0,1 *Upraveno a/nebo doplněno dle potřeby tak, aby byla splněna kritéria účinnosti. PA Strana 1 z 8

2 BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Pouze k odbornému použití. Pokud misky vykazují známky mikrobiální kontaminace, změny zabarvení, vysušení, popraskání nebo jiné známky poškození, nepoužívejte je. Nadměrné svraštění tohoto média následkem vysušení může vést k nesprávným výsledkům citlivosti. Pokyny pro aseptickou manipulaci, informace týkající se biologického nebezpečí a pokyny k likvidaci použitého produktu naleznete v dokumentu VŠEOBECNÝ NÁVOD K POUŽITÍ. SKLADOVÁNÍ A ŽIVOTNOST Po převzetí až do doby těsně před použitím skladujte misky v originálním pouzdru, v temnu a při teplotě 2 až 8 C. Chraňte před mrazem a přehřátím. Misky lze inokulovat až do data expirace (viz štítek na obalu) a inkubovat po doporučenou dobu inkubace. Misky z otevřených sad po 10 kusech lze používat po dobu jednoho týdne, pokud jsou uloženy v čistém prostředí při teplotě 2 až 8 C. KONTROLA KVALITY UŽIVATELEM Při kontrole kvality uživatelem postupujte podle doporučení EUCAST. 9 Naočkujte reprezentativní vzorky následujících kmenů na všechna média (podrobnosti viz část Typy vzorků a Provedení testu). Misky inkubujte ideálně v převrácené poloze po uvedenou dobu, při uvedené teplotě a atmosférickém tlaku. Tabulka 1: Očekávané výsledky kmenů pro kontrolu kvality podle doporučení EUCAST 9 Antimikrobiální látka Rozsah Inkubace Kmen (mm) Erythromycin (15 µg) Oxacillin (1 µg) h, Streptococcus Norfloxacin (10 µg) ± 1 C, pneumoniae Meropenem (10 µg) atmosféra ATCC Trimethoprim-Sulfamethoxazole s CO ( µg) Haemophilus influenzae ATCC Campylobacter jejuni ATCC (DSM 4688) Vzhled nenaočkovaného média Ampicillin (2 µg) Cefuroxime (30 µg) Chloramphenicol (30 µg) Trimethoprim-Sulfamethoxazole h, 35 ± 1 C, atmosféra s CO 2 ( µg) Ciprofloxacin (5 µg) h, Erythromycin (15 µg) Tetracycline (30 µg) Červené až vínové, matné POSTUP Dodaný materiál BD Mueller Hinton Fastidious Agar. Mikrobiologicky kontrolováno. 41 ± 1 C, mikroaerofilní atmosféra Materiál, který není součástí dodávky 1. 0,9% fyziologický roztok (množství po 5 ml) pro přípravu standardního inokula. 2. Porovnávací standard síranu barnatého (0,5 ml 0,048M BaCl 2 [1,175% w/v (hmotnost/obj.) BaCl 2 2H 2 O] v 99,5 ml 0,18M [0,36N] H 2 SO 4 [1% v/v]) nebo 3. Fotometrické zařízení pro úpravu zakalení očkovací suspenze tak, aby odpovídalo McFarlandově normě o hodnotě 0,5. 4. Jako alternativu výše uvedených materiálů (1 3) lze použít očkovací systém BD Prompt Inoculation System (zařízení pro titrační přípravu nátěru) Kontrolní kultura Streptococcus pneumoniae ATCC 49619, Haemophilus influenzae ATCC a Campylobacter jejuni ATCC 33560/DSM PA Strana 2 z 8

3 6. Papírové terčíky impregnované předepsaným množstvím antibakteriálních látek, např. terčíky pro testování citlivosti BD Sensi-Disc. 7. Zásobník terčíků, např. 6místné samotěsnicí zařízení BD Sensi-Disc. 8. Pravítko nebo jiné zařízení pro měření velikosti zóny v milimetrech. 9. Inkubátor, který je schopen vytvořit atmosféru s 5 % CO 2, nebo jiné zařízení, které vytváří stejnou atmosféru obohacenou o CO Pomocná kultivační média, činidla a laboratorní vybavení dle potřeby. Typy vzorků Tento produkt se používá k testování citlivosti čistých kultur izolovaných z klinických vzorků (viz také část SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚČINNOSTI A OMEZENÍ POSTUPU). Provedení testu Tato metodika popisuje metodu přímé suspenze kolonií dle doporučení EUCAST Zajistěte si čistou, čerstvou (= přes noc) kulturu z neselektivního média. Při rutinním testování citlivosti lze inokulum připravit vytvořením přímé suspenze několika morfologicky podobných kolonií ve fyziologickém roztoku. 