Vliv kvasinkové mikroflóry na finální jakost vína

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Vliv kvasinkové mikroflóry na finální jakost vína Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Tomáš Gregor, Ph.D. Vypracovala: Bc. Tereza Machalínková Brno 2015

2 ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE

3 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: Vliv kvasinkové mikroflóry na finální jakost vína vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

4 PODĚKOVÁNÍ Děkuji panu Ing. Tomáši Gregorovi, Ph.D., za cenné rady, připomínky a laskavý přístup při vedení diplomové práce. Ráda bych poděkovat i své rodině a blízkým za psychickou podporu při zpracování této práce.

5 ABSTRAKT Tato diplomová práce se zabývá vlivem kvasinek na finální fázi vína, skládá se z teoretické a praktické části. V teoretické části se zabývám samotnými kvasinkami, jejich popisem, výživou, nejdůležitějšími kvasinkami pro výrobu vína, způsoby fermentace a vlivy, které působí na kvasný proces. V druhé části se věnuji úpravě moštu pro optimální fermentaci, zde se zabývám sířením moštu a způsoby odkalování. V další části se věnuji chemickým reakcím během kvašení, složení vína a v poslední části popisuje školení a zrání vína. V praktické části se věnuji výrobě vína z odrůdy Rulandské bílé a jeho následnými analytickými rozbory, stanovením jednotlivých prvků jako je alkohol, glukóza, fruktóza, glycerol a celkový obsah kyselin. V poslední fázi se věnuji vyhodnocení jednotlivých rozboru a diskuzi. Klíčová slova: Rulandské bílé, AVSK, fermentace, Saccharomyces, kapalinová chromatografie ABSTRACT This thesis examines the influence of yeasts on the final stage of wine, consists of theoretical and practical parts. The theoretical part deals with the yeast themselves, their description, nutrition, the most important yeast for wine fermentation methods and influences that affect the fermentation process. The second part is devoted to work for bridges for optimal fermentation, there must be engaged in expanding and methods of sludge. The next section is devoted to chemical reactions during fermentation, wine composition and in the last part describes the training and maturation of wine. In the practical part is devoted to the production of wine from Pinot Blanc and his subsequent analytical analysis, determination of individual elements such as alcohol, glucose, fructose, glycerol and total acidity. In the last phase is devoted to the evaluation of individual analysis and discussion. Keywords: Pinot Blanc, AVSK, fermentation, Saccharomyces, liquid chromatography

6 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Kvasinky Taxonomie kvasinek Morfologie a způsoby rozmnožování kvasinek Kvasný proces ve víně Rod Saccharomyces Fáze růstu kvasinek Způsoby kvašení Výživa kvasinek Mikrobiální kontaminace Vlivy na kvasný proces Řízení kvasného procesu Úprava moštu pro optimální kvašení Síření moštu Provzdušňování moštu Odkalování moštu Úpravy cukernatosti moštu Odkyselování moštu Přidávání bentonitu Chemické reakce při kvašení Glykolýza Alkoholové kvašení Glyceropyruvátová fermentace Citrátový cyklus Složení vína Alkoholy... 32

7 3.4.2 Sacharidy Primární produkty kvašení Kyseliny Minerální látky Dusíkaté sloučeniny Polyfenoly Aromatické látky Školení a zrání vína Zrání vína na kvasničných kalech SUR LIE EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Rulandské bílé Příprava vzorků Použité kvasinky Nádoba číslo 1 SPONTANNÍ FERMENTACE Nádoba číslo 2 UVAFERM SLO Nádoba č. 3 SIHA VARIOFERM Nádoba číslo 4 LALVIN EC Nádoba číslo 5 SIMI WHITE Nádoba číslo 6 VINIFERM COOL WHITE Metody stanovení analýzy vína Stanovení titrovatelných kyselin ve víně Stanovení cukrů a alkoholu pomocí kapalinové chromatografie Stanovení senzorické analýzy u vína VÝSLEDKY Analytické rozbory vína Množství titrovatelných kyselin Rozbory v průběhu kvašení Celková analýza hotového vína... 56

8 5.2 Senzorická analýza DISKUZE ZÁVĚR LITERÁRNÍ ZDROJE SEZNAM TABULEK SEZNAM OBRÁZKŮ... 70

9 1 ÚVOD Pěstování vinné révy má na našem území dlouhou tradici pěstuje se u nás od raného středověku. V počátcích se réva pěstovala, hlavně na prudkých svazích, které nešly využít k pastvě nebo pěstování jiných náročnějších plodin. Založení vinice bylo pracné a výsledek se dostavil až za několik let. Prvními významnějšími pěstiteli a zakladateli vinic byla šlechta nebo kláštery, podle kterých jsou pojmenována dodnes některá vinařství jako Chateau. Víno je jedním z nejstarších alkoholových nápojů, k jehož výrobě se používají plody révy vinné. Výroba vína je složitý proces, na který má vliv mnoho faktorů počínaje polohou vinice, kvalitou hroznů, použitou technologii, zkušenosti vinaře a samotnou manipulací s vínem před jeho konzumací. Obliba vína v České republice stále roste. Zvyšuje se poptávka po kvalitních vínech. Na počátku vinaři neměli technologie a přípravky na výrobu vína, využívali pouze divokých kvasinek, pocházejících z prostředí vinice. Ke stabilitě používali pouze síru. Vína byla neudržitelná, a proto se často při nekvalitní surovině, špatném zacházení objevovaly choroby a vady vína. Pro zlepšení kvality vín docházelo postupem času k vývoji moderních technologií, které se neustále zdokonalují. Mění se chutě a preference spotřebitelů a o kvalitě vína nerozhoduje jen vinař, ale i spotřebitel, neboť ten posoudí, co mu chutná a za co je ochoten zaplatit. Velký vliv na kvalitu vína a smyslové vlastnosti mají kvasinky. Dnes se využívají aktivní vinné suché kvasinky. Šlechtěním a testováním nabízí trh plnou škálu AVSK. Rozlišují se podle druhu odrůdy, způsobu kvašení i podle aroma, které tvoří. Každý vinař se může rozhodnout, jaký druh kvasinek zvolí, nebo zda nechá víno spontánně fermentovat. V této diplomové práci se snažím pozorovat vliv jednotlivých kvasinek na jakost vína. K pozorování jsem použila odrůdu Rulandské bílé, ve světě známou jako Pinot blanc. Patří k nejstarším odrůdám pocházející z Francie, Burgundska. Ve francouzském Alsasku se využívá k výrobě šumivých vín a v německém Bádensku se nechává zrát v sudech barrique. Tato odrůda dozrává nejčastěji do přívlastkových vín. V České republice vytváří ovocné až květinové aroma a je vhodná k archivaci. V této diplomové práci se snažím zjistit, zda kvasinky mají výrazný vliv na charakter vína nebo se jedná o přirozený projev odrůdy. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je z vyhledaných informací vypracovat literární rešerši k problematice kmenů kvasinek přidávaných do moštu během výroby vína a jejich ovlivnění finální jakosti vína. Podle rešerše navrhnout vhodný experiment s využitím kvasinkových kultur během výroby vína. Navrhnout metody pro analýzu odebraných vzorků. Podle metodiky vše zrealizovat, vyhodnotit měření a provést senzorické hodnocení finálního vína. 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Kvasinky Na kvalitu vína má vliv mnoho faktorů a jedním z nich je i typ použitých kvasinek. Tradiční cestou je použití vlastních kmenů autochtonních kvasinek Saccharomyces cerevisiae je jedna z možností, jak vrátit vínu jeho přirozený charakter získaný z kvalitních hroznů a výskytem přirozené mikroflóry na vinici (NOVOTNÝ a VRÁNOVÁ, 2015). Kvasinky hrají důležitou roli ve výsledném charakteru vína. Výsledný senzorický profil vína je výsledkem kombinace aromatických sloučenin, kterými jsou převážně estery, alkoholy, kyseliny, aldehydy a ketony. Tyto látky pochází buď přímo z hroznů podle konkrétní odrůdy, nebo vznikají při fermentaci či při procesu zrání. Enologové se již dlouhou dobu zajímají o ekologii kvasinek kvůli velkému významu přírodní mikroflóry na průběh a charakter kvašení. Znalost kvasinkové mikroflóry je také důležitá pro sledování zdrojů kvasinek způsobujících kažení a pro zjišťování důležitých informací o působení klimatických podmínek na mikroflóru.(fernandez-gonzalez et al., 2001). Díky těmto studiím se zvýšil zájem o možnosti použití smíšených kultur kvasinek na výrobu vína zejména kvůli ovlivnění vznikajícího aromatického profilu. Nejvíce prostudovanými kvasinkami z pohledu výroby vína jsou Saccharomyces cerevisiae, protože ty obvykle převládají v celém průběhu alkoholového kvašení. Přesto je známo až 15 dalších rodů, které mohou být přítomny při zahájení procesu kvašení a tím přispívat k speciálním charakteristikám jednotlivých druhů vín (LIANG et al., 2013) Taxonomie kvasinek Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní mikroorganismy patřící mezi vyšší houby (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Kvasinky potřebují vhodné prostředí, přítomnost kyslíku a živin, pro svoji existenci. Mají vysoký nárok na vodní aktivitu. Většina kvasinek se při pomnožování v tekutém živném prostředí projevuje jako zákal. Nakonec se shlukují a usazují na dně nádoby jako pevný nebo práškový sediment, kdy se víno postupně čeří. Pro množení kvasinek je důležitý zdroj kyslíku. Žádná kvasinka není striktně anaerobní. Pro většinu kvasinek je důležité alespoň stopové množství kyslíku, jedná se o fakultativně anaerobní kvasinky. Řadí se sem například Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe a Brettanomyces. Fermentativní kvasinky i v aerobních 11

