EXPRESNÍ PROFIL VYBRANÝCH KANDIDÁTNÍCH MOLEKUL U PACIENTŮ S ENDOPROTÉZOU KYČLE

Transkript

1 UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA ZOOLOGIE EXPRESNÍ PROFIL VYBRANÝCH KANDIDÁTNÍCH MOLEKUL U PACIENTŮ S ENDOPROTÉZOU KYČLE Autor: Veronika Králíková Vedoucí práce: Dr. Ing. Eva Kriegová Diplomová práce 2011

2 PALACKY UNIVERSITY OLOMOUC FAKULTY OF SCIENCE DEPARTMENT OF ZOOLOGY EXPRESSION PROFILE OF SELECTED CANDIDATE MOLECULES IN PATIENTS WITH TOTAL HIP ARTHROPLASTY Author: Veronika Králíková Supervisor: Dr. Ing. Eva Kriegová Diploma thesis 2011

3 Prohlašuji, ţe diplomovou práci jsem vypracovala samostatně pod vedením Dr.Ing. Evy Kriegové. Veškerou literaturu a ostatní prameny, z nichţ jsem při přípravě práce čerpala, řádně cituji a uvádím v seznamu pouţité literatury. Svoluji se zapůjčováním této práce v knihovně PřF Univerzity Palackého v Olomouci.. Veronika Králíková

4 Poděkování: Děkuji v prvé řadě své školitelce Dr. Ing. Evě Kriegové za odbornou pomoc, vedení při vypracování diplomové práce a stálou ochotu ke konzultacím. Děkuji také Mgr. Tereze Tománkové za předání praktických zkušeností, odbornou pomoc, ochotu a pomoc při interpretaci dat a sepisování práce. V neposlední řadě děkuji Prof. MUDr. Martinu Petřkovi CSc. za poskytnutou příleţitost pracovat na diplomové práci v Laboratoři imunogenomiky a imunoproteomiky Ústavu imunologie při LF UP Olomouc. Děkuji Doc. MUDr. Jiřímu Gallo, Ph.D. za ochotu a spolupráci při poskytnutí vzorků ortopedických pacientů pro potřeby této práce. Taktéţ děkuji celému kolektivu pracovníků Ústavu imunologie LF UP Olomouc za vstřícný přístup. Diplomová práce vznikla za podpory projektu CZ.1.05/2.1.00/ a interní grantové agentury PU LF_2010_008.

5 ABSTRAKT Těţká poškození kyčelního nebo kolenního kloubu mohou být řešena operačně, pomocí totální endoprotézy (TEP). Komplikací těchto léčebných postupů však často bývá periprotetická osteolýza, která je způsobena částečkami uvolňovanými z povrchu protéz. Částice spouští imunitní reakci: dochází k zánětlivé reakci a zvýšené osteoklastogenezi. Ukazuje se však, ţe někteří pacienti jsou vůči osteolýze vnímavější. Cílem této práce bylo studovat vyuţitelnost kultivací periferních buněk k predikci osteolýzy u pacientů s TEP. Sledovali jsme proto proteinovou expresi vybraných kandidátních molekul u periferních mononukleárních buněk (PBMC) po stimulaci prozánětlivým lipopolysacharidem (LPS), které byly získány u pacientů s totální endoprotézou kyčle. Skupina pacientů (n=32) byla dále rozdělena dle ţivotnosti endoprotézy na pacienty bez komplikací a pacienty s nutností reoperace z důvodu osteolýzy. Kandidátní molekuly (cytokiny, jejich receptory a další regulační molekuly) byly vybrány na základě asociace genových polymorfismů s vývojem onemocnění popsané v literatuře a dle výsledků vlastních genetických analýz Laboratoře imunogenomiky a imunoproteomiky. Proteinové koncentrace byly měřeny v získaných supernatantech a sérech pomocí Luminex technologie. Při studiu proteinových expresních profilů cytokinů v supernatantech, odebraných po kultivaci PBMC buněk pacientů s totální endoprotézou kyčle, jsme pozorovali zvýšenou expresi cytokinů interleukinu (IL) 2, interleukinu (IL) 5, interferonu gamma (IFN-γ) a vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) u pacientů se závaţnou osteolýzou v porovnání se skupinou pacientů s mírnou osteolýzou. Při porovnání skupin pacientů s běţným genotypem TNF -238 GG a závaţnou nebo mírnou osteolýzou jsme pak pozorovali signifikantní rozdíly v expresi cytokinů IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a moncytů (GM-CSF), tumor nekrotizujícího faktoru α (TNF-α) a IFN-γ. U pacientů nosičů vzácné TNF -238*A alely se závaţnou osteolýzou byla pozorována zvýšená exprese VEGF v porovnání s nenosiči této alely se závaţnou i mírnou osteolýzou, coţ naznačuje, ţe k rozvoji periprotetické osteolýzy mohou přispívat i jiné neţ zánětlivé molekuly, a mohou být tedy aktivovány i jiné regulační dráhy. V sérech odebraných pacientům s totální endoprotézou jsme detekovali pouze cytokiny IL- 6, L TNF-α a VEGF, z nichţ pouze u cytokinu IL-6 jsme pozorovali rozdíly v expresi mezi jednotlivými skupinami pacientů.

6 Naše výsledky prokázaly změny v proteinovém expresním profilu cytokinů po stimulaci PBMC prozánětlivým LPS u pacientů s osteolýzou ve srovnání s pacienty bez známek osteolýzy. Potvrdili jsme také vliv genotypu TNF -238 na expresní profil cytokinů u pacientů se závaţnou osteolýzou. Naše nálezy tedy podporují teorii vyuţitelnosti kultivací buněk izolovaných z periferní krve pro predikci komplikací pacientů s TEP. Klíčová slova: totální endoprotéza kyčle, osteolýza, aseptické uvolnění, cytokiny, jednonukleotidové polymorfismy

7 ABSTRACT Severe hip- or knee-joint damages may be treated surgically, with total endoprosthesis. These medical procedures are, however, quite often complicated by periprosthetic osteolysis, which is caused by particles released from the surface of the prosthesis. The particles trigger the immune response characteristic by the inflammatory reaction and increased osteoclastogenesis. However, it appears that some patients are more susceptible to osteolysis. The aim of this work was to study the usefulness of culturing of peripheral cells for the prediction of osteolysis in patients with total hip arthroplasty (THA). We therefore investigated the protein expression of selected candidate molecules in peripheral mononuclear cells (PBMC) after stimulation with proinflamatory lipopolysaccharide (LPS); cells were obtained in patients with total hip arthroplasty. The group of 32 patients was divided according to the lifetime of the prosthesis and in groups of patients without complications and those in need of reoperation because of osteolysis. Candidate molecules (cytokines, their receptors and other regulatory molecules) were chosen on the basis of the association of gene polymorphisms with the osteolysis described in the literature and own results of genetic analysis executed in the Laboratory of immunogenomics and proteomics. Protein concentrations were measured in obtained supernatants and sera using Luminex technology. When studying protein expression profiles of cytokines in the supernatants collected after cultivation of PBMC cells of patients with total hip arthroplasty, we observed increased expression of cytokines interleukin (IL) 2, interleukin (IL) 5, interferon gamma (IFN- ) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in patients with severe osteolysis compared with a group of patients with mild osteolysis. We also observed significant differences in the expression of cytokines IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), tumor necrosis factor- (TNF- ) and INF- when comparing groups of patients with common TNF-238 GG genotype and severe or mild osteolysis. For patients - carriers of rare TNF-238*A allele with severe osteolysis increased expression of VEGF was observed when compared with non carriers of this allele with severe and moderate osteolysis, suggesting that the development of periprosthetic osteolysis may also be influenced by others than inflammatory molecules and may therefore be activated by other regulatory pathways. In serum samples in patients with total endoprosthesis, we detected only the cytokines IL-6,

8 IL-8, TNF- and VEGF, of which only for IL-6 we observed differences in expression between groups of patients. Our results showed changes in protein expression profiles of cytokines after stimulation of PBMC with proinflammatory LPS in patients with severe osteolysis compared with patients with mild osteolysis. We confirmed the effect of TNF-238 genotype on the expression profile of cytokines in patients with severe osteolysis. Our findings therefore support the theory of usability of cultivations of cells isolated from peripheral blood for the prediction of complications in patients with TEP. Key words: total hip arthroplasty, osteolysis, aseptic loosening, cytokines, singlenucleotide polymorphism