2. Pomocí fotometrického zařízení upravte inokulum na zákal 0,5 McFarlanda nebo vizuálně tak, aby odpovídal standardnímu roztoku síranu barnatého (standard 0,5 McFarlanda). 3. Bylo zjištěno, že pro účely běžného testování jsou přijatelné alternativní metody přípravy nátěru pomocí zařízení, která umožňují přímou standardizaci nátěru bez úpravy zakalení, například očkovací systém BD Prompt Inoculation System Připravte si suspenzi kolonií Streptococcus pneumoniae (preferenčně) z misky s krevním agarem na hustotu 0,5 McFarlanda. Při vytvoření suspenze Streptococcus pneumoniae z misky s čokoládovým agarem musí inokulum odpovídat zákalu 1,0 McFarlanda. 5. Inokulum použijte optimálně do 15 minut od provedení úpravy zákalu. Za všech okolností je nutné suspenzi spotřebovat během 60 minut od přípravy. Namočte sterilní bavlněný tampón do správně naředěného inokula a několikrát jím důkladně otočte proti horní vnitřní stěně zkumavky tak, abyste vytlačili nadbytečnou kapalinu a zabránili nadměrnému naočkování. 6. Naočkujte na agar BD Mueller Hinton Fastidious Agar: rozetřete inokulum třikrát po celém povrchu agaru a po každém rozetření otočte misku o 60, abyste dosáhli rovnoměrného naočkování. 7. Postupujte podle bezpečnostních opatření pro aseptické podmínky a do 15 minut od naočkování aplikujte terčíky na zaschlou misku. Na jednu misku položte maximálně šest terčíků. Po uložení terčíků na agar je přitlačte sterilní jehlou nebo pinzetou, aby byly v úplném kontaktu s povrchem média. Tento krok není nutný, pokud jsou terčíky uloženy pomocí samopřítlačného zásobníku BD Sensi-Disc. 8. Do 15 minut po aplikaci terčíků misky otočte (preferovaný postup) a umístěte je do inkubátoru. Podmínky inkubace jsou shrnuty v tabulce 2. Tabulka 2: Podmínky inkubace pro různé náročné organismy dle doporučení EUCAST 2 Organismus Podmínky inkubace Streptokoky skupiny A, B, C a G 35 ± 1 C v atmosféře 4 6 % CO 2 ve vzduchu po dobu h Streptococcus pneumoniae 35 ± 1 C v atmosféře 4 6 % CO 2 ve vzduchu po dobu h Skupina viridujících streptokoků 35 ± 1 C v atmosféře 4 6 % CO 2 ve vzduchu po dobu h Haemophilus spp. 35 ± 1 C v atmosféře 4 6 % CO 2 ve vzduchu po dobu h Moraxella catarrhalis 35 ± 1 C v atmosféře 4 6 % CO 2 ve vzduchu po dobu h Listeria monocytogenes 35 ± 1 C v atmosféře 4 6 % CO 2 ve vzduchu po dobu h Pasteurella multocida 35 ± 1 C v atmosféře 4 6 % CO 2 ve vzduchu po dobu h Corynebacterium spp. 35 ± 1 C v atmosféře 4 6 % CO 2 ve vzduchu po dobu h. Izoláty s nedostatečným růstem po hodinách se ihned znovu inkubují a zóny inhibice se odečítají po uplynutí celkem hodin inkubace Campylobacter jejuni a coli 41 ± 1 C v mikroaerobním prostředí po dobu 24 h. Některé izoláty C. coli nemusí po uplynutí 24 hodin vykazovat dostatečný růst. Tyto izoláty se ihned znovu inkubují a zóny inhibice se odečítají po uplynutí celkem hodin inkubace PA Strana 3 z 8