12 podmínkách převážně fermentují. Respirace u nich představuje jen malou část. Respirativní kvasinky, pro které je výhodnější respirace než fermentace, neobsahují enzym alkoholdehydrogenasu vůbec, proto nedokáží tvořit etanol. Jedná se o rody Rhodotorula, Saccharomycopsis nebo Lipomyces. Kvasinky se rozdělují i podle nároku na teplotu. Dělíme je na psychrofilní, mezofilní a termofilní. Psychrofilní kvasinky se pomnožují při -2 až 20 C. Většina kvasinek patří do mezofilní kultury, které rostou od 0 do 48 C, v laboratorních podmínkách se kultivují při 25 až 30 C. Termofilní kvasinky se množí při minimální teplotě 20 C a výš. Tyto kvasinky představují většinou patogeny pro člověka. Maximální teplota pro přežití kvasinek je 57 až 59 C (JANDEROVÁ et al., 1999) Morfologie a způsoby rozmnožování kvasinek Tvar buněk je závislý na rodové příslušnosti, způsobu kultivace a zejména na způsobu rozmnožování. Obvykle dosahují rozměrů 3 až 15μm. Mezi nejčastější tvary patří elipsoidní, vejčitý až kulovitý. Vyskytuje se i tvar citrónkovitý, např. u Kloeckery apiculaty, cylindrický pak u Schizosaccharomyces nebo trojúhelníkový u rodu Trigonopsis (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Typické rozmnožování pro většinu kvasinek je pučení. Na mateřské buňce se vytvoří pupen, který se postupně zvětšuje, dochází k fragmentaci všech buněčných organel v buňce, kde část putuje do pupenu. Zúženina mezi mateřskou buňkou a pupenem se postupně zavírá a dochází k oddělení. Rozlišujeme monopolární, bipolární a multipolární pučení podle toho, kde pupen vzniká. Monopolární kvasinky vznikají vždy na stejném místě. Bipolární kvasinky střídavě pučí na obou pólech, tvar bývá citrónkovitý. U multipolárních kvasinek vzniká pupen kdekoliv na povrchu buňky, ale nikdy na stejném místě. Tím je počet generací prostorově omezen. Pokud nedojde k oddělení dceřiné buňky od mateřské, při pučení, buňky zůstávají spojeny a vzniká pseudomycelium. Pseudomycelium vzniká zejména za nedostatku živin. Vytvářejí ho například rody Candida, Trichospora (JANDEROVÁ, 1999). Rozmnožování pučením se může konat asi sedmkrát, na povrchu kvasinky zůstávají jizvy, které snižují intenzitu látkové výměny. Proto starší kvasinky s mnoha jizvami mají nízkou kvasnou výkonnost (STEIDL et al., 2004). 12

13 3.1.3 Kvasný proces ve víně Prokvášením cukru nevzniká jenom alkohol a CO 2, ale i charakteristické kvasné aroma sekundární buket. Za tento buket odpovídají kvasinky. Jsou to jednobuněčné houby s rozdílnými tvary buněk a různým způsobem množení. U alkoholového kvašení se jedná o rod Saccharomyces a jeho druhy. Podle druhu mají kvasinky tvar kulovitý, oválný, prodloužený až válcovitý nebo zašpičatělý. Velikost buněk se pohybuje mezi 5 14 μm Původ kvasinek Z větší části pocházejí kvasinky z vnějšího povrchu slupek bobulí, kde se rozmnožují na místech, kde mají přístup ke šťávě (jizvy, trhlinky, přechod mezi stopkou a bobulí). Na jedné bobuli se nachází až 8 milionů kvasinek, na poškozených bobulích až 40x více. Pomocí deště se kvasinky z půdy dostávají na bobule. Na hroznech visících blízko půdy se nachází až 5x více buněk, než u vzdálenějších hroznů od země. Důležitým místem pro množení je i lis, počet zárodků může být i 100x větší, než na počátku plnění (STEIDL, 2002) Rod Saccharomyces Jeden z nejvýznamnějších technologických pokroků bylo použití vybrané kultury Saccharomyces cerevisiae pro očkování ovocných šťáv. Tento rod dává vínu spolehlivý, konzistentní a předpokládaný styl a kvalitu. Může mít jak pozitivní, tak negativní vlivy na vlastnostech kvašení vína. Bylo prokázáno, že pozitivně změní víno chemické složení, a to zejména v senzorických vlastnostech vína. Negativní dopad má růst některých jiných kmenů v hroznovém moštu, než Saccharomyces, který může způsobit vývoj antagonistů interakce mezi kvasinkami a vést k nadměrné akumulaci několika nežádoucích metabolitů, jako je kyselina octová, ethylacetát, aldehyd a aceton. Dalším problémem je to, že některé druhy Saccharomyces mohou být nevhodné pro vinařské prostředí, jako je nízká fermentace a pomalé prokvášení nebo nesnášenlivost siřičitanů. Saccharomyces je nejdůležitější kvasinka během kvašení, ale kvašení podporuje i mnoho jiných druhů kvasinek, které spíše doplňují nebo předchází kvašení rodem Saccharomyces (YANG SUN et al., 2014). 13

14 Vinařsky nejvýznamnější kvasinky 1) Saccharomyces cerevisiae nejčetnější výskyt tohoto kmenu. Izolují se na stanovišti výskytu, poté se množí a používají jako čisté kultury. Mají oválný tvar a zkvašuje glukózu, fruktózu, sacharózu, maltózu a galaktózu. Nezkvašuje laktózu. Je odolná vůči siřičitanům. Produkuje nejvýše 16% obj. etanolu. 2) Saccharomyces uvarum vyskytuje se v našich oblastech. Fermentuje a asimiluje glukózu, fruktózu, maltózu, rafinózu a galaktózu. 3) Saccharomyces bayanus odolné vůči etanolu a vysoká fermentační schopnost. Tolerantní k siřičitanům a etanolu. Prokváší maximálně do 15% obj. etanolu. Využívá se pro čisté kultury. 4) Saccharomyces bailii vyskytuje se zejména v moštech a vínech tokajského typu. U ostatních vín je výskyt malý. Tolerantní k siřičitanům. Zkvašují nejdříve fruktózu, pak glukózu. 5) Saccharomyces aceti dobrá schopnost zkvašování glukózy, ale přeměňuje etanol na kyselinu octovou, což je nevýhoda. 6) Saccharomyces ludwigii zkvašuje glukózu, sacharózu částečně i rafinózu. Rozmnožuje se při fermentaci pučením i dělením. 7) Schizosaccharomyces pompe fermentuje kyselinu jablečnou na etanol a oxid uhličitý. 8) Hansenula anomala křísotvorná kvasinka, má schopnost přeměňovat etanol na některé nežádoucí estery, např. octan ethylnatý. 9) Pichia fermentans výskyt na bobulích není častý. Je zodpovědná za tvorbu bílého až šedého povlaku. 10) Pichia membranaefaciensis asimiluje glukózu a etanol. Tvoří hrubý, vrásčitě zvedající se povlak. 11) Kloeckera apiculata zodpovědná za rozkvášení v počátcích spontánně kvašených moštů. Zkvašuje a asimiluje pouze glukózu. Produkuje maximálně 4% obj. etanolu. 12) Candida pulcherrima zodpovědná za tvorbu červenofialového barviva pulcherimínu, které jsou obsaženy v moštech z vinic bohatých na železité ionty. Obsah na hroznech je ve všech oblastech ČR vysoký. Prokváší jen glukózu a to jen na velmi málo etanolu. 13) Metschnikowia vini zodpovědná kvasinka za křísovatění vína. 14

15 14) Torulopsis berlese a Torulopsis candida rod, který je nejčastějším kontaminantem technologického vybavení sklepa. Zkvašuje glukózu až na 10% obj. etanolu (ŽIŠKA, 2014). 15) Brettanomyces vyskytuje se přirozeně na vinici. Vyskytuje se také na hroznech napadených octovou hnilobou. Hlavní kontaminace hrozí i z nedostatečné hygieny. Vysoká přítomnost je zejména na zařízeních, která lze těžko sterilizovat (např. čerpadla, hadice). Výsledkem těchto kvasinek je tvorba negativních látek jako je kyselina octová a těkavé fenoly, které se projevují ve vůni jako tóny - kouře, koňského sedla, spáleného plastu. Tato kvasinka se nachází zejména v červených vínech. V zahraničí červená vína, která obsahují animální tóny z rodu Brettanomyces označují jako tzv. Brett charakter, který nepovažují za negativní stránku (BAROŇ a ČERNOHORSKÁ, 2013) Fáze růstu kvasinek Růst kvasinek závisí na druhu kvasinek, dostatku živin a vlastnostech prostředí. Růst můžeme rozdělit do 4 fází: 1) Klidová fáze (lag fáze) - kvasinky se ještě nemnoží tak rychle, připravují se enzymaticky na růst v novém prostředí. 2) Exponenciální fáze (logaritmická fáze) - probíhá intenzivní množení kvasinek a populace dosahuje exponenciálního růstu. Během této fáze se populace rychle zvyšuje a začíná proces fermentace. 3) Stacionární fáze - postupně se zpomaluje rychlost množení buněk, až do konstantní hodnoty, kdy se počet buněk zhruba nemění. Akumulují se toxické produkty a je vyčerpáno živné médium. 4) Fáze odumírání - v této fázi již převyšuje počet odumřelých buněk nad buňkami vzniklými (JACKSON, 2000). Lag fáze je v hroznové šťávě typicky krátká, někdy až nedetekovatelná. Exponenciální fáze je relativně krátká, někdy dochází k více než 8 dělením. Stacionární fáze může být jak krátká, tak dlouhá, která je limitována nedostatkem živin. Fáze odumírání je nejdelším obdobím. Zbytky životaschopných buněk přežívají několik měsíců. Během fáze odumírání je 40 % cukru metabolizováno na alkohol (RIBEREAU-GAYON, 1985). 15

16 Obrázek č. 1: Graf růstového cyklu kvasinek Technologické vlastnosti izolovaných kvasinek Nejdůležitější schopností vinných kvasinek je jejich prokvášení, odolnost vůči alkoholu a SO 2, dobrá sedimentační schopnost a nízká produkce prchavých kyselin. Jen asi 1-3 % požadovaných kvasinek přichází z vinice. Jedná se asi o 16 kmenů kvasinek, ale jen 5 kmenů může zcela prokvasit mošt. Podle prokvášení je můžeme dělit do 4 skupin: 1) žádná kvasná aktivita - Candida mycoderma 2) nízká prokvášecí schopnost, 1-5 obj. % alkoholu - Hansenula anomala, Candida pulcherrima 3) průměrná prokvášecí schopnost, 5-10 obj. % alkoholu - Saccharomyces uvarum, Torulopsis rosei 4) výborná prokvášecí schopnost, obj. % alkoholu - většina druhů Saccharomyces cerevisiae, oviformnis, bayanus, carlsbergensis (MINARIK, 1966) Způsoby kvašení Aby se zahájilo kvašení, je zapotřebí asi 10 milionů buněk v jednom mililitru. Nejdůležitějším zdrojem infekce jsou lisy a zařízení, kde se zvyšuje přirozený počet buněk v moštu až stonásobně. Pro dosažení počtu potřebných kvasinek pro zahájení kvašení existují dvě možnosti. Spontánní kvašení a kvašení pomocí čistých kultur kvasinek (STEIDL,2002). 16