9 OBSAH ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST TOTÁLNÍ ENDOPROTÉZA Totální endoprotéza kyčle Totální endoprotéza kolene REMODELACE KOSTI ASEPTICKÉ UVOLNĚNÍ A PERIPROTETICKÁ OSTEOLÝZA GENETICKÁ VNÍMAVOST KE VZNIKU PPOL CYTOKINY Klasifikace cytokinů Charakteristika vybraných kandidátních cytokinů HYPOTÉZA CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST POUŢITÝ MATERIÁL PRŮBĚH EXPERIMENTU Výběr pacientů Příprava reagencií Odběr periferní krve Zpracování krevního séra Izolace mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) Kultivace PBMC Zpracování PBMC po kultivaci Technologie přístroje Luminex Postup stanovení zvolených cytokinů pomocí 12plex Human Inflammation Multiplex Kitu Zpracování výsledků a statistické vyhodnocení VÝSLEDKY VÝSLEDKY OPTIMALIZACE LIPOPOLYSACHARIDU (LPS) VÝSLEDKY MĚŘENÍ HLADINY CYTOKINŮ V SUPERNATANTU IL-1β IL IL IL IL IL IL

10 IL GM-CSF IFN-γ TNF-α VEGF VÝSLEDKY MĚŘENÍ HLADINY CYTOKINŮ V KREVNÍM SÉRU IL IL TNF-α VEGF DISKUSE ZÁVĚR PŘEHLED ZKRATEK SEZNAM PŘÍLOH POUŽITÉ ZDROJE PŘÍLOHA I PŘÍLOHA II... 91

11 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 7 ÚVOD Totální endoprotézy jsou operačním řešením těţkých poškození kyčelního nebo kolenního kloubu a napomáhají zlepšit kvalitu ţivota pacientů. Tento léčebný postup však provázejí také komplikace, přičemţ k nejvýznamnějším z nich patří periprotetická osteolýza a aseptické uvolnění. Tyto procesy jsou reakcí na otěrové částice, které se uvolňují z povrchu kloubní náhrady a vyvolávají zvýšenou osteoklastogenezi a zánětlivou odpověď. Na základě analogie s jinými chorobami se zánětlivou sloţkou lze předpokládat, ţe se na individuální predispozici k periprotetické osteolýze a aseptickému uvolnění mohou podílet také genetické faktory. Výzkum a znalost genů, které ovlivňují osteolýzu a aseptické uvolnění a následné odmítnutí implantátu, se dosud nacházejí v úplných počátcích. Objevují se první geneticky zaměřené práce, avšak dosud nejsou známy funkční dopady genotypu na fenotyp a změny v proteinové expresi u různých genotypů. Výzkum faktorů, podílejících se na osteolýze a aseptickém uvolnění, můţe přispět k pochopení patogeneze a určit klíčové molekuly těchto neţádoucích procesů. Současné výzkumy ukazují na účast celé řady pro-zánětlivých a pro-osteoklastických cytokinů, matrix metaloproteináz a dalších regulačních molekul. V budoucnu by znalost expresních profilů klíčových molekul mohla přispět ke stanovení rizika odmítnutí endoprotézy. Příspěvkem do dané problematiky je i tato práce, která se zabývá moţností vyuţití kultivací mononukleárních buněk periferní krve získaných od pacientů s totální endoprotézou kyčle a následným měřením proteinových expresních profilů v získaných supernatantech k individualizaci léčby a moţnosti predikce komplikací vedoucích k selhání totální endoprotézy. 7

12 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 8 1. TEORETICKÁ ČÁST 1.1. Totální endoprotéza Kaţdoročně je po celém světě implantován přes jeden milión totálních endoprotéz, přičemţ u 80% implantátů se jedná o totální endoprotézu kyčelního kloubu (KONTTINEN et al. 1997). Díky pokrokům v operační technice funguje u starších pacientů více neţ 75% kyčelních implantátů aţ po dobu 25 let (BERRY et al. 2002). Narůstá také počet implantátů u mladších a aktivnějších pacientů (HEISEL et al. 2003), u nichţ je však i přes pouţití nejvyspělejších technologií ţivotnost implantátů omezená (HEISEL et al. 2003; BERRYet al. 2002; CALLAGHAN et al. 1998) a po určité době je nutná revizní operace Totální endoprotéza kyčle Totální endoprotéza kyčelního kloubu (TEP) se pouţívá u pacientů s těţkým poškozením kyčelního kloubu, se zlomeninami v oblasti krčku stehenní kosti a u pacientů s kostními nádory v oblasti kyčlí. Aloplastiky kyčle patří mezi velmi časté výkony a lze očekávat jejich další nárůst v souvislosti se stárnoucí populací a zvyšující se průměrnou délkou ţivota. Náhrada kyčle uleví pacientům od bolesti a zlepšuje kvalitu jejich ţivota LEARMONTH et al. 2007). Implantace totální endoprotézy kyčle se provádí v celkové nebo epidurální anestezii a spočívá v náhradě jamky i hlavice kosti stehenní [ d=70]. Stavba totální endoprotézy Kaţdá endoprotéza se skládá z tzv. dříku, který je zaveden do dřeňového kanálu stehenní kosti. Na krček tohoto dříku je nasazována hlavička, která je vyráběna buď ze stejné kovové slitiny jako dřík, nebo ze speciální keramiky. Velmi důleţitou vlastností u těchto hlaviček je jejich maximální hladkost, neboť čím hladší je jejich povrch, tím menší je opotřebení polyetylenové vloţky v kloubní jamce umělého kyčelního kloubu při kaţdém pohybu (SOSNA et al. 1999). Další důleţitou vlastností je velikost průměru hlavičky: čím menší je hlavička, tím menší je třecí plocha a otěr, a tedy můţe být i silnější inzert, který pak odolává asymetrickému opotřebení (DUNGL et al. 2005). Z hlediska volby materiálu máme k dispozici hlavičky kovové nebo keramické. Kovové hlavičky jsou vyráběny z antikorozní oceli, nebo z CCM (chrom-cr, kobalt-co, molybden-mo) slitiny. Keramické hlavičky jsou buď na bázi korundové, nebo zirkoniové a mají výhodu ve velké 8

13 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 9 odolnosti vůči otěru a také lepší lubrikační charakteristiku. Jejich relativní nevýhodou je křehkost (DUNGL et al. 2005). Další komponentou umělého kloubu je jamka. Typů jamek je celá řada, liší se jednak tvarem některé mají tvar tzv. sférický (polokulovitý), jiné mají tvar konický (kuţelovitý); dále se odlišují materiálem, ze kterého jsou vyráběny a také povrchovou úpravou (SOSNA et al. 1999). Materiál povrchů totálních endoprotéz V současnosti se nejčastěji pouţívá kontaktní povrch typu kov-polyetylen. Kontaktní povrch typu keramika-polyetylen je druhým nejčastěji pouţívaným rozhraním, oproti předchozímu typu je zde aţ o 50% sníţen výskyt otěrových částic. Polyetylen s velmi vysokou molekulární hmotností (ultra-high molecular weight polyetylene, UHMWPE) je pouţíván jako nosný povrch TEP jiţ více neţ třicet let. Přeţívání u kolenní i kyčelní náhrady je vyšší neţ 90% po deseti letech a asi 80% po dvaceti letech (DUNGL et al. 2005). Materiály na povrchu hlaviček mohou být kovové (CoCr, nerez, ocel, titan), nebo keramické ze slinuté korundové, případně zirkoniové keramiky. Titan jakoţto relativně měkký kov byl však pouţíván spíše v minulosti. (DUNGL et al. 2005). Typy totální endoprotézy TEP kyčle rozdělujeme podle typu ukotvení do kosti na cementovanou, necementovanou a hybridní nebo typ Hip resurfacing [ U cementované TEP (Obr.č.1) jsou obě komponenty fixovány kostním cementem (polymethylmetakrylátem), který po smíchání práškové a tekuté sloţky vytvoří exotermickou reakcí velmi pevnou strukturu, fixující komponenty v kosti [ 9

