Polymerázová řetězová reakce

Transkript

1 Polymerázová řetězová reakce PCR (Polymerase( Chain Reaction) 1

2 Princip PCR Zavedení PCR v roce 1983 (Kary Mullis) Publikace Nobelova cena Metoda pro mnohonásobn sobné zmnožen ení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založen ená na principu replikace. K opakující se enzymové syntéze komplementárn rních řetězců vybraných úseků dvouřet etězcové DNA dochází po připojenp ipojení dvou primerů vázajících ch se na protilehlé řetězce DNA tak, že e jejich 3'-OH OH-konce směř ěřují proti sobě. PCR umožň žňuje získat z skat požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování. 2

3 PCR využívá základních rysů replikace (enzymatické syntézy) DNA: Jako templát slouží ssdna,, podle nížn je syntetizován komplementárn rní řetězec. K zahájen jení reakce je zapotřeb ebí primer, který se připojuje na komplementárn rní úseky DNA. Tím T m je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. Jako templáty ty pro syntézu mohou sloužit oba řetězce dsdna, po předchozp edchozí denaturaci. Primery se vybíraj rají tak, aby se připojovaly p k místm stům ohraničuj ujícím m z obou stran amplifikovaný úsek. Teoreticky lze získat z 2 n řetězců (kopií). Předpoklady pro zavedení PCR Syntéza oligonukleotidů Vlastní myšlenka (K. Mullis) Teplotně stabilní DNA polymeráza Automatické termocyklery 3

4 Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzymů 4

5 Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym Reakční směs s obsahuje: Templátovou nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA). Množstv ství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízkn zké: : obvykle postačuje méněm než 1 μg g genomové DNA, teoreticky postačuje jedna molekula. Kvalita templátu tu ovlivňuje výsledek PCR. Velké množstv ství RNA můžm ůže e vázat v ionty Mg2+ znečištěný ný templát může e obsahovat inhibitory PCR Zdroj: mikroorganizmy, buňky z tkáňových kultur, tělnt lní tekutiny, bioptické vzorky, stěry, vlasy, atd Primery. Chemicky syntetické ologonukleotidy o velikost nukleotidů. dntp ve formě Na + nebo Li + solí Mg ionty tvoří rozpustný komplex s dntp a vytvářej ejí substrát, t, který rozpoznává DNA polymeráza za. Termostabilní DNA polymerázu, která odolává teplotám m aža 98 C. Taq Thermus aquaticus Tth Thermus thermophilus Tma Thermotoga maritima Pfu Pyrococcus furiosus Pwo Pyrococcus woesei 5

6 Syntéza obou řetězců u specifické sekvence TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC 5 3 TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3 Přímý primer dntps TTGAGAAAGGAATAAGC DNA POL AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG DNA POL TCTTTAGCTCATATACG 3 5 dntps Zpětný primer 5 3 TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3 6 5

7 REAKČNÍ PODMÍNKY PCR 1. Počáte teční denaturace DNA. DůleD ležitá je kompletní denaturace templátu, tu, obvykle postačuje zahřátí směsi si na 2 5 min / 95 C. V případp padě, že e dojde pouze k částečné denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují a to vede k nespecifické vazbě primerů ( self-priming )) a možným falešným výsledkům. Vlastní řetězová reakce: 2. Denaturační krok (separace řetězců) ) : C C / s, zález leží na objemu reakce, tloušťce stěn n zkumavek. Nedostatečně denaturovaná DNA neumožň žňuje přístup p primerům,, naopak přílip liš dlouhá denaturace snižuje aktivitu DNA polymerázy (stabilní cca 2 hod / 98 C). 3. Připojení primerů (55-65 C C / s) teplota určuje uje specifičnost a závisí na Tm primeru a templátu. tu. Pro oba primery by měla m být Tm podobná.. Ta se optimalizuje v teplotním m gradientu nebo se stanovuje empiricky. 4. Prodlužov ování primeru (polymerační reakce) při p i standardní PCR probíhá při i 72 C C /15 90 s. Taq DNA polymeráza syntetizuje DNA při p i této t to teplotě rychlostí cca 60 bází/s. b Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty ty pro další cyklus. Cyklické střídání teplot jednou založen ené směsi si zajišťuje průběh h reakce PCR, provádí se v termocyklerech,, většinou v se provádí cyklů. 5. Závěrečná extenze se provádí obvykle po posledním m cyklu (72 C C / 5 min) a slouží k dokončen ení syntézy a renaturaci jednořet etězcových produktů. 30 7

8 REAKČNÍ PODMÍNKY PCR Denaturace vzorku DNA Pro oddělení jednořetězců (94 C, 5 min) Připojení primerů na řetězce DNA (30-65 C, 1 min) Denaturace pro separaci řetězců DNA (94 C, 30 s) Syntéza nových řetězců DNA polymerázou (72 C, 45s - 2 min) Pcr.exe 8

9 Schéma PCR 9

10 Počet nově syntetizovaných molekul dsdna při jednotlivých cyklech PCR 2 n Počet nových Cyklus číslo dvouřetězcových molekul

11 KONCENTRACE JEDNOTLIVÝCH SLOŽEK PŘI STANDARNÍ PCR REAKCI DNA. Pro standardní PCR se doporučuje uje následujn sledující množstv ství DNA podle velikosti templátu: tu: lidská genomová DNA: ng bakteriáln lní DNA: 1 10 ng plazmidová DNA: 0,1 1 ng Primery. Sekvence a koncentrace primeru významně ovlivňuje výsledek PCR. Optimáln lní koncentrace je mezi 0,1 a 0,6 µm. U některých n systémů může e vyšší koncentrace (až 1 µm) zlepšit výsledky. Nižší koncentrace vede k předp edčasnému vyčerp erpání primerů a snížen ení výtěž ěžku. dntp. Výsledná koncentrace se můžm ůže e pohybovat v rozmezí µm (pro každý nukleotid) Nejběž ěžnější koncentrace dntp je 200 µm. Při P i zvýšen ení koncentrace dntp je třeba t zvýšit koncentraci Mg 2+ iontů. 11

12 MgCl 2. Volné Mg2+ ionty ovlivňuj ují aktivitu enzymu a zvyšuj ují hodnotu T m u dsdna. Pro dosažen ení nejlepší šího výsledku vždy v stanovujeme koncentraci Mg 2+ experimentáln lně. Optimáln lní koncentrace můžm ůže e kolísat od 1 mm do 5 mm. Nejčasteji používan vaná koncentrace je 1,5 mm (pro 200 µm M dntp). 12

13 DNA polymeráza za. Obvyklá koncentrace je 0,5 2,5 jednotek / 50 µl. ph je dané reakčním m pufrem, obvykle odpovídá ph 8,3 9,0. Přídatné látky mohou v některých n případech p padech ovlivnit účinnost a specifičnost PCR reakce. Jejich vliv se obvykle určuje uje experimentáln lně: albumin z bovinního séra s (BSA) (100 ng/50 µl) dimetylsulfoxid (DMSO) (2-10 % v/v) redukce nespecifické vazby primeru detergenty (Triton X-100, X Tween 20) betain (0,5 2 M) želatina glycerol (1 5 % v/v) spermidin protein 32 genu fága f T4 optimalizace PCR přídatnými látkami: Mineráln lní olej zabraňuje vypařov ování během reakce 13