17 Spontánní kvašení Někdy se setkáváme s názorem vinařů, že odrůdový charakter vína nejlépe zajistí původní kvasinky. Při výrobě vína spontánním kvašením, kdy je kvašení zprostředkováno pouze kvasinkami z vinice, bylo zjištěno, že převládajícími kvasinkami, které byly nalezeny na povrchu bobulí a tedy i na počátku kvasícího procesu v moštu jsou kvasinky rodu Hanseniaspora. Dalšími méně rozšířenými druhy kvasinek jsou Candida, Brettanomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodotorula. Kvasinky rodu Saccharomyces cerevisiae jsou v hroznové šťávě z počátku poměrně málo zastoupeny (NOVOTNÝ a VRÁNOVÁ, 2015). V průběhu kvašení, kdy se snižuje obsah živin a vzrůstá množství etanolu, se zvyšuje selektivita média. Množství divokých kvasinek přítomných v hroznovém moštu začíná přibližně v polovině fermentace, kdy obsah etanolu překročí 5 7 %, postupně klesat. V této fázi spontánního kvašení se tedy kvasinky rodu Saccharomyces stávají dominantními a dokončují kvašení. Snižováním teploty fermentace pod 15 C lze dosáhnout lepší adaptace na etanol některých jiných druhů kvasinek, jako jsou např. Hanseniaspora a Candida, což významně přispívá k senzorickým vlastnostem vína (QUEROL a FLEET, 2006). Divoké kvasinky ale mohou negativně ovlivnit fermentaci. Tvoří malé množství etanolu a velké množství kyseliny octové (SCHULLER a CASAL, 2005). Charakteristika spontánního kvašení: - vyšší obsah glycerolu - více vyšších alkoholů - často víc těkavých kyselin - často vyšší potřeba SO 2 - často zůstane zbytkový cukr (kvašení se samovolně zastaví) - vlastní kvasinky z vlastní vinice - originalita, větší riziko a nutnost kontroly (STEIDL, 2002) Kvašení pomocí čistých kultur kvasinek Spontánní procesy jsou obecně nekonzistentní a neefektivní a často vedou k tvorbě příchutí, proto se v dnešní době používá v drtivé většině kvašení pomocí čistých kultur. Většina dnešní průmyslové výroby využívá definované startovací kultury, často se skládá z určitého domestikovaného kmene Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces 17

18 bayanus. I když tento postup výrazně lepší procesní konzistence, účinnost a celkovou kvalitu, je rovněž omezen na senzorickou složitost konečného produktu. Při přidání selektovaných sušených čistých kultur kvasinek je dosaženo dostatečné množství buněk od začátku a zabrání se tím negativnímu kvašení (STEENSELS et al., 2014). Požadavky čistých kultur kvasinek jsou: - rychlé zakvašení - kvašení v širokém rozsahu teplot - bezproblémové prokvášení - žádné nebo málo vedlejších produktů - dobrá výtěžnost alkoholu - snášenlivost alkoholu - snášenlivost cukru u vín s přívlastkem - rychlá sedimentace po prokvášení - žádné ovlivnění odrůdového charakteru nebo způsobu vyzrávání Bezpodmínečně nezbytné je využití čistých kvasinek u moštu o vysoké cukernatosti, moštu z nahnilých hroznů, při velmi nízkých teplotách a u opětovného překvášení a druhotného kvašení (STEIDL, 2002). Kvašení pomocí aktivních sušených vinných kvasinek se provádí pomocí zákvasu. Prvořadá je rehydratace kvasinek. Je mnoho faktorů, které jsou důležité pro správnou rehydrataci kvasinek. Teplota kapaliny, ve které se kvasinky rozmíchávají, se musí pohybovat mezi C, vyšší teploty kvasinky usmrcují. Musí se namíchat směs vody a moštu v poměru 1:1. Pokud tak neučiníme, kvasinky budou hladovět a jejich reprodukce nebude ideální. Nesmí mošt obsahovat ani velké množství cukru, kvasinky by měly problém s osmotickým tlakem a reprodukce by byla opět omezená. Je potřeba také zohlednit poměr při zvyšování objemu kvasinek, který by měl být 1:8 až 1:10. To znamená jeden díl kvasící směsi a 8-10 dílů čerstvého moštu. Pokud bude špatně připravený zákvas a mošt bude obsahovat větší množství namnožených divokých kvasinek, může být investice do ASVK zbytečná. Pokud budeme mít perfektně odkalený mošt, je lepší použít vyšší dávku kvasinek než u hůř odkalených moštů, protože rychlost fermentace při stejné dávce kvasinek bude u kalnějšího moštu vyšší než u čistšího. Při výběru kvasinek musíme dbát na specifikaci. Každá kvasinka má jinou specifikaci. Některé jsou citlivé na nízké teploty, alkohol nebo potřebují dostatečné množství živin (PTÁČEK, 2014). 18

19 Vína vyrobená za použití pouze nesaccharomycetyckých kvasinek mají odlišné složení než vína vyrobená za pomoci ASVK a vína vyrobená ve směsi nesaccharomycetyckých a ASVK se blížila složením vínům zakvašených pouze ASVK. Při inokulaci nesaccharomycetyckých a Saccharomyces cerevisiae je nutné brát na vědomí také killer faktor kvasinek. Jedná se o kvasinky, které produkují proteinový nebo glykoproteinový toxin, který má smrtící účinek na ostatní senzitivní kmeny. Při nesprávné volbě kmenů může totiž nastat situace, kdy nesaccharomytycké kvasinky, které produkují metabolity důležité pro senzorické vlastnosti vína, uhynou při inokulaci se Saccharomyces cerevisiae mnohem dříve, než je běžné (PAVELKOVÁ, 2008) Výživa kvasinek Dobrá aktivita kvasinek je důležitá při výrobě vína. Pro kvasinky je důležitý příjem kyslíku, dostatečné množství živin a správná teplota. Složení přírodního révového moštu z hlediska výživy může být velmi proměnlivé každým rokem v závislosti na půdě a klimatických podmínkách. Přídavkem živin se vinař vyhne zpomalením kvašení a tvorbě nežádoucích aromatických projevů během kvašení (BLOMQVIST, 2012) Amonium Nejsnadnější zdroj dusíku pro kvasinky v průběhu kvašení je přídavek amonných solí. Na začátku kvašení je důležitý zdroj dusíku pro tvorbu nových buněčných stěn, tvorbu enzymů a také pro tvorbu bílkovin, které odpovídají za transport cukrů a aminokyselin. V první polovině kvašení by se měl aplikovat přídavek dusíku, v pozdější fázi kvašení může být přijímaný kvasinkami díky zvyšující se hladině alkoholu Thiamin Přídavek se doporučuje pro révové mošty, které byly tepelně ošetřené nebo pochází z napadených hroznů botrytidou. Má pozitivní vliv na kvašení za obtížných podmínek. Přidává se v kombinaci s amonnými solemi nebo jako thiaminchlorid Kyslík Kvasinky v prostředí anaerobiózy provádí alkoholové kvašení, ale v moštu jsou schopné prodýchávat cukr v aerobních podmínkách. Podle závislosti koncentrace cukru v moštu mají schopnost využívat vinné kvasinky glukózu při dýchání. Po inokulaci selektova- 19

20 nými kvasinkami se doporučuje provzdušnění moštu pro podporu kvasného procesu. Využití cukrů při dýchání vytváří více energie, než kvašení. Dýchání je podporováno rozmnožováním kvasinek v průběhu průmyslové výroby selektovaných kvasinek Buněčné stěny kvasinek Buněčné stěny jsou důležitým zdrojem sterolů, nejsou využity jako zdroj energie, ale začleňují se do nových buněčných stěn rozmnožujících kvasinek. Buněčné stěny mají důležitý podíl pro optimalizaci alkoholového kvašení, ale nemohou nahradit dusík. Preparát buněčných kvasinek se skládá z přirozených součástí kvasinek, které se vytvářejí při rozkladu buněk kvasinek a extrakci rozpustných částí Neaktivní kvasinky Tyto kvasinky jsou neživotaschopné buňky přirozených kvasinek a to i v případě, že je složení živin srovnatelné s kulturou aktivních suchých kvasinek. Každý výrobek má lehce odlišný vliv na kvašení. Závisí na teplotě ošetření buněk kvasinek, praskání jednotlivých buněčných stěn a uvolňování živin (TRIOLI a HOFMANN, 2009) Mikrobiální kontaminace Oxidativní kvasinky Patří sem kvasinky rodu Hansaenula, Pichia, Candida. Přežívají i při velkém množství alkoholu, mají oxidativní metabolismus. Vedlejším produktem je tvorba sloučenin jako kyseliny octové a acetaldehyd, které mohou vytvářet vady vína a nežádoucí aroma. Tyto kvasinky se nacházejí na hroznech, v moštu i ve víně Apikulární kvasinky Patří sem kvasinky rodu Kloeckera apiculata. Nachází se v moštu na úplném začátku před alkoholovým kvašením. Kloeckera tvoří více těkavých kyselin, než Saccharomyces. Jakmile dosáhneme 4 5 % alkoholu, převažují Saccharomyces a Kloeckera se téměř nevyskytuje. 20

21 Fermentativní kvasinky Nejdůležitější pro výrobu vína je rod Saccharomyces. Vyskytuje se mnoho druhů. Provádí alkoholové kvašení za přítomnosti a úplného spotřebování cukru. Patří mezi důležité a pozitivní rody, ale některé kmeny mohou ovlivňovat kvalitu vína (MACHALÍNKOVÁ, 2013) Vlivy na kvasný proces Teplota Teplota patří mezi nejdůležitější faktor, který ovlivňuje kvašení. Nejvíce problémů způsobuje právě nevhodná teplota. Optimální teplota pro množení kvasinek je okolo 25 C. Objem nádoby ovlivňuje teplotu. Čím je nádoba větší, tím se intenzivněji ohřívá mošt. Teplota kvašení může být velmi rozdílná. Kvasinky prokvasí beze zbytku mošt, který je teplejší a tím pádem se ztrácí i více aromatických látek a alkoholu. Používají se i speciální kvasinky pro tzv. studenou fermentaci, kdy prokvášejí mošt už při C. Mladá vína jsou za použití této fermentace v chuti i vůni čistá a bakterie octového a mléčného kvašení se nemohou při tak nízkých teplotách rozmnožovat Cukernatost moštu Kvašení bez problémů je u moštů s nízkou cukernatostí. Vysoké obsahy cukrů v důsledku vysokého osmotického tlaku prokvášejí špatně. Mošt odnímá z buněk kvasinek vodu, a tím se snižuje intenzita množení. Pro vína s přívlastkem musíme aplikovat osmotolerantní kvasinky, aby měly nejen dobrou schopnost prokvášet, ale i odolávat vysoké cukernatosti Obsah alkoholu Tolerantní vůči alkoholu jsou silně prokvášející kvasinky rodu Saccharomyces. Mohou se množit ještě při % obj. etanolu. Závěrečné dokvášení provádějí při vysokém obsahu alkoholu nejčastěji Saccharomyces bayanus, které mají ještě větší rezistenci vůči alkoholu než Saccharomyces cerevisiae. Vysokého alkoholu se využívá při výrobě Portských a Sherry vín. Kdy se po dosažení požadovaného zbytkového cukru zastaví kvašení přídavkem vinného alkoholu (STEIDL, 2002). 21

