Hybridizace nukleových kyselin

Transkript

1 Hybridizace nukleových kyselin tvorba dvouřetězcových hybridů ze dvou jednořetězcových a alespoň částečně komplementárních molekul nukleových kyselin založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA specifita párování mezi definovanou DNA (sondou) a zkoumaným vzorkem je základem mnoha metod

2 Denaturace a renaturace DNA Espero Publishing, s.r.o. oddělení plně komplementárních vláken DNA lze dosáhnout např. působením vysoké teploty ( o C), extrémních hodnot ph nebo denaturačních činidel (formamid, močovina) obnovení běžných podmínek umožňuje pozvolnou renaturaci

3 260 Použití spektroskopie pro sledování hybridizace DNA DNA absorbuje UV světlo při vlnové délce 260 nm změna v uspořádání bazí při denaturaci zvyšuje absorbci světla při této vlnové délce (hyperchromní efekt) Optická hustota Měření absorbance lze využít, protože se mění v závislosti na struktuře DNA vlnová délka (nm) dsdna Nízký extinkční koeficient ssdna Vyšší extinkční koeficient

4 Průběh denaturace i renaturace DNA lze sledovat spektrofotometricky

5 Teplota tání DNA T m -odpovídáteplotě, kdy je molekula DNA denaturována z jedné poloviny

6 Stanovení hodnoty Tm Teplota, při které dochází k denaturaci DNA závisí na obsahu guaninu a cytozinu v DNA. Čím více obsahuje GC-párů, tím vyšší teploty je zapotřebí k její denaturaci. Rozmezí denaturačních teplot je zhruba o C. Denaturaci DNA provází hyperchromní efekt, tj. dochází ke zvýšení absorbance ultrafialového světla. Hyperchromní efekt je způsoben rozpadem dvouřetězcových molekul DNA na molekuly jednořetězcové, které absorbují UV-záření silněji než molekuly dvouřetězcové. Teplota, při níž zdenaturovalo 50 % dvoušroubovicových molekul DNA, se označuje jako teplota tání a vyjadřuje se symbolem T m. Tato teplota odpovídá inflexnímu bodu denaturační křivky.

7 Monitorování teploty tání dsdna Teplota tání (denaturace) závisí na čtyřech hlavních faktorech: - obsahu GC (a AT) - koncentraci solí - délce sekvence -přítomnosti nespárovaných úseků GC rich AT rich GC rich Temp Temp

8 Teplota tání DNA T m se lineárně zvyšuje s obsahem G+C obsah G+C v DNA se u různých organismů pohybuje od 22% - 73% vliv obsahu G+C na T m vyplývá z faktu, že páry G-C jsou spojeny třemi vodíkovými vazbami a páry A-T dvěma

9 Vliv dalších faktorů na denaturaci DNA organická rozpouštědla jako DMSO (dimetylsulfoxid) a formamid přerušují vodíkové můstky mezi řetězci DNA změny ph rovněž porušují vodíkové můstky snížení obsahu solí odstraňuje ionty, které poskytují ochranu negativním nábojům v molekule DNA (eliminace vzájemného ovlivňování nabitých skupin): DNA lze denaturovat při nižší teplotě

10 Renaturace opětná tvorba dvouřetězcových struktur z jednořetězcových polynukleotidů za vhodných připojovacích ( annealing ) podmínek nastává při pomalém ochlazování (65 o C) roztoku teplem denaturované DNA nenastává při prudkém ochlazení roztoku denaturované DNA při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA rozsah renaturace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí

11 Hybridizace molekul nukleových kyselin. Spojení částečně nebo úplně komplementárních DNA řetězců pocházejících z různých dvouřetězcových molekul DNA nebo podobně spojení DNAřetězce s RNA řetězcem; oba procesy probíhají in vivo a mohou být navozeny in vitro. Hybridní molekuly DNA. Renaturované molekuly, v nichž se spojily řetězce pocházející z molekul DNA různých zdrojů. Homoduplex. Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují úplnou komplementaritou. Heteroduplex. Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují neúplnou komplementaritou. 5 GATCGATCGATCGATC 3 3 CTAGCTAGCTAGCTAG 5 zvýšení teploty 5 GATCGATCGATCGATC 3 + přidání 3 CTAGCTAGCCGGCTAG 5 ochlazení 5 GATCGATCGATCGATC 3 3 CTAGCTAGCCGGCTAG 5