14 Struktura Taq DNA polymerázy 14

15 BEZCHYBNOST SYNTÉZY Replikace s Taq DNA-polymer polymerázou neprobíhá bezchybně,, DNA- polymeráza příležitostně zařazuje azuje do nově syntetizovaných řetězců chybné (nekomplementárn rní) ) nukleotidy. Buňka mám schopnost tyto báze b odstraňovat ovat opravnými mechanizmy. In vitro Taq DNA-polymer polymeráze tato vlastnost chybí. Frekvence chbného ho začle leňování za podmínek amplifikace in vitro je asi Chybné začle leňování je důled ležité,, pokud jsou PCR produkty klonovány, ny, neboť každý klon je odvozen z jedné molekuly DNA. Chybně začlen leněné báze (mutace) potom obsahuje celé potomstvo. Řešení problému: použit ití dvojice DNA polymeráz, z nichž jedna mám opravné mechanizmy (proofreading( proofreading). 15

16 Základní optimalizace PCR Složka Teplota pro připojenp ipojení primeru MgCl 2 KCl Enzym,, Primer Formamid Nižší stringence Vyšší stringence Zpravidla se optimalizuje Teplota pro připojenp ipojení primeru v termocykleru s teplotním gradientem Koncentrace MgCl 2 16

17 Stanovení teploty pro připojení primeru Teplota pro připojenp ipojení primeru (annealing( temperature) ) zkr. T a. Teplota používan vaná pro teplotní hybridizaci molekul primeru a matricové DNA in vitro. Optimáln lní teplota pro připojenp ipojení primeru při p i PCR se vypočítá podle vztahu: T a Primer = 0,3 Tm + 0,7 Tm Produkt 25 kde T Primer m je hodnota T m nejméně stabilního páru p primer- matrice a T Produkt m je hodnota T m amplifikačního produktu. Orientačně lze vypočítat T a podle vztahu: T a = 2(A+T) + 4(G+C) 5 C C = T m 5 C 17

18 Hodnota Tm T m závisí na třech t základních faktorech: Zastoupení bází Složen ení roztoku Koncentrace solí ph Délka molekuly DNA 18

19 NÁVRH PRIMERŮ PRO STANDARDNÍ PCR bázíb dlouhé neobsahují vnitřní sekundárn rní struktury obsahují % G+C mají rovnoměrnou rnou distribuci oblastí bohatých na G/C a A/T páryp nejsou komplementárn rní navzájem na 3 -konc3 koncích, ch, takže nevytvářej ejí navzájem nebo samy se sebou duplexy na matricové DNA nemají falešná vazebná místa mají T m teplotu C 19

20 Pro návrh primerů se obvykle používá specializovaný software (některý je volně dostupný na internetu). 20

21 PŘÍKLADY STRUKTUR VYTVÁŘENÝCH PRIMERY, KTERÉ JE NUTNÉ ZOHLEDNIT PŘI JEJICH NÁVRHU Chybně navržen ená dvojice primerů,, která vytváří stabilní duplex na 3 -konci: 3 Správn vně navržen ená dvojice primerů,, která vytváří pouze málo stabilní duplex na 5 -konci; 5 na 3 -konci 3 je G nebo C zaručuj ující stabilní párování s templátem: tem: Chybně navržený primer, vytvářej ející vlásenku: 21

22 Nesprávn vně navržený primer s falešnými vazebnými místy m na templátov tové DNA: Správn vně navržený primer, který nemá falešná vazebná místa na templátu: tu: 22

23 HOT START PCR Hot-start PCR významně ovlivňuje specifičnost, citlivost a výtěž ěžek reakce Princip: Při hot-start PCR jsou určit ité složky reakční směsi si odděleny od ostatních, dokud teplota ve zkumavce nepřekro ekročí optimáln lní teplotu pro připojenp ipojení primeru (obvykle C). DNA polymeráza je v této t to nekompletní reakční směsi si nefunkční. Nedochází k prodlužov ování nespecificky navázaných primerů během doby než je dosažena teplota T a. 23

24 Separace důled ležitých složek reakční směsi si je dosažena některým z následujn sledujících ch způsob sobů: Manuáln lně Některé složky jako DNA polymeráza nebo Mg 2+ jsou vynechány ny v původnp vodní reakční směsi si a přidp idány manuáln lně po dosažen ení teploty > 70 C. Nevýhodou je možnost kontaminace a možná ztráta ta reprodukovatelnosti. Fyzikáln lní separace Reakční komponenty jsou rozděleny do dvou směsí,, které jsou odděleny bariérou rou (vosková přepážka, nebo voskové korálky obsahující MgCl 2 ). Během počáte teční denaturace vosk roztaje a umožní smích chání reakčních složek. Protilátky tky proti DNA polymeráze Přídavek teplotně nestabilních protilátek tek umožní počáte teční inaktivaci polymerázy. Chemická modifikace polymerázy Přídavek teplotně nestabilních látek, l které se vážou v na určit ité aminokyselinové zbytky blokují enzym (ten je potom při p i pokojové teplotě inaktivní). K aktivaci enzymu dochází při i počáte teční denaturaci ( FastStart( Taq DNA polymeráza za ). Další inhibitory např.. oligonukleotidy specificky se vázajv zající na polymerázu 24

25 DETEKCE AMPLIFIKOVANÉHO PRODUKTU PCR 1. Stanovení fyzikáln lní velikosti produktu gelovou elektroforézou (agar( agaróza, polyakrylamid). Detekce obarvením m a pozorování pod UV světlem. 2. Štěpení produktu restrikčními enzymy a posouzení spektra vznikajících ch restrikčních fragmentů (PCR-RFLP) RFLP) 3. Elektroforetická separace produktů za specifických podmínek pro detekci sekvenčních polymorfizmů DGGE denaturační gradientová gelová elektroforéza SSCP analýza polymorfizmu konformace jednořet etězcových forem Příklad standardní gelové elektroforézy s produkty PCR v agarózovém gelu. 1 = hmotnostní st. 2-4 = produkty PCR 25

26 DETEKCE AMPLIFIKOVANÉHO PRODUKTU PCR 4. hybridizací s neradioaktivně značenou sondou komplementárn rní k části sekvence amplifikovaného úseku a detekcí enzymoimunoanalýzou v mikrotitrační destičce (PCR-EIA/ELISA), hybridizační sonda můžm ůže e být následně amplifikována (PCR-OLA) 5. imobilizací PCR-produkt produktů na membráně a tečkovou hybridizací se značenými alelově- specifickými oligonukleotidy (ASO) nebo zpětnou tečkovou hybridizací s různými ASO imobilizovanými na membráně, 6. hybridizací na DNA-čipech, 7. stanovením m sekvence DNA. 26

27 Kontaminace při PCR Vynikající citlivost PCR můžm ůže e být ovlivněna na kontaminací i jedinou molekulou exogenní nebo neznámé DNA. Pro minimalizaci falešných pozitivních výsledků je doporučeno: používání autoklávovaných roztoků fyzikáln lní separace používaných PCR-reagenci reagencií od templátov tové DNA a PCR-produkt produktů příprava prava reagencií i vzorků do alikvotních částí používání UV-sv světla k odstranění exogenních nukleových kyselin na pracovní ploše používání jednorázových rukavic přidávání DNA do reakce jako poslední pečliv livá volba pozitivních, negativních a vnitřních kontrol Vyloučen ení kontaminace je důled ležité zejména tam, kde je potřeba použít vysokého počtu amplifikačních cyklů,, aby bylo dosaženo požadovan adovaného produktu nízkokopiových templátů DNA degradovaných vzorků. V případě pochybností je nejlepší ším m přístupem p opakování experimentu s úzkostlivou pozorností k detailům m a kontrolám. Jako zdroj kontaminace DNA je nejčast astěji uváděn: přenos kontaminující DNA z dříve amplifikovaných produktů PCR, vzájemn jemná kontaminace zdrojových materiálů, kontaminace plazmidem z rekombinantního klonu, který obsahuje cílovou sekvenci. 27