22 Kyselina siřičitá Množení kvasinek stěžuje aplikace kyseliny siřičité. Jsou potlačovány zejména divoké kvasinky, kvasinky Saccharomyces méně. Lze ovlivnit pouze počátek kvašení, ne další průběh. Pokud během kvašení dojde k síření, byla by kyselina siřičitá vyvázaná z volné formy na vázanou. Došlo by jen ke krátkodobému ovlivnění a omezení kvasného procesu a nežádoucímu zvýšení obsahu celkového SO 2. Při konci kvašení nebude k dispozici stejně žádný volný SO 2 a z celkového množství zůstane pouze % vázaného, zbytek se odstraní stáčením vína z kalů. Účinnost kyseliny siřičité závisí na ph moštu, u moštu s nižšími kyselinami je podstatně nižší účinek Obsah kalů Uvolňování oxidu uhličitého podporují kalové částice, to vede k výraznému promísení a k dalšímu prudkému kvašení. Kaly by měly být odstraněny z moštu, pokud chceme dosáhnout klidného a řízeného kvašení. Po odkalení kvasí mošt pomaleji, neohřívá se a vznikají z něj mladá vína bez postranních tónů. Při velmi pomalém kvašení se zvyšuje obsah alkoholu, ale i obsah acetaldehydu a potřeba oxidu siřičitého Nežádoucí látky Obsah kovů, který se do moštu dostává přímým stykem s takovými kovy, přímo neovlivňuje kvašení, ale může bránit druhotnému kvašení. V počátku kvašení mohou způsobovat problémy rezidua pesticidů, zejména když jsou použity vyšší dávky než předepsané nebo došlo k nedodržení ochranné lhůty. Důkladným odkalením se zbavíme reziduí pesticidů. Množení kvasinek brzdí výskyt bakterií octového kvašení, které se mohou do moštu dostat z narušených bobulí a pomnožují se při pomalém nástupu kvašení (STEIDL, 2002) Řízení kvasného procesu Postupy podporující kvašení Hlavní je dostatečný počet dobře kvasících buněk. - Provzdušnění moštu podporuje množení kvasinek. - Teplota kvašení je nejdůležitějším parametrem, měla by se pohybovat okolo 18 C. - Čisté kultury kvasinek. 22

23 - Přídavek vinných kvasnic. - Scelování nekvasícího moštu s kvasícím Postupy zpomalující průběh kvašení Jedná se o všechny kroky, které zabraňují množení kvasinek: - Nízká teplota. - Ostré odkalení moštu. - Působení oxidu uhličitého. - Stupňovité plnění kvasné nádoby: tím dochází vždy k ochlazení, ale i riziku výskytu sirky (STEIDL, 2002). 3.2 Úprava moštu pro optimální kvašení Síření moštu K síření moštů se používá oxid siřičitý, působí současně jako redukční a antiseptické činidlo. Je účinný i proti enzymovým oxidacím. Oxidace, kterou způsobují enzymy, probíhá velmi rychle, hlavně v hroznovém rmutu nebo ve vlastním moštu. Enzymovým oxidacím snadněji podléhají bílá vína z nahnilých hroznů. V bílých vínech se oxidace projevuje změnou chuti a nahnědlou barvou, v červených vínech zhnědlou barvou a rozkladem anthokyanů. Oxid siřičitý váže kyslík a zabraňuje tak okysličení ostatních složek vína. Antiseptický účinek SO 2 je silnější vůči bakteriím a divokým kvasinkám než vůči kvasinkám kulturním. K zabránění rozvoje bakterií, plísní a divokých kvasinek stačí dávka 50 až 150 mg. Pravé kvasinky jsou inhibovány teprve dávkou 200 až 600 mg SO 2. Oxid siřičitý je velmi dobrý prostředek k síření moštů vzniklých zejména z nahnilých hroznů anebo jinak poškozených hroznů, v nichž jsou nežádoucí mikroorganismy nejvíc rozšířeny. Oxid siřičitý se váže i s cukry, zejména s glukózou, méně často s fruktózou. V době aplikace dávky oxidu siřičitého zůstává jeho většina volná, váže se pouze v nepatrném množství. Po 48 hodinách se podíl vázaného oxidu siřičitého zvýší a to podstatně více ve vylisovaném moštu. Vázání oxidu siřičitého v moštu ovlivňují i jiné faktory. Oxid siřičitý působí na barevné a aromatické látky v moštu a zabraňuje jejich ztrátám (FARKAŠ, 1980). 23

24 3.2.2 Provzdušňování moštu Mošt se obohacuje vzdušným kyslíkem, okysličuje se, pomocí provzdušňování. Okysličování podporuje množení kvasinek a sedimentaci bílkovinných látek, pektinů a tříslovin. Provzdušňovat se mohou pouze zdravé mošty ze zdravých hroznů. Nedoporučuje se provzdušňovat mošty pocházející z nahnilých hroznů. Podléhají totiž snadno oxidačním enzymům, které vyvolávají jejich zhnědnutí. Při provzdušňování vadných moštů hrozí i rozšíření aerobních mikrobů, které vyvolávají octové kvašení a neenzymové oxidační procesy, které jsou nežádoucí. Způsob provzdušňování záleží na účinku, kterého se má dosáhnout. Obvykle stačí, teče-li mošt z lisu do kádě nebo do sběrné nádrže, odkud se čerpá do kvasných nádob. Při potřebě většího provzdušňování se přelévá mošt z nádoby do nádoby nebo se rozstřikuje v nádrži hadicí. Při vleklém kvašení moštu způsobeném nedostatkem vzdušného kyslíku se osvědčilo i přidávání vzduchu kompresorem (FARKAŠ, 1980) Odkalování moštu Kaly v moštu jsou zlomky slupek, třapin a pevných částí dužiny, které se do moštu dostávají lisováním. Z hlediska chemického složení obsahují tyto kaly třísloviny, dusíkaté látky, pektiny, celulosy, které se během kvašení ještě vyluhují, a víno dostává od nich nepříjemnou, neharmonickou chuť. Odkalování moštu z bílých odrůd před kvašením má příznivý vliv na charakter vína, zejména na tvorbu aromatických látek. Odkalováním se odstraňuje i část oxidačních enzymů. Tím se snižuje stupeň oxidace v moštu a budoucím víně. Odkalováním se též zpomaluje kvasný proces, protože se odstraní část kvasinek a zmenšuje se vnitřní kvasný povrch (STEIDL, 2002). Odkalování je možné podpořit oxidem siřičitým, ochlazováním nebo ohřevem moštu, dávkou enzymů nebo enzymových přípravků. Rozdělujeme čtyři hlavní způsoby odkalování: a) Statické odkalování Kaly v moštu klesají na dno a mošt se čistí. Největší potíže při statickém odkalování moštů působí malá hmotnost kalových částic. Tyto částice jsou v neustálém pohybu a to znesnadňuje jejich sedimentaci a usazování na dně. Ochlazením se také urychluje odkalování. Nízká teplota brání rozmnožování kvasinek, zpomaluje kvasný proces a podporuje vysrážení zákalových částic. Ochlazování moštu se úspěšně používá při odkalování 24

25 menších množství moštu, u větších množství je to velmi nákladné. Odkalování se zvyšuje i ohřevem a následným ochlazením. Tlumí se tak růst a rozmnožování mikroorganismů i kvasný proces. Teplo s následujícím ochlazením urychluje sedimentaci a čištění moštu. Mošty tepelně ošetřeny jsou méně náchylné k oxidaci a vína jsou odolnější vůči bílkovinným zákalům. Statické odkalování se urychluje použitím enzymových přípravků. Nevýhodou statického odkalování moštu je velké množství kalu, který se pohybuje od 10 do 50 %. b) Odkalování dynamické (odstředivkou) Kalové částice se odkalují pomocí odstředivky. Odpadá potřeba velkého množství nádob a obtížná manipulace jako je tomu při statickém odkalování. Odstraňování kalových částic odstředivkou je rychlejší než sedimentace při statickém odkalování. Statické odkalování působí však lépe na kvalitu vína. Odkalování dynamické je oproti statické sedimentaci finančně náročnější, díky nákupu odstředivky. c) Odkalování filtrací Odkalování moštu filtrací na naplavovacích filtrech, kalolisech nebo vakuových filtrech se využívá pouze ojediněle, protože je poměrně nákladné. Dochází k malým ztrátám a získává se čirý mošt. Nejčastěji se používá kombinace dvou různých způsobů, například kombinace statického odkalování s filtrací. d) Odkalování flotací Tímto postupem dochází současně k úpravě tříslovin pomocí provzdušnění a přídavku želatiny, což se využívá při velkovýrobě s méně šetrným zpracováním hroznů. Do moštu je pod tlakem zaváděn plyn (dusík nebo vzduch). Po ukončení působení tlaku se vytvářejí malé bublinky, které přilnou k částicím kalu a s nimi plavou na hladině. Průběžně se snímá pěna vznikající na hladině. Odkalený mošt pomalu kvasí, protože se odstraní se zákalovými částicemi i původní mikroflóra v moštu. Zákvas pomocí čistých kultur nevyvolává takové intenzivní kvašení, jaké probíhá v neodkaleném moštu. Je samozřejmé, že na snížení zkvasitelnosti působí zejména stupeň odkalení moštu. Odkalení moštu má příznivý vliv na kvalitu budoucího vína, protože zákalové částice, které vznikly při silném lisování hroznů, se z moštu odstraní a nemohou se vyluhovat. Vína z odkalených moštů jsou proto jemnější, harmonicky sladěná a méně náchylná na oxidaci, takže si udržují správnou barvu (FARKAŠ, 1980). 25

26 3.2.4 Úpravy cukernatosti moštu Kvalita moštu a budoucího vína se posuzuje zejména podle poměru obsahu cukru a kyselin v hroznech. V příznivých letech mošty nepotřebují před kvašením zvláštní úpravu. V nepříznivých vegetačních podmínkách obsahuje mošt nižší procento cukru a mnoho kyselin. Z takových moštů jsou po vykvašení slabá a neharmonická vína, která se obtížně udržují delší dobu nepoškozená, neboť podléhají nežádoucím mikrobiologickým změnám. Proto se může doslazovat řepným cukrem na požadovanou cukernatost (PAVLOUŠEK, 2006). V ČR platí zákon č. 321/2004Sb, podle kterého lze zvýšit cukernatost v moštu určeného k výrobě stolního vína, ale ne u jakostního vína s přívlastkem Odkyselování moštu Nejvíce kyselin obsahují hrozny, které nejsou úplně dozrálé nebo dozrávají v nepříznivých teplotních podmínkách. Nejdůležitější kyseliny v moštu jsou kyselina vinná a kyselina jablečná. Během růstu a zrání hroznů se obě tyto kyseliny částečně odbourávají. Kyselina vinná se vysráží hydroxidem draselným na kyselý vínan draselný a kyselina jablečná se vlivem bakterií štěpí na kyselinu mléčnou. Víno tak ztrácí na kyselosti. Je-li v moštu vysoký obsah kyselin, doporučuje se zpravidla část jich odstranit. Výhodnější je odkyselovat mošt než hotové víno. Všechny zásahy do moštu mají totiž vždy příznivější vliv na kvalitu budoucího vína než zásahy do hotového vína. Odkyseluje se uhličitanem vápenatým, podvojným odkyselováním nebo scelováním vín (MINÁRIK, NAVARA, 1986) Přidávání bentonitu Bentonitem se odstraňují bílkoviny, které způsobují ve víně zákaly. Jedná se o preventivní ošetření proti bílkovinným zákalům. Vyšší teplota, která vzniká v průběhu kvasného procesu, příznivě ovlivňuje eliminaci bílkovin. Izoelektrický bod a hodnota ph jsou si v moštu bližší než ve víně, kde je hodnota ph vyšší. Čím blíže jsou hodnoty izoelektrického bodu a ph, tím rychleji se vylučují termolabilní bílkoviny (FARKAŠ, 1983). 26

