PCR - polymerázová řetězová reakce (princip metody)

Transkript

1 PCR - polymerázová řetězová reakce (princip metody) PCR umožňuje získat požadovanou sekvenci bez klonování, navíc zcela specifickou. PCR využívá základních rysů replikace DNA: Jako templát slouží ssdna, podle níž je syntetizován komplementární řetězec. K zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. Jako templáty pro syntézu mohou sloužit oba řetězce dsdna, po předchozí denaturaci. Primery se vybírají tak, aby se připojovaly k místům ohraničujícím z obou stran amplifikovaný úsek. Teoreticky lze získat 2 n řetězců (kopií), což vede k nesmírně rychlé amplifikaci původní molekuly. Provedení reakce Výchozím materiálem pro PCR je DNA obsahující sekvenci určenou k amplifikaci. Tuto sekvenci není nutné izolovat - výběr zajistí primery. Jako vzorek je možné použít i biologický materiál (DNA není nutné purifikovat). Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle postačuje méně než 1 mg genomové DNA, teoreticky postačuje jedna molekula. Reakční směs obsahuje: 1. DNA 50 ng - 1 µg mikroorganismy, tkáňové kultury, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stěry, vlasy, atd. 2. Primery. Primery pro PCR mívají velikost bp s obsahem GC mezi 40% - 70%. 3' konec primeru nesmí být komplementární k žádné části sebe sama (self-complementatity). Primer nesmí obsahovat palindromy a tvořit stabilní sekundární struktury. Oba primery by měly mít přibližně stejný obsah GC a podobnou teplotu annealingu (Ta). K navrhování primerů se používají počítačové programy, z nichž některé jsou volně dostupné. 3. dntp ve formě Na nebo Li solí, koncentrace v reakci je 0,1-0,2 mm. 4. Mg + ionty. Přítomnost Mg iontů v reakci je nezbytná, jejich množství závisí na množství DNA a dntp v reakci. V jejich nepřítomnosti se netvoří žádný produkt, v nadbytku vznikají nespecifické produkty. Optimální koncentrace se stanovuje experimentálně pro každý pár primerů zvlášť. 5. DNA polymerázu Taq Thermus aquaticus Tth Thermus thermophilus Tma Thermotoga maritima Princip: 1. denaturace 95 C (separace řetězců) 2. připojení primerů (30-65 C) teplota určije specifičnost a závisí na sekvenci primeru. T a = T m - 5 C 3. polymerační reakce (65-75 C) 4. nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus Cyklické střídání teplot jednou založené směsi zajišťuje průběh reakce PCR, provádí se v termocyklerech, většinou se provádí cyklů. Jako polymeráza se používá Taq DNA polymeráza z Thermus aquaticus, která odolává teplotě 94 C.

2 Protokol PCR Detekce genu pro:... Režim termocykleru: Složky reakční směsi Deionizovaná sterilní H 2 O Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace Množství přidané do 25 µl 1 vzorek Množství přidané do µl... vzorků Pufr pro PCR bez MgCl Pufr pro PCR s 15mM MgCl 2 MgCl 2 25 mm / 50 mm 1,5 mm dntp 10 / 5 mm 1 / 200 µm BSA / želatina Primer F 100 µm / 10 µm 0,4 µm Primer R 100 µm / 10 µm 0,4 µm Taq DNA-polymeráza 5 U µl -1 1 U Templátová DNA 50 ng

3 ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PŘI STANDARDNÍ PCR Problém Možná příčina Doporučení Nevzniká produkt Produkt není čistý Vznikají četné nespecifické produkty Nevyvážená reakce Kontrola koncentrace jednotlivých složek Teplotní podmínky Kontrola nastavení cyklů Nízká koncentrace templátu Koncentrace primeru nebo jeho sekvence Zvýšit koncentraci templátové DNA Optimalizovat koncentraci primeru Navrhnout primer s novou sekvencí Ruzné faktory Testovat reakci s pozitivní kontrolou a funkčními primery Nízká kvalita templátu (degradovaný, kontaminovaný, obsahující inhibitiry) Nízká účinnost polymerázy Vzniká sekundární amplifikační produkt Nespecifická vazba primeru Začít s novými roztoky, H 2 O a enzymem Použít primery, které amplifikují kratší úseky Přidat pomocné látky (DMSO) Optimalizovat koncentraci Mg 2+ Připravit nový templát Zamezit častému zmrazování a rozmrazování templátu Používat pozitivní kontrolu Zvýšit počet cyklů Zvýšit koncentraci enzymu Použít jinou polymerázu Kontrola koncentrace složek reakce Optimalizovat koncentraci Mg 2+ Optimalizovat koncentraci primerů Snížit počet cyklů Smížit koncentraci templátu Použít vyšší teplotu T a Optimalizovat koncentraci primerů Použít hot start Narhnout nové primery