28 Jako prevence před přenosem kontaminující DNA je v reakční směsi rutinně používána náhrada dttp za dutp. Následným působením uracil-n-glykosylázy na reakční směs před zahájením amplifikace. 28

29 Alternativně lze amplifikační produkty PCR inaktivovat fotochemicky pomocí derivátů psoralenu nebo isopsoralenu, Furokumarinové sloučeniny interkalující se mezi páry p bázíb DNA. Pokud jsou tyto látky l excitovány UV-sv světlem o vlnové délce nm, kovalentně se vážou v na nukleové kyseliny a tvoří cyklobutanové adukty s pyrimidinovými bázemi, které blokují reakci s DNA-polymer polymerázou O O O 5' DNA R O O O O O R 3 4 4' OH hν O O OH 29

30 ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PŘI STANDARDNÍ PCR Problém Nevzniká produkt Možná příčina Doporučen ení Nevyvážen ená reakce Kontrola koncentrace jednotlivých složek Teplotní podmínky Kontrola nastavení cyklů Nízká koncentrace templátu tu Koncentrace primeru nebo jeho sekvence Zvýšit koncentraci templátov tové DNA Optimalizovat koncentraci primeru Navrhnout primer s novou sekvencí Ruzné faktory Testovat reakci s pozitivní kontrolou a funkčními primery Začít t s novými roztoky, H 2 O a enzymem Nízká kvalita templátu tu (degradovaný, kontaminovaný, obsahující inhibitiry) Použít t primery, které amplifikují kratší úseky Přidat pomocné látky (DMSO) Optimalizovat koncentraci Mg 2+ Připravit nový templát Zamezit častému zmrazování a rozmrazování templátu tu 30

31 ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PŘI STANDARDNÍ PCR Problém Nevzniká produkt Produkt není čistý Vznikají četné nespecifické produkty Možná příčina Nízká účinnost polymerázy Vzniká sekundárn rní amplifikační produkt Nespecifická vazba primeru Doporučen ení Používat pozitivní kontrolu Zvýšit počet cyklů Zvýšit koncentraci enzymu Použít t jinou polymerázu Kontrola koncentrace složek reakce Optimalizovat koncentraci Mg 2+ Optimalizovat koncentraci primerů Snížit počet cyklů Snížit koncentraci templátu tu Použít t vyšší teplotu T a Optimalizovat koncentraci primerů Použít hot start Narhnout nové primery 31

32 VYUŽITÍ METODY PCR 1. Základní výzkum izolace genů nebo jejich částí sekvencování DNA mutageneza in vitro modifkace konců DNA analýza (selekce) klonů z genových knihoven příprava prava značených sond 2. Aplikovaný genetický výzkum prenatáln lní diagnostika (dědi dičných chorob) detekce mutací v genech studium polymorfizmu genů (např.. RAPD) populační genetika 3. Využit ití v klinických disciplinách ch detekce patogenních mikroorganismů (baktéri rií,, virů, prvoků,, hub) identifikace onkogenů typizace nádorn dorů stanovení pohlaví 4. Využit ití v praxi archeologie soudnictví kriminalistika 32

33 PCR amplifikace se používá k detekci bakteriálních a virových infekcí Konvenční diagnostické metody jsou založeny na schopnosti vypěstovat organismy v kultuře e nebo detekovat jejich přítomnost p v pacientu za použit ití protilátek. tek. vyžaduje několik n týdnů (mykobakterie) někdy metoda málo m citlivá (protilátky) tky) Zvláš áštní význam mám PCR při p i diagnostice virů,, např.. HIV. Cílem je detegovat infikované buňky na pozadí mnohonásobn sobně početn etnějších neinfikovaných buněk. Detekce odhalí HIV inkorporované v buňkách. Přítomnost P virové RNA naznačuje aktivní infekci, a to lze prokázat provedením m PCR za použit ití cdna jako templátů vytvořených pomocí RT z RNA infikovaných buněk. U tuberkulózy je pomocí PCR prokazován n některý n z vysoce konzervativních genů (sekvencí) mykobakterií pomocí primerů připravených k těmto t sekvencím. Amplifikovaný fragment je pak hybridizován n se sondami vysoce specifickými pro daný kmen (druh). Tímto postupem je možno detekovat i jen 10 bacilů v 10 6 eukaryotických buněk. 33

34 PCR je používána k monitorování terapie rakoviny Některé formy rako- viny vznikají jako výsledek chromozo- mových translokací týkajících ch se známých genů.. Např.. existuje translokace mezi chromozomy 14 a 18 u folikulárn rního lymfomu. Techniky PCR jsou schopny detekovat jedinou buňku z 10 6 normáln lních buněk, tedy daleko citlivěji než hybridizační metody. Dva PCR primery se vyberou ze sekvencí sousedících ch s místy m zlomu na každém m chromozomu. Pak pouze v buňkách, kde proběhla translokace, dojde k amplifikaci a vznikne fragment konstatní délky. Podobná strategie byla použita k detekci leukemií za použit ití mrna jako výchozího materiálu. To mám výhodu v tom, že e mrna představuje p již amplifikační produkt daného genu genomové DNA. 34

35 PCR je používána ke stanovení pohlaví u prenatálních buněk Širokou oblastí využit ití PCR je prenatáln lní diagnostika obecně. Pro choroby děděnéd na X-chromozomum X které postihují pouze samce, je stanovení pohlaví prvním m krokem. To je možné proto, že e samci nesou pouze jeden X a jeden Y chromozom, obsahující jedinečné sekvence. Při i oplození in vitro se odebere jedna buňka z rané zygoty pomocí mikromanipulátoru toru, vyizoluje se DNA a ta se popdorbí amplifikaci pomocí specifických primerů. Prokáže e se amplifikační fragment. Výsledku se pak využívá v genetickém m poradenství při výběru samičích embryí pro implantaci. 35

36 Analýza genové vazby s využitím jednotlivých spermií a) Polohy lokusu genu pro paratyroidní hormon (PTH) a lokusu Gg- globinového genu (HBG2) se nacházej zejí na krátk tkém m rameni lidského chromozomu 11. b) Jednotlivé spermie se přenesou p do zkumavek, amplifikace obou lokusů proběhne současn asně za použit ití dvou sad primerů c) Reakční produkty se nanesou na nitrocelulózový filtr a jsou testovány probami specifickými pro každou ze čtyř možných alel, A a a pro PTH a B a b pro HBG2. Výsledek hybridizace je vizualizována autoradiograficky. d) Z autoradiogramu lze odečíst haplotypy každé ze spermií,, z nich pak vypočítat frekvenci rekombinace mezi oběma lokusy a stanovit genetickou vzdálenost mezi nimi. FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) 36

37 Kvantitativní PCR (qpcr) Polymerázov zová řetězová reakce sledovaná v reáln lném čase (real- time PCR, online PCR, kinetic PCR, quantitative PCR, zkr. Q-Q PCR). Varianta PCR umožň žňující přímou kvantifikaci PCR- produktu v reáln lném čase provádí se prostřednictv ednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciáln lním m přístrojovp strojovém zařízen zení,, které umožň žňuje cyklické střídání teplot detekci fluorescence monitorování postupu PCR v reáln lném čase bez nutnosti detekovat PCR-produkty elektroforeticky 37

38 Metody kvantitativní detekce produktu Pro kvantitativní detekci produktu v průběhu qpcr existují následující metody: Na DNA se vázajv zající interkalační barviva SYBR green I Na menší žlábek dsdna se vázajv zající barviva BEBO Technologie využívaj vající fluorescenční výměny dvakrát t fluorescenčně značen ené sondy vázajv zající se na středn ední část amplifikovaného produktu TaqMan Molekulárn rní majáky QZyme jedenkrát t fluorescenčně značen ené sondy nebo primery FRET LUX PNA dvakrát t fluorescenčně značen ené primery AmpliFluor Scorpions 38