27 3.3 Chemické reakce při kvašení Kvasinky mohou metabolizovat cukry aerobně díky dýchání nebo anaerobně kvašením. Během kvašení dochází k přeměně cukrům glukózy a fruktózy na etanol a CO 2. Oba dva způsoby metabolizmu mají společný počátek reakcí glykolýzu Glykolýza Jedná se o katabolický proces, probíhající bez přístupu kyslíku. Hexóza, glukóza a fruktóza, je přes několik látek rozštěpena na pyruvát. Při této metabolické dráze se uvolňuje energie, která je zachycena do ATP. Hlavním oxidačním činidlem je kofaktor NAD + a jeho dostatečné množství je nezbytné pro průběh glykolýzy. V průběhu dochází ke vzniku NADH, které je pak nutné reoxidovat zpět na NAD +, možné jsou dva způsoby aerobně a anaerobně. Obrázek č. 2: Schéma glykolýzy a možnosti reoxidace NADH 27

28 Obrázek č. 3: Průběh chemické reakce v buňce První reakcí je přenos fosfátové skupiny z ATP na glukózu za katalýzy enzymem hexokinázou za vzniku glukóza-6-fosfátu. Druhou reakcí je přeměna glukóza-6-fosfátu na fruktóza-6-fosfát katalyzovaná enzymem glukosafosfátizomerasou. Jde o izomeraci aldosy na ketosu. Následuje fosforylace fruktóza-6-fosfátu na fruktózu-1,6-bisfosfát, katalyzována fruktokinázou za spotřeby druhého ATP. Fruktokináza je hlavní enzym, který reguluje reakční rychlost celé glykolytické dráhy. Další reakcí je štěpení fruktóza- 28

29 1,6-bisfosfátu na dvě triosy glyceraldehyd-3-fosfát a glyceronfosfát. Jedná se o aldolové štěpení katalyzováné enzymem aldolázou. Glyceraldehyd-3-fosfát postupuje dále do reakcí. Šestou reakcí je oxidace a fosforylace glyceraldehyd-3-fosfátu prostřednictvím NAD+ a Pi, která je katalyzována glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázou. V této reakci pohání exergonická oxidace aldehydu syntézu acylfosfátu 1,3-bisfoglyrerátu. V sedmé reakci se tvoří ATP za pomocí fosfoglycerátkinásy a 1,3-bisfosfoglycerát se mění na 3- fosfoglycerát. 3-fosfoglycerát je katalyzován fosfoglycerátmutázou na 2-fosfoglycerát. Tento 2-fosfoglycerát je dehydratován na fosfoenolpyruvát katalyzovaný enolázou. V poslední reakci glykolýzy využívá pyruvátkinasa volnou energii hydrolýzy fosfoenolpyruvátu pro syntézu ATP za vzniku pyruvátu (RIBÉREAU-GAYAON, LONVAUD et al., 2006) Alkoholové kvašení Během alkoholového kvašení nepřeměňují kvasinky jen cukr na alkohol a vedlejší produkty, ale uvolňuje se i aroma a vznikají nové sloučeniny kvasný buket. Hlavní chemickou reakcí je přeměna cukru na etanol a oxid uhličitý. 1 mol glukózy 2 mol etanolu + 2 mol oxidu uhličitého 100 g 51,11 g + 48,89 g Ve skutečnosti nevznikne ze 100 g glukózy 51,1 g etanolu, ale jen asi 47 g. Vznikají totiž i jiné produkty než etanol (STEIDL, 2002). Kvasný proces probíhá přes mnoho meziproduktů a vedlejších produktů, přes kyselinu pyrohroznovou a acetaldehyd až k alkoholu. Obrázek č. 4: Alkoholová fermentace Vzniklý pyruvát je dekarboxylován za vzniku acetaldehydu a oxidu uhličitého. Reakce je katalyzována pyruvátdekarboxylazou. Koenzym je zde thiamindifosfát, jehož prekurzorem je thiamin. Poslední reakcí je redukce vytvořeného acetaldehydu NADH na etanol katalyzované alkoholdehydrogenazou (ADH). 29

30 Alkoholové kvašení rozdělujeme na tři fáze na začátek, bouřlivé kvašení a dokvášení (PÁTEK, 1998). Začátek kvašení charakterizuje rozmnožování kvasinek. Rozmnožování zpočátku probíhá zvolna, proto obvykle mošt hned nekvasí, zejména byl-li silněji zasířený. Bouřlivé kvašení moštu trvá 5 10 dní a prokvasí při něm podstatná část cukru. Mošt v době bouřlivého kvašení, který obsahuje více cukru než alkoholu, se nazývá burčák. Mošt začíná mít více alkoholu díky prokvášení cukru. Lepšímu prokvášení moštů pomůžeme promícháváním s kvasnicemi nebo přidáním zákvasu z aktivních suchých vinných kvasinek. Po skončení kvašení kvasinky klesají ke dnu a víno se začne čistit (KRAUS et al., 2004) Glyceropyruvátová fermentace Kvasinky využívají druhou metabolickou dráhu pro tvorbu pyruvátu, za určitých podmínek. Jedná se o glyceropyruvátovou dráhu, jejími hlavními produkty jsou glycerol a pyruvát. Kvasinky biosyntetizují především proteiny, lipidy, nukleotidy a další látky. Kyselina pyrohroznová slouží jako substrát pro syntézu většiny látek. Na počátku fermentace je nízká produkce alkoholu a pro syntézu pyruvátu je nedostatek NAD+. Proto kvasinky využívají glycerolpyruvátovou dráhu, kdy se dihydroxyaceton-1-fosfát redukuje a přijímá H+ z NADH. Glycerol-3-fosfát se defosforyluje za vzniku glycerolu. Glyceropyruvátová fermentace se využívá také při přítomnosti siřičitanů, které vážou acetaldehyd a ten tak nemůže být redukován na etanol, díky nedostatku NAD+ (RIBÉREAU-GAYAON, LONVAUD et al., 2006). Glycerol patří mezi tři látky s nejvyšší koncentrací ve víně. Hodnota se pohybuje okolo g/l, kde minimální koncentrace je 5 g/l. Množství glycerolu je ovlivněno zasířením moštu. Je zodpovědný zejména za plnost a hladkost vína. V suchých vínech se projevuje jeho přítomnost nasládlou chutí (RIBÉREAU-GAYAON et al., 2006). 30

31 Obrázek č. 5: Glyceropyruvátová fermentace Citrátový cyklus Jinak také Krebsův cyklus nebo cyklus trikarboxylových kyselin. Tvoří společnou metabolickou dráhu při aerobní oxidaci sacharidů, lipidů a proteinů. Zisk energie je ATP. Hlavním produktem je CO 2 a voda. Jedná se o sled reakcí, při kterých je acetylkoenzym A odbouráván na oxid uhličitý a redukované koenzymy NADPH + H+, FADH. Probíhá v matrix mitochondrií. Acetylkoenzym A se váže na oxalacetát za vzniku kyseliny citrónové, která v dalších krocích postupně ztrácí 2 uhlíky za vzniku 2 molekul CO 2, jedná se o dekarboxylaci, a vodíky dehydrogenace. A opět vzniká NADPH + H+, FADH2 a obnovení oxalacetátu, který opět vstupuje do tohoto cyklu (BENEŠOVÁ et al., 2003). 31

32 Obrázek č. 6: Citrátový cyklus 3.4 Složení vína Složení vína se s každým významným procesem, žádoucím či nežádoucím, mění. Např. při zvýšení cukernatosti, alkoholovém kvašení, vysrážením vinného kamene, čiřením mladého vína. Některé množství látek se snižuje nebo zcela odstraňuje, u jiných procesů vznikají úplně nové sloučeniny, např. během kvašení Alkoholy Methanol zvyšuje se intenzivním nakvášením rmutu, vzniká odbouráváním pektinů. Obsah methanolu se u bílého vína pohybuje mezi mg/l a u červeného mezi mg/l. Ethanol jedná se o hlavní složku vína ihned po vodě. Víno obsahuje 9-13 % obj. a je důležitým jakostním kritériem. Ethanol podporuje aroma ve víně a jeho zásluhou je víno plné a extraktivní. Glycerol primární produkt kvašení, který dodává vínu tělo a plnost. Je vytvářen především divokými kvasinkami na počátku kvašení (STEIDL, 2002). 32

33 3.4.2 Sacharidy Během kvašení se glukóza a fruktóza mění různou rychlostí. Pokud je kvasný proces zastaven v průběhu kvašení, převažuje výskyt fruktózy, která působí i sladším dojmem, které můžeme pozorovat u senzorického hodnocení. Víno v malých koncentracích obsahuje i pentózy, které jsou nezkvasitelné. Nežádoucí sloučeninou jsou polysacharidy, které způsobují problémy při filtraci. Pokud má mošt malou cukernatost, může se doslazovat řepným cukrem. Sacharóza se rozkládá během kvašení enzymaticky na invertní cukr, což je glukóza a fruktóza. Při nedokonalém prokvášení cukru může ve víně zůstat různý obsah zbytkového cukru (KRAUS et al., 1997) Primární produkty kvašení Acetaldehyd je předstupněm etanolu a vzniká z kyseliny pyrohroznové. Pokud nemůže enzym alkoholdehydrogenáza redukovat acetaldehyd na alkohol, zůstává větší množství acetaldehydu ve víně a znamená to zvýšení dávky SO 2. U červených vín je acetaldehyd nezbytný pro zrání, ale nepochází z kvašení. Pochází z alkoholu, jedná se o opačný proces než kvašení. Kyselina pyrohroznová jedná se o předstupeň acetaldehydu. Je nezbytný enzym pyruvátdekarboxyláza, aby proběhla změna na acetaldehyd. Tento enzym vyžaduje thiamin jako koenzym. Tohoto vitamínu může být obsaženo málo v hroznech napadených šedou hnilobou. Dochází k příliš pomalému kvašení způsobenému pomalou přeměnou na acetaldehyd. Kyselina 2-ketoglutarová látka, kterou syntetizují kvasinky k vytvoření vlastních buněčných substancí. Nejedná se o vedlejší produkt. Vzniká v cyklu kyseliny citronové jako produkt kvašení Kyseliny Většinu kyselin ve víně tvoří kyselina vinná a jablečná. Jablečná je zastoupena více u vín v nevyzrálých ročnících, vinná zase u dobře vyzrálých ročníků. Kyselina vinná během kvašení kvasinky tuto kyselinu nenapadají. Část této kyseliny se vysráží ve formě vinného kamene. Velmi vysoký obsah kyselin může být snížen odkyselováním, kde kyselina vinná vypadne ve formě uhličitanu vápenatého. 33