14 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 10 Obr.č.1 Cementovaná kloubní náhrada Převzato z: U necementované TEP (Obr.č.2) jsou komponenty fixovány do kosti bez cementové mezivrstvy. Tyto endoprotézy jsou vyrobeny z titanu, který umoţňuje kosti přirůst k povrchu implantátu. Zpravidla bývají implantovány mladším lidem, neboť je u nich technicky jednodušší případná reimplantace. Obr.č.2 Necementovaná kloubní náhrada Převzato z: 10

15 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 11 Endoprotézy, u nichţ je cementována pouze jedna z jeho částí (obvykle dřík) a druhá část (obvykle jamka) je připevněna bez cementu, označujeme jako hybridní (Obr.č.3). [ Obr.č.3 Hybridní kloubní náhrada Převzato z: U indikovaných pacientů lze provádět také náhradu kloubu typu Hip resurfacing (Obr.č.4). Konstrukce implantátu se snaţí maximálně anatomicky a biomechanicky přiblíţit zdravému kyčelnímu kloubu. Tento typ se vyuţívá u pacientů, u kterých nedošlo k rozsáhlým anatomickým změnám v oblasti kyčelního kloubu. Pouţité materiály jsou odolné a mají nízký otěr (kov-kov bez PE), a tedy splňují poţadavky na doţivotní plnění funkce [ 11

16 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 12 Obr.č.4 Náhrada kloubu typu Hip resurfacing Převzato z: Totální endoprotéza kolene Počet onemocnění, která mohou být léčena pomocí náhrady kolenního kloubu, stále narůstá. Mezi nejčastější patří degenerativní onemocnění kolenního kloubu gonartróza, poškození kolenního kloubu úrazem poúrazová destrukce kloubu, destrukce kloubu v důsledku revmatického onemocnění, systémové choroby pohybového aparátu, nádorová onemocnění (VAVŘÍK et al. 2005). Totální endoprotéza kolene (Obr.č.5) se stejně jako náhrada kyčle provádí v anestezii a spočívá v náhradě opotřebených kloubních ploch implantáty [ d=71]. Stejně jako u totální endoprotézy kyčle rozlišujeme endoprotézy kolene na cementované, necementované a hybridní. Kloubní povrch čéšky můţe být v indikovaných případech pokryt také čéškou z umělé hmoty, která při pohybu klouţe po kovovém štítu femorálního implantátu. Před implantací definitivní endoprotézy pacientovi je přezkoušen pohyb a stabilita kloubu na zkušební protéze, poté je na kostní lůţko nasazen definitivní implantát. Fixace ke kosti je zajištěna pomocí kostního cementu nebo díky povrchu implantátu, umoţňujícímu přímý vrůst do kosti (VAVŘÍK et al. 2005). 12

17 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 13 Obr.č.5 Totální endoprotéza kolene Převzato z: Remodelace kosti Funkce kosti a její remodelace je závislá na koordinované činnosti specifických kostních buněk: osteoklastů, osteoblastů a osteocytů (ZIMA, 2007). Osteocyty se uplatňují jako mechanosenzory. Osteoblasty, které zůstaly na povrchu kosti po dokončení předchozího remodelačního cyklu, tzv. lining cells, se podílejí na další remodelaci kosti. Stupeň remodelace závisí na frekvenci aktivace osteoklastů a v různých úsecích skeletu je v důsledku rozdílného mikroprostředí také různý stupeň remodelace (Obr.č.6). Sekvence remodelačních dějů je vţdy stejná: aktivace prekurzorů osteoklastů, osteoplastická osteoresorpce a osteoplastická novotvorba kosti, zajišťující úplné nebo částečné zaplnění resorpční dutiny (ZIMA, 2007). K remodelaci kosti dochází v tzv. základních remodelačních jednotkách kosti (basic multicellular unit BMU; bone remodeling unit BRU), kde spolu koordinovaně spolupracují specializované skupiny kostních buněk (ZIMA, 2007). U zdravých dospělých osob prodělává remodelaci v kaţdém okamţiku přibliţně 10 15% kostního povrchu a podílí se na ní přibliţně 1 milion BMU. Zbývající kost je relativně v klidovém stadiu, kdy je povrch kosti pokryt 1-2 µm vrstvou nemineralizované kostní matrix a vrstvou kostních buněk osteoblastů (ZIMA, 2007). Remodelace kosti je rovnováţný proces: 13

18 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 14 resorpci kosti vţdy předchází její formování a u mladých jedinců je mnoţství nově vytvořené a resorbované kosti podobné (GIL et al. 2006). Obr.č.6 Indukce osteoklastů, diferenciace, přežívání a aktivita. Osteoklasty jsou diferencovány díky progenitoru GM-CFU v kostní dřeni. První prekurzory osteoklastů iniciují expresi RANK a migrují do osifikující kosti (BMU) za specifické signalizace, kde je diferenciace dokončena. Zralé osteoklasty vyţadují extracelulární signály pro přeţívání a aktivitu, která je spojena s osteolýzou. Převzato z GALLO et al Remodelace kosti probíhá v několika fázích. Z klidové fáze přechází kost do fáze aktivační, kdy dochází k uvolňování osteoblastů (lining cells) z povrchu kosti a narušení membrány působením kolagenáz. Tím se odkrývá mineralizovaný kostní povrch, na který se mohou přichytit osteoklasty. Ty pak zahajují proces kostní resorpce a odbourávají kostní matrix (GIL et al. 2006). Při tomto procesu se uvolňují z matrix růstové faktory TGF-β 14

19 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 15 (transforming growth factor), PDGF (platelet derived growth factor), IGF-I a II (insulinlike growth factor I, II), které přitahují k povrchu kosti preosteoblasty a stimulují jejich proliferaci (LIND et al. 1995). Preosteoblasty syntetizují látky, umoţňující přichycení nové tkáně, a exprimují proteiny (BMP, bone morphogenic proteins), zodpovědné za diferenciaci. Diferencované osteoblasty pak syntetizují kostní matrix, která zaplňuje odbourané úseky kosti. Poslední fází je mineralizace kosti, která nastupuje asi 30 dní po syntéze kostní matrix a přechází následně ve fázi klidovou (GIL et al. 2006). Rovnováha mezi formováním a odbouráváním kosti je ovlivňována řadou genetických, mechanických, hormonálních a jiných faktorů. Genetické faktory určují objem kostní hmoty: jedinci černé pleti mají větší objem kostní hmoty neţ běloši, kteří mají zase větší objem kostní hmoty neţ asiaté (GRANT a RALSTON, 1997). Mechanické faktory rovněţ ovlivňují vývoj kosti: předpokládá se, ţe svalová aktivita je přenášena na kost, kde je detekována osteocyty. Ty pak produkují regulátory, jako např. prostaglandiny NO a IGF-I, které stimulují aktivitu osteoblastů a podporují tak formování kosti (MOREY a BAYLINK, 1978). Normální vývoj kosti je také ovlivňován funkcí endokrinního systému, zejména růstovým hormonem (GH, growth hormone) a kalciotropními hormony, jako jsou parathyroidní hormon (PTH), kalcitonin a metabolity vitamínu D (GIL et al. 2006). Důleţitou úlohu v remodelaci kosti sehrávají také lokální faktory, z nichţ nejvýznamnějšími jsou růstové faktory (IGF-I, -II, TGF-β, PDGF, VEGF, TNF) cytokiny (IL-1, IL-6, IL-11, prostaglandiny) a proteiny kostní matrix (GIL et al. 2006). V procesu vyzrávání a aktivace osteoklastů hrají důleţitou úlohu také proteiny RANK (Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B) a jeho ligand, RANKL (Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B ligand) (BOYLE et al. 2003). RANKL se váţe na receptory na povrchu preosteoklastů a stimuluje jejich diferenciaci ve zralé osteoklasty, které zahajují proces osteoresorpce (STEJSKAL et al. 2001). Po aktivaci RANK jeho ligandem dochází k indukci TNF-α a IL-1, které podporují expresi RANKL v buňkách stromatu kostní dřeně, T-lymfocytech, fibroblastech a osteoblastech a napomáhají tak vyzrávání osteoklastů (GALLO et al. 2008). Naopak osteoprotegerin (OPG), produkovaný dendritickými buňkami, fibroblasty, osteoblasty a jejich prekurzory (KORENY et al. 2006), brzdí formování osteoklastů vazbou na RANKL (BOYCE et al. 2006). Koncentrace OPG a RANKL, a tedy míra diferenciace osteoklastů, je regulována řadou osteotropních hormonů a cytokinů (STEJSKAL et al. 2001). Lokální poměr mezi OPG a RANKL 15