4 Odečítání výsledků 1. Po inkubaci by měl být vidět slévající se růst. Rostou-li pouze izolované kolonie, nátěr byl příliš slabý a test je nutno opakovat. 2. Sejměte víčko misky, držte misku ve vzdálenosti asi 30 cm od očí a pomocí posuvného měřítka nebo pravítka změřte průměr zón úplné inhibice (při posouzení prostým okem) včetně průměru terčíku na nejbližší celý milimetr. 3. Za hraniční bod je nutno považovat oblast, která při zjištění prostým okem nevykazuje zjevný viditelný růst. Slabého růstu drobných kolonií, které lze zjistit jen s obtížemi u okraje zjevné zóny inhibice, si nevšímejte. 4. V případě výskytu dvojitých zón se vždy měří vnitřní zóna, není-li výslovně uvedeno jinak. 2,4,9,11 5. U hemolytických streptokoků odečítejte inhibici růstu a nikoli inhibici hemolýzy. β-hemolýza obvykle nevykazuje růst, zatímco α-hemolýza se obvykle objevuje souběžně s růstem. Interpretace výsledků Průměry zón interpretujte podle tabulek hraničních hodnot. 2 Výsledky jednotlivých organismů lze poté vykazovat jako rezistentní, nebo citlivé. Další informace o specifických vlastnostech růstu, interpretaci a další pokyny naleznete na webové stránce SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚČINNOSTI A OMEZENÍ POSTUPU BD Mueller Hinton Fastidious Agar byl navržen k testování antimikrobiální citlivosti náročných organismů dle doporučení komise EUCAST. 1 Tabulky hraničních hodnot pro interpretaci citlivosti se aktualizují každý rok; 4 pro správnou interpretaci získaných výsledků je nutné použít jejich nejaktuálnější verzi. Výsledky účinnosti Vnitřní hodnocení účinnosti Účinnost agaru BD Mueller Hinton Fastidious Agar byla interně ověřena pomocí doporučených kmenů pro kontrolu kvality (QC) 9 (viz tabulka 3) a 151 dalších dříve charakterizovaných kmenů (viz tabulka 4), včetně rodů Corynebacterium spp., skupiny viridujících streptokoků, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, streptokoků skupiny A, B, C a G, Haemophilus ssp. a Streptococcus pneumoniae. V tabulce 3 jsou shrnuty ověřené antimikrobiální látky pro kmeny pro kontrolu kvality. Není-li uvedeno jinak, stanovené velikosti zón inhibice pro ověřené antimikrobiální látky odpovídaly rozsahu průměrů zón inhibice dle doporučení EUCAST. 9 U kmene H. influenzae ATCC byla velikost zóny inhibice u amoxicilinu-kyseliny klavulanové mimo rozmezí doporučené komisí EUCAST. 9 U kmene S. pneumoniae ATCC byla velikost zóny inhibice u cefepimu, cefpodoximu a cefuroximu mimo rozmezí doporučená komisí EUCAST. 9 Testování antimikrobiální citlivosti u 151 dalších charakterizovaných náročných bakterií (viz tabulka 4) vykazovala uspokojivý růst po uplynutí doporučeného času inkubace, což umožňovalo dostatečné odečtení zón inhibice a stanovení příslušné antimikrobiální rezistence podle hraničních hodnot EUCAST. 4 PA Strana 4 z 8

5 Tabulka 3: Ověřené antimikrobiální látky a kmeny pro kontrolu kvality. Není-li uvedeno jinak, průměry zón inhibice odpovídaly příslušným rozmezím dle doporučení EUCAST. 9 Uvedeny jsou odchylné zóny inhibice Antimikrobiální látka Obsah terčíku (µg) H. influenzae ATCC S. pneumoniae ATCC Ampicilin 2 Amoxicilinkyselina klavulanová mm 1 Benzylpenicilin 1 jednotka Cefaklor 30 Cefepim mm 1 Cefixim 5 Cefotaxim 5 Cefpodoxim mm 1 Ceftarolin Ceftibuten 30 Ceftriaxon 30 Cefuroxim mm 1 Chloramfenikol 30 C. jejuni ATCC Ciprofloxacin 5 Klindamycin 2 Doripenem 10 Ertapenem 10 Erytromycin 15 Imipenem 10 Levofloxacin 5 Linezolid 10 Meropenem 10 Minocyklin 30 Moxifloxacin 5 Kyselina nalidixová 30 Nitrofurantoin 100 Norfloxacin 10 Ofloxacin 5 Oxacillin 1 Rifampicin 5 Teikoplanin 30 Telitromycin 15 Tetracyklin 30 Tigecyklin 15 Trimetoprim sulfametoxazol 1,25 23,75 Vankomycin 5 Označuje zóny inhibice odpovídající rozsahu dle doporučení EUCAST. 9 1 Průměrné rozsahy zón inhibice jsou mimo doporučená rozmezí pro kontrolu kvality dle EUCAST. Pro porovnání nahlédněte do nejaktuálnějších doporučení EUCAST pro kontrolu kvality. 9 *H. influenzae NCTC 8468 byl v roce 2016 vyloučen z Tabulek pro kontrolu kvality kvůli svým neobvyklým růstovým charakteristikám. Místo něj se pro rutinní kontrolu kvality doporučuje kmen H. influenzae ATCC PA Strana 5 z 8