39 Na DNA se vázající interkalační barviva Pro kvantifikaci amplikonů se běžne používaj vají fluorescenční kyaninová barviva SYBR Green,, která fluoreskují po vazbě na dsdna. Fluorescence SYBR green I je po vazbě na DNA aža 1000 vyšší Fluorescenční signál l se zvyšuje se vzrůstaj stajícím m množstv stvím m PCR- produktu. Signál l se měřm ěří na konci elongace nebo kontinuáln lně. Na DNA se vázajv zající barviva nemohou být použita u mnohonásobných reakcí Hlavním m omezením m je nemožnost nost odlišen ení nespecifických produktů. Nespecifické signály tvořen ené dimery primerů mohou být zháš ášeny při p použit ití primerů značených specifickými fluorofory. 39

40 Fluorescenční výměny při qpcr Pro značen ení primerů a hybridizačních sond se používaj vají specifické molekuly fluoroforů emitují světlo určit ité vlnové délky po předchozp edchozí absorpci světla odlišné vlnové délky emitovaná vlnová délka světla je vždy v vyšší než absorbovaná Dvojitě fluorescenčně značen ené sondy obsahují kromě fluoroforu také zháš ášeč molekula, která přijímá energii z fluoroforu ve formě světla a způsobuje její rozptýlení ve formě světla s vyšší vlnovou délkou d ve formě tepla k dosažen ení optimáln lního zháš ášení je třeba, t aby se absorbční spektrum zháš ášeče překrývalo s emisním m spektrem fluoroforu. V současn asné době existuje mnoho fluroforů určených pro jednobarevné nebo vícebarevnv cebarevné mnohonásobn sobné detekce polymorfních sekvencí 40

41 Absorpční a emisní spektra fluoroforů 41

42 Jedna z nejčast astěji používaných dvojic fluoroforů při i metodách FRET donorový fluorofor FAM (6-karboxyfluorescein karboxyfluorescein) akceptorový fluorofor TAMRA (5-karboxytetrametylrhodamin karboxytetrametylrhodamin). HO O O FAM-dT HN O O N H H N O C O OH O N C 1' TAMRA-dT H 3 C H 3 C N CH 3 O N + CH 3 HN O O N H H N O C O O O N C 1' 42

43 TaqMan technologie Hybridizační metoda, kterou využívá kvantita- tivní PCR např.. pro detekci bodových mutací Oligonukleotid s fluores- cenční značkou a zháš ášečemem se vážev na vnitřní část amplifi- kované sekvence Pokud primer vytváří homoduplex (a), je rozložen 5 -exonukleázovou aktivitou DNA-polymer polymerázy a vznikne fluorescence TaqMan.exe 43

44 Molekulární majáky (Beacons ) Oligonukleotidové sondy detekující přítomnost nukleové kyseliny v homogenním m roztoku Obsahují vnitřně zháš ášený fluorofor, jehož fluorescence je obnovena po vazbě na cílovou c sekvenci Vytvářej ejí sekundárn rní strukturu vlásenky se smyčkou Smyčka mám komplementárn rní sekvenci k cílovc lové molekule Krátk tká stopka je tvořen ená obrácenou repeticí Stopka není homologická s cílovou c molekulou Udržuje v těsnt sné blízkosti na koncích ch připojený p fluorofor a zháš ášeč Hybridní forma s templátem je stabilnější něž volná forma 44

45 Použit ití Jeden z nejcitlivější ších chemizmů pro detekci SNP Monitorování kvantitativní PCR Detekce mrna v živých buňkách Výhody Vysoká specificita k cílové sekvenci Může být levný při screeningu jednoho cílového místa Možnost volby fluoroforu oru (i multiplex) Nevýhody Obtížný design Specifické pouze k jedinému cílovému místu Drahé při testování jednoho cíle v malém počtu experimentů Aplikace Detekce jednonukleotidových mutací v genech Detekce transgenních organizmů Detekce virů (HIV aj.) 45

46 Molekulární majáky R Excitace Emise R Q Q R Q Excitace 46

47 Příklad detekce ekce SNP s více v variantami sondy systém vyžaduje duplikáty sond Jednobarevné Vícebarevné A CGA C T A A T Cílové místo C G G T T C G A T G A A T G G G T G T C C T C C A C A A Q Cílová molekula Fluorofor Zhášeč Molekulární maják 47

48 MoBe.exe 48

49 Technologie BD QZyme 49

50 Technologie sond s přenosem energie fluorescenční rezonancí (FRET, Fluorescent Resonance Energy Transfer) FRET je excitovaný stav interakce dvou fluoroforů závislý na vzdálenosti, ve kterém m je emise energie z jednoho fluoroforu (donoru) na 3 -konci 3 první sondy spojená s excitací druhého ho (akceptoru) na 5 konci 5 druhé sondy Přenos energie mezi ligandy se můžm ůže e uskutečnit na vzdálenost Å (1-5 nukleotidů) Citlivost FRET (změny intenzity fluorescence) může e detekovat změny vzdálenost leností 1-2 Å 50

51 FRET sondy Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Přenos Excitace 470 nm Emise 640 nm 51

52 AmpliFluor TM Systém (univerzální primery) AmpliFluor je univerzáln lní detekční systém m umožň žňující amplifikaci a detekci v jedné reakční směsi si Metoda je založen ená na inkorporaci fluorecenčně značen eného primeru s vlásenkovou smyčkou Primer je navržen tak, že e fluorescenční signál l je tvořen pouze tehdy, když je porušena sekundárn rní struktura primeru během b jeho inkorporace do PCR produktu Nezačlen leněné primery vykazují extrémn mně nízkou fluorescenci Není potřeba purifikovat produkt pro kvantifikaci Ampli fluor primery jsou univerzáln lní,, pracují spolu s jinými PCR primery Využit ití Q-PCR - vysoká přesnost In situ PCR Detekce SNP Excitace Studium exprese (RT-PCR) fluoroforu Přenos energie z FAM Multiplex reakce 495 nm zhášená DAB Komerční kity rrna, bax, bcl-2, DAB fas (apoptóza), HPV-16, FAM PSA, β-aktin,, interferony, < 100Å Univerzální cílový interleukiny primer 52

53 AmpliFluor cykly PCR amplifikace s primerem 1 a alelově specifickým primerem 2 s přídatnou sekvencí (Z) na 5 -konci cyklů s univerzáln lním AmpliFluor primerem, který je komplementárn rní k sekvenci Z a s primerem 1 3. Během amplifikace druhý řetězec vytlačí strukturu AmpliFluor primeru a dojde k separaci fluoroforu a zháš ášeče,, což umožní emisi fluorescence 53

54 AmpliFluor sondy Emise Excitace 495 nm 3 Q R 5 R Q R Q R Q R Q R R 54

55 Technologie škorpiónů (Scorpions ) Škorpióny jsou bi-funk funkční molekuly obsahující PCR primer kovalentně vázaný k hybridizační sondě Molekula obsahuje na 5 -konci fluorofor, který interaguje se zháš ášečemem redukujícím fluorescenci Po proběhnut hnutí PCR dojde k intramolekulárn rnímu přeskupení a fluorofor a zháš ášeč jsou separovány, což vede ke vzniku světeln telného signálu ve zkumavce 3 55