20 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 16 významně ovlivňuje rozsah periprotetické osteolýzy, coţ bylo ukázano v několika nedávných studiích (HOLDING et al. 2006, MANDELIN et al. 2003, VEIGL et al. 2007) Aseptické uvolnění a periprotetická osteolýza Aseptické uvolnění je proces, při kterém dochází k uvolnění mezi implantátem a kostí. K této komplikaci dochází u cementovaných i necementovaných totálních endoprotéz kyčelního kloubu [ Působením mikročástic polyetylénu, kovu, nebo kostního cementu vzniká granulom. Růstem tohoto granulomu, pak na rozhraní implantátu a kosti dochází ke kostní resorpci a vznikají kostní defekty, jeţ vedou k uvolnění implantátu. [ Osteolýza je, spolu s výše uvedeným aseptickým uvolněním, současným největším problémem endoprotetiky kyčle a kolena. Periprotetická osteolýza (PPOL) je definována jako vystupňovaná resorpce kosti, související s působením velmi malých částic (0,1 aţ 10 µm), uvolňovaných z povrchu kloubní náhrady (ŠLOUF et al. 2004). Polyetylenová jamka acetabula se pohybuje proti tvrdé kovové nebo keramické hlavici femuru, opotřebovává ji a uvolňuje mnoţství částic, které mohou způsobit zánětlivou reakci a osteolýzu (např. WITT a SWANN, 1991; McGRATH et al. 2001). Volbou vhodného materiálu endoprotézy lze počet částic i jejich biologickou aktivitu sníţit, ne však zcela odstranit (CAPELLO et al. 2005; DORR a LONG, 2005). Implantáty s rychlostí opotřebení do 0,05 mm/rok mívají velmi nízkou četnost periprotetických osteolýz a uvolnění, zatímco implantáty s rychlostí otěru větší neţ 0,3 mm/rok mají signifikantně vyšší riziko vzniku a rozvoje osteolýzy (DUMBLETON et al. 2002). Při periprotetické osteolýze spouštějí uvolňované částice kaskádu reakcí (Obr.č.7), na jejímţ konci jsou zralé osteoklasty a metaloproteinázy, které realizují kostní resorpci (GALLO et al. 2002). Celý proces proto bývá označován jako částicová nemoc (HARRIS, 1994). V patogenezi PPOL hrají nejvýznamnější roli částice polyetylenu (PE), které mají největší potenciál způsobovat PPOL, a proto je někdy částicová nemoc označována jako polyetylenová (GALLO et al. 2007). K nastartování kaskády komplexní odpovědi je nutná fagocytóza PE částic makrofágy, které spouštějí expresi genů kódujících syntézu matrix metaloproteináz, cytokinů, chemokinů, prostaglandinu E 2 a dalších biologických látek (GALLO et al. 2007). Z řad cytokinů se jedná o pro-zánětlivé cytokiny, včetně interleukinu-1 (IL-1), interleukinu-6 (IL-6), interleukinu-18 (IL-18) a tumor 16

21 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 17 nekrotizujícího faktoru alfa (TNF- ) (GORDON et al. 2010). Tyto uvolněné faktory zvyšují vaskulární permeabilitu, aktivují další monocyty, vrozenou i získanou imunitu a podporují tvorbu a aktivaci mnohojaderných osteoklastů. Všechny tyto procesy vedou k posunu homeostázy kosti směrem k resorpci (GALLO et al. 2008). Kromě makrofágů reagují s částicemi také fibroblasty, osteoblasty a některé další buňky. Pokud jsou částice příliš velké na to, aby mohly být fagocytovány, dochází k tvorbě mnohojaderných obřích buněk (MA et al. 2005), jejichţ příspěvek k periprotetické osteolýze není dosud objasněn (GALLO et al. 2008). 17

22 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 18 Obr.č.7 Schématické znázornění drah, které se účastní periprotetické osteolýzy. Mikroprostředí remodelační kostní jednotky ( bone multicellular unit BMU) je regulováno buď signály z BMU buněk (osteoblasty, osteoklasty, buňkami stromatu) nebo přitahovanými buňkami (např. makrofágy, lymfocyty, neutrofily, dendritickými buňkami). Tyto signály mohou buď stimulovat (M-CSF, RANKL, TNF-α, IL-1β, otěrové částice, CD40L) nebo utlumit (OPG, IL-6, IFN-γ, TGF-β, Wnt, BMP-2, IL-4) aktivitu a formování osteoklastů. Stimulace osteoklastů se účastní i další molekuly: např. PGE2, COX-1, COX-2 (prostanoidní dráha), chemokiny (např. MCP-1/CCL2, CXCL8/IL-8, CXCL-12). Převzato z GALLO et al Genetická vnímavost ke vzniku PPOL Vzhledem k individuální vnímavosti pacientů k rozvoji PPOL a aseptického uvolnění je předpokládána účast genetické variability. Předpokládá se, ţe mezi pacienty existují jedinci konstitutivně citlivější ke vzniku PPOL (GALLO et al. 2007). Kandidátními geny, které se mohou podílet na vnímavosti k PPOL, jsou zejména geny pro cytokiny a jejich receptory, které hrají klíčovou úlohu v rozvoji PPOL (MANDELIN et al. 2005). Produkce a funkce cytokinů je ovlivňována variantami jejich genů, tj. genovým polymorfismem (GALLO et al. 2007). Příkladem takového polymorfismu mohou být varianty promotoru genu pro cytokin TNF, kdy bylo prokázáno, ţe záměnou jednoho nukleotidu (SNP, single nucleotide polymorphism) v promotorové oblasti genu pro TNF dochází ke zvýšení transkripční aktivity, a tedy i mnoţství produkovaného TNF-α (GALLO et al. 2007). V případě TNF byla také nalezena asociace mezi alelami -238A a -863C a časným aseptickým uvolněním TEP kyčle (MALIK et al. 2006). Nositelé alely TNF -238A pak měli signifikantně vyšší pravděpodobnost vzniku PPOL; jednalo se navíc o faktor nezávislý na ostatních rizicích (WILKINSON et al. 2003). Další studie dále upozornila na polymorfismy molekul signalizační dráhy RANKL/RANK/OPG (MALIK et al. 2006). U případů s aseptickým selháním byla zjištěna častější alela A, resp. genotyp A/A na pozici 163 promotoru genu pro OPG, a dále se pak u aseptických uvolnění častěji vyskytovala alela T genu kódujícího syntézu RANK receptoru (RANK+575) (GALLO et 18

23 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 19 al. 2007). V nedávné studii laboratoře Imunogenomiky a imunoproteomiky Ústavu imunologie při LF UP Olomouc byla také prokázána asociace alely TNF-238A a IL6-174G se závaţnou osteolýzou, naopak nosiči alely IL2-330G měli mírnější průběh osteolýzy (GALLO et al. 2009). V další studii pak byla studována asociace polymorfismů genu P2RX7 (purinergic receptor P2X, ligand-gated ion channel 7), který je významným regulátorem zánětlivé odpovědi a procesu remodelace kosti, s rozvojem PPOL a rizikem selhání TEP (MRAZEK et al. 2009). Nebyla pozorována signifikantní asociace variant genu P2RX7 s rozvojem PPOL, avšak nosiči vzácných variant tohoto genu byli početnější ve skupině pacientů, u kterých došlo k revizi TEP (MRAZEK et al. 2009) Cytokiny Cytokiny jsou proteinové molekuly úzce vázané s imunitním systémem, jejichţ spektrum působení je široké a zdaleka ne úplně objasněné. Jsou důleţitými regulačními faktory imunitního systému: regulují zánět, uplatňují se v buněčné komunikaci, při procesech buněčného růstu a diferenciace různých typů buněk apod. (HOŘEJŠÍ a BARTŮŇKOVÁ, 2009). Jejich funkčnost je podmíněna vazbou na specifické receptory. Mohou existovat jak volné, tak vázané na membránu, přičemţ membránové cytokiny jsou ukotveny v cytoplazmatické membráně pomocí hydrofobní sekvence aminokyselin. Charakteristickou vlastností těchto molekul je jejich způsob účinku: jsou pleiotropní (působí na různé druhy buněk), působí v kaskádách a jsou také redundantní, coţ umoţňuje zastoupení jednotlivých cytokinů jinými v rámci cytokinového systému. Syntéza cytokinů začíná vţdy po buněčné aktivaci a následné transkripci genů, samotná sekrece cytokinů pak bývá krátkodobá. Spektrum působení cytokinů je různorodé, ať uţ se jedná o působení apokrinní, endokrinní, nebo parakrinní. Sloţité spolupůsobení i antagonistické interakce cytokinů jsou dosud jen málo prozkoumané a spolupůsobení cytokinových molekul v takzvané cytokinové síti skýtá široký prostor pro budoucí výzkum (HOŘEJŠÍ a BARTŮŇKOVÁ, 2009) Klasifikace cytokinů Díky širokému spektru funkcí cytokinových molekul, které se navíc často překrývají, je klasifikace cytokinů spíše orientační. Dle nejnovějších výzkumů lze předpokládat, ţe 19