12 Faktory ovlivňující tvorbu hybridů mezi sondou a testovanou DNA teplota koncentrace solí stupeň komplementarity délka fragmentů koncentrace sondy komplexita sondy (přítomnost autokomplementárních sekvencí) nukleotidové složení sondy přítomnost denaturačních činidel (formamid) viskozita roztoku ph roztoku

13 Využití hybridizace nukleových kyselin test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou dostatečně komplementární) z toho lze vyvozovat stupeň příbuznosti testovaných organismů testy genové exprese (hybridizovat mnohou i molekuly DNA a RNA) amplifikace nukleových kyselin pomocí PCR (připojení primeru k templátu je rovněž typ hybridizační reakce) vyhledávání klonů nesoucích rekombinantní DNA lokalizace genů na chromozomech testy paternity, identifikace osob, atd. čipové technologie ( microarrays )

14 Různé možnosti uspořádání hybridizačních experimentů

15 Typy přenosu z gelu na membránu podle typu analyzovaných molekul Southernův přenos - DNA northernový přenos - RNA westernový přenos - proteiny southwesternový přenos - proteiny vázající DNA (sondou je DNA) northwesternový přenos - proteiny vázající RNA (sondou je RNA)

16 Typický hybridizační experiment Southernův přenos technika vyvinuta E.M. Southernem vlastní hybridizaci předchází elektroforéza DNA a přesávka (blotting) na pevnou podložku Běžné použití: detekce přítomnosti určitých genů v buněčné DNA sledování evoluční příbuznosti vzorků DNA z různých organismů

17 Southernův přenos - postup příprava a značení sondy rozdělení restrikčních fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr inkubace filtru se značenou jednořetězcovou sondou: hybridizace sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou na filtru odmytí nenavázané sondy detekce navázané sondy - vizualizace hybridů (autoradiografie)

18 Před přenosem na pevný podklad se provádí elektroforéza

19 Detekce specifického fragmenu kapilárním přenosem a hybridizací (Southern blotting) Přenos DNA z gelu na membránu a hybridizace se sondou Espero Publishing, s.r.o.

20 Ukázky provedení hybridizace SouthernHybridization.mov hybrid2.mov hybrid3.mov hybrid4.mov

21 Southernův přenos DNA obarvená etidium bromidem autoradiogram

22 Typy sond restrikční fragmenty dvouřetězcové DNA produkty PCR mrna izolovaná z buněk nebo tkání RNA transkripty in vitro syntetické oligonukleotidy

23 Způsoby značení sond prostřednictvím náhodných hexanukleotidů ( random primer DNA labeling ) posunem jednořetězcového zlomu ( nick translation ) koncovým značením značením vektoru s naklonovanou sondou značením transkriptů in vitro

24 Značení DNA pomocí náhodných oligonukleotidů Random primer DNA labeling k ssdna se přidá směs hexanukleotidů o různých sekvencích k těmto primerům připojuje DNA polymeráza značené nukleotidy

25 Značení DNA posunem jednořetězcového zlomu Nick translation vytvoření náhodných jednořetězcových zlomů DNázou I odstranění nukleotidů od místa zlomu DNA polymerázou I (exonukleázová aktivita 5-3 ) současné připojení značených nukleotidů k 3 konci zlomu