4 Polymerázová etzová reakce PCR (Polymerase( Chain Reaction) Princip PCR Zavedení PCR v roce 1983 (Kary Mullis) Publikace Nobelova cena Metoda pro mnohonásobn sobné zmnožen ení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založen ená na principu replikace. K opakující se enzymové syntéze komplementárn rních etzc vybraných úsek dvouet etzcové DNA dochází po pipojení dvou primer vázajících ch se na protilehlé etzcezce DNA tak, že e jejich 3'-OH OH-konce sm ují proti sob. PCR umož žuje získat z požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování. 1 2 PCR využívá základních rys replikace (enzymatické syntézy) DNA: Jako templát slouží ssdna,, podle nížn je syntetizován komplementárn rní etzec. K zahájen jení reakce je zapoteb ebí primer, který se pipojuje na komplementárn rní úseky DNA. Tím T m je zárove vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. Jako templáty ty pro syntézu mohou sloužit oba etzce dsdna, po pedchozp edchozí denaturaci. Primery se vybíraj rají tak, aby se pipojovaly p k místm stm ohraniuj ujícím m z obou stran amplifikovaný úsek. Teoreticky lze získat z 2 n etzc (kopií). Pedpoklady pro zavedení PCR Syntéza oligonukleotid Vlastní myšlenka (K. Mullis) Teplotn stabilní DNA polymeráza Automatické termocyklery Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzym termocyklery 3 4

5 Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym Syntéza obou etzc u specifické sekvence 5 3 Reakní sms s obsahuje: TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC Templátovou nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA). AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG Množstv ství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízkn zké: : obvykle 3 postauje ménm než 1 g g genomové DNA, teoreticky postauje jedna Pímý primer 5 dntps 5 molekula. 3 DNA POL Kvalita templátu tu ovlivuje výsledek PCR. TTGAGAAAGGAATAAGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG Velké množstv ství RNA mžm že e vázat v ionty Mg zneištný ný templát mžže e obsahovat inhibitory PCR 5 3 Zdroj: mikroorganizmy, buky z tkáových kultur, tlnt lní tekutiny, TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC bioptické vzorky, stry, vlasy, atd DNA POL TCTTTAGCTCATATACG Primery.. Chemicky syntetické ologonukleotidy o velikost nukleotid. 3 5 dntp ve form Na + nebo Li + solí dntps Zptný primer Mg 2+ ionty tvoí rozpustný komplex s dntp a vytváej ejí substrát, t, který 5 3 rozpoznává DNA polymeráza za. TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC Termostabilní DNA polymerázu zu,, která odolává teplotám m aža 98 C. AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG Taq Thermus aquaticus 3 5 Tth Thermus thermophilus 5 3 Tma Thermotoga maritima TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC Pfu Pyrococcus furiosus AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG Pwo Pyrococcus woesei REAKNÍ PODMÍNKY PCR REAKNÍ PODMÍNKY PCR 1. Poáte tení denaturace DNA. DleD ležitá je kompletní denaturace templátu, tu, obvykle postauje zahátí smsi si na 2 5 min / 95 C. V pípadp pad, že e dojde pouze k ástené denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují a to vede k nespecifické vazb primer ( self-priming )) a možným falešným výsledkm. Vlastní etzová reakce: 2. Denaturaní krok (separace etzc) ) : C C / s, zález leží na objemu reakce, tloušce stn n zkumavek. Nedostaten denaturovaná DNA neumož žuje pístupp primerm,, naopak pílip liš dlouhá denaturace snižuje aktivitu DNA polymerázy (stabilní cca 2 hod / 98 C). 3. Pipojení primer (55-65 C C / s) teplota uruje uje specifinost a závisí na Tm primeru a templátu. tu. Pro oba primery by mla m být Tm podobná.. Ta se optimalizuje v teplotním m gradientu nebo se stanovuje empiricky. 4. Prodlužov ování primeru (polymeraní reakce) pi p i standardní PCR probíhá pi i 72 C C /45 90 s. Taq DNA polymeráza syntetizuje DNA pi p i této t to teplot rychlostí cca 60 bází/s. b Nov syntetizované etzce slouží jako templáty ty pro další cyklus. Cyklické stídání teplot jednou založen ené smsi si zajišuje prbh h reakce PCR, provádí se v termocyklerech,, vtšinou v se provádí cykl. 5. Závrená extenze se provádí obvykle po posledním m cyklu (72 C C / 5 min) a slouží k dokonen ení syntézy a renaturaci jednoet etzcových produkt Denaturace vzorku DNA Pro oddlení jednoetzc (94 C, 5 min) Denaturace pro separaci etzc DNA (94 C, 30 s) Pcr.exe Pipojení primer na etzce DNA (30-65 C, 1 min) Syntéza nových etzc DNA polymerázou (72 C, 45s - 2 min) 8