24 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 20 samotná funkce cytokinu je dána charakterem receptoru, na nějţ se cytokin váţe, nikoliv cytokinem samotným (HOŘEJŠÍ a BARTŮŇKOVÁ, 2009). Podle dosud všeobecně přijímaných pravidel lze klasifikovat cytokiny do následujících skupin: interleukiny (např. IL-1, IL-2), chemokiny (např. CCL5, CXCL8 a řada příbuzných chemotakticky aktivních molekul), interferony (INF-α,β,γ), transformující růstové faktory (TGF-α, TGF-β), granulocytární faktory stimulující kolonie (G-CSF, GM-CSF), tumor nekrotizující faktory (TNF-α,β) a další růstové faktory (SCF, EPO, FGF, NGF). Dále je pak moţné třídění cytokinů na hemopoietiny, interferony a rodinu IL-10, skupinu IL-1, skupinu IL-12, skupinu TNF, skupinu TGF-β, chemokiny a ostatní struktury nepodobné jiným cytokinům. Cytokiny lze také dělit na pro-zánětlivé (podporující zánětlivou reakci), proti-zánětlivé (s převáţně inhibičním účinkem na zánětlivé reakce), cytokiny s aktivitou růstových faktorů hemopoetických buněk, cytokiny uplatňující se v humorální a buněčně zprostředkované imunitě a cytokiny s antivirovým účinkem (HOŘEJŠÍ a BARTŮŇKOVÁ, 2009). Receptory cytokinů Cytokinové receptory bývají tvořeny obvykle dvěma aţ třemi podjednotkami. Pomocí jedné dochází k vazbě cytokinu a ostatní zajišťují spojení se signalizačními intracelulárními molekulami. Tyto signalizační podjednotky bývají sdíleny několika různými cytokinovými receptory; na základě toho je moţné receptory pro cytokiny zařadit do několika skupin tzv. receptorových rodin (HOŘEJŠÍ a BARTŮŇKOVÁ, 2009). Výsledek signalizace přes cytokinové receptory závisí na typu buňky, typu signálu a na spolupůsobení dalších signálů. Výsledkem mohou být procesy od stimulace buněčného dělení a diferenciace, přes spouštění efektorových mechanismů aţ po zablokování buněčného cyklu a indukce apoptózy (HOŘEJŠÍ a BARTŮŇKOVÁ, 2009) Charakteristika vybraných kandidátních cytokinů TNF α Název pochází z angl. tumour necrosis factor a bývá označován také jako kachektin (Obr.č.8). Jedná se o trimer s molekulovou hmotností 17 kda a skládá se ze 157 aminokyselin. Gen pro TNF-α se nachází v hlavním histokompatibilním komplexu (MHC), u člověka na chromozomu 6 (BUC a FERENČÍK, 1994). TNF-α je produkován monocyty, makrofágy a NK buňkami. Je mediátorem nespecifické i specifické imunity, a také 20

25 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 21 důleţitým mediátorem mezi specifickou imunitní odpovědí a akutním zánětem (BUC, 2001). Receptor pro TNF α se nachází na všech somatických buňkách s výjimkou erytrocytů. Existují dvě formy receptoru, vysokoafinitní a nízkoafinitní, které jsou si podobné a váţí stejný ligand. Receptory existují nejen v transmembránové formě, ale i jako solubilní proteiny (BUC, 2001). Biologické účinky TNF α jsou široké a závisí na jeho koncentraci v daném mikroprostředí, respektive v séru. Při nízkých koncentracích působí parakrinně a apokrinně, při vyšších koncentracích působí endokrinně (BUC, 2001). Hlavní funkcí je indukce místního zánětu a aktivace endotelií (HOŘEJŠÍ a BARTŮŇKOVÁ, 2009). Fyziologické koncentrace TNF-α jsou nutné k apoptóze a remodelaci tkání a k normální aktivaci imunitního systému (ZIMA, 2007). TNF-α se účastní akutní fáze zánětu: stimuluje syntézu proteinů akutní fáze v játrech. Můţe vyvolat horečku přímým účinkem na hormony hypotalamu, nebo indukci tvorby IL-1, který pak působí jako endogenní pyrogen. Aktivuje granulocyty a zvyšuje jejich adherenční a fagocytární aktivitu. TNF-α také můţe poškodit bazální metabolismus člověka zvýšením prokoagulační aktivity na povrchu endoteliálních buněk. Při mnohých účincích působí TNF-α společně s IL-1, IL-6, TNF-β a IFN-γ (BUC a FERENČÍK, 1994). TNF-α vzniká působením exogenních stimulů, jako jsou lipopolysacharid (LPS) a bakteriální superantigeny, i endogenních stimulů, jsou to IL- 1, IFN-γ, GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) (BUC, 2001). Obr.č. 8 Struktura TNF α. Převzato z: 21

26 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 22 IL-1 Náleţí ke skupině interleukinů a zahrnuje dvě základní formy: IL-1α a IL-1β. IL-1α (Obr.č.9 a Obr.č.10) se skládá ze 159 aminokyselinových jednotek a molekulová hmotnost činí 17,5 kda. IL-1β má 153 aminokyslin a jeho molekulová hmotnost je 17 kda. (BUC a FERENČÍK, 1994). Syntetizují se formou prekurzorových molekul obsahujících 270 aminokyselin. Obě formy IL-1 jsou kódovány samostatnými geny, nacházejícími se těsně vedle sebe na chromozómu 2. Většina buněk exprimuje oba IL-1 geny. IL-1 vykonává svou funkci prostřednictvím vazby na vysokoafinitní receptor IL-1R, přičemţ na tento receptor se váţou obě jeho formy. (BUC a FERENČÍK, 1994). IL-1 produkují zejména makrofágy, neutrofily a keratinocyty, ale i další buňky, s výjimkou erytrocytů. Tvorbu IL-1 indukují mnohé exogenní i endogenní faktory (viry, bakterie, plísně, imunokomplexy C5a, TNF, CSF-1 a další), v některých tkáních se však můţe IL-1 syntetizovat i bez indukce (BUC a FERENČÍK, 1994). Hlavní funkcí IL-1 je kostimulace T-lymfocytů a indukce TNF a IL-8 (HOŘEJŠÍ a BARTŮŇKOVÁ, 2009). Pod vlivem IL-1 začínají Th-lymfocyty ve spolupráci s IL-6 produkovat IL-2 a exprimovat receptor pro IL-2, coţ způsobuje jejich proliferaci a diferenciaci. Aktivované Th-lymfocyty následně uvolňují další cytokiny (IL-3 aţ IL-6 a IFN-γ), které působením na další imunokompetentní buňky zvyšují účinnost imunitní odpovědi. IL-1 působí také na aktivované B-lymfocyty, čímţ zvyšuje protilátkovou odpověď, podněcuje cytotoxické působení cytotoxických T-lymfocytů (CTL), NK buněk a makrofágů, a také potlačuje aktivitu supresorových T-lymfocytů. IL-1 má nepřímé protinádorové účinky a zároveň sám inhibuje růst nádorových buněk. (BUC a FERENČÍK, 1994). IL-1 má dva specifické inhibitory. Jedním je solubilní fragment receptoru pro IL-1, druhým je jeho antagonista IL-1Ra. Lidský IL-1Ra je protein obsahující 152 aminokyselin, jeho molekulová hmotnost se pohybuje od 18 do 25 kda a produkují ho zejména monocyty (BUC a FERENČÍK, 1994). 22