26 Značení konců fragmentů DNA a) značení 5 konců

27 Značení konců DNA fragmentů b) značení 3 konců

28 Značení 3 konců DNA T4-DNA-polymerázou

29 Příprava sondy značením vektoru

30 Příprava značených transkriptů

31 Izotop síry lze využít při značení nukleových kyselin Adenosin 5 -[α- 35 S] thio trifosfát

32 Detekce radioizotopů rozpad radioaktivních izotopů vede k uvolnění energie ve formě záření, které lze monitorovat kvalitativní: autoradiografie (vystavení rentgenového filmu účinkům radioaktivních částic) kvantitativní: -scintilační spektrometrie -scintilační činidla emitují světlo, když dojde k uvolnění elektronů s vysokým obsahem energie tzv. částic beta - radioaktivními izotopy -světelné pulzy lze detekovat

33 Neradioaktivní značení sond Digoxineninem Biotinem fluorescenčními značkami (fluorescein)

34 Neradioaktivní značení nukleových kyselin digoxigeninem

35 Detekce biotinu protilátkou s navázanou alkalickou fosfatázou (AP) Substrát pro AP: A) X-fosfát + NBT B) lumi-fosfát Enzymová reakce: odstranění fosfátové skupiny Detekce: A) po reakci s kyslíkem se produkt reakce zbarvuje B) emise světla, zachycení na filmu

36 Neradioaktivní značení nukleových kyselin biotinem K značení NK se používá např. biotin-16-dutp (analog TTP) Detekce DNA značené bio-dutp 1. avidin (streptavidin) konjugovaný s alkalickou fosfatázou chromogenní substrát (X-fosfát + NBT) barevná reakce 2. avidin (streptavidin) konjugovaný s luciferázou substrát (luciferin) emise světla detekce luminometricky 3. avidin (streptavidin) konjugovaný s křenovou peroxidázou substrát (luminol) emise světla detekce luminometricky

37 Neradioaktivní značení nukleových kyselin biotinem

38 kb 8,3 4,1 1,7 Elektroforetický gel Hybridizace s radioaktivně značenou sondou Hybridizace s neradioaktivně značenou sondou

39 Typy filtrů pro přenos nukleových kyselin nitrocelulózové filtry (0,1-0,45 μm) nylonové membrány (0,1-0,45 μm) chemicky modifikovaný papír nebo celulóza (DBM - diazobenzyloxymetyl, APT-aminofenyltioester)

40 Způsoby přenosu ( blotingu ) kapilární přenos elektroforetický přenos vakuový přenos

41 Kapilární přenos

42 Elektroforetický přenos

43 Vakuový přenos

44 Imobilizace nukleových kyselin na filtrech zapékání UV-crosslinking

45 Hybridizační postup Prehybridizace -zabránění nespecifické vazbě sondy na membránu (Denhardtův roztok, BLOTTO, heparin, heterologní DNA) Hybridizace - navázání sondy na komplementární sekvence (68 o C nebo 42 o C s formamidem) - lze volit různé podmínky ( stringence ) Promývání -odstranění nenavázané sondy (účinnost je ovlivněna teplotou, koncentrací solí) Detekce navázané sondy - autoradiografie - imunologická reakce barvení (luminiscence, fluorescence)

46 Stupeň stringence reakční podmínky pro hybridizaci umožňující vytváření hybridů jen plně nebo téměř plně komplementárním řetězcům (vysoká stringence) nebo i řetězcům s nižší mírou komplementarity (nízká stringence)

47 Tečková hybridizace ( dot blot ) Postup: sonikace nebo restrikce genomové DNA; linearizace plazmidové DNA denaturace nanesení vzorků DNA na podložku v podobě teček hybridizace se sondou hodnocení hybridizace (vizuálně, denzitometrem, β-spektrometrem)

48 Tečková hybridizace při analýze genové exprese Postup: hybridizační sondy specifické pro jednotlivé geny se nanesou na membránu pomocí vakuového filtračního přístroje membrána se vloží do hybridizačního roztoku obsahujícího molekuly RNA označené radioaktivním izotopem nebo fluorescenčním barvivem vizualizace označené RNA navázané na sondy