34 Kyselina jablečná tato kyselina je lehce zpracována mikroorganismy. Kvasinky přeměňují během kvašení kyselinu jablečnou. Vzniká při tom alkohol, ne kyselina mléčná jako při biologickém odbourávání kyselin. Kyselina mléčná vzniká ve větším množství jen při přeměně kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou. Kvasinky mohou v malém množství měnit kyselinu pyrohroznovou na kyselinu mléčnou. Kyselina octová kvasinky za nepřístupu vzduchu mohou vytvářet kyselinu octovou. Hlavně vzniká ale za přístupu vzduchu oxidací etanolu. Kyselina citronová obsah se pohybuje mezi mg/l a může být odbourávána bakteriemi jablečno-mléčného kvašení. Zvýšený obsah je v ledovém víně, jinak má ve víně relativně malý význam. Je to stabilizační prvek proti kovovým zákalům na základě vytváření chalátů. Kyselina jantarová vzniká odbouráváním kyseliny jablečné kvasinkami a jedná se tak o vedlejší produkt kvašení. Kyselina glukonová jedná se o oxidační produkt glukózy. Velké množství se nachází v moštu z botrytických hroznů Kyselina slizová je oxidačním produktem kyseliny galakturonové, hlavní složky pektinů a vytváří ji Botrytis cinerea. U vín s vyšší cukernatostí se může vysrážet ve formě bílých krystalků (STEIDL, 2002) Minerální látky Kořeny révy přijímají minerální látky spolu s vodou. Množství těchto látek je závislý na půdě, počasí, hnojení, odrůdě a vyzrálosti. Nejdůležitější látky jsou draslík, hořčík, vápník a sodík z aniontů pak sírany, fosforečnany, chloridy a uhličitany. Obsah železa se může zvýšit kontaktem s železným nářadím při zpracování a skladování. Obsah se snižuje krystalizací, vysrážením a spotřebováním kvasinkami (STEIDL, 2002) Dusíkaté sloučeniny Jedná se o sloučeniny bílkovin aminokyseliny a amonné sloučeniny. Obsah dusíku stačí zejména k tomu, aby došlo k prokvášení. Volné aminokyseliny mají význam pro vznik kvasného buketu. Botrytis cinerea využívá aminokyseliny pro látkovou výměnu a může tím obsah dusíkatých látek snížit. Značné množství dusíkatých látek je spotřebo- 34

35 váváno kvasinkami. Při zrání vína na kvasnicích se obsah aminokyselin opět zvyšuje. Množství bílkovin je různé u odlišných odrůd i ročníků. V suchých letech je bílkovin více. Koncentrace bílkovin se snižuje kvašením, reakcí s tříslovinami a ošetření bentonitem. Termolabilní bílkoviny mohou vést k zákalům v lahvi (KRAUS et al., 1997) Polyfenoly Polyfenoly jsou často zahrnovány pod společné označení tříslovin a barviv. Tato skupina látek obsahuje asi 8000 sloučenin. Polyfenoly ovlivňují barvu, hořkost, stahující pocit v chuti jímavost kyslíku a průběh stárnutí moštu a vína. Naležení rmutu a silnější lisování podporuje zvyšování obsahu polyfenolů, velký obsah je pak v moštu z narušených bobulí. U červeného vína je obsah polyfenolů 3krát až 10krát vyšší (STEIDL, 2002). Víno obsahuje zbytky zeleného barviva chlorofylu, karotinu a žlutého xantofylu. Tyto barviva jsou obsažena ve slupkách bobulí. Bílým vínům tato barviva dodávají různé odstíny zelenkavé až žluté barvy. Vína, která byla delší dobu ve styku se slupkou, mají zlatožlutou barvu, kdežto vína rychle lisovaná jsou zelenkavá. U červených vín se jedná o antokyanové barviva. Vznik antokyanů je závislý na dostatečném slunečním záření. Barva závisí na kyselosti prostředí. Červená vína s vyšším obsahem kyselin mají světlejší barvu a vína s nižším obsahem kyselin mají barvu tmavě červenou. Červená vína s vyšším obsahem tříslovin mívají také tmavší rubínově červenou barvu. Při stárnutí se antokyany rychleji rozkládají a barva vín se mění na cihlově červenou (KRAUS et al., 1997) Aromatické látky Jedná se o vonné a chuťové látky moštu a vína, které pojmenováváme výrazem buket. Buketní látky z hroznů jsou náchylné na vzduch a napadení hnilobou je pozměňuje již v bobulích. Aromatické látky ve víně jsou nejrůznějšího původu. Může se jednat o jednoduché látky jako kyseliny a estery, nebo složitější jako terpenoly, které vínu dodávají vůně kořenité či květinové. Zvyšující se cukernatost hroznů neznamená automaticky větší aromatickou vyzrálost. Velký vliv na ni má stanoviště a agrotechnické zásahy prováděné na vinici, zejména zelená práce. Stejná odrůda může mít na různých stanovištích zcela odlišné aromatické zastoupení. Aromatická zralost je tedy kombinací odrůdy, vlivu stanoviště a uplatňování agrotechnických zásahů (ILAND et al., 2002). 35

36 Rozdělení aroma Aroma patří mezi hlavní charakteristiky vín. Může tak zásadně ovlivňovat úspěch či neúspěch vína na trhu, protože spolu s chutí a barvou se podílí na vnímání daného vína konzumenty. V některých případech sice ve vůni převládá konkrétní aromatická látka charakteristická pro danou odrůdu, obecně je ale aroma způsobené projevem stovek aromatických látek. Podle aroma můžeme rozlišit jednotlivá vína i jednotlivé odrůdy. Jako aroma vína lze označit soubor látek senzoricky zachytitelných při čichové a chuťové zkoušce (STÁVEK, 2002). Rozlišujeme aroma do tří skupin: primární, sekundární, terciální aroma. Primární aroma tvoří odrůdové aroma, základ aroma vína a aromatické látky jsou přítomny již v moštu. Jsou to terpenoly (linalol, garaniol, nerol), alkoholy a aldehydy. Pro každou odrůdu je charakteristické složení a poměr aromatických látek, jejichž obsahy jsou v různých ročnících velmi podobné. Různá vyzrálost hroznů může způsobit odchylky v jejich složení. Sekundární aroma aromatické látky vznikají během alkoholového kvašení ze sacharidů (alkoholy, mastné kyseliny, estery, aldehydy a ketony). Sekundární aroma hraje v celkovém buketu vína nejdůležitější roli. Vznikající látky jsou velmi těkavé a při kvašení za vyšších teplot jich velká část unikne. Je tedy třeba klást důraz na pomalé kvašení vína při nízké teplotě, kdy je větší pravděpodobnost udržení těchto látek ve víně. Terciální aroma aromatické látky vznikají různými biochemickými reakcemi v průběhu zrání vína (ÁLVAREZ-PEREZ et al., 2012) Významné aromatické látky ve víně Nejdůležitější prvky pro aroma vína jsou kyslíkaté terpenové sloučeniny, jako jsou alkoholy, estery a další deriváty (VELÍŠEK, 1999). Z bobulí révy vinné vznikají zejména aromatické sloučeniny terpenoidy, těkavé fenoly a vysoce vonné sloučeniny thioly. Tyto sloučeniny hrají hlavní roli v kvalitě a aromatu vína (RIBÉREAU-GAYON, 2006). Estery - patří k nejvýznamnějším aromatickým látkám vín. Estery jsou nositelem jemného aroma a nacházejí se i u silně aromatických odrůd. Estery vznikají za působení kvasinek a bakterií za reakce alkoholu s organickými kyselinami. Dodávají vínu celkový odrůdový charakter, vůni a chuť (ROJAS et al., 2003). 36

37 Tvoří se během kvašení a zpomaluje se během dokvášení. Dělí se na neutrální, které vznikají enzymatickými procesy a patří sem kyselina octová nebo kyselé, které jsou tvořeny chemickou esterifikací a sem řadíme kyselinu jablečnou a vinnou (FARKAŠ, 1983). Tabulka 1: Estery ve víně (SWINGERS et al., 2005) LÁTKA CHARAKTERISTICKÉ AROMA Ethylacetát kyselé, ovoce, lak na nehty Izoamylacetát banán, hruška Izobutylacetát banán, ovoce Ethylbutanoát květiny, ovoce Ethylhexanoát zelené jablka Ethyloktanoát mýdlo 2-fenyletylacetát květiny, růže, ovoce Těkavé fenoly většinou ve víně způsobují nežádoucí aroma, které poškozují kvalitu vína. Nižší koncentrace jsou žádoucí, ve vyšších koncentracích jsou nežádoucí. Těkavé fenoly jsou přítomny v bílých i červených vínech s velkými rozdíly podle odrůdy, počasí a způsobu zpracování. Hnědě zbarvené hrozny ve vinici u bílých odrůd jsou znakem vyšší koncentrace těkavých fenolů. V chuti jsou bobule nahořklé a hrozen nemá zcela typickou ovocnou vůni (PAVLOUŠEK, 2010). Tabulka 2: Těkavé fenoly ve víně (SWINGERS et al., 2005) LÁTKA 4-ethylfenol 4-etylguajakol 4-vinylfenol 4-vinylguajakol CHARAKTERISTICKÉ AROMA pach kůže, pot koně, lak kouřově kořeněné farmaceutické hřebíčkové Vonné thioly jedná se o sirné sloučeniny, které jsou zodpovědné za senzorické vady vína. Podílejí se ale na aroma aromatických odrůd. Pro tvorbu thiolů je důležitá vyrovnaná výživa dusíkem ve vinici a správná vláha v půdě. Enzymatická aktivita -lyázy se podílí na uvolňování thiolů do vonné podoby. K tomuto pro- 37