56 Scorpions Scorpions.exe 56

57 Využití škorpiónů Škorpióny jsou vylepšen ením TaqMan a molekulárn rních majáků Kombinují sondu a primer v jedné sekvenci Vysoce specifické Zháš ášená sonda vykazuje nízkn zké pozadí Sonda vidí prodloužen ení produktu jejího vlastního primeru konformační přeskupení uvnitř jedné molekuly Design sekvence je snazší než u molekulárn rních majáků Využit ití při i Q-PCR, Q genotypizaci a haplotypizaci 57

58 Technologie LUX (Light Upon extension) LUX využívá dva primery, znichž pouze jeden je značený Zháš ášení primeru je zajištěno sekundárn rní strukturou (vlásenkou) a přítomnostp tomností páru dg- dc nebo dc-dg dg na 3-3 konci Primery se snadno navrhují 3 -konec značen eného primeru detekuje SNP Možnost využít t různr zné fluorescenční značky 58

59 Modifikace PCR používané při analýze genomu 59

60 Amplifikace sekvencí klonovaných ve vektorech 60

61 Modifikace konců DNA, expression cassete PCR (EC-PCR) Připojení sekvencí prostřednictvím 5 -konců primerů 5 3 sticky foot Přidávané sekvence RE místam Promotory Terminátory Translační signály 61

62 Asymetrická PCR Podobně jako jiné DNA, lze produkty PCR sekvencovat. Templátem pro Sangerovu metodu jsou ssdna.. Pro jejich přípravu p pravu se používá se technika označovan ovaná jako asymetrická PCR, při p i nížn jsou tvořeny preferenčně ssdna. Standardní PCR se založí s tím t rozdílem, že e výchozí koncentrace primerů se liší faktorem 100 (tj. jeden z primerů je ve 100 x vyšší konectraci než druhý). Dvouřet etězcové DNA fragemnty se tvoří až do doby, než se jeden z primerů nevyčerp erpá. Druhý primer pak dále d syntetizuje pouze jeden z řetězců - i když se tento tvoří spíš íše e lineárn rní než exponenciáln lní rychlostí,, je jeho množstv ství postačuj ující pro sekvencování. Cycseqpc.exe 62

63 Obrácená PCR (I-PCR) PCR umožň žňující amplifikovat úseky DNA o neznámé sekvenci ohraničen ené na obou stranách DNA se známou sekvencí. 63

64 Využití adaptorů pro PCR amplifikaci neznámé sekvence 64

65 Zpětná (reverzní) PCR (RT-PCR) detekce sekvencí na RNA RNA nemůž ůže e sloužit jako templát pro PCR. Produkty RT-PCR se tvoří,, jestliže e je izolovaná RNA nejdříve převedena na cdna pomocí retrovirové zpětn tné transkriptázy M-MuLVMuLV = Moloney murine leukemia virus AMV = avian myeloblastosis virus a poté amplifikována pomocí PCR se dvěma specifickými primery. Nevýhody: Zpětn tná transkriptáza je termolabilní a obvykle nefunkční nad 42 C. Navíc c v některých n případech p padech znemožň žňuje převod p RNA na cdna, zejména při p i složit ité sekundárn rní struktuře e RNA. Současn asná technika: Termostabilní Tth DNA polymeráza z Thermus thermophilus je schopná převést RNA na DNA (RNA dependentní DNA polymerázov zová aktivita) za přítomnosti p Mn 2+ iontů při i 72 C. Pomocí stejného enzymu je poté prováděna PCR reakce. Použit ití: mrna virové genomy (např.. hepatitis C virus, virus chřipky, pikornaviry) 65

66 Princip RT-PCR 66

67 Návrh primerů pro RT-PCR RT-PCR amplifikace mrna vyžaduje dvojici specifických primerů. Primery můžm ůžeme navrhnout tak, abychom odlišili ili produkty vznikací při RT-PCR a při p i standardní PCR s genomovou DNA. Dva přístupy p pro návrh n primerů: Primery, které se připojujp ipojují k sekvenci 2 exonů na obou stranách určit itého intronu. Amplifikační produkt z genomové DNA je většív než produkt RT-PCR. Primery komplementárn rní k sekvenci na spojení exon/exon. Takové primery neamplifikují genomovou DNA. 67

68 Uspořádání RT-PCR reakce Jednokroková RT-PCR Tth DNA polymeráza dvojice primerů syntéza cdna za přítomnosti Mn 2+ Výhody: rychlost není riziko kontaminace vyšší citlivost (probíhá při vyšší teplotě) Dvoukroková RT-PCR První krok: zpětn tná transkriptáza + oligo(dt dt) Druhý krok: Taq DNA polymeráza + dvojice primerů Výhody: umožň žňuje optimalizovat zvláš ášť zpětnou transkripci a zvláš ášť PCR umožň žňujě syntézu dlouhých produktů (až 14 kb) 68

69 DD-PCR, Differential Display-PCR V genomech obratlovců existuje cca strukturních genů V jednotlivých tkáních je exprimováno pouze malé procento z nich DD-PCR slouží pro studium úrovně exprese genů v různých r tkáních při i patologických procesech Princip: Vzorek RNA je převeden p na cdna pomocí RT-PCR s oligo-dt primerem, který mám na 3 -konci dvě degenerované báze: 5 TTTTTTTTTTTTMN 3, kde M = A, G nebo C; N = jakýkoli dntp) druhý primer je směsný sný náhodný n 8-10mer8 tvořený náhodnými n sekvencemi Pro odhalení co největší šího počtu mrna mohou být využity různr zné sady druhého ho náhodného primeru RT-PCR se provádí s radioaktivně značenými oligonukleotidy Rozdíln lně exprimované mrna jsou detekovány na autoradiogramu 69

70 RACE (Rapid Amplification of cdna Ends) Rychlá amplifikace konců cdna (RACE) je technika založen ená na PCR vyvinutá k usnadnění klonování cdna o úplné délce s 5 a 5 a 3 konci 3 poté, co byla stanovena část sekvence cdna jinými metodami. Syntéza cdna z mrna o úplné délce není pomocí reverzní transkripce snadná. Pomocí RACE se amplifikuje kratší úsek od jednoho konce (3 nebo 5 ) 5 ) a ze středn ední části o známé sekvenci. 3 RACE 5 RACE 70

71 3 RACE Využívá výhody přirozenp irozeného poly(a) konce na mrna jako místa m pro zahájen jení PCR amplifikace. Při i reverzní transkripci od 3 konce 3 je první řetězec cdna je inciován u poly(a) pomocí oligo-dt hybridního ho kotvícího primeru. 17 oligo-dt zbytků navázaných na 17-mer adaptor má Tm vyšší než samotný oligo(dt17) je vhodné,, když nese restrikční místa pro následnn sledné klonování Amplifikace je docílena bez další purifikace, za využit ití PCR kotvícího primeru a uživatelem u navržen eného specifického primeru ve vnitřní části mrna, která je cílem c další analýzy. 71

72 5 RACE První řetězec cdna je nasyntetiozován z celkové poly(a) RNA za použit ití prvního genově-specifick specifického primeru (SP1) pomocí AMV RT a deoxynukleotidového mixu. První řetězec cdna je purifikován n od neinkorporovaných nukleotidů a primeru SP1 Reakční produkt první reakce (cdna) je pak prodloužen pomocí termináln lní transferázy zy,, která přidá homopolymerní konec da na 3 konec 3 cdna cdna s napojeným koncem je pak amplifikována PCR s použit itím m druhého ho genově-specifick specifického primeru SP2, oligo dt-kotv kotvícího primeru a Taq polymerázy stejným systémem jako u 3 3 RACE. Pokud je to třeba, t získanz skaná cdna můžm ůže být dále d amplifikována s použit itím m druhé PCR s využit itím nested (sousedního) primeru SP3 a PCR kotvícího primeru. 72