49 Hybridizace in situ detekce DNA nebo RNA v intaktních buňkách radioaktivními nebo fluorescenčními sondami kombinace hybridizace s mikroskopií Využití: prostorová lokalizace nukleových kyselin v buňkách a tkáních (hybridizace buněčné RNA) lokalizace genů (sekvencí) na chromozomech (hybridizace jaderné DNA)

50 Buňky produkující určitou mrna mohou být vizualizovány hybridizací in situ buňky vrcholové části hledíku Sonda je specifická pro mrna cyklinu a barví buňky tmavě modře, ostatní buňky jsou barveny DAPI (světlá modř)

51 Použití hybridizace in situ pro detekci genů na chromosomech (FISH) Použito 6 různých sond pro analýzu lidského metafázního chromozomu 5. Každá sonda vytváří 2 tečky na každém chromozomu (v mitóze je DNA zreplikována, tj. chromozom je složen ze dvou chromatid).

52 Postup hybridizace in situ při studiu chromozómů příprava cytologického preparátu fixace objektu na podložním sklíčku inkubace za přítomnosti ribonukleázy a NaOH (degradace RNA a denaturace DNA, chromozómy se částečně rozbalí a odhalí tak struktury DNA běžně skryté uvnitř chromozómů) hybridizace se značenou sondou autoradiografie nebo stanovení fluorescence barvení preparátu světelná nebo fluorescenční mikroskopie

53 Obvyklá fluorescenční barviva fluorescein (zelená fluorescence) rhodamin (červená fluorescence) kumarin (modrá fluorescence)

54 Využití hybridizačních technik v praxi

55 Detekce rekombinantních klonů Postup: -bakteriálních -fágových výsev na plotnu ( CFU/PFU) růst do přiměřené velikosti kolonií přenos na 1-2 filtry lýze bakterií denaturace DNA hybridizace se sondou autoradiografie vyhledání odpovídajících kolonií (plak) obsahujících hledanou sekvenci DNA

56 Detekce bakteriálního klonu nesoucího určitý fragment DNA

57 Detekce fágového klonu nesoucího určitý fragment DNA

58 Selektivní hybridizace restrikčních fragmentů (SRFH) Základní metodické kroky při SRFH štěpení celkové chromozomální DNA restrikčním enzymem separace fragmentů pomocí elektroforézy přenos fragmentů z gelu na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu hybridizace DNA navázané na membráně s jednou nebo více značenými sondami homologickými se zkoumanými geny detekce navázané sondy sondy značené radioizotopy + autoradiografie sondy značené neradioaktivně (digoxigenin, biotin, fluorescein, atd.) a následná detekce zahrnující enzym (AP) a barvotvorný substrát nebo enzym a chemiluminiscenční substrát vyhodnocení RFLP

59 Lokalizace specifických sekvencí v genomové DNA

60 Southernova analýza potomků heterozygotních rodičů (RFLP) Pokud je výskyt většího fragmentu spojen s nemocí je třeba sledovat dceru #1, sourozenci #2 a 3 jsou přenašeči

61 Princip selektivní hybridizace Příklad hybridizace se sondou specifickou pro16s rdna.

62 Přehled používaných sond pro SRFH u prokaryot 1. Náhodně klonované sondy Relativně stabilní oblasti bakteriálního chromozómu Použití: Legionella, Brucella 2. Sondy specifické pro geny kódující metabolické faktory nebo faktory virulence Sondy je nutné připravit individuálně pro určité bakteriální druhy, tzn. že tento přístup není použitelný obecně. Sekvence některých genů jsou velice konzervativní a jsou proto nevhodné k přípravě sond, naopak geny s určitou sekvenční variabilitou, případně geny vyskytující se ve více kopiích jsou velice vhodné. Použití: Pseudomonas aeruginosa: gen pro exotoxin A Staphylococcus aureus: mec (determinant meticilinové rezistence) Genově specifické sondy je možné využít k hybridizaci s makrorestrikčními fragmenty separovanými pomocí PFGE