38 cesu dochází v průběhu macerace hroznů nebo během kvašení. Délka macerace, teplota při ní, použitý kmen kvasinek, teplota kvašení a způsob výroby rozhoduje o projevu vonných thiolů ve víně (PAVLOUŠEK, 2010). Tabulka 3: Thioly ve víně (SWINGERS et al., 2005) LÁTKA Methanthiol Ethanthiol 4-merkapto-4- methyl-pentan-2-on Merkaptohexanol thiofen-2-thiol CHARAKTERISTICKÉ AROMA hnijící voda cibule, guma, zemní plyn černý rybíz, krušpánek černý rybíz, grapefruit, granátové jablko spálená guma, pražená káva 3.5 Školení a zrání vína Po ukončení kvašení dochází ke stáčení mladého vína. Jedná se o složité fyzikální, chemické a biochemické děje, které mají významný vliv na charakter vína. Látky, které zejména podléhají změnám, jsou organické kyseliny a dusíkaté látky. Esterifikací kyselin a alkoholů dochází ke vzniku esterů, které jsou významné buketní látky. Dbá se zejména na co nejmenší kontakt vzduch s vínem, aby nedocházelo k poškození aromatického charakteru. Provzdušnění vína provádíme pouze, pokud chceme z vína odstranit nežádoucí pach po kvasnicích nebo začínající sirky. Ideální podmínky pro zrání bílých vín ve vinném sklepě představuje teplota 9-12 C a vlhkost okolo 70 %. Vyšší teploty mohou způsobovat vznik chorob a vad ve víně a nižší mohou zpomalovat zrání. Obsah kyselin se pohybuje okolo 5-10 g/l. Po prvním stočení je nejvhodnější doba pro úpravu kyselin, aby víno bylo harmonické, a nezpůsobují trpkou chuť. Délka zracího procesu je závislá na odrůdovém charakteru, chemickém složení, způsobu skladování a ošetření vína. Po několika měsících získávají bílá vína optimální kvalitu, u odrůd s nízkým obsahem kyselin a extraktu dozrávají ještě dřív. V procesu školení a zrání vína se provádí čiření, odstranění bílkovin, filtrace a nakonec lahvování (PAVLOUŠEK, 2006). 38

39 3.5.1 Zrání vína na kvasničných kalech SUR LIE Jedná se o technologii, kdy víno zraje na jemných kvasničných kalech, vykvašené víno se nestáčí, ale je po určitou dobu na vlastních kvasnicích. Jde o francouzskou metodu, kdy jsou kvasinky prospěšné i po prokvašení veškerého cukru na alkohol. Mrtvé buňky kvasinek se ve víně rozkládají a stávají se hlavní složkou jemných kvasničných kalů. Jejich pravidelným promícháváním během zrání se do vinného moku extrahují nové chutě a vůně za vzniku aromatičtějších, plnějších a komplexnějších vín. Během alkoholového kvašení se na dně nádob usazují hrubé kaly. Hrubé kaly tvoří odumřelé buňky kvasinek a baktérií společně s krystaly vinného kamene a zbytky slupek. Tyto látky mohou uvolňovat nežádoucí chuťové a aromatické tóny, proto je třeba víno nejprve stočit z hrubých kalů. Jemné kaly zůstanou a víno zraje na nich. Po ukončení procesu ležení na kalech se víno již nefiltruje, ale po poslední sedimentaci se stáčí do lahví přímo ze sudů, nebo se stočí do nového sudu. Pokud byl mošt dobře odkalen, kal mladého vína může obsahovat pouze kvasničné buňky, ale žádné jiné nečistoty. Stáčení z hrubých kalů je pak zbytečné. Pro kvasinky to může být riziko teplotního šoku, poté je možná i vyšší pravděpodobnost zastavení kvašení a vyšší obsah zbytkového cukru. Nové výživové látky se do vína dostávají autolýzou. Autolýza je děj, kdy se kvasinka zničí sama. Kvasinka se rozmnožováním zjizví a v těchto jizvách není možná látková výměna, a tak kvasinka umírá. Autolýzu lze ovlivnit výběrem kvasinek, teplotou nebo enzymy. Promíchávání kalů se provádí na počátku ležení dvakrát za týden, po čase se snižuje na jedenkrát za měsíc. Promíchávání má vliv na zamezení vzniku sirky, která vzniká na povrchu vína, na zvýšení množství polysacharidů a zesílení pocitu krémové chuti. Vína leží na kvasnicích maximálně 9 měsíců, ale doba je ovlivněna na mnoha faktorech, teplotě, autolýze, enzymech (STEIDL, 2010). 39

40 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Rulandské bílé Pro svoji diplomovou práci jsem použila odrůdu Rulandské bílé. Tato odrůda vznikla pupenovou mutací v rámci skupiny odrůd Pinot z Rulandského šedého. Odrůda se pěstuje ve Francii od 14. století. Dříve tato odrůda nazývaná také jako Burgundské bílé, Roučí bílé či Pinot blanc pochází zřejmě z Burgundska a je rozšířená po celém světě. Ve státní odrůdové knize je zapsána od roku 1941do roku 1993 pod názvem Burgundské bílé, v roce 1993 se změnil název na Rulandské bílé. Po celém světě je tato odrůda známá jako Pinot blanc. Na území České republiky zaujímá okolo 5% vysázených ploch vinic. Dochází k postupnému snižování v důsledku konkurence odrůdy Chardonnay. Průměrné stáří vinic osázených Rulandským bílým činí 22 let. Nejvíce je tato odrůda zastoupena v podoblasti slovácké a litoměřické. Hrozen je středně velký, hustý, s krátkou stopkou. Bobule je malá, kulatá. Barva bobule je žlutozelená. List je středně velký, kruhovitý, pětilaločnatý s mělkými horními bočními výkroji. Vrchní strana čepele listu je středně až silně puchýřkovitá. Růst je středně bujný s polovzpřímenými letorosty. Sklizeň začíná podle zralosti v druhé polovině září. Odrůda je poměrně dobře odolná proti napadení plísní révovou a padlím révy. Plíseň šedá často napadá jemnou slupku bobule. Proti poškození mrazem je odrůda středně odolná, někdy bývá poškozena jarními mrazíky. Odrůda klade vysoké nároky na polohu a půdu. Vyžaduje slunné polohy, záhřevné půdy, hlinité, dostatečně vodozdržné s vyšším obsahem CaCO 3, který podporuje tvorbu aromatických látek. Výnos bývá vysoký, 8-12 t/ha. Dosahuje v dobrých ročnících vysoké cukernatosti s možností produkce vína v pozdním sběru či výběru z hroznů. Obsah kyselin bývá vyšší, pohybuje se okolo 8 až 14 g/l. Typická odrůdová vína jsou světle žlutá až zlatavě zelenožlutá. Vína z této odrůdy bývají plná, extraktivní s vyšším obsahem kyselin. Kyselinka nesmí být drsná, ale příjemná. Ve vůni můžeme hledat chlebovinku, vlašské ořechy, lipový květ, hrušky, citrusové plody, vanilku nebo med. Vína jsou vhodná k archivaci. Rulandské bílé je výborná surovina pro výrobu šumivých vín a také pro zrání v sudech barique. 40

41 4.2 Příprava vzorků Odrůdu Rulandské bílé pěstujeme ve vlastních vinicích na 700 keřích révy vinné. Hrozny jsme sbírali od 11 hodin. Viniční trať Dolní Padělky, kde tuto odrůdu pěstujeme, se nachází ve vinařské obci Hovorany ve Slovácké podoblasti. Odrůdě Rulandské bílé se v této lokalitě daří a každoročně vyzrává do jakostních vín. Hrozny byly ručně posbírány, vzhledem k špatnému počasí, velkým dešťům, nebyl tento rok optimální, a proto na některých hroznech byla viditelná hniloba. Bylo vybráno 10 bedýnek asi po 25 kg hroznů zdravých, bez známky hniloby. Na těchto 250 kg bylo nasypáno 25 g pyrosulfitů draselného. Tyto bedýnky se přímo nasypaly do horizontálního mechanického lisu, bez odstopkování, a lisovaly se ihned bez přídavku cukru. Cukernatost těchto hroznů byla 20 NM. Zbytek hroznů z vinice, který činil 450 kg, se posbíral do sběrného vozu. Tyto hrozny už byly částečně napadeny hnilobou, ale jen z malé části. Hrozny pohlcené celé hnilobou, jsme střihali na zem. Tato část hroznů byla odstopkována na mlýnkoodstopkovači a lisována na horizontálním mechanickém lisu. Hrozny mírně napadlé hnilobou měli vyšší cukernatost 22 NM. Hrozny jsem zasířila větší dávkou pyrosulfitu draselného, 120 g, ihned po sběru do vozu, z důvodu napadení hnilobou a aby nedošlo k zapaření suroviny před samotným lisováním. Lisování proběhlo ihned po samotném sběru v horizontálním mechanickém lisu. Výlisnost činila 60 %. Získaný mošt byl odkalen přírodní cestou, kdy se po dobu 12 hodin nechaly usazovat kaly na dno a následně se stočil vrchní podíl bez kalů do barelu. Kromě nemletých hroznů, které byly použity ke spontánní fermentaci, se vylisovaný mošt rozdělil na 5 částí. Ke každému moštu bylo přidáno před začátkem kvašení 20 g/hl Supervitu, což je komplexní startér kvašení obsahující živné soli na bázi fosforečnanu a síranu, dusík ve formě amonného iontu a thiamin jako vitamín B1. Stimuluje růst a propagaci kvasinek. Všech 5 částí bylo zaočkováno různými druhy AVSK. Jejich aktivace probíhala ve směsi vlažné vody a moštu v poměru 1:1 asi 20 minut a poté se zákvas aplikoval. Každé kvasinky při samotné aktivaci reagovaly úplně jinak. Vzorek číslo tři vytvořil pěnu na povrchu, shluk malých nabobtnaných částic vytvořily vzorky číslo 2 a 5. Zatím co vzorek číslo 4 a 6 pokryl celý povrch jemným povlakem. Fermentace probíhala při teplotě 15 C. Všechny vzorky byly zastaveny zasířením pyrosulfitem draselným v dávce 15 g na 60 litrů dne Po zastavení kvašení byl ke vzorku přidán Aktiv Bentonit 41

42 pro snadnější a rychlejší vyčeření. Poté se vzorky stočily do 50 litrových demižonů. Na začátku roku 2015 byl opět přidán Bentonit pro vyčiření a stabilitu vůči bílkovinám. V lednu 2015 proběhla filtrace deskovým filtrem přes desky S 60 N z demižonu a zpět do demižonu přes S 20 N. Během zrání vína byla neustále kontrolována hodnota volného oxidu siřičitého, kdy při poklesu byla přidána tekutá síra v potřebném množství. V průběhu kvašení byly odebírány jednotlivé vzorky pro pozorování prvků během fermentace. Celkem bylo odebráno 5 vzorků. 1) Odběr č mošt z nemletých nebo mletých hroznů 2) Odběr č těsně po zakvašení AVSK 3) Odběr č v průběhu plného kvašení 4) Odběr č těsně před zastavením kvašení 5) Odběr č hotové víno Všechny odebrané vzorky, kromě vína, byly ihned po odebrání zamraženy a rozmraženy byly až těsně před jednotlivými stanoveními. 4.3 Použité kvasinky Všechny nádoby byly očíslovány od 1 do 6 a každá byla zaočkována jiným druhem aktivních suchých vinných kvasinek. Všechny druhy kvasinek jsem zakoupila ve vinařských potřebách Lipera ve Velkých Bílovicích Nádoba číslo 1 SPONTANNÍ FERMENTACE Vzorek nebyl zaočkován žádnou AVSK. Kvašení probíhalo pouze s kvasinkami, které byly přirozeně obsaženy na hroznech. Spontánní kvašení popsáno viz. kapitola Nádoba číslo 2 UVAFERM SLO Jedná se o speciálně selektované suché čisté kvasinky, vhodné zejména na studené kvašení. Univerzální kvasinky na odrůdy rulandského typu. Kvasinky druhu Saccharomyces bayanus vykazují příznivý průběh kvašení s vysokým stupněm konečného prokvašení. Divoké kvasinky a nežádoucí bakterie jsou potlačovány. Tato kvasinka vytváří ovocný buket. Dokáže vytvářet až 16 % obj. alkoholu. Praktická alkoholová výtěžnost činí asi 47 % z prokvašeného cukru. 42