73 Degenerovaná PCR Využívá pro amplifikaci směsi si degenerovaných primerů Používá se, jestliže e nevíme, která z variant sekvence se můžm ůže v genomu vyskytovat Kolísav savé sekvence Sekvence předpoklp edpokládané na základz kladě zpětn tné translace z proteinového motivu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu 5' TGG GAY ACN GCN GGN CAR GA 3' T G G G G Degenerace je zajištěna C A A A A při i syntéze primeru. Není T T T nutné objednávat zvláš ášť C C C všechny varianty Výsledkem je 256 variant primeru Příklady využit ití: Vyhledání sekvence DNA na základz kladě sekvence aa stanovené u proteinu Vyhledání a klonování homologických genů např. člověka a myši Hledání a studium genových rodin s určitou strukturní podobností Fylogenetické a evoluční studie: hledání a srovnávání ortologních genů 73

74 Overlap extension PCR má využití v mutagenezi 74

75 Modifikace PCR používané v diagnostice PCR metody nabízej zejí následující výhody: rychlost je potřeba malé množstv ství buněk 75

76 PCR-RFLP Amplifikace známé sekvence se dvěma specifickými primery Cílová sekvence (obvykle určit itého genu) o délce d 1 aža 2 kb je amplifokována při vysoce stringentních podmínk nkách. Výsledkem amplifikace jsou amlikony (PCR produkty o stejné délce) detekované elektroforeticky Amplikony jsou štěpeny restrikční endonukleázou se 4 bp rozpoznávac vacím místem a poté opět t analyzovány ny pomocí elektroforézy Separace fragmentů DNA v agarózov zovém nebo polyakralamidovém gelu. Srovnání restrikčních fragmentů amplifikované DNA u různých r vzorků. 76

77 PCR-RFLP fingerprinting ilustrovaný na příkladu genu pro 16S rrna (rdna-rflp) 77

78 Prenatální diagnóza hemofilie pomocí PCR-RFLP V analyzované oblasti DNA mohou být aža tři i místa m BclI, přičemž jedno z těchto t míst m v intronu 18 je polymorfní. Fragment DNA o délce d 142 bp obklopující polymorfní místo BclI je nasyntetizován s pomocí oligonukleotidových primerů. Normáln lní alela má BclI místo a proto je fragment štěpen na bp fragmenty Polymorfní místo můžm ůže chybět t na obou chromozomech (5), přítomné na jednom a chybět t u druhého ho (2,4,7) nebo být přítomnp tomné na obou (1,3,6). 78

79 Mnohonásobná PCR (multiplex PCR) Při multiplex PCR je použito více v párůp specifických primerů. Dochází k amplifikaci více v cílových c sekvencí při i jedné reakci. Použítí a výhody: Vyhledávání změn n na dlouhých úsecích ch DNA Testování vzájemn jemně nesouvisejících ch oblastí na DNA Amplifikace vnitřních kontrol současn asně se vzorky Nižší cenové náklady než při i samostatných amplifikacích ch Používan vané aplikace: Detekce specifických toxinů produkovaných některými n organizmy (Clostridium difficile, Staphylococcus aureus) - může e být detekováno aža 7 různých genů kódujících ch toxiny. Detekce více v genů kódujících ch rezistenci k různým r antibiotikům. Detekce více v druhově specifických genů - identifikace organizmů Ko-amplifikace vnitřních kontrol Příklad detekce lyzogenie v genomu bakterie Staphylococcus aureus pomocí multiplex PCR profág serol. skupiny A profág serol. skupiny F profág serol. skupiny B vnitřní kontrola 79

80 Příklad použití multiplex PCR pro analýzu mutací v jednom genu Diagnóza Duchennovy muskulárn rní dystrofie za použit ití mnohonásobn sobné PCR k detekci deletovaných exonů V genu pro dystrofin o délce d 2000 kbp je navrženo celkem 9 úseků určených k amplifikaci. Tyto úseky představujp edstavují části genu, které bývají nejčast astěji postiženy delecí. Vzorky DNA z pacienta jsou amplifikovány za současn asného použit ití sady devíti primerů v jedné reakci a produkty jsou separovány na elektroforéze a barveny EB. Pacient 1 mám 1 deleci,, pacient 2 má velkou deleci asi 1000 kbp. Ostatní mají více různých r delecí. 80

81 Odstupňovaná PCR Při PCR pomocí vnější ších a vnitřních primerů ( nested PCR) se amplifikace provádí ve dvou krocích. ch. Metoda mám oproti standardní PCR velmi vysokou citlivost. Používaj vají se 2 modifikace: Dvoukroková První kolo zahrnuje cyklů amplifikace s jedním m páremp vnější ších primerů. Potom je reakce převedena p do druhé zkumavky a prováděna amplifikace zahrnující opět t cyklů s párem p vnitřních primerů. Jednokroková První kolo amplifikace s jedním párem primerů se provádí při nestringentních podmínk nkách (nížší teplota pro připojenp ipojení primerů) s cykly. Následuje reamplifikace zahrnující cyklů při stringentních podmínk nkách s vnitřními primery, při i které se ověř ěří specifita amplifikace z prvního kola. 81

82 Alelově specifická PCR (AS-PCR) Využit ití Pro detekci bodových mutací v genomech detekce homozygotního a heterozygotního ho stavu v klinických disciplínách ch Je prováděna ve dvou nebo více v paralelních reakcích ch V první reakci je horní primer komplementárn rní ke standardní sekvenci V další reakci k mutantní nebo polymorfní sekvenci Spodní primer je v obou reakcích ch stejný Předpokládá se, že e k elongaci dojde pouze tehdy, pokud jsou primer a cílovc lová sekvence plně komplementárn rní. Uvažujeme ujeme-li homozygotní stav, k amplifikaci bude docházet pouze v jedné reakci. Metoda byla popsána nezávisle pod různými r označen eními a využívá dva odlišné přístupy. První přístup je založen na chybějící elongaci v důsledku chybného ho párovp rování bází na 3'- konci primeru. amplifikaci nedostupný mutační systém m (ARMS), PCR-amplifikace specifických alel (PASA) alelově specifická amplifikace (ASA). Ve druhém m přístupu p se chybné párování nachází ve středn ední části sekvence primeru a brání tak hybridizaci primeru k cílovému místu m v případě, že e se v templátov tové DNA vyskytuje. kompetitivní připojení oligonukleotidu (COP). Pro snazší odlišen ení heterozygotního ho stavu v jediné reakci je používána varianta označen ená jako PCR-amplifikace více v specifických alel (PAMSA) nebo dvojitý ARMS. Jeden z alelově-specifických primerů obsahuje na 5'-konci přídatný p úsek několika n nekomplementárn rních nukleotidů,, a tak mohou být amplifikační produkty obou alel rozlišeny na základz kladě své délky. lky. Metoda je obecně velmi citlivá na optimalizaci experimentáln lních podmínek reakce, zejména koncentrace jednotlivých reagentů a templátov tové DNA. 82

83 PCR s degenerovanými oligonukleotidovými primery (DOP-PCR) DOP (degenerate( oligonucleotide primer) PCR slouží pro uniformní náhodnou amplifikaci DNA pokud je k dispozici pouze malé množstv ství vzorku. Další postupy (klonování,, značen ení, hybridizace, následnn sledná PCR) mohou být potom provedeny účinněji. DOP-PCR PCR se používá jako první krok při: p hybridizaci in situ srovnávac vací genomové hybridizaci (CGH) přípravě DNA fragmentů frakcionovaných podle velikosti pro další hybridizace analýzu DNA ze špatně kultivovatelných organizmů analýzu nebo klonování stopových množstv ství DNA Amplifikace DOP- PCR vede ke vzniku různě dlouhých DNA fragmentů, které jsou viditelné na agarózovém gelu obarveném etidiumbromidem ve formě šmouhy. 83