6 Schéma PCR 9 Poet nov syntetizovaných molekul dsdna pi jednotlivých cyklech PCR 2 n -1 Poet nových Cyklus íslo dvouetzcových molekul KONCENTRACE JEDNOTLIVÝCH SLOŽEK PI STANDARNÍ PCR REAKCI DNA. Pro standardní PCR se doporuuje uje následujn sledující množstv ství DNA podle velikosti templátu: tu: lidská genomová DNA: ng bakteriáln lní DNA: 1 10 ng plazmidová DNA: 0,1 1 ng Primery. Sekvence a koncentrace primeru významn ovlivuje výsledek PCR. Optimáln lní koncentrace je mezi 0,1 a 0,6 µm. U nkterých n systém mžže e vyšší koncentrace (až 1 µm) zlepšit výsledky. Nižší koncentrace vede k pedp edasnému vyerp erpání primer a snížen ení výtž žku. dntp. Výsledná koncentrace se mžm že e pohybovat v rozmezí µm (pro každý nukleotid) Nejbž žnjší koncentrace dntp je 200 µm. Pi P i zvýšen ení koncentrace dntp je teba t zvýšit koncentraci Mg 2+ iont. MgCl 2. Volné Mg2+ ionty ovlivuj ují aktivitu enzymu a zvyšuj ují hodnotu T m u dsdna. Pro dosažen ení nejlepší šího výsledku vždy v stanovujeme koncentraci Mg 2+ experimentáln ln. Optimáln lní koncentrace mžm že e kolísat od 1 mm do 5 mm. Nejasteji používan vaná koncentrace je 1,5 mm (pro 200 µm dntp)

7 DNA polymeráza za. Obvyklá koncentrace je 0,5 2,5 jednotek / 50 µl. ph je dané reakním pufrem,, obvykle odpovídá ph 8,3 9,0. Pídatné látky mohou v nkterých n pípadech p padech ovlivnit úinnost a specifinost PCR reakce. Jejich vliv se obvykle uruje uje experimentáln ln: albumin z bovinního séra s (BSA) (100 ng/50 µl) dimetylsulfoxid (DMSO) (2-10 % v/v) redukce nespecifické vazby primeru detergenty (Triton X-100, X Tween 20) betain (0,5 2 M) želatina glycerol (1 5 % v/v) spermidin protein 32 genu fága T4 optimalizace PCR pídatnými látkami: Struktura Taq DNA polymerázy Mineráln lní olej zabrauje vypaov ování bhem reakce BEZCHYBNOST SYNTÉZY Replikace s Taq DNA-polymer polymerázou neprobíhá bezchybn,, DNA- polymeráza píležitostn zaazuje azuje do nov syntetizovaných etzc chybné (nekomplementárn rní) ) nukleotidy. Buka mám schopnost tyto báze b odstraovat ovat opravnými mechanizmy. In vitro Taq DNA-polymer polymeráze tato vlastnost chybí. Frekvence chbného ho zale leování za podmínek amplifikace in vitro je asi Chybné zale leování je dled ležité,, pokud jsou PCR produkty klonovány, ny, nebo každý klon je odvozen z jedné molekuly DNA. Chybn zalen lenné báze (mutace) potom obsahuje celé potomstvo. ešení problému: použit ití dvojice DNA polymeráz, z nichž jedna mám opravné mechanizmy (proofreading( proofreading). 15 Složka Základní optimalizace PCR Teplota pro pipojenp ipojení primeru MgCl 2 KCl Enzym,, Primer Formamid Zpravidla se optimalizuje Nižší stringence Vyšší stringence Teplota pro pipojenp ipojení primeru v termocykleru s teplotním gradientem Koncentrace MgCl 2 16