63 3. Sondy odvozené z vícekopiových elementů typu inzerčních sekvencí a transpozonů Inzerční sekvence (IS) jsou transponovatelné repetitivní DNA elementy nacházející se v genomu prokaryotických a eukaryotických organizmů. Přítomnost elementu na určitých místech chromozómu je odrazem chromozomálních přestaveb během evoluce. Hybridizace se sondami připravenými z IS elementů vykazují vysokou reprodukovatelnost a vysokou diskriminační schopnost související s přítomností těchto elementů ve více lokusech na chromozómu. Bakteriální IS elementy mají na koncích obvykle bp dlouhé obrácené repetice, sonda se proto připravuje z vnitřních sekvencí elementu. Výběr restrikční endonukleázy a vhodného elementu pro přípravu sondy je nutné provést pro každý bakterální druh. Použití: Mycobacterium tuberculosis IS6110 další druhy mykobakterií Staphylococcus aureus IS257/431

64 4. Sondy připravené z krátkých repetitivních sekvencí Pro stanovení polymorfizmů metodou SRFH byly použity některékrátkérepetitivnísekvence obecně přítomné v genomech organizmů. Pouze některé repetice jsou obecně použitelné: 15-bp repetice z pozdního genu coa z bakteriofága M13 Escherichia coli Staphylococcus polymorfní tandemová repetice z mykobakterií Mycobacterium tuberculosis (MPTR-SRFH) repetitivní sekvence označovaná BOX Streptococcus pneumoniae náhodné trinukleotidové repetice jako např. (GTG)5 Salmonella, Shigella a Mycobacterium.

65 Ribotypizace - Sondy připravené z 16S rrna nebo 23S rrna (rdna-srfh, rdna-rflp) Ribotypizace je nejvšestrannější a nejvíce využívaná strategie pro získání informace o polymorfizmu bakteriálního genomu. Historie: bylo zjištěno, že sekvence ribozomální RNA mohou být využitelné ke stanovení příbuznosti organizmů poprvé byl použit termín ribotyp byla potvrzena teorie, že ribozomální RNA všech organizmů pochází ze společného předka byla patentována metoda charakterizace organizmů na základě ribozomálních DNA sekvencí ribotypizace byla použita pro srovnávací studii 41 různých bakteriálních druhů od široké využití v oblasti lékařské a veterinární epidemiologie, patologie, zjišťování kontaminace potravin atd Bylo zavedeno automatizované zařízení RiboPrinter pro fingerprinting DNA bakterií.

66 Charakteristika bakteriálního rrn operonu rrna-operon (rrn operon) se vyskytuje na bakteriálním chromozómu v několika kopiích. geny trna DNA P1 P2 16S-rRNA trna 23S-rRNA 5S-rRNA trna T1 T2 promotory pre-rrna transkripce terminátory posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) 16S-rRNA trna 23S-rRNA 5S-rRNA trna

67 Princip ribotypizace Ribotypizace zahrnuje fingerprinting restrikčních fragmentů genomové DNA, které obsahují celý nebo část genu kódujícího 16S a 23S rrna. Hlavní výhody ribotypizace: Sekvence genů pro ribozomální RNA jsou velice konzervativní, proto pro ribotypizaci všech Eubakterií může být použita jediná sonda. Jelikož většina bakterií obsahuje několik ribozomálních operonů, získáme po hybridizaci dostatečné množství fragmentů umožňujícíci mezidruhové i vnitrodruhové odlišení kmenů.

68 Automatizace ribotypizace

69 Sondy používané pro SRFH u eukaryot Jednolokusové sondy Hybridizují k jedné hypervariabilní oblasti genomu a vytvářejí vzor o 1-2 proužcích Pro identifikační účely se používá směs ( kokteil ) jednolokusových sond Jsou citlivější a dávají jednodušší obraz než multilokusové sondy Pro hybridizaci je třeba min 10 ng DNA Mnoholokusové sondy Hybridizují k repetitivním sekvencím vyskytujícím se s četností v genomu Při Southernově hybridizaci se detekuje proužků U člověka se využívá minisatelitů, z nichž 60 má společnou konvenční sekvenci Délka repeticí u každé z alel je polymorfní Pravděpodobnost, že 2 jedinci budou mít stejnou délku 1 repetice po štěpení restriktázou HinfI je 0,25. Pokud uvažujeme 36 detekovatelných lokusů (proužků), je pravděpodobnost výskytu stejného vzoru 0,25 36 =10-22 Nevýhodou je vysoký nárok na množství DNA (250 ng) Příklad hybridizace se sondou připravenou z minisatelitu v myoglobinovém genu s konvenční sekvencí GGAGGTGGGCAGGANG