27 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 23 Obr. č.9 Struktura IL-1α Převzato z: 1Alpha01.png?uselang=cs Obr č.10 Struktura IL-1β Převzato z: IL-2 Interleukin-2 (Obr.č.11) je glykoprotein sloţený ze 133 aminokyselinových jednotek a v závislosti na stupni glykosylace se jeho molekulární hmotnost pohybuje mezi 14 aţ 17 kda (BUC, 2001). Gen pro IL-2 se nachází na 4. chromozómu a skládá se ze čtyř exonů, oddělených introny (BUC a FERENČÍK, 1994). Interleukin 2 je produkován 23

28 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 24 především T-lymfocyty, zejména pomocnými Th1 lymfocyty a v menší míře i jinými buňkami imunitního systému. Vzniká v průběhu imunitní odpovědi v Th-lymfocytech v době, kdy rozpoznávají antigen prezentovaný makrofágy prostřednictvím MHC-molekul druhé třídy. Při této interakci dojde k indukci syntézy jednak vlastního IL-2 a jednak k expresi IL-2 receptorů. IL-2 se váţe jen na lymfocyty, které exprimují IL-2 receptor; ten nesou pouze ty lymfocyty, které stimuloval antigen rozpoznaný specifickým receptorem T- lymfocytů, čímţ je dána vlastní limitace a specifita imunitní odpovědi (BUC a FERENČÍK, 1994). Kromě stimulů vlastních imunitnímu systému existuje celá řada fyziologických i nefyziologických podnětů, které jsou schopny navodit produkci IL-2. (BUC a FERENČÍK, 1994). IL-2 stimuluje Th-lymfocyty k proliferaci a zároveň také k produkci dalších cytokinů, zejména IFN-γ, IL-4 a IL-6, které ovlivňují další buňky imunitního systému (NK, CTL, makrofágy, B-lymfocyty). Působením na aktivované B-lymfocyty je podporováno zvýšení protilátkové odpovědi, působením na makrofágy, CTL a NK-buňky je pak podporována jejich cytotoxická aktivita (BUC a FERENČÍK, 1994). IL-2 se váţe na svůj specifický receptor (IL-2R), který se skládá ze tří řetězců α, β, γ. Řetězec IL-2Rα je polypeptid s molekulární hmotností 55 kda a v membráně buňky se objevuje pouze po její aktivaci. Proto se původně označoval Tac (T activation; dnes CD25). Navázání IL-2 na IL-2Rα nevede k biologické odpovědi. Řetězec IL-2Rβ je taktéţ transmembránový glykoprotein s molekulární hmotností 75 kda, který se exprimuje současně s třetím řetězcem IL-2Rγ s molekulární hmotností 64 kda. Buňky, které současně exprimují IL-2Rα i IL-2Rβ,γ váţou IL-2 s vyšší afinitou. Buňky v klidu exprimují IL- 2Rβ,γ, nikoliv IL-2Rα, a mohou je stimulovat pouze vysoké dávky IL-2. Po aktivaci T- lymfocytů se v membráně buňky rychle objevuje IL-2Rα; jeho syntézu indukuje sám IL-2. IL-2R je v membráně buňky asociovaný s MHC molekulami první třídy a s adhezívní molekulou ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1), coţ ukazuje na účast molekul MHC s ICAM-1 při aktivaci T-lymfocytů (BUC a FERENČÍK, 1994). 24

29 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 25 Obr.č.11 Struktura IL-2 Převzato z: 462bhonors2006/gajt/identification.html IL 6 Interleukin 6 (Obr.č.12) patří do skupiny glykoproteinových cytokinů interleukinů, hemopoietinů. Býval také označován jako interferon beta 2 (IFN-β), nebo B-buňky stimulující faktor 2 (BSF-2) (BUC a FERENČÍK, 1994). Jeho molekulární hmotnost je 26 kda a zdrojem jsou především makrofágy, neutrofily a Th2 buňky (HOŘEJŠÍ a BARTŮŇKOVÁ, 2009). Strukturní gen pro lidský IL-6 se skládá z 5 exonů a 4 intronů a nachází se na krátkém raménku chromozomu 7 (BUC a FERENČÍK, 1994). Polypeptidový řetězec IL-6 má 184 aminokyselin, mezi kterými jsou dvě glykosylační místa (BUC a FERENČÍK, 1994). Tento cytokin s alfa helikální strukturou hraje významnou roli v syntéze proteinů akutní fáze zánětlivé reakce, ve stimulaci sekrece imunoglobulinů (Ig), stimulaci lymfocytů, hematopoéze, metabolismu kosti a progresi karcinogeneze (HOŘEJŠÍ a BARTŮŇKOVÁ, 2009; IL-6 působí prostřednictvím 25

30 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 26 specifického receptoru IL-6R, který se vyskytuje ve dvou formách, a to s nízkou a vysokou afinitou (BUC a FERENČÍK, 1994). K základním biologickým účinkům IL-6 patří indukce diferenciace B-buněk. Na B- buňky aktivované IL-4 a IL-5 působí cytokin IL-6 tak, ţe v nich zvyšuje produkci IgM, IgG a IgA. IL-6 nepůsobí na buňky v klidu, protoţe tyto nemají na svém povrchu IL-6R. Na druhé straně však stimuluje růst maligních plazmatických buněk. IL-6 také stimuluje proliferaci pluripotentních hematopoetických buněk a tím i hematopoézu, ulehčuje dozrávání cytotoxických T-buněk aktivovaných antigenem a je velmi účinným induktorem syntézy proteinů akutní fáze v játrech. Ovlivňuje hypofýzu, jeţ působením IL-6 v předním laloku zvyšuje syntézu ACTH (adrenokortikotropního hormonu), který stimuluje tvorbu glukokortikoidů v kůře nadledvin. Glukokortikoidy naopak inhibují produkci IL-6 v monocytech a makrofázích. Podobně jako IL-1 a TNF-α má také IL-6 funkci endogenního pyrogenu a stimuluje jaterní buňky k produkci proteinů akutní fáze. Tento cytokin znamená pro jedince poplašný signál, na který musí organismus reagovat v zájmu udrţení své integrity (BUC a FERENČÍK, 1994). Obr. č..12 Struktura IL 6 Převzato z: 26

31 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká Hypotéza Předpokládáme, ţe expresní profil kandidátních cytokinů po kultivaci mononukleárních buněk periferní krve v přítomnosti pro-zánětlivého lipopolysacharidu bude odlišný u skupiny pacientů se závaţnou osteolýzou a případně aseptickým uvolněním, které vyţadují revizní operaci, ve srovnání se skupinou pacientů s menší reakcí na totální endoprotézu a malými kostními defekty, vedoucími k menším komplikacím a pozdním reoperacím. Změny v expresi vybraných molekul mohou být způsobeny genovými polymorfismy Cíle diplomové práce Optimalizace kultivačních podmínek periferních mononukleárních buněk s prozánětlivým lipopolysacharidem pro sledování proteinové exprese vybraných cytokinů Sledování proteinových expresních profilů kandidátních cytokinů u kultivovaných periferních mononukleárních buněk získaných u pacientů s totální endoprotézou kyčle Analýza expresních proteinových profilů u podskupin pacientů dle genotypu vybraných cytokinů, klinického průběhu onemocnění a nutnosti revizní operace 27