43 4.3.3 Nádoba č. 3 SIHA VARIOFERM SIHA VARIOFERM je vysoce aktivní kombinace tří kultur sušených kvasinek ze Saccharomyces cerevisiae D4, SF8 a U17 k spolehlivému, čistému kvašení při výrobě vína. Kvašení je mírné, kvasinky dominují nad spontánní flórou, tvoří se malá pěna a rychle sedimentují. Díky kombinaci více druhů kvasinek vytváří široké aromatické spektrum. Vhodné pro tvorbu bílých vín se zbytkovým cukrem. Nevznikají téměř žádné nežádoucí vedlejší produkty kvašení, a tím je vyloučeno ovlivnění chuti cizími tóny z kvašení Nádoba číslo 4 LALVIN EC 1118 Jedná se o sektovou kvasinku. Tato suchá čistá kultura kvasinek byla speciálně selektovaná z kmene druhu Saccharomyces bayanus používaná velmi spolehlivě při zkvašení bílých moštů a vín. U tichých vín zdůrazňuje citrusová aroma, u sektů vytváří spíše aroma zelených jablek. Z důvodu vyšší aktivity - glukosidáze se uvolňují vázané terpeny, které zvyšují ovocný charakter. Kvasinky jsou velmi odolné i za nejnepříznivějších podmínek kvašení a tím se snižuje i potřeba živin kvasinek. Optimální teplota kvašení se pohybuje mezi 14 a 18 C Nádoba číslo 5 SIMI WHITE SIMI WHITE jsou speciálně selektované aroma kvasinky z kmene Saccharomyces cerevisiae, které se dobře hodí zejména k prokvašení neutrálních odrůd. Vytváří mohutné exotické aroma. Vykazuje příznivý průběh kvašení s vysokým stupněm konečného prokvašení. Plynulé kvašení je nutné podpořit vysokou dávkou živných solí pro kvasinky. Optimální teplota kvašení se pohybuje mezi 15 a 18 C. Dokáže vytvářet až 14 % obj. alkoholu Nádoba číslo 6 VINIFERM COOL WHITE Jedná se o BIO kvasinku, která je jednou ze dvou celosvětově prvních sušených čistých kultur kvasinek Saccharomyces cerevisiae, které byly pečlivě selektovány z biodynamického biotopu a speciálně vyvinuty pro kvašení bílých a růžových vín. Tyto kvasinky byly vybrány na základě prokázaných, přirozených fyziologických vlastností k výrobě vína s důrazem na terroir a odrůdu. Kombinuje senzorickou rozmanitost jiných druhů 43

44 než Saccharomyces a spolehlivost prokvašení kmenů Saccharomyces. Vytváří široké spektrum aroma a velkou toleranci vůči alkoholu, ideálně zdůrazňuje charakteristické vlastnosti odrůdy a terroiru v každém víně. Kvasinka má nízkou potřebu živin a je ideální pro následnou malolaktickou fermentaci (LIPERA, 2014). 4.4 Metody stanovení analýzy vína Stanovení titrovatelných kyselin ve víně Celkový obsah kyselin je souhrn titrovatelných kyselin, těkavých a netěkavých kyselin při neutralizaci vína roztokem hydroxidu sodného do ph = 7,0. Analýza titrovatelných kyselin měří koncentraci všech vodíkových iontů ve vzorku, které jsou přístupné pro reakce s roztokem hydroxidu sodného při titraci. Bod ekvivalence se určí vizuálně s použitím indikátoru bromthymolová modř, která po dosažení bodu ekvivalence obarví víno do modrozelena. Titrovatelné kyseliny se vyjadřují jako g/l kyseliny vinné. Pro kontrolu jsem vzorky stanovovala titrací hydroxidu sodného i na indikátor fenolftalein. Spotřeba NaOH se neměnila, proto indikátor nemá vliv na titraci vzorku Stanovení cukrů a alkoholu pomocí kapalinové chromatografie Jedná se HPLC chromatografii, kde princip metody spočívá v pohybu vzorku v systému dvou fází, mobilní a stacionární. Mobilní fází je zředěná kyselina sírová a stacionární fáze je uložena v koloně, kudy prochází mobilní fáze za stálého tlaku. Vzorek se nanáší na kolonu a výsledek je pozorován detektorem, který množství látky vyhodnotí jako pík. HPLC chromatogram se skládá ze zásobníku mobilní fáze, vysokotlakého čerpadla, dávkovacího zařízení, detektoru a počítače pro záznam a zpracování vyhodnocených dat. Měření probíhalo na přístroji značky Ecom, který se skládá z dvoupístové pumpy, dávkovacího ventilu, termostatu kolon, ocelové kolony 250mm x 8mm s náplní Ostion 10 μm. Detektor je refraktometrický RIDK-102. Detekuje látky podle rozdílu indexu lomu. Odezva závisí na teplotě, má nižší citlivost a umožňuje detekci skoro všech látek. Vzorky byly před nástřikem odkaleny na centrifuze. Kolona byla vytemperována na 80 C, nástřik činil 5 μl, průtok byl 0,5 ml/min. Vše se vyhodnocovalo programem Clari- 44

45 ty za stálého tlaku 5,4 MPa. Nejprve jsem provedla kalibraci na stanovované prvky, sacharózu, fruktózu, glukózu, glycerol, metanol a ethanol v koncentraci 1% a 5%. Obrázek č. 7: Schéma kapalinového chromatografu Stanovení senzorické analýzy u vína Senzorická analýza je hodnocení vín pomocí smyslových vjemů. Hodnotí se barva, vůně, chuť. U vín se stanovoval i senzorický profil. Vína byla hodnocena 100 bodovým systémem. Platí, že vína, která přesáhnou 90 bodů, jsou zcela ojedinělá, excelentní a mimořádná. Vína, která dosáhnou více než 75 bodů, jsou pak standardní kvality a bez závad. Hodnocení vín je subjektivní záležitost, ale vždy by mělo být snahou všech organizátorů a degustátorů, aby všechna vína měla stejnou šanci na objektivní hodnocení. 45

46 nedostatečné dostatečné dobré velmi dobré vynikající Tabulka 4: Hodnocení vín 100 bodovým systémem poznámky: VZHLED čirost barva VŮNĚ čistota intenzita harmonie CHUŤ čistota intenzita perzistence harmonie Celkový dojem vyřazeno: datum: podpis degustátora: body celkem: 46

47 5 VÝSLEDKY 5.1 Analytické rozbory vína Všechna měření u vzorků se pokaždé prováděla dvakrát. Z výsledků jsem následně vypočítala aritmetický průměr a následně vypočítala směrodatnou odchylku, většina hodnot vykazuje nízký rozptyl od průměrných hodnot Množství titrovatelných kyselin Při stanovování celkových kyselin, jsem nejprve provedla standardizaci odměrného roztoku 0,1 M NaOH na 0,1 M HCl. Každý vzorek byl titrován třikrát, kde jsem z naměřených výsledků udělala aritmetický průměr. Kyseliny jsem přepočítávala na kyselinu vinnou g/l. Množství kyselin jsem měřila při každém odběru, i během fermentace. Tabulka 5: Množství kyselin u SPONTÁNNÍ FERMENTACE ODBĚR MNOŽSTVÍ KYSELIN (g/l) 1. 8, , , , ,20 ODBĚR MNOŽSTVÍ KYSELIN (g/l) 1. 9, , , , ,49 Tabulka 6: Množství kyselin u kvasinek UVAFERM SLO 47

48 Tabulka 7: Množství kyselin u kvasinek SIHA VARIOFERM ODBĚR MNOŽSTVÍ KYSELIN (g/l) 1. 9, , , , ,10 ODBĚR MNOŽSTVÍ KYSELIN (g/l) 1. 9, , , , ,64 Tabulka 8: Množství kyselin u kvasinek LALVIN EC 1118 Tabulka 9: Množství kyselin u kvasinek SIMI WHITE ODBĚR MNOŽSTVÍ KYSELIN (g/l) 1. 9, ,18 ODBĚR MNOŽSTVÍ 3. 8,34 KYSELIN (g/l) 4. 8, , , , , , ,74 Tabulka 10: Množství kyselin u kvasinek VINIFERM COOL WHITE Podle výsledků je zřejmé, že kyseliny se během fermentace snižují, proto není vhodné odkyselovat vína během kvašení, ale až po zrání vína. Na počátku se v moštu vyskytovaly kyseliny ve velkém množství, které se u některých druhů kvasinek zredukovali až skoro o 2 g/l. 48

49 Množstvý titrovatelných kyselin ve víně (g/l) Obrázek č. 8: Množství titrovatelných kyselin ve víně Je zřejmé, že se kyseliny v hotovém víně pohybovali v podobném rozmezí. Rozdíl byl hlavně během kvašení, kdy jednotlivé kvasinky různě snižovaly kyselost. Nejvýraznější průběh byl u kvasinek VINIFERM COOL WHITE, které snížily množství kyselin z původních 9 g/l až na 7 g/l. Tyto bio kvasinky měly nejblíže i svým průběhem ke spontánnímu kvašení. Je zajímavé, že spontánní fermentace obsahuje nejméně kyselin - 7,20 g/l. Kdežto nejvíce kyselin obsahovaly sektové kvasinky LALVIN EC , 64 g/l. Nelze přímo říct, že mají kvasinky vliv na kyseliny ve víně Rozbory v průběhu kvašení Během fermentace byly pomocí kapalinové chromatografie měřeny znaky, jako je glukóza, fruktóza, oligosacharidy, glycerol, ethanol a metanol. Veškeré cukry při sečtení dávají hodnotu zbytkového cukru. Ve vzorcích jsem měřila i obsah oligosacharidů, když jsem vzorky nedoslazovala řepným cukrem, obsahovaly malé množství oligosacharidů. Tyto cukry se mohou vyskytovat ve vzorku v důsledku obsahu slizů a vosků obsažených v bobuli hroznu, které se postupem času rozkládají na jednodušší cukry. Naměřené hodnoty jsem zaznamenala do tabulky pro každý vzorek zvlášť. Pomocí tohoto měření jsem pozorovala, jak se mění úbytek cukru vůči narůstajícímu alkoholu. 49