8 Stanovení teploty pro pipojení primeru Hodnota Tm Teplota pro pipojenp ipojení primeru (annealing( temperature) ) zkr. T a. Teplota používan vaná pro teplotní hybridizaci molekul primeru a matricové DNA in vitro. Optimáln lní teplota pro pipojenp ipojení primeru pi p i PCR se vypoítá podle vztahu: T a 0,3T Primer m 0,7 T Produkt m 25 kde T Primer m je hodnota T m nejmén stabilního páru p primer- matrice a T Produkt m je hodnota T m amplifikaního produktu. T m závisí na techt základních faktorech: Zastoupení bází Složen ení roztoku Koncentrace solí ph Délka molekuly DNA Orientan lze vypoítat T a podle vztahu: T a = 2(A+T) + 4(G+C) 5 C C = T m 5 C NÁVRH PRIMER PRO STANDARDNÍ PCR bázíb dlouhé neobsahují vnitní sekundárn rní struktury obsahují % G+C mají rovnomrnou rnou distribuci oblastí bohatých na G/C a A/T páryp nejsou komplementárn rní navzájem na 3 -konc3 koncích, ch, takže nevytváej ejí navzájem nebo samy se sebou duplexy na matricové DNA nemají falešná vazebná místa mají T m teplotu C Pro návrh primer se obvykle používá specializovaný software (nkterý je voln dostupný na internetu)

9 PÍKLADY STRUKTUR VYTVÁENÝCH PRIMERY, KTERÉ JE NUTNÉ ZOHLEDNIT PI JEJICH NÁVRHU Nesprávn vn navržený primer s falešnými vazebnými místym na templátov tové DNA: Chybn navržen ená dvojice primer,, která vytváí stabilní duplex na 3 -konci: 3 Správn vn navržen ená dvojice primer,, která vytváí pouze málo stabilní duplex na 5 -konci; 5 na 3 -konci 3 je G nebo C zaruuj ující stabilní párování s templátem: tem: Správn vn navržený primer, který nemá falešná vazebná místa na templátu: tu: Chybn navržený primer, vytváej ející vlásenku: HOT START PCR Hot-start PCR významn ovlivuje specifinost, citlivost a výtž žek reakce Princip: Pi hot-start PCR jsou urit ité složky reakní smsi si oddleny od ostatních, dokud teplota ve zkumavce nepekro ekroí optimáln lní teplotu pro pipojenp ipojení primeru (obvykle C). DNA polymeráza je v této t to nekompletní reakní smsi si nefunkní. Nedochází k prodlužov ování nespecificky navázaných primer bhem doby než je dosažena teplota T a. 23 Separace dled ležitých složek reakní smsi si je dosažena nkterým z následujn sledujících ch zpsob sob: Manuáln ln Nkteré složky jako DNA polymeráza nebo Mg 2+ jsou vynechány ny v pvodnp vodní reakní smsi si a pidp idány manuáln ln po dosažen ení teploty > 70 C. Nevýhodou je možnost kontaminace a možná ztráta ta reprodukovatelnosti. Fyzikáln lní separace Reakní komponenty jsou rozdleny do dvou smsí,, které jsou oddleny bariérou rou (vosková pepážka, nebo voskové korálky obsahující MgCl 2 ). Bhem poáte tení denaturace vosk roztaje a umožní smích chání reakních složek. Protilátky tky proti DNA polymeráze Pídavek teplotn nestabilních protilátek tek umožní poáte tení inaktivaci polymerázy. Chemická modifikace polymerázy Pídavek teplotn nestabilních látek, l které se vážou v na urit ité aminokyselinové zbytky blokují enzym (ten je potom pi p i pokojové teplot inaktivní). K aktivaci enzymu dochází pi i poáte tení denaturaci ( FastStart( Taq DNA polymeráza za ). Další inhibitory nap.. oligonukleotidy specificky se vázajv zající na polymerázu 24