70 Vytváření profilů DNA při identifikaci osob založeno na předpokladu, že s výjimkou jednovaječných dvojčat neexistují dvě osoby s identickou sekvencí nukleotidů lidský genom obsahuje mnoho rodin polymorfizmů DNA, které lze využít k vytváření profilu DNA (otisk, DNA fingerprint ) jde o krátké sekvence, které se vyskytují v podobě tandemových repeticí různé délky tandemové repetice variabilního počtu (VNTR, variable number of tandem repeats) profil DNA je specifický soubor pruhů získaných Southernovou hybridizací genomové DNA, která byla štěpena specifickým restrikčním enzymem profil DNA lze připravit z minimálního množství krve, spermatu, vlasových nebo jiných buněk po amplifikaci pomocí PCR

71 Využití VNTR při přípravě profilu DNA

72 Využití VNTR při testování otcovství izolace DNA z buněk otce, matky a dítěte štěpení DNA, elektroforéza, Southernův přenos všechny pruhy v zobrazení profilu DNA dítěte by měly být přítomny v kombinaci profilů jeho rodičů lze použít více sond

73 Soudní vyšetřování profil DNA se používá pro identifikaci zločinců od roku 1988 biologické vzorky testovány v kriminalistice pravděpodobnost shody profilů dvou různých osob je 1:10 9

74 Sledování nukleových kyselin elektronovou mikroskopií paprsek elektronů má menší vlnovou délku než viditelné světlo proto má EM vyšší rozlišovací schopnost než světelná mikroskopie zaostření paprsků elektronů je možné elektromagentickými čočkami (ne skleněnými) materiály absorbující elektrony účinněji jsou ve výsledném obrazu tmavší

75 Sledování nukleových kyselin elektronovou mikroskopií neošetřené molekuly nukleových kyselin nelze pozorovat EM úroveň absorpce elektronů je nízká musí se nejprve pokrýt atomy kovu (zdrojem je kovové vlákno ze zlata, platiny nebo woflramu)

76 Sledování hybridizace elektronovou mikroskopií sledování hybridů DNA-RNA se používá pro studium přítomnosti intronů počet a poloha smyček odpovídá počtu a poloze intronů

77 Testování podobnosti DNA na základě hybridizace DNA-DNA studium příbuznosti organismů základ pro studium jejich evolučních vztahů, tvorbu fylogenetických stromů otcem metody je Charles Sibley

78 Testování podobnosti DNA Postup: štěpení DNA na malé fragmenty a jejich separace (denaturace) smísení denaturovaných DNA ze srovnávaných vzorků renaturace méně příbuzných řetězců nebude perfektní, stabilita hybridů bude odpovídat míře komplementarity řetězců lze prověřit podle míry energie nutné pro jejich opětnou separaci DNA hybridy příbuzných řetězců budou denaturovat při vyšších teplotách

79 Testování podobnosti DNA touto metodou bylo zjištěno, že lidská a šimpanzí DNA je více příbuzná než vzhledem k DNA orangutanů a goril

80 Jak získat profily tání ( melting profiles )? DNA 1 se naváže filtr kolony přidá se DNA 2, dojde k hybridizaci směs se postupně zahřívá (teplota se zvyšuje po malých intervalech) po každém intervalu se kolony promyje fragmenty, které roztají se stanou jednořetězcovými a odmyjí se teploty, při kterých se DNA odmyje, odrážejí míru podobnosti sekvencí