32 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 2.1. Použitý materiál Biologický materiál Periferní krev získaná u pacientů s endoprotézou kyčle Pomůcky Jednorázové pipetovací špičky s filtrem, Gilson Diamond Latexové a vinylové rukavice, Sempermed Mikropipety Eppendorf, multikanálová mikropipeta Eppendorf Plastové zkumavky 15 ml, Gama Group a.s. Odběrové EDTA zkumavky Odběrové zkumavky s gelem pro analýzu séra, Vacuette Zkumavky 50 ml Falcon Inkubační zkumavky, Nunc Nunclon Pasteurovy transfer pipety 1,5 ml mikrozkumavky Eppendorf Parafilm Pechiney, Plastic Packaging Menasha Přístroje Box s laminárním prouděním LC2.12 Jouan, Trigon-plus Centrifugy Jouan MR 1812 Centrifuga Hermle Z300, Z300K Digital water bath, LabTech Lednička Whirpool Mrazák -80 C Freezer, Cryogenics Limited Luminex 100/200 TM Systém, Luminex Corporation Digital Dry Bath, Accu Block, Labnet Minicentrifuga Spektrafuge, Labnet Inkubátor IG 150 Jouan, Trigon - plus Minishaker MS1, IKA Vakuová vývěva Reagencie a roztoky (pro izolaci a kultivaci buněk) PBS+DEPC pufr, BioTech a.s. DEPC (diethylpyrocarbonate), Sigma-Aldrich 28

33 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 29 Ficoll 400, Sigma-Aldrich, 119K0077 Telebrix 30 Megalumine (300mg/l) RPMI 1640 tekuté médium se stabilním glutaminem a 2,0 g/l NaHCO 3, Biochrom AG, FG 1215 FBS (Fetal Bovine serum) 2%, Sigma-Aldrich, F 7524 LPS (Salmonella typhimurium), Sigma-Aldrich, L6143 LPS (Escherichia coli), Sigma-Aldrich, L4516 Trypanová modř 0,4% roztok, Sigma-Aldrich, T8154 Lysis binding buffer, MirVana mirna Isolation Kit, Ambion, AM1561 Reagencie a roztoky použité při měření na přístroji Luminex Human Inflammation Multiplex Kit, Flurokine MAP, R&D Systems, Inc Průběh experimentu Obr.č.13 Schéma průběhu experimentu 29

34 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká Výběr pacientů Pro účely této studie byli vybráni pacienti s totální endoprotézou kyčelního kloubu. Všichni pacienti zařazení do studie byli operováni na Ortopedické klinice Fakultní nemocnice Olomouc (přednosta Doc. Jiří Gallo) a měli stejný typ kloubního implantátu ABG (necementovaný kloubní implantát s povrchovou vrstvou hydroxyapatitu). Tito pacienti byli rozděleni do skupin dle ţivotnosti endoprotézy, a to na pacienty s mírnou osteolýzou, bez závaţných komplikací a na pacienty, u kterých byla nutná reoperace v souvislosti s rozvojem periprostetické osteolýzy a aseptického uvolnění. Z celkového počtu 50 vybraných pacientů se k odběru periferní krve dostavilo 32 pacientů. Odběry periferní krve byly uskutečněny vţdy v ranních hodinách (8,00-10,00 h) a vzorky byly ihned po odběru zpracovány v laboratoři. Všichni pacienti zařazení do studie podepsali informovaný souhlas o pouţití vzorků pro vědecké účely této studie. Studie byla schválena Etickou komisí LF UP a FN Olomouc. U všech pacientů ve studii byl předem znám genotyp vybraných cytokinů a klinický průběh onemocnění (tabulky č.16 a 17, příloha I). Genotypizace byla provedena pomocí PCR se sekvenčně specifickými primery (PCR-SSP) za pouţití Heidelberg kitu (Cytokin Typing Tray kit, University of Heidelberg, Německo) v předchozích studiích v Laboratoři imunogenetiky a imunoproteomiky. Výsledky genotypizace následujících polymorfismů u jednotlivých pacientů je uveden v tabulce č. 18 (příloha I): IL-1α-889, IL-1β-511, IL-1β +3962, IL-1R pst l 1970, IL-1 RA mspa , IL-4 R α +1902, IL , γ INF UTR 5644, TGF β 10.Codon, TGF β 25.Codon, TNF -308, TNF -238, IL-2-330, IL , IL , IL-4-590, IL-4-33, IL-6-174, IL-6 nt 565, IL , IL , IL , MCP Pacienti byli rozděleni do podskupin dle nosičství alely TNF -238 a dle závaţnosti osteolýzy: 1) Severe TNF+: skupina nosičů alely TNF -238 se závaţnou osteolýzou, N=11 (všichni byli reoperováni pro závaţnou osteolýzu) 2) Severe TNF-: skupina nenosičů TNF -238 se závaţnou osteolýzou, N=12 (všichni byli reoperováni pro závaţnou osteolýzu) 3) Mild TNF-: skupina nenosičů alely TNF -238 s mírnou osteolýzou, N=8 (vybráni byli pacienti s nejmenšími kostními defekty a preţitím protézy déle neţ 9 let) 4) Mild TNF+: skupina nosičů TNF -238 s mírnou osteolýzou, N=1 30

35 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká Příprava reagencií Ficoll pouţitý při izolaci mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) byl připraven dle následujícího postupu. Do skleněného dţbánu bylo nalito 522 ml sterilní destilované vody. 38 g naváţeného Ficollu 400 bylo opatrně přisypáno do dţbánu s destilovanou vodou. Dále bylo přidáno 106 ml Telebrixu a rozpouštěno za mírného míchání krouţivým pohybem skleněnou tyčinkou (rozpouští se několik hodin). Dţbán byl během rozpouštění (mezi mícháním) zakrytý alobalem. Na závěr byla zkontrolována hustota připraveného roztoku hustoměrem. Pokud by byla hustota niţší neţ poţadovaná (1,077g/ml ± 0,003 g/ml), pak by se přidal Telebrix. Pokud by byla hustota vyšší, přidala by se sterilní destilovaná voda. Hotový roztok byl plněn do 500 ml skleněných lahví s uzávěrem, nebo do dávkovačů. Skladován mohl být maximálně šest měsíců při teplotě 2-8 C. Trypanová modř dodávaná jako 0,4% roztok byla naředěna v poměru 1:10 pufrem PBS+0,1%DEPC (diethyl pyrocarbonate). Připravené aliquoty s trypanovou modří byly skladovány při 2-8 C a pouţívány k počítání buněk v Bürkerově komůrce. Lipopolysacharid (LPS) Salmonella typhimurium/escherichia coli je dodáván jako lyofilizovaný γ ozářený prášek, jehoţ rozpuštěním v 1 ml PBS jsme získali zásobní roztok LPS o koncentraci 1 mg/ml (Salmonella typhimurium) a 2 mg/ml (Escherichia coli). Takto připravené roztoky byly skladovány při -20 C. Optimalizace lipopolysacharidu a podmínek kultivace Pro potřeby výzkumu bylo třeba zjistit a ověřit optimální koncentraci a typ LPS, který vyvolá u periferních mononukleárních buněk (PBMC) největší prozánětlivou odpověď, která byla následně měřena pomocí detekce TNF α, IL-6 a MCP-1/CCL2 v kultivačním médiu. Optimalizace LPS probíhala při pokusných kultivacích PBMC dobrovolných, zdravých dárců. Pro tyto kultivace byly pouţity dva typy lipopolysacharidu, LPS od Salmonella typhimurium o výsledné koncentraci 0,1 µg/ml v kultivačním médiu a LPS od Escherichia coli o výsledné koncentraci 1 µg/ml. Dále bylo také třeba optimalizovat podmínky kultivace, a to její délku a nutnost přídavku 2% FBS. Buňky jsme tedy kultivovali po dobu 3h a 24h, bez séra či s přídavkem séra. Izolace periferních mononukleárních buněk proběhla dle stejného protokolu jako při izolaci mononukleárních buněk periferní krve u pacientů s totální endoprotézou kyčle, viz následující text této kapitoly, podkapitoly aţ Kultivace probíhaly celkem v sedmnácti zkumavkách dle rozpisu v tabulce č.1. 31