84 DOP-PCR DOP-PCR PCR primery mají definované sekvence na 5-5 a 3 -koncích ch a náhodnou n hexamerovou sekvenci mezi těmito definovanými konci. Prvních 5 cyklů DOP-PCR PCR probíhá při i velmi nízkn zké stringenci. Další ších 35 cyklů probíhá při vyšší teplotě pro připojenp ipojení primerů. Za stringentnější ších podmínek je materiál l vytvořený při p prvních cyklech amplifikován preferenčně,, protože obsahuje kompletní primerovou sekvenci na obou koncích. ch. Na jiných místech m se DOP-primer při p stringentních podmínk nkách neváže. e. NNNNNN NNNNNN NNNNNN NNNNNN NNNNNN NNNNNN 84

85 Náhodně amplifikovaná DNA Náhodná amplifikace využívaj vající jeden nebo více v primerů s neznámou homologií k cílovc lové sekvenci DNA Vzniká více amplikonů s různou r velikostí a rozdílným molárn rním m množstv stvím, nevyžaduje se proto štěpení restrikčními endonukleázami Úspěšná,, rychlá a jednoduchá technika pro DNA fingerprinting popsaná nezávisle pod různými r označen eními: AP-PCR PCR (arbitrarily( primed PCR fingerprinting) RAPD (randomly( amplified polymorphic DNA) DAF (DNA-amplified fingerprinting) MAAP (multiple( arbitrary amplicon profiling) PCR-mediated genotyping Princip metody: Metoda používá obvykle jeden krátký primer (8-10 bp nebo M13). Teplota pro připojenp ipojení primeru je mnohem nižší než teoretická hodnota T a. Za těchto t podmínek dochází k nasedání primeru s vysokou pravděpodobnost podobností na více v místech m na obou řetězcích ch chromozomáln lní nebo plazmidové DNA. Obvykle se vyskytne několik n míst m pro připojenp ipojení primeru umožň žňujících ch nasednutí primerů 3 konci k sobě,, která se vyskytují na protilehlých řetězcích, ch, a nejsou od sebe přílip liš vzdálen lená. Výsledkem je amplifikace mnoha fragmentů s různou r délkou d (max bp). 85

86 Náhodně amplifikovaná DNA Použit ití: Rychlá typizace většiny v izolátů mikroorganizmů Typizace genomové rostlinné DNA z různých r kultivarů Taxonomické studie a identifikační postupy Analýza mikrosatelitů AP-PCR PCR můžm ůže e být kombinována na s DGGE nebo SSCP analýzou. Produkty AP-PCR PCR slouží pro přípravu p pravu hybridizačních sond používaných při p i binárn rní typizaci Metoda mám vyšší diskriminační schopnost než PCR 16S-23S mezerníkových oblastí,, ale nižší než Rep-PCR. Nevýhody: Nízká reprodukovatelnost mezi laboratořemi. Částečné zvýšen ení reprodukovatelnosti je možné provedením reakce s různým r ředěním m DNA. Výsledek ovlivňuj ují plazmidy přítomné v izolované DNA. 86

87 Náhodně amplifikovaná DNA (AP-PCR) Příklad elektroforézy s AP-PCR produkty bp 300 bp 87

88 Analýza mezerníkových oblastí mezi repeticemi (Interrepetitivní-PCR, Rep-PCR) Technika pro analýzu celého chromozómu mu využívaj vající přítomnosti repetitivních elementů v bakteriáln lních nebo eukaryotických genomech. Princip metody: Amplifikace známé sekvence, vyskytující se v genomu ve více v kopiích (repetice, IS elementy, mezerníky, VNTR) Pro získz skání DNA fingerprintu je třeba t kompletní chromozomáln lní DNA podobně jako u AP- PCR, ačkoli a jsou amplifikovány pouze malé části chromozómu. mu. Primery jsou navrhovány ny tak, aby se připojovaly p přímo p ke koncovým, konzervativním oblastem repeticí. vzniká více amplikonů o různr zné velikosti, nevyžaduje se proto štěpení restrikčními endonukleázami Nejčast astěji je interrepetitivní PCR používa vaána u prokaryot: Je třeba t navrhnou konsenzní sekvenci primeru a zvolit nížší teplotu pro připojenp ipojení. 3 konce primeru směř ěřují směrem k mezerníkovým oblastem tak, aby se neamplifikovala samotná repetice. Jelikož se mezerníkov kové oblasti mezi repeticemi liší svou délkou, d při p i amplifikaci vzniká směs s různr zně dlouhých amplikonů (fragmentů DNA), které dávají jedinečný ný fingerprint V závislosti z na zvolené repetici jemožné získat specifický fingerprint pro druhy (trna-interrepetitivní PCR) nebo kmeny (ERIC, REP, BOX a IS6110 interrepetitivní PCR). 88

89 TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH GENOMECH A. Polynukleotidové sekvence a tandemové repetice B. Kr Trinukleotid TGG nejčast astější trinukleotid E. coli (součást st penta nebo oktanukleotidů). Nonamer AAGTGCGGT (uptake signal sequence USS) H. influenzae kopií. Tandemově opakované polynukleotidové sekvence (GTG)n nebo (GCC)n - vysoce repetitivní u E. coli, S. typhimurium a Shigella sp. Short tandemly repeated repetitive (STRR) sequences - heptanukleotidová opakování u sinice Calothrix. Major polymorphic tandem repeat (MPTR) - polymorfní 10-bp DR u Mycobacterium tuberculosis a další ších mykobakterií. Krátké roztroušen ené repetitivní sekvence (kratší než 50 bp) REP (repetitivní extragenové palindromatické sekvence) bp, obrácen cené repetice typu palindromů; ; REP u E. coli. PU (palindromic units) u E. coli a S. typhimurium. Mnohokopiový 26-mer (ngrep) u Neisseria sp. Mnohokopiový 24-mer DR element u Mycobacterium bovis (38 kopií). C. Dlouhé roztroušen ené repetitivní elementy (větší než 50 bp) Intergenic repeat unit (IRU) Enterococcal repetitive intergenic consensus (ERIC) bp nebo zkrácen cené formy. Chromozomová lokalizace se liší u kmenů a druhů.. ERIC-like sekvence přítomnp tomné v kopiích v celé bakteriáln lní říši. RLEP ( bp) u Mycoplasma leprae 28 (0,6% genomu). Mx-REP u Myxococcus xanthus - 87 pb jádrová sekvence. Dr-REP (SARK) u Deinocccus radidurans.. Element o variabilní délce ( bp). RepMP1-2, SDC1 (150 bp 1 kb) u Mycplasma pneumoniae,, v genomu kopií. RepMP2-like u Staphylococcus D. Mosaikové repetitivní elementy Bacterial Interspersed Mosaic Elements (BIME) (kombinace REP a sedmi další ších repetitivních motivů). REP MP bp element ohraničený kratší šími reeptitivními sekvencemi u M.pneumoniae pneumoniae. BOX elementy 154 bp rozptýlené repetitivní elementy přítomnp tomné v 25 kopiích u G+ (Streptococcus( pneumoniae). 89