6 Tabulka 4: Přehled schválených náročných organismů a antimikrobiálních látek Celkový počet kmenů: 151 Antimikrobiální látka Obsah terčíku (µg) H. influenzae H. parainfluenzae H. aprophilus S. pneumoniae Streptokoky skupiny A, B, C, G Viridující streptokoky M. catarrhalis L. monocytogenes C. pseudodiphtheriticum C. striatum C. jeikeium C. amycolatum C. xerosis C. urealytikum C. afermentans C. jejuni C. coli P. multocida Ampicilin 2 Amoxicilinkyselina klavulanová 2-1 Benzylpenicilin 1 jednotka Cefaklor 30 Cefazolin 30 Cefepim 30 Cefixim 5 Cefotaxim 5 Cefpodoxim 10 Ceftarolin 5 Ceftibuten 30 Ceftriaxon 30 Cefuroxim 30 Chloramfenikol 30 Ciprofloxacin 5 Klindamycin 2 Doripenem 10 Ertapenem 10 Erytromycin 15 Gentamicin 10 Imipenem 10 Levofloxacin 5 Linezolid 10 Meropenem 10 Minocyklin 30 Moxifloxacin 5 Kyselina nalidixová 30 Nitrofurantoin 100 Norfloxacin 10 Ofloxacin 5 Oxacillin 1 Rifampicin 5 Teikoplanin 30 Telitromycin 15 Tetracyklin 30 Tigecyklin 15 Trimethoprim 5 Trimetoprim 1,25 sulfametoxazol 23,75 Vankomycin 5 PA Strana 6 z 8

7 Externí hodnocení účinnosti V rámci externího hodnocení účinnosti bylo na agaru BD Mueller Hinton Fastidious Agar testováno celkem 169 (charakterizovaných) klinických izolátů. Souběžné porovnání výsledků antimikrobiální citlivosti získaných pomocí jiného dostupného média s agarem Mueller- Hintonové pro náročné organismy vykazovalo míru shody 99,8 % ve stanovených kategoriích rezistence (S citlivý, R rezistentní nebo I středně citlivý). Médium BD MH-F podporovalo uspokojivý růst všech testovaných organismů při dodržení doporučené doby inkubace. Tabulka 5: Testované klinické izoláty na agaru BD Mueller Hinton Fastidous Agar (MH-F) v rámci externího hodnocení účinnosti Testované Kmen/izolát Č. kmene antimikrobiální látky Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Campylobacter jejuni 31 3 Streptokoky skupiny A, B, C a G 10 9 Skupina viridujících streptokoků Moraxella catarrhalis 11 9 Pasteurella multocida 4 9 Pasteurella canis 1 9 Listeria monocytogenes 10 5 Campylobacter coli 10 3 Corynebacterium ssp Haemophilus ssp Celkový počet kmenů 169 Omezení postupu Difúzní terčíkové testy citlivosti jsou navrženy pouze k použití s čistými kulturami. Před přípravou testu antimikrobiální citlivosti se doporučuje provést Gramovo barvení a předběžnou identifikaci izolátu. U některých kombinací organismů a antibakteriálních látek nemusí mít zóna inhibice ostře ohraničený okraj (neostré okraje zóny byly pozorovány u S. pneumoniae), což může vést k nesprávné interpretaci. Podrobné informace naleznete v návodu pro odečítání EUCAST. 11 Bylo zjištěno, že difúzní terčíkové testy na citlivosti ovlivňují různé faktory. Mezi tyto faktory patří médium, hloubka agaru, kapacita terčíku, koncentrace inokula, stáří inokula a ph. 12 Nesprávná koncentrace nátěru může vést k nesprávným výsledkům. Je-li nátěr příliš silný, mohou být zóny inhibice příliš malé, a je-li nátěr příliš slabý, mohou být tyto zóny příliš velké a těžko měřitelné. Proto důrazně doporučujeme dodržovat pokyny EUCAST pro manipulaci s inokulem a naočkovanými miskami, čímž minimalizujete riziko nesprávných výsledků z důvodu nevhodné manipulace. 