10 DETEKCE AMPLIFIKOVANÉHO PRODUKTU PCR DETEKCE AMPLIFIKOVANÉHO PRODUKTU PCR 1. Stanovení fyzikáln lní velikosti produktu gelovou elektroforézou (agar( agaróza, polyakrylamid). Detekce obarvením m a pozorování pod UV svtlem. 2. Štpení produktu restrikními enzymy a posouzení spektra vznikajících ch restrikních fragment (PCR-RFLP) RFLP) 3. Elektroforetická separace produkt za specifických podmínek pro detekci sekvenních polymorfizm DGGE denaturaní gradientová gelová elektroforéza SSCP analýza polymorfizmu konformace jednoet etzcových forem Píklad standardní gelové elektroforézy s produkty PCR v agarózovém gelu. 1 = hmotnostní st. 2-4 = produkty PCR hybridizací s neradioaktivn znaenou sondou komplementárn rní k ásti sekvence amplifikovaného úseku a detekcí enzymoimunoanalýzou v mikrotitraní destice (PCR-EIA/ELISA), hybridizaní sonda mžm že e být následn amplifikována (PCR-OLA) 5. imobilizací PCR-produkt produkt na membrán a tekovou hybridizací se znaenými alelov- specifickými oligonukleotidy (ASO) nebo zptnou tekovou hybridizací s rznými ASO imobilizovanými na membrán, 6. hybridizací na DNA-ipech, 7. stanovením m sekvence DNA. 26 Kontaminace pi PCR Vynikající citlivost PCR mžm že e být ovlivnna na kontaminací i jedinou molekulou exogenní nebo neznámé DNA. Pro minimalizaci falešných pozitivních výsledk je doporueno: používání autoklávovaných roztok fyzikáln lní separace používaných PCR-reagenci reagencií od templátov tové DNA a PCR-produkt produkt píprava prava reagencií i vzork do alikvotních ástí používání UV-sv svtla k odstranní exogenních nukleových kyselin na pracovní ploše používání jednorázových rukavic pidávání DNA do reakce jako poslední peliv livá volba pozitivních, negativních a vnitních kontrol Vylouen ení kontaminace je dled ležité zejména tam, kde je poteba použít vysokého potu amplifikaních cykl,, aby bylo dosaženo požadovan adovaného produktu nízkokopiových templát DNA degradovaných vzork. V pípad pochybností je nejlepší ším m pístupem p opakování experimentu s úzkostlivou pozorností k detailm m a kontrolám. Jako zdroj kontaminace DNA je nejast astji uvádn: penos kontaminující DNA z díve amplifikovaných produkt PCR, vzájemn jemná kontaminace zdrojových materiál, kontaminace plazmidem z rekombinantního klonu, který obsahuje cílovouc sekvenci. 27 Jako prevence ped penosem kontaminující DNA je v reakní smsi rutinn používána náhrada dttp za dutp. Následným psobením uracil-n-glykosylázy na reakní sms ped zahájením amplifikace. 28

11 Alternativn lze amplifikaní produkty PCR inaktivovat fotochemicky pomocí derivát psoralenu nebo isopsoralenu, Furokumarinové sloueniny interkalující se mezi páry p bázíb DNA. Pokud jsou tyto látky l excitovány UV-sv svtlem o vlnové délce nm,, kovalentn se vážou v na nukleové kyseliny a tvoí cyklobutanové adukty s pyrimidinovými bázemi, které blokují reakci s DNA-polymer polymerázou O O R DNA O O O R O O O 5' 3 4' h 4 O O OH OH 29 EŠENÍ PROBLÉM PI STANDARDNÍ PCR Problém Nevzniká produkt Možná píina Doporuen ení Nevyvážen ená reakce Kontrola koncentrace jednotlivých složek Teplotní podmínky Nízká koncentrace templátu tu Koncentrace primeru nebo jeho sekvence Kontrola nastavení cykl Zvýšit koncentraci templátov tové DNA Optimalizovat koncentraci primeru Navrhnout primer s novou sekvencí Ruzné faktory Testovat reakci s pozitivní kontrolou a funkními primery Zaít t s novými roztoky, H 2 O a enzymem Nízká kvalita templátu tu (degradovaný, kontaminovaný, obsahující inhibitiry) Použít t primery, které amplifikují kratší úseky Pidat pomocné látky (DMSO) Optimalizovat koncentraci Mg 2+ Pipravit nový templát Zamezit astému zmrazování a rozmrazování templátu tu 30 EŠENÍ PROBLÉM PI STANDARDNÍ PCR VYUŽITÍ METODY PCR Problém Nevzniká produkt Produkt není istý Vznikají etné nespecifické produkty Možná píina Nízká úinnost polymerázy Vzniká sekundárn rní amplifikaní produkt Nespecifická vazba primeru Doporuen ení Používat pozitivní kontrolu Zvýšit poet cykl Zvýšit koncentraci enzymu Použít t jinou polymerázu Kontrola koncentrace složek reakce Optimalizovat koncentraci Mg 2+ Optimalizovat koncentraci primer Snížit poet cykl Snížit koncentraci templátu tu Použít t vyšší teplotu T a Optimalizovat koncentraci primer Použít hot start Narhnout nové primery Základní výzkum izolace gen nebo jejich ástí sekvencování DNA mutageneza in vitro modifkace konc DNA analýza (selekce) klon z genových knihoven píprava prava znaených sond 2. Aplikovaný genetický výzkum prenatáln lní diagnostika (ddi diných chorob) detekce mutací v genech studium polymorfizmu gen (nap.. RAPD) populaní genetika 3. Využit ití v klinických disciplinách ch detekce patogenních mikroorganism (baktéri rií,, vir, prvok,, hub) identifikace onkogen typizace nádorn dor stanovení pohlaví 4. Využit ití v praxi archeologie soudnictví kriminalistika 32