90 Interrepetitivní PCR bp 100 bp 90

91 Využití interrepetitivní PCR u eukaryot U eukaryotických genomů se amplifikují markery označen ené jako inverzní sekvenčně značen ené repetice (ISTR) primery komplementárn rní např.. k rozptýleným vysokokopiovým retrotranspozonům. amplifikace mezi jednoduchými repetitivními sekvencemi (ISSR) amplifikační reakce s jedním m primerem (SPAR) primery homologické k sekvencím m SSR v rostlinných genomech Pro zahájen jení amplifikace je navržen primer odvozený ze samotné repetitivní sekvence a ten umožň žňuje amplifikaci jedinečných ných sekvencí odděluj lujících ch jednotlivé SSR. Pro zamezení překrývání primerů mohou být prodlouženy o jedinečnou nou genomovou sekvenci ohraničuj ující repetici. Primery navržen ené z tetranukleotidových repeticí,, např.. (GATA)4, dávajd vají lepší výsledky než dinukleotidové nebo trinukleotidové. Určitým vylepšen ením m metody interrepetitivní PCR je fluoroforem zdokonalená interrepetitivní PCR (FERP), která používá primerů značených na 5'-konci fluorescenční látkou, rozdělen lení produktů PCR v nedenaturujícím polyakrylamidovém m gelu a digitáln lní zpracování otisků DNA. Další obměnou je automatická laserová fluorescenční analýza (ALFA), při p které se rovněž používaj vají 5'-koncov koncově fluorescenčně značen ené PCR-primery a produkty PCR jsou rozděleny v denaturujícím m polyakrylamidovém m gelu na automatizovaném sekvenátoru toru,, což značně zlepší rozlišen ení a reprodukovatelnost. 91

92 AluI-PCR PCR je používána k amplifikaci DNA sekvencí specifických pro člověka, představuje p velmi jednoduchý prostředek k charakterizaci a amplifikaci právě jen lidské DNA. Metoda používá primery pro repetitivní sekvence, které jsou inzertovány ny na mnoha místech m genomu. Z těchto t elementů jsou Alu- sekvence (opakování) ) přítomny p v množstv ství kopií v lidském genomu. Tato 300-bp Alu-repetice je velmi variabilní,, ale obsahuje sekvenci, která je specifická pro člověka. PřipravP ipraví se dva primery, každý pro jeden směr, přičemp emž se využije nejvíce konzervativních úseků těchto sekvencí. Primery nelze použít t společně,, neboť vzájemn jemně hybridizují.. Sekvence Alu však mohou být přítomny p na DNA v obou směrech, takže e primery se používaj vají samostatně. Lidské sekvence se budou amplifikovat, pokud leží mezi sousedními Alu-repeticemi, které jsou umíst stěny (orientovány) ny) v opačných směrech. Tvoří se různý r počet fragmentů lidské DNA v závislosti z na velikosti lidské DNA v buněč ěčné linii. Tato technika je často používána pro "odhalení" " lidské DNA od ostatních DNA. 92

93 AluI-PCR 93

94 Analýza mezerníkových oblastí v rdna (RS-PCR, PCR-ribotypizace) U prokaryot obsahují rdna operony geny pro všechny v tři t typy rrna (16S, 23S a 5S). Geny pro 16S a 23S rrna jsou odděleny mezerníkovou oblastí,, která se liší délkou v závislosti na druhu (od 278 bp u mykobakterií do do 2 kb u borrelií). Navíc c u většiny v Eubakterií se vyskytuje více v kopií rdna operonu, u nichž se vyskytují menší rozdíly v délce mezerníků. 500 bp 00 bp U Staphylococcus aureus se nachází v genomu 6 rrn operonů, všech 6 mezerníků mezi 16S a 23S rrna se může lišit svou délkou. 94

95 Polymorfizmus délky jednoduchých repetitivních sekvencí (SSLP-PCR) Jednoduché repetitivní sekvence (SSR) jsou tandemové repetice o délce 2 aža 10 bp (např. mikrosatelity) ) přítomnp tomné v eukaryotických genomech s četností až 80. V důsledku d mutací nebo rekombinace se počet těchto t repeticí může zvýšit nebo snížit. Primery pro tuto metodu jsou navrhovány ny tak, aby se připojovaly p oblastem ohraničuj ujícím m SSR. Tyto ohraničuj ující sekvence bývají konzervativní pouze v rámci druhu a proto je nutné navrhovat pro každý druh novou sadu primerů. Jelikož je mezi jedinci počet repeticí značně variabilní,, výsledkem amplifikace je vznik různr zně dlouhých PCR produktů,, které jsou separovány na polyakrylamidové nebo agarózov zové gelové elektroforéze s vysokým rozlišen ením. Rozdílů v délce d fragmentů genomové DNA podmíněné přítomností SSR se používá k odlišen ení blízce příbuzných p jedinců a k detekci vztahů mezi nimi zejména v genetice populací. 95

96 Příklad amplifikace mikrosatelitů Struktura Jedinečné ohraničující oblasti = Repetice (např. GA) Počet repeticí je velice variabilní mezi jedinci Návrh pimerů ( ) komplementárních k ohraničujícím sekvencím Amplifikace repeticí pomocí PCR 96

97 Multiplex PCR-SSLP Fluorescenční značen ení primerů pro amplifikaci mikrosatelitů umožň žňuje amplifikaci několika lokusů 97

98 AFLP - Polymorfizmus velikostí amplifikovaných fragmentů (Amplified Fragment Length Polymorphism) Selektivní amplifikace určit itého souboru fragmentů DNA vytvářen eného štěpením m restrikční endonukleázou. Polymorfizmus je založen na ztrátě nebo získz skání restrikčních míst. m Metoda využívaj vající kroky restrikce jednou nebo dvěma restrikčními endonukleázami a ligace genomové DNA se speciáln lně navrženými adaptory s následnou n amplifikací pomocí jednoho nebo dvou selektivních primerů. Nevyžaduje znalost sekvence. Technicky i finančně náročnější ale spolehlivější než RAPD. Další používan vaná označen ení: : SRFA (primer dependent selective restriction fragment amplification), IRS-PCR (infrequent restriction site amplification). 98

99 Schema obvyklého postupu AFLP 3. Ligace s adaptory 99

100 100

101 In situ PCR (PCR in situ, incell PCR) Hybridizace in situ (ISH) umožň žňuje lokalizaci určit ité sekvence NK uvnitř jednotlivých buěnk nk,, ale vykazuje nízkou n detekční aktivitu. Konvenční PCR vyžaduje nutnost tkáně nebo buňky destruovat a izolovat NK, nelze asociovat výsledek amplifikaceke specifickému histologickému typu buněk. In situ PCR kombinuje vysokou citlivost PCR s cytologickou lokalizací sekvencí poskytnutou ISH PCR in situ hybridization incell PCR PCR driven ISH umožň žňuje asociovat výsledek amplifikace ke specifickému histologickému typu buněk umožň žňuje korelovat výsledek s histopatologickými rysy nebo množstv stvím m buněk, obsahujících ch cílovou sekvenci Specifické sekvence jsou uvnitř buňky amplifikovány, čímž se zvýší počet kopií natolik, že e je lze snadno detekovat pomocí ISH (nepřímá in situ PCR) imunochemicky (přímá in situ PCR) 101

102 Příprava vzorku pro in situ PCR Fixace buněk k nebo tkáně zachování morfologie (paraformaldehyd) Permeabilizace - přístup PCR reagentů k NK (detergenty, proteázy zy) průběh h PCR v buněč ěčných suspenzích v cytocentrifugačních ch preparátech pod mikroskopickým sklem Detekce intracelulárn rních produktů ISH Imunochemicky (protilátky tky proti DIG dUTP,, fluorescein-dutp dutp,, 3H-CTP) In situ PCR mám aplikace jak ve výzkumu, tak v diagnostice: detekce virových nebo provirových NK (HIV, CMV, HBV, HSV-2) chromozomáln lní přeskupení,, translokace, hledání jednokopiových genů mapování nízkokopiových chromozomáln lních sekvencí v metafázických chromozomech detekce nízkokopiových mrna a virových RNA 102