36 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 32 Tab.č.1 Rozpis kultivace při optimalizaci LPS Označení vzorků Typ LPS délka kultivace (h) FBS (µl) E.coli E.coli S.typhimurium S.typhimurium S.typhimurium Odběr periferní krve Na Ortopedické klinice LF UP a FNOL byla vybraným pacientům odebrána periferní krev do dvou zkumavek: 10 ml do odběrové EDTA zkumavky (nesráţlivá krev) a 5 ml do odběrové zkumavky s gelem (sráţlivá krev). Krev byla urychleně přenesena do Laboratoře imunogenetiky a imunoproteomiky LF UP Olomouc a ihned zpracována. Zkumavky s krví nebyly chlazeny na ledu, aby nedošlo k teplotnímu šoku a následnému narušení průběhu kultivace Zpracování krevního séra Odběrové zkumavky s gelem (sráţlivá krev) byly vloţeny do centrifugy a po dobu 15 min centrifugovány při 3000 otáčkách pro získání krevního séra. Po centrifugaci bylo sérum rozděleno do mikrozkumavek, vţdy 3x 500µl pro kaţdého pacienta. Zkumavky se sérem byly označeny, zajištěny parafilmem a uloţeny v mrazáku při -80 C Izolace mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) Krev z EDTA zkumavky kaţdého pacienta byla přenesena do dvou plastových zkumavek a naředěna PBS+0,1%DEPC v poměru 1:1. Tedy k cca 5 ml krve bylo přidáno 5 ml PBS+0,1%DEPC. Takto naředěná krev pak byla nanášena na flotační roztok Ficoll. Na jeden díl Ficollu byly opatrně navrstveny 2 díly naředěné krve Pasteurovou pipetou tak, aby se krev na hladině Ficollu udrţela. Následnou centrifugací po dobu 15 min při

37 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 33 otáčkách a 15 min při 3000 otáčkách došlo k rozvrstvení krve. Mononukleární buňky vytvořily díky niţší hustotě prstenec na povrchu vrstvy Ficollu. Erytrocyty a granulocyty s vyšší hustotou pak vytvořily vrstvu pod Ficollem. Trombocyty zůstávají obvykle v séru a kontaminují frakci mononukleárních buněk na povrchu ficollového gradientu, viz obr.č.14. Obr.č.14 Rozvrstvení krve pomocí Ficollu Převzato z: Pasteurovou pipetou byla opatrně odebrána střední bílá vrstva, tzv. prstenec mononukleárních buněk, ze všech centrifugovaných zkumavek daného pacienta a přenesena do nové zkumavky Falcon. K promytí buněk bylo pouţito RPMI médium, vytemperované ve vodní lázni na 37 C, které bylo přidáno k buňkám zhruba v poměru 1:1. Buňky byly poté centrifugovány po dobu 20 min při 2100 otáčkách a po opatrném odsátí supernatantu bylo k buňkám přidáno 200 µl RPMI média pro resuspendování buněk a jejich následnému pouţití pro kultivace. Počet buněk byl počítán pomocí Bürkerovy komůrky a kultivace probíhaly při koncentraci asi 1 milion buněk/ml Kultivace PBMC Z původního vzorku krve kaţdého pacienta byly izolované mononukleární buňky kultivovány ve čtyřech zkumavkách, v celkovém objemu 500 µl RPMI média. Ve dvou zkumavkách byly kultivovány buňky s přídavkem LPS Salmonella typhimurium 33

38 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 34 o výsledné koncentraci 0,1 µg/ml a 2% FBS. FBS se pouţívalo po inaktivaci při 56 C po dobu 30 min. Ve zbývajících dvou zkumavkách pak byly kultivovány buňky pouze s přídavkem 2% FBS. Všechny kultivační zkumavky byly umístěny do CO 2 inkubátoru s mírně pootevřenými víčky a buňky byly kultivovány do druhého dne při 37 C a 5% CO Zpracování PBMC po kultivaci Druhého dne ráno byly zkumavky vyjmuty z inkubátoru a buňky byly centrifugovány po dobu 15 min při 3000 otáčkách. Po centrifugaci byl z kaţdé kultivační zkumavky opatrně odsát supernatant, který byl rozpipetován do tří mikrozkumavek po 150 µl a po označení uloţen v daných mikrozkumavkách do mrazáku při -80 C do doby pouţití pro stanovení proteinové exprese vybraných cytokinů. Pelet s buňkami pak byl lyzován 600 µl lyzačního pufru přímo v kultivačních nádobkách, lyzované buňky pak byly přeneseny do mikrozkumavek a po označení uloţeny do mrazáku při -80 C Technologie přístroje Luminex Přístroj Luminex můţe pracovat s technologií xtag a xmap. V našem případě byla pouţita technologie xmap, jeţ vyuţívá 5,6 µm velké polystyrénové mikrosféry, které jsou vnitřně barveny červenými a infračervenými fluorofory. Pomocí odlišné intenzity barev pro mikrosféry bylo vytvořeno 100 xmap mikrosférických sad, kaţdá s jedinečným rozsahem spektra. Na povrchu xmap mikrosfér specifické barvy jsou ukotveny protilátky proti studovaným analytům (Obr.č.15). Obr. č.15 Schéma mikrosféry MAP technologie Převzato z: 34

39 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 35 Testy jsou prováděny na 96-ti jamkových mikrodestičkách. Detekce je zaloţena na principu průtokové cytometrie [ Mikrosféry s navázaným vzorkem protékají detekčním kanálem, skrze který probíhají dva laserové paprsky. Jeden laser detekuje intenzitu fluorescence částic, čímţ určuje typ stanovovaného analytu. Druhý laser je specifický pro fykoerytrin a měří intenzitu fluorescence fykoerytrinu, která je přímo úměrná koncentraci navázaného analytu. Tímto způsobem je změřena kaţdá jednotlivá částice (Obr.č.16 a Obr.č.17). [ Obr.č.16 Průchod mikrosfér s protilátkami laserem Převzato z : Prime+Diagnostics/Products/luminex/ Obr.č.17 Schéma procesu detekce Převzato z: h-luminex-xmap-assays.html Výhodou této technologie oproti tradičním metodám jako je např. ELISA je moţnost analýzy několika desítek aţ stovek analytů současně Postup stanovení zvolených cytokinů pomocí 12plex Human Inflammation Multiplex Kitu Pro změření zvolených kandidátních cytokinů byl vybrán komerční Human Inflammation Multiplex Kit firmy R&D Systems, Inc. (katalogové číslo LKT005), umoţňující kvantitativní stanovení proteinové koncentrace 12-ti zánětlivých biomarkerů: IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, VEGF. Měření bylo provedeno u supernatantů, získaných po kultivaci mononukleárních buněk periferní 35

40 Univerzita Palackého v Olomouci, Fakulta přírodovědecká 36 krve pacientů s totální endoprotézou kyčle. Paralelně bylo provedeno měření také v krevním séru získaném u stejné skupiny pacientů. Příprava reagencií před měřením Promývací pufr: 20 ml koncentrovaného promývacího pufru bylo smícháno se 480 ml destilované vody za vzniku 500 ml promývacího pufru. Standard: koktejl standardu byl rozmíchán s Calibrator Diluentem RD6-40 podle karty hodnot standardu, přiloţené jako součást kitu. Před přípravou se standard za jemného míchání nechal 15 min usadit. Příprava kalibrační řady proběhla podle schématu znázorněného na Obr.č μl Standardu upraveného dle předchozího popisu bylo napipetováno do zkumavky č.1 a 300 μl Calibrator Diluentu RD6-40 pak bylo napipetováno do zbývajících šesti zkumavek. Ze zkumavky č.1 bylo odebráno 100 μl a přeneseno do zkumavky č.2. Obsah zkumavky č.2 byl důkladně promíchán, poté bylo odebráno 100 μl a přeneseno do zkumavky č.3. Tento postup byl opakován aţ po zkumavku č.7. Calibrator Diluent RD-40 poslouţil jako negativní kontrola. Obr č.18 Příprava Standardu pro kalibrační křivku Převzato z: Human Inflammation Multiplex Kit, Flurokine MAP, R&D Systems, Inc., LKT005 Mikročástice: Nádobka se směsí mikročástic byla po dobu 30s v mikrocentrifuze centrifugována a následně zvortexována, aby došlo k rovnoměrnému rozvíření mikročástic, které mají tendenci přisedat ke stěnám nádobky. Podle počtu jamek pouţitých na mikrodestičce (96 jamek) bylo 500 μl mikročásticové směsi smícháno s 2,5 ml Microparticle Diluentu. Biotin Antibody Cocktail : po centrifugaci po dobu 30s v mikrocentrifuze a následném zvortexování bylo smícháno 500 μl směsi s 5 ml Biotin Antibody Diluentu. Mnoţství 36