1 Nevhodné uskladnění antibakteriálních terčíků může způsobit ztrátu účinnosti a zdánlivě rezistentní výsledek. Nadměrné svraštění tohoto média následkem nesprávného skladování může vést k ke zdánlivě citlivému výsledku. Citlivost organismu na určitou antibakteriální látku in vitro nemusí nutně znamenat, že tato látka bude účinná také in vivo. Pokyny k interpretaci výsledků naleznete v příslušných referenčních odkazech. 12,13 PA Strana 7 z 8

8 ODKAZY 1. Matuschek, E., Brown, D.F. and Kahlmeter, G. Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laboratories. Clin Microbiol Infect. 2014; 20(4): EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing. Nejnovější verzi najdete na stránce 3. Bauer, A.W., Kirby, W.M.M, Sherris, J.C., and Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 1966: 45: The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 6.0, Koch, A.E. and Burchall, J.J. Reversal of the antimicrobial activity of trimethoprim by thymidine in commercially prepared media. Appl. Microbiol. 1971; 22: Ferone, R., Bushby, S.R.M., Burchall, J.J., Moore, W.D., and Smith, D. Identification of Harper-Cawston factor as thymidine phosphorylase and removal from media of substances interfering with susceptibility testing to sulfonamides and diaminopyrimidines. Antimicrob. Agents Chemother. 1975; 7: Reller, L.G., Schoenknecht, F.D., Kenny, M.A., and Sherris, J.C. Antibiotic susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa: selection of a control strain and criteria for magnesium and calcium content in media. J. Infect. Dis. 1974: 130: D'Amato, R.F., and Thornsberry, C. Calcium and magnesium in Mueller-Hinton agar and their influence on disk diffusion susceptibility results. Current Microbiol. 1979: 2: The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Routine and extended internal quality control for MIC determination and disk diffusion as recommended by EUCAST. Version 6.0, Baker, C.N., Thornsberry, C. and Hawkinson R.W. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 1983: 17: The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Reading guide. EUCAST disk diffusion method for antimicrobial susceptibility testing. Nejnovější verzi najdete na stránce Washington, J.A., and Woods G.L Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods. p In Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C., and Yolken, R.H. (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C Neumann, M.A., Sahm, D.F., Thornsberry, C., McGowan, J.E., Jr. Cumitech 6A, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing: a practical guide. Coordinating ed., J.E. McGowan, Jr. American Society of Microbiology, Washington, D.C BALENÍ/DOSTUPNOST BD Mueller Hinton Fastidious Agar Kat. č. Popis REF Médium na miskách k okamžitému použití, 20 kusů v balení DALŠÍ INFORMACE Další informace vám poskytne místní zástupce společnosti BD. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse Heidelberg/Germany Phone: Fax: Reception_Germany@europe.bd.com ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BBL, BD, BD logo, Difco and Stacker are trademarks of Becton, Dickinson and Company 2016 Becton, Dickinson and Company PA Strana